JPH0630783A - ３，５−ジオキソエステルの立体選択性微生物的または酵素的還元による３−ヒドロキシ−５−オキソ、３−オキソ−５−ヒドロキシおよび３，５−ジヒドロキシエステルの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 コレステロール低下剤の化学合成に必要なキ
ラル中間体の製造法を提供すること。 【構成】 微生物またはそれらから誘導されるレダクタ
ーゼを用い、 【化１】 で示されるジケトエステルを還元し、３−ヒドロキシ，
５−ヒドロキシ，３，５−ジヒドロキシエステル化合物
を製造する。好ましい立体異性体は、 【化２】 【化３】 【化４】 で示されるエナンチオマー化合物であり、これらを用い
て、 【化５】 で示されるコレステロール低下剤を製造することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコレステロール低下剤の
化学合成に必要なキラル中間体の製造に関する。

【０００２】

【発明の構成と効果】本発明に従って、式［Ｉ］：

【化１６】 ［式中、Ｘ¹はアルキル、アリール、シクロアルキル、
アラルキルまたはシクロアルキルアルキル；およびＸ²
はアルキルである］で示されるジケトエステルをレダク
ターゼ供給微生物または該微生物から誘導されるレダク
ターゼで処理して、式［ＩＩ］：

【化１７】 で示される３−ヒドロキシエナンチオマー化合物または
式［ＩＩＩ］：

【化１８】 で示される５−ヒドロキシエナンチオマー化合物もしく
は式［ＩＶ］：

【化１９】 で示される３，５−ジヒドロキシエナンチオマー化合物
を形成する。さらに、化合物［ＩＩ］と［ＩＩＩ］を上
記レダクターゼまたは微生物で処理して、化合物［Ｉ
Ｖ］のエナンチオマーを形成する。

【０００３】さらに本発明に従って、エナンチオマー化
合物［ＩＶ］を有機酸（ｐ−トルエンスルホン酸など）
で処理することにより、式［Ｖ］：

【化２０】 ［式中、Ｘ³とＸ⁴はそれぞれ独立して水素、アルキル、
シクロアルキルまたはアリール、あるいはいっしょにな
って、それらが結合する炭素原子とともに炭化水素環を
形成する炭素数４〜６のアルキレンである］で示される
ジアルコキシ化合物と反応させて、式［ＶＩ］：

【化２１】 で示されるジオキシンを形成する。化合物［ＶＩ］に水
素添加（たとえば、パラジウム／炭素の存在下にてＨ₂
処理）して、式［ＶＩＩ］：

【化２２】 で示されるアルコールを形成する。アルコール［ＶＩ
Ｉ］を酸化（たとえば、ジメチルスルホキシド、塩化オ
キサリルおよび塩化メチレン中のトリエチルアミンでス
ワーン酸化）して、式［ＶＩＩＩ］：

【化２３】 で示されるアルデヒドを形成する。

【０００４】アルデヒド［ＶＩＩＩ］を米国特許第４８
９７４９０号（１９９０年１月３０日登録）および該特
許明細書に引用された特許出願に記載の方法でコレステ
ロール低下剤の製造に用いることができる。アルデヒド
［ＶＩＩＩ］をテトラヒドロフランまたはジメチルホル
ムアミドなどの不活性有機溶媒中、ｎ−ブチルリチウム
などの強塩基の存在下、約−５０〜−７８℃で式［Ｉ
Ｘ］：

【化２４】 で示されるホスホノエステルまたは塩とカップリングさ
せて、式［Ｘ］：

【化２５】 ［式中、Ｒ¹とＲ⁴はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、
トリフルオロメチルまたは炭素数１〜４のアルキルまた
はアルコキシ；Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵およびＲ⁶はそれぞれ独立
して水素、ハロゲンまたは炭素数１〜４のアルキルまた
はアルコキシ；Ｚは

【化２６】 または

【化２７】 Ｒ⁷およびＲ⁸はそれぞれ独立してアルキル；Ｒ⁹、Ｒ¹⁰
およびＲ¹¹はそれぞれ独立してフェニル、要すれば、ク
ロロおよび炭素数１〜４のアルキルから選ばれる１また
は２個の置換基を有する置換フェニル；およびＸはクロ
ロ、ブロモまたはヨードである］で示される化合物
［Ｘ］を形成する。

【０００５】化合物［Ｘ］を加水分解（たとえば、水酸
化リチウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムで
処理）して、式［ＸＩ］：

【化２８】 ［式中、Ｍはリチウム、ナトリウムまたはカリウムであ
る］で示される塩［ＸＩ］を形成する。

【０００６】語句の定義 次に述べる定義は他に特別な限定がない限り本明細書を
通じて適用される。「アルキル」および「アルコキシ」
とは、直鎖および分枝鎖基の両方を意味する。炭素数１
〜１０の基が好ましい。「低級アルキル」および「低級
アルコキシ」とは、炭素数１〜４の基を意味する。「シ
クロアルキル」とは、炭素数３，４，５，６または７の
基を意味する。「アリール」とは、フェニルまたは置換
フェニルを意味する。典型的な置換フェニルとは、アミ
ノ（−ＮＨ₂）、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、
ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、トリフルオロメチ
ル、低級アルキル、低級アルコキシ、アルカノイルオキ
シ、カルバモイル、カルボキシルまたはカルボキシ（低
級アルキル）から選ばれる１，２または３個の基で置換
されたフェニルである。「アルカノイル」とは、式：−
Ｃ（Ｏ）アルキル［アルキルの炭素数１〜５］で示され
る基を意味する。「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭
素およびヨウ素を意味する。

【０００７】製造工程 本発明の工程は１ステージまたは２ステージ発酵および
転換工程にて行うことができる。１ステージ工程では、
炭素源および窒素源を含有する適当な培地中で微生物を
成長させる。微生物が十分成長した後、微生物培養菌に
式［Ｉ］の化合物を加え、完全に変換されるまで転換を
継続する。２ステージ工程では、最初のステージにおい
て、所望のオキシドレダクターゼ活性を発現する発酵に
より、微生物を適当な培地中で成長させる。続いて、遠
心分離して細胞を収穫する。適当な緩衝液に収穫した細
胞を懸濁させて、微生物細胞懸濁液を調製する。トリス
−ＨＣｌ、リン酸塩、酢酸ナトリウムなどの緩衝液を使
用することができる。水を用いて微生物細胞懸濁液を調
製して、転換工程を行うこともできる。

【０００８】化合物［Ｉ］を微生物細胞懸濁液と混合
し、微生物細胞懸濁液で、化合物［Ｉ］の転換が触媒さ
れる。ほとんどすべての化合物［Ｉ］が転換されるまで
反応を継続する。微生物は湿潤細胞、凍結乾燥細胞また
は加熱乾燥細胞として遊離状態で使用できる。物理的吸
着または固定手段によって担体上に固定された細胞もま
たこの工程に使用できる。微生物的に誘導されたオキシ
ドレダクターゼは遊離状態または担体に固定されて使用
される。微生物の成長に適した培地とは、微生物細胞の
成長に必要な栄養を提供する培地である。典型的な成長
培地は必要な炭素源、窒素源および微量成分を含有して
いる。インデューサー（誘発物質）も加えてもよい。こ
こで用いる「インデューサー」とは微生物細胞内で所望
のオキシド−レダクターゼ酵素を生産するような、ケト
基を包含するどのような化合物をも意味する。化合物
［Ｉ］は微生物の成長中にインデューサーとして加える
ことができる。

【０００９】炭素源としては、マルトース、ラクトー
ス、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビ
トール、シュクロース、スターチ、マンニトール、プロ
ピレングリコールなどの糖；酢酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムなどの有機酸；グルタミン酸ナトリウムなど
のアミノ酸；エタノール、プロパノールなどのアルコー
ルが挙げられる。窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、ト
ウモロコシ浸し酒、大豆ミール、ビーフ抽出物、酵母抽
出物、糖みつ、パン酵母、トリプトン、nutrisoy、ペプ
トン、酵母アミン、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム
などが挙げられる。微量成分としては、リン酸塩および
マグネシウム塩、マンガン塩、カルシウム塩、コバルト
塩、ニッケル塩、鉄塩、ナトリウム塩およびカリウム塩
が挙げられる。

【００１０】適当な培地が１種以上の炭素源または窒素
源およびそれらの混合物を含有することは本発明の範囲
に含まれる。典型的な好ましい培地は次の通りである。

【００１１】１２１℃で３０分間滅菌する前に、培地の
ｐＨを約６〜８、好ましくは６．５に、滅菌後は約６．
５〜７．５、好ましくは７．０に調節すべきである。微
生物成長中および転換工程中は、培地のｐＨを４．０〜
９．０、好ましくは６．０〜８．０で維持してもよい。
反応混合物の温度は工程に利用できるに充分なエネルギ
ーの存在を確保するような温度に維持すべきである。温
度は転換工程に利用できる熱エネルギーの尺度である。
適当な温度範囲は約１５〜６０℃である。約２５〜４０
℃の温度範囲が好ましい。

【００１２】１ステージまたは２ステージ工程におい
て、微生物の成長中に震盪フラスコ培養器もしくは発酵
タンク内の反応混合物の撹拌および通気は転換工程中に
利用できる酸素の量に影響を与える。震盪は５０〜１０
００ＲＰＭの範囲で行うのが好ましい、５０〜５００Ｒ
ＰＭが最も好ましい。通気は１分間当たり培地の単位体
積当たり約０．１〜５空気体積（すなわち、０．１〜１
０ｖ／ｖｔ）が好ましい。１分間当たり培地の単位体積
当たり約５空気体積（すなわち、５ｖ／ｖｔ）が最も好
ましい。化合物［Ｉ］の完全な変換には、最初に化合物
［Ｉ］を微生物または酵素で処理してから約１２〜４８
時間、好ましくは４〜２４時間が必要である。補因子と
して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）を用いて、転換を行ってもよい。ＮＡＤＨは後記実
施例３で述べるように、その使用後再生産され再利用さ
れる。

【００１３】本発明工程に用いる典型的な微生物には、
バクテリア、酵母および真菌属が含まれる。典型的な微
生物の属として、アクロモバクター（Achromobacte
r）、アシネトバクター(Acinetobacter)、アクチノミセ
ス(Actinomyces)、アルカリゲネス(Alkaligenes)、アー
スロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター(Azotoba
cter)、バシラス(Bacillus)、ブレビバクテリウム(Brev
ibacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、
フラボバクテリウム(Flavobacterium)、メチロモナス(M
ethylomonas)、ミコバクテリウム(Mycobacterium)、ノ
カルジア(Nocardia)、シュードモナス(Pseudomonas)、
ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトミセス(Strept
omyces)、キサントモナス(Xanthomonas)、アスペルギル
ス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、フザリウム(Fus
arium)、ジオトリクム(Geotrichum)、ハンゼヌラ(Hanse
nula)、クロエケラ(Kloekera)、ペニシリウム(Penicill
ium)、ピシア(Pichia)、リゾープス(Rhizopus)、ロドト
ルラ(Rhodotorula)、サッカロミセス(Saccharomyces)、
トリコデルマ(Trichoderma)、モルチエレラ(Mortierell
a)、カニンガメラ(Cunninghamella)、トルロプシス(Tor
ulopsis)およびロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)
が挙げられる。アースロバクター・シンプレックス(Art
hrobacter simples)、ノカルジア・グロベルラ(Nocardi
a globerula)、ノカルジア・レストリクタ(Nocardia re
stricta)、ノカルジア・サルモニコラー(Nocardia salm
onicolor)、ロドコッカス・ファシアンス(Rhodococcus
fascians)、ロドコッカス・ロドコラス(Rhodococcus rh
odochorous)、ミコバクテリウム・バッカ(Mycobacteriu
m vacca)、ノカルジア・メジテラネイ(Nocardia meditt
eranei)、ノカルジア・アウトトロフィカ(Nocardia aur
totorophica)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equ
i)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorph
a)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ジオ
トリクム・カンジダム(Geotrichum candidum)、サッカ
ロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、
モルチエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)、ピシア
・パストリス(Pichia pastoris)、ピシア・メタノリカ
(Pichia methanolica)、カニンガメラ・エチナラテ(Cunn
inghamella echinalate)、トルロプシス・ポリスポリウ
ム(Torulopsis polysporium)およびアシネトバクター・
カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)が好
ましい。ピシア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ハ
ンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、トル
ロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)、モルチ
エレラ・アルピナ(Mortierella alpina)、アシネトバク
ター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoacetic
us）が最も好ましい。

【００１４】化合物［Ｉ］の転換を微生物から単離され
たレダクターゼによって行ってもよい。細胞懸濁液を均
質化し、次いで分解し、遠心分離し、ＤＥＡＥセルロー
スクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、セファ
クリルクロマトグラフィーおよびモノ−Ｑクロマトグラ
フィーに付して、該単離を行うことができる。

【００１５】本発明の各工程において、Ｘ¹がフェニ
ル、Ｘ²がエチルが好ましい。Ｘ³およびＸ⁴がメチルが
好ましい。化合物［ＩＩ］、［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
は下記立体化学構造を有するものが好ましい。

【化２９】

【化３０】

【化３１】

【００１６】次いで、化合物［ＩＶａ］の立体化学構造
は化合物［Ｖ］〜［ＶＩＩＩ］を経て化合物［Ｘ］にな
る。化合物［ＩＸ］は下記の化合物が好ましい。

【化３２】 化合物［Ｘ］は下記の化合物が好ましく、

【化３３】 さらに、下記の化合物が最も好ましい。

【化３４】

【００１７】好ましい立体異性体［ＩＩａ］〜［Ｘａ］
の製造のために、化合物［Ｉ］をピシア・メタノリカ、
ピシア・パストリス、ジオトリクム・カンジダム、ノカ
ルディア・グロベルラ、アシネトバクター・カルコアセ
チカスまたはこれらのいずれかから誘導されたレダクタ
ーゼで処理することが好ましい。アシネトバクター・カ
ルコアセチカスが、最も好ましい種である。好ましい菌
株を実施例１の表１に列挙する。

【００１８】

【実施例】次の実施例において、本発明を実行、利用す
る方法および工程を述べる。これらの実施例は好ましい
具体例であって、限定ではない。これらは請求の範囲に
よって定義される本発明の意図および範囲に含まれる他
の具体例が存在することを理解すべきである。 実施例１全細胞の利用：種々の菌株 この工程の基質（化合物Ａ）は式：

【化３５】 で示される化合物であり、化合物名は３，５−ジオキソ
−６−（ベンジルオキシ）ヘキサン酸エチルエステルで
ある。所望生成物（化合物Ｂ）は式：

【化３６】 で示される化合物であり、化合物名は（Ｒ，Ｓ）−３，
５−ジヒドロキシ−６−（ベンジルオキシ）ヘキサン酸
エチルエステルである。他の生成物は、式：

【化３７】 で示され、化合物名がＲ−３−ヒドロキシ−５−オキソ
−６−（ベンジルオキシ）ヘキサン酸エチルエステルで
ある化合物Ｃ、および式：

【化３８】 で示され、化合物名がＳ−５−ヒドロキシ−３−オキソ
−６−（ベンジルオキシ）ヘキサン酸エチルエステルで
ある化合物Ｄである。

【００１９】微生物は液体窒素中のバイアルで保存す
る。通常の接種成長過程に準じて、ひとつのバイアルを
５００ｍｌフラスコ中で、培地１（１００ｍｌ）に接種
し、２８℃、２８０ＲＰＭで４８時間震盪する。微生物
の成長後、培養菌１０ｍｌを５００ｍｌフラスコ中で培
地１（１００ｍｌ）に接種し、２８℃、２５０ＲＰＭで
震盪する。細胞を収穫し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．８）に懸濁させる。２０％ｗ／ｖ細胞懸濁
液１０ｍｌを調製する。細胞懸濁液に基質（化合物Ａ）
２５ｍｇおよびグルコース７５０ｍｇを追加し、２８
℃、１５０ＲＰＭで４８時間転換を行う。一体積のサン
プルを取り上げ、二体積の６５：３５ヘキサン：ｎ−ブ
タノールで抽出し、有機層を分離して０．２μｍＬＩＤ
／ｘフィルターで濾過収集する。

【００２０】サンプル（６５：３５ヘキサン：ｎ−ブタ
ノール混合物中の）を基質と生成物の濃度について、ヒ
ューレット・パッカード（Hewlett Packrd）１０７０Ｈ
ＰＬＣシステムで分析する。ＨＰ−ハイパージルＯＤＳ
（５μｍ）カラム（２００×４．６ｍｍ）を用いる。移
動相は、水５０％とアセトニトリル５０％の混合物から
なる。流速は周囲温度にて１ｍＬ／分である。検出波長
は２２０ｎｍである。保持時間は化合物Ａと化合物Ｂで
それぞれ６．７４分と３．１７分である。化合物Ｃと化
合物Ｄの分離はＨＰＬＣによって行う。２つのカラム
（ポリスファー（Polyspher）ＲＰ−１８、１５０×
０．４ｍｍとキラルセル（Chiralcel）ＯＤ、２５０×
０．４ｍｍ）を連続して用いる。カラム１は約２５℃、
カラム２は約０℃に維持する。メタノール：ｎ−ブタノ
ール：ヘキサン（１：５：９４）からなる移動相は流速
０．８ｍｌ／ｍｍで用いる。検出波長は２２０ｎｍであ
る。保持時間は化合物Ｃと化合物Ｄでそれぞれ９．４分
と１１．３分である。

【００２１】次いで、キラルセルＯＤカラムを用いて化
合物Ｃと化合物Ｄをそれぞれの不要のエナンチオマーか
ら互いに分離する。メタノール：１−プロパノール：ヘ
キサン（２：１：９７）からなる移動相を０．０１ｍｏ
ｌベータ−シクロデキストリンと共に用いる。流速は
０．５ｍＬ／分であり、検出波長は２２０ｎｍである。
保持時間は化合物Ｃと化合物Ｄでそれぞれ１９．１分と
２３．５分である。生成物Ｂのラセミ体の２つのエナン
チオマーの分離をキラルセルＯＢカラムで行う。移動相
はヘキサン：Ｎ−ブタノール：イソプロパノール（６
３．５：３１．５：５）からなる。流速は１ｍＬ／ｍｍ
であり、検出波長は２３０ｎｍである。所望のエナンチ
オマー（化合物Ｂ）の保持時間は１４．２分であり不要
のエナンチオマーは１９．８分である。

【００２２】培地１で成長した種々の微生物を用い、実
施例１の操作に従って得られる結果を下記表１に示す。
幾つかの微生物が化合物Ａを立体選択的に所望の化合物
Ｂに還元し、幾つかの微生物が化合物Ａを式：

【化３９】 で示される化合物Ｅに変換する。

【００２３】

【表１】微生物 反応収量 化合物Ｂ 化合物Ｅ ピシア・メタノリカ(ATCC 58403) ５６ ８９ − ハンゼヌラ・ポリモルファ(ATCC 26012） ５２ − ９０ ピシア・パストリス(ATCC 28485) ４８ ９２ − カニンガメラ・エチナラテ(ATCC 9244) １５ − ８９ サッカロミセス・セレビシアエ(ATCC 12341) １８ − ７５ ジオトリクム・カンジダム(ATCC 34614) ４０ ７８ − モルチエララ・アルピナ(ATCC 16266) ７８ − ８５ ノカルディア・グロベルラ(ATCC 21505) ４８ ９１ − アシネトバクター・カルコアセチカス ８５ ９７ −(ATCC 33305)

【００２４】実施例２全細胞の利用：時間的考察 この工程の基質（化合物Ａ）と所望生成物（化合物Ｂ）
は実施例１に記載のものである。アシネトバクター・カ
ルコアセチカス（ＡＴＣＣ３３３０５）の細胞を５００
ｍｌフラスコ中で１００ｍｌの培地１で成長させる。成
長は２５℃にて２８０ＲＰＭで４８時間行う。培養菌１
００ｍｌを発酵器内で１５Ｌの培地２に接種する。発酵
器内の成長は２５℃にて１５ＬＰＭで通気、５００ＲＰ
Ｍで３０時間震盪して行う。発酵器から細胞を収穫し、
化合物Ａから化合物Ｂへの生化学的変換に用いる。

【００２５】細胞（３００ｇ）を１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）３リットルに懸濁させ、均質な
細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液に化合物Ａ６ｇとグ
ルコース７５ｇを加え、化合物Ａの化合物Ｂへの生化学
的変換を２８℃、１６０ＲＰＭで２４時間行う。結果を
表２に示す。サンプルを調製し、生成物収率と光学的純
度を実施例１の記載に準じて測定する。

【表２】 反応時間（時間） 化合物Ｂ(g/L) 収率(％) 光学的純度(％) ４ ０.６８ ３８ −− ２０ １.５４ ８７ −− ２３ １.６６ ８６ ９９

【００２６】実施例３細胞抽出物と補因子の利用 この工程の基質（化合物Ａ）と所望生成物（化合物Ｂ）
は実施例１に記載のものである。アシネトバクター・カ
ルコアセチカス（ＡＴＣＣ３３３０５）の細胞を実施例
２に記載の培地１と培地２で成長させる。細胞（１５０
ｇ）を０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
１．５リットルに懸濁させる。均質化した細胞懸濁液を
４℃でマイクロフルイダイザー（Microfluidizer）にて
１３０００ｐｓｉで分解する。分解された細胞懸濁液を
１２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離する。透明な上澄
み液（細胞抽出物）を化合物Ａから化合物Ｂへの生化学
的変換に用いる。

【００２７】細胞抽出物１リットルを基質（化合物
Ａ）、グルコース脱水素酵素（３５００ユニット）、
０．４ｍＭＮＡＤ⁺（ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド）およびグルコース（１０００ｇ）に加える。反
応はｐＨ一定（ｐＨ６．０）、１５０ＲＰＭ震盪、３０
℃で行う。定期的にサンプルを取り出し、実施例１の記
載に準じて、化合物Ｂの反応収率および光学的純度を分
析する。結果を表３に示す。

【表３】 反応時間（時間） 化合物Ｂ(g/L) 収率(％) 光学的純度(％) ２４ ８.２ ８６ ＞９９

【００２８】上記実験において、化合物Ａから化合物Ｂ
への生化学的転換に用いるＮＡＤＨ補因子は、グルコー
スデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ⁺およびグルコースを用い
て下記のとおり再生産される。

【化４０】

【００２９】化合物Ａが化合物Ｂに完全に変換した後、
反応混合物をｐＨ７．０に調節し、等量のジクロロメタ
ンで３回抽出する。有機相を分離し、０．７Ｍ重炭酸ナ
トリウムで２回洗浄する。分離した有機層を無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し、減圧下にジクロロメタンを除去す
る。得られる油状残渣を室温で減圧乾燥して、淡い黄色
の固体を得る（収率８５％、光学的純度９９％）。

【００３０】実施例４細胞抽出物の利用：時間的考察 基質と所望生成物は実施例１に記載したものである。ア
シネトバクター・カルコアセチカス（ＡＴＣＣ３３３０
５）の細胞を実施例２に記載の培地１と培地２で成長さ
せる。実施例３の記載に準じて、細胞抽出物の調製、細
胞抽出物を用いた化合物Ａから化合物Ｂ、ＣおよびＤへ
の生化学的転換を行う。１６時間後に反応を停止する。
結果を表４に示す。生成物濃度を実施例１に記載のＨＰ
ＬＣで分析する。実施例３の記載に準じて、ＮＡＤＨを
再生産する。

【表４】 反応時間（時間） 化合物Ｂ(g/L) 化合物ＣとＤの混合物(g/L) １６ ２.６１ ４.８

【００３１】化合物ＣとＤを下記の操作で単離する。 遠心分離した細胞抽出物（１リットル、化合物ＣとＤ４．８ｇ） ↓ ｐＨ７．０に調節、 ↓ 等量のジクロロメタンで３回抽出、 ↓ 有機層分離（エマルジョン分解まで遠心分離）、 ↓ ７％塩化ナトリウムで２回有機層洗浄、 ↓ 無水硫酸ナトリウムで有機層乾燥、 ↓ 減圧下のジクロロメタン除去。 粘稠油状液（４．８ｇ）。 ↓ 室温で減圧乾燥、 濃茶色液体（化合物ＣとＤ２．１ｇ） ↓ 中和したシリカカラム(３５×２.０ｃｍ)溶離、 ↓ ヘキサン：酢酸エチル（８０：２０，７０：３０， ６０：４０）各１００ｍｌで洗浄、 ↓ 画分＃３４〜３９採取（２ｍｌ画分）、 ↓ 溶媒を減圧除去、 淡い黄色の液体，化合物ＣとＤの混合物０．６ｇ、ＨＰＬＣＨＩ９０％。 次いで、化合物ＣとＤを実施例１の記載に準じてプレパ
ラティブＨＰＬＣで分離する。

【００３２】実施例５精製レダクターゼの利用 この工程の基質（化合物Ａ）と所望生成物（化合物Ｂ）
は実施例１に記載したものである。アシネトバクター・
カルコアセチカス（ＡＴＣＣ３３３０５）の細胞を実施
例２に記載の培地１で成長させる。実施例３の記載に準
じて、アシネトバクター・カルコアセチカス（ＡＴＣＣ
３３３０５）の細胞抽出物を調製する。細胞抽出物（７
００ｍｌ）をＤＥＡＥセルロース（ＤＥ−５２）カラム
に通し、塩化ナトリウム含有緩衝液を用い、０〜０.５
Ｍのこう配で溶離する。レダクターゼ活性含有画分を集
め、硫酸アンモニウム沈殿（７０％飽和）により濃縮す
る。沈殿した物質を遠心分離して集め、緩衝液に溶解
し、セファクリルＳ−２００カラムに通す。クロマトグ
ラフィー後、レダクターゼ活性含有画分を集め、モノ−
Ｑカラムに通す。モノ−Ｑカラムに結合するタンパク質
は塩化ナトリウム含有緩衝液を用い、０〜０．５Ｍのこ
う配で溶離される。レダクターゼ活性含有画分を集め、
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動により
分析する。精製された酵素は均質であり、分子量３５０
００±３０００ダルトンである。精製操作中の比活性を
表５に示す。

【００３３】

【表５】

【００３４】精製酵素（モノ−Ｑ画分）を用い、化合物
Ａから化合物Ｂへの転換を行う。０．１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌ中の反応混合物には、
精製レダクターゼ酵素１０ユニット、グルコースデヒド
ロゲナーセ１００ユニット、グルコース１ｇおよびＮＡ
Ｄ⁺５０ｍｇが含まれる。ｐＨ６．０、１００ＲＰＭ震
とう、２５℃で１６時間の条件で反応を行う。生成物
（化合物Ｂ）と基質（化合物Ａ）の濃度は実施例１に記
載の操作で測定する。１６時間反応後、化合物Ｂは反応
収率８９％、光学的純度は９９％以上で得られる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 クライド・ジー・マクナミー アメリカ合衆国ニュージャージー州ローレ ンスビル、テイラー・コート1112番 (72)発明者 アミット・バナージー アメリカ合衆国ペンシルベニア州ニュータ ウン、エセックス・プレイス25番 (72)発明者 ラズロ・ジェイ・シャルカ アメリカ合衆国ニュージャージー州イース ト・ブランズウィック、ウェリントン・ロ ード５番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (a)式： 【化１】 ［式中、Ｘ¹はアルキル、アリール、シクロアルキル、
   アラルキルまたはシクロアルキルアルキル；およびＸ²
   はアルキルである］で示されるジケトエステルをレダク
   ターゼ供給微生物または該微生物から誘導されるレダク
   ターゼで処理して、式： 【化２】 で示される３−ヒドロキシエナンチオマー化合物または
   式： 【化３】 で示される５−ヒドロキシエナンチオマー化合物もしく
   は式： 【化４】 で示される３，５−ジヒドロキシエナンチオマー化合物
   を形成し、次いで(b)該３−、５−または３，５−ジヒ
   ドロキシエナンチオマーを回収することを特徴とする工
   程。
2. 【請求項２】 該３−ヒドロキシまたは５−ヒドロキシ
   エナンチオマーをレダクターゼ供給微生物または該微生
   物から誘導されるレダクターゼで処理して３，５−ジヒ
   ドロキシエナンチオマーを形成することを特徴とする請
   求項１記載の工程。
3. 【請求項３】 (a)該３，５−ジヒドロキシエナンチオ
   マーを式： 【化５】 で示されるジアルコキシ化合物とカップリングさせて、
   式： 【化６】 で示されるジオキシンエーテルを形成し、 (b)該ジオキシンエーテルに水素添加して、式： 【化７】 で示されるアルコールを形成し、次いで(c)該アルコー
   ルを酸化して、式： 【化８】 ［式中、Ｘ³とＸ⁴はそれぞれ独立して水素、アルキル、
   シクロアルキルまたはアリール、あるいはいっしょにな
   って、それらが結合する炭素原子とともに炭化水素環を
   形成する炭素数４〜６のアルキレンである］で示される
   アルデヒドを形成することを特徴とする請求項１記載の
   工程。
4. 【請求項４】 該アルデヒドを式： 【化９】 ［式中、Ｘ³とＸ⁴はそれぞれ独立して水素、アルキル、
   シクロアルキルまたはアリール、あるいはいっしょにな
   って、それらが結合する炭素原子とともに炭化水素環を
   形成する炭素数４〜６のアルキレン；Ｒ¹とＲ⁴はそれぞ
   れ独立して水素、ハロゲン、トリフルオロメチルまたは
   炭素数１〜４のアルキルまたはアルコキシ；および
   Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵およびＲ⁶はそれぞれ独立して水素、ハロ
   ゲンまたは炭素数１〜４のアルキルまたはアルコキシで
   ある］で示される生成物に変換することを特徴とする請
   求項３記載の工程。
5. 【請求項５】 (a)式： 【化１０】 で示されるジケトエステルをピシア・メタノリカ、ピシ
   ア・パストリス、ジオトリクム・カンジダム、ノカルジ
   ア・グロベルラおよびアシネトバクター・カルコアセチ
   カスから選ばれる微生物またはこれらの微生物から誘導
   されるレダクターゼで処理して、式： 【化１１】 で示される３−ヒドロキシエナンチオマー化合物または
   式： 【化１２】 で示される５−ヒドロキシエナンチオマー化合物もしく
   は式： 【化１３】 で示される３，５−ジヒドロキシエナンチオマー化合物
   を形成し、次いで(b)該３−、５−または３，５−ジヒ
   ドロキシエナンチオマーを回収することを特徴とする工
   程。
6. 【請求項６】 ピシア・メタノリカ、ピシア・パストリ
   ス、ノカルジア・グロベルラおよびアシネトバクター・
   カルコアセチカスから選ばれる微生物またはこれらの微
   生物から誘導されるレダクターゼでジケトエステルを処
   理することにより、式： 【化１４】 で示される化合物を形成する請求項５記載の工程。
7. 【請求項７】 ピシア・メタノリカ、ピシア・パストリ
   ス、ノカルジア・グロベルラおよびアシネトバクター・
   カルコアセチカスから選ばれる微生物またはこれらの微
   生物から誘導されるレダクターゼでジケトエステルを処
   理することにより、式： 【化１５】 で示される生成物を形成する請求項６記載の工程。
8. 【請求項８】 Ｘ¹がフェニルおよびＸ²がエチルである
   請求項１記載の工程。
9. 【請求項９】 Ｘ¹がフェニルおよびＸ²がエチルである
   請求項２記載の工程。
10. 【請求項１０】 Ｘ¹がフェニルおよびＸ²がエチルであ
    る請求項３記載の工程。
11. 【請求項１１】 Ｘ¹がフェニルおよびＸ²がエチルであ
    る請求項４記載の工程。
12. 【請求項１２】 Ｘ¹がフェニルおよびＸ²がエチルであ
    る請求項６記載の工程。
13. 【請求項１３】 Ｘ³とＸ⁴がメチルである請求項３記載
    の工程。
14. 【請求項１４】 Ｘ³とＸ⁴がメチルである請求項６記載
    の工程。
15. 【請求項１５】 Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³のいずれか１つが
    パラ−フルオロであり、他の２つが水素；およびＲ⁴、
    Ｒ⁵およびＲ⁶のいずれか１つがパラ−フルオロであり、
    他の２つが水素である請求項４記載の工程。
16. 【請求項１６】 Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³のいずれか１つが
    パラ−フルオロであり、他の２つが水素；およびＲ⁴、
    Ｒ⁵およびＲ⁶のいずれか１つがパラ−フルオロであり、
    他の２つが水素である請求項７記載の工程。
17. 【請求項１７】 Ｘ¹がフェニルであり、Ｘ²がエチル；
    Ｘ³とＸ⁴がメチル；Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³のいずれか１つ
    がパラ−フルオロであり、他の２つが水素；および
    Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶のいずれか１つがパラ−フルオロで
    あり、他の２つが水素である請求項４記載の工程。
18. 【請求項１８】 Ｘ¹がフェニルであり、Ｘ²がエチル；
    Ｘ³とＸ⁴がメチル；Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³のいずれか１つ
    がパラ−フルオロであり、他の２つが水素；および
    Ｒ⁴、Ｒ⁵およびＲ⁶のいずれか１つがパラ−フルオロで
    あり、他の２つが水素である請求項７記載の工程。
19. 【請求項１９】 アクロモバクター、アシネトバクタ
    ー、アクチノミセス、アルカリゲネス、アースロバクタ
    ー、アゾトバクター、バシラス、ブレビバクテリウム、
    コリネバクテリウム、フラボバクテリウム、メチロモナ
    ス、ミコバクテリウム、ノカルジア、シュードモナス、
    ロドコッカス、ストレプトミセス、キサントモナス、ア
    スペルギルス、カンジダ、フザリウム、ジオトリクム、
    ハンゼヌラ、クロエケラ、ペニシリウム、ピシア、リゾ
    ープス、ロドトルラ、サッカロミセス、トリコデルマ、
    モルチエレラ、カニンガメラ、トルロプシスおよびロド
    シュードモナスから選ばれる微生物またはこれらの微生
    物から誘導されるレダクターゼでジケトエステルを処理
    することを特徴とする請求項１記載の工程。
20. 【請求項２０】 アースロバクター・シンプレックス、
    ノカルジア・グロベルラ、ノカルジア・レストリクタ、
    ノカルジア・サルモニコラー、ロドコッカス・ファシア
    ンス、ロドコッカス・ロドコラス、ミコバクテリウム・
    バッカ、ノカルジア・メジテラネイ、ノカルジア・アウ
    トトロフィカ、ロドコッカス・エクイ、ハンゼヌラ・ポ
    リモルファ、カンジダ・アルビカンス、ジオトリクム・
    カンジダム、サッカロミセス・セレビシアエ、モルチエ
    レラ・アルピネ、ピシア・パストリス、ピシア・メタノ
    リカ、トルロプシス・ポリスポリウムおよびアシネトバ
    クターカルコアセチカス、最も好ましくはピシア・メタ
    ノリカ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トルロプシス・グ
    ラブラタ、モルチエレラ・アルピネ、アシネトバクター
    ・カルコアセチカスから選ばれる微生物またはこれらの
    微生物から誘導されるレダクターゼでジケトエステルを
    処理することを特徴とする請求項１記載の工程。