Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Hydroxycarbonsäureestern, die sich als Ausgangs- bzw. Zwischenprodukte für die Herstellung von stereospezifischen Verbindungen mit biologischer Aktivität, insbesondere pharmakologische Stoffe, eignen.
Die Herstellung von Ethyl(S)-3-hydroxybutanoat und (S)-2-Hydroxymethylbutanoat durch stereospezifische mikrobiologische Reduktion entsprechender Ausgangs- beta -Ketoverbindungen mit Hilfe von Hefen unter Wachstumsbedingungen ist von Ehrler, J. et al. in Chimia 40 (1986), Seiten 172-173, beschrieben. Bei diesem Verfahren wird nach Art von Schüttelkulturen, d.h. chargenweise, gearbeitet.
Die zur vorliegenden Erfindung führenden Versuche zeigten, dass eine Übertragung der beschriebenen diskontinuierlichen Methode auf kontinuierlichen Betrieb nicht oder allenfalls nur mit sehr unbefriedigenden Ergebnissen in bezug auf Produktreinheit und Ausbeute bzw. Produktivität zum Erfolg führt.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass es für eine kontinuierliche Produktion mit befriedigenden Ergebnissen wesentlich ist, ganz bestimmte Parameter einzuhalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren hat die in Patentanspruch 1 angegebenen Merkmale.
Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens haben die in den Ansprüchen 2-9 genannten Merkmale.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens hat die in Anspruch 10 angegebenen Merkmale.
Die Erfindung wird nachstehend insbesondere mit Bezug auf die Herstellung eines bevorzugten Produktes, nämlich 3-(S)-Hydroxybuttersäureestern, insbesondere dem Methyl- und Ethylester, aus den entsprechenden beta -Ketoverbindungen, d.h. Acetessigsäureethyl- oder Acetessigsäuremethylester, beschrieben.
Allgemein können jedoch auch entsprechend substituierte Derivate der im Patentanspruch 1 angegebenen Formel (1) aus Verbindungen der Formel (2) hergestellt werden, sofern die jeweiligen Substituenten R<1>, R<2>, R<3> und R<4> mikrobiell inert sind, d.h. für die verwendeten Hefen nicht toxisch sind und die metabolitische Umwandlung der jeweiligen beta -Ketocarbonsäureverbindung in die an der Ketogruppe und nur an dieser reduzierte beta -Hydroxycarbonsäureesterverbindung nicht wesentlich behindern.
Im allgemeinen soll die Ausgangsverbindung (2) im verwendeten Kulturmedium bei Arbeitstemperaturen im Bereich von 20-38 DEG C, vorzugsweise bei 30 DEG C, in einer Menge von mindestens 1 g/Liter, vorzugsweise mindestens 5 g/Liter, löslich sein. Dies ist jedoch nicht kritisch, da auch suspendierte bzw. emulgierte Ausgangsverbindungen von den Hefen umgesetzt werden können, insbesondere bei den in den bevorzugten Bioreaktoren vorherrschenden Turbulenzbedingungen.
Typische Beispiele für mikrobielle inerte Substituenten sind Kohlenwasserstoffreste, wie C1-18-Alkylreste, insbesondere C1-6-Alkylreste, wobei C1-3-Alkylreste für R<1> und R<2 >bevorzugt werden.
R<3> und R<4> sind vorzugsweise Wasserstoffatome; ebenfalls bevorzugt wird, dass mindestens eine der Gruppen R<3>, R<4> Wasserstoff ist und die andere eine C1-3-Gruppe, insbesondere die Methylgruppe, ist.
Allfällige Halogenatome als Substituenten in den Gruppen R<1> und R<2> treten vorzugsweise nur in endständigen C-Atomen auf. Beispiele sind endständige Gruppen der Formeln -CCl3 und -CH2Br, wobei solche Gruppen vorzugsweise nur in R<1> auftreten.
Geeignete Ausgangsverbindungen der Formel (2) sind als solche bekannt oder können nach üblichen Methoden aus bekannten Verbindungen hergestellt werden.
Beispiele für bevorzugte Hefen sind Saccharomyces cerevisiae, z. B. der Stamm ETH 1022, und Candida utilis, z.B. der Stamm CBS 621.
Allgemein ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren die Reduktion von beta -Ketosäurederivaten der Formel (2) unter Bildung der entsprechenden 3-(S)-Hydroxycarbonsäurederivate mit hoher optischer Reinheit, hoher chemischer Ausbeute und hoher Produktivität.
Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens können kommerziell erhältliche Bioreaktoren (Chemostaten) für mehrstufigen, vorzugsweise einstufigen kontinuierlichen Betrieb verwendet und in an sich üblicher Weise zur Züchtung der ver wendeten Mikroorganismen (Hefen) in einer kontinuierlichen Kultur unter praktisch sterilen Wachstumsbedingungen eingesetzt werden. Vorzugsweise werden dabei synthetische Medien zur Kohlenstofflimitierung des Wachstums der Hefen verwendet; Ethanol ist hierfür eine bevorzugte Kohlenstoffquelle. Dabei werden die Wachstumsbedingungen (vorzugsweise ausweislich der spezifischen Wachstumsrate) allgemein unter definierten und kontrollierten Parametern der aerob gezüchteten Hefekultur (Temperatur, Begasung und Sauerstoffpartialdruck) kontrolliert; zweckmässigerweise wird ohne Sauerstofflimitierung gearbeitet.
Erfindungswesentlich ist dabei das Einhalten eines praktisch konstanten pH-Wertes im sauren Bereich, meist von 1 bis 5 und vorzugsweise von 2 bis 3, weil überraschenderweise nur dann die gewünschten hohen Produktivitätswerte eingehalten werden können. Insbesondere wurde gefunden, dass die bevorzugten Zielverbindungen in diesen pH-Bereichen sowohl mit Produktionsausbeuten (%) als auch optischen Reinheitswerten (%) von jeweils 85 bis 99% erzielt werden können, wobei im pH-Bereich von 2 bis 3 sogar Ausbeuten von 98 bis 99% erzielbar sind.
Die angegebenen pH-Werte sind auf die Arbeitstemperatur bezogen und können mit üblichen, z.B. potentiometrischen Methoden im Bioreaktor gemessen werden. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt vorzugsweise durch Zusatz von saurem oder basischem Material zur Kultur.
Die Ausgangsverbindung (2) wird kontinuierlich in den Reaktor eingeführt, am einfachsten zusammen mit dem Medium; gleichzeitig wird aus dem Reaktor ein Produktstrom aus Biomasse zusammen mit der gebildeten Zielverbindung (1) und mit dem als flüssiger Träger dienenden Medium aus dem Reaktor ausge tragen. Die Abführung der Biomasse wird so gesteuert, dass sie mit gleicher Menge/Zeiteinheit ausgetragen wird, wie sie im Reaktor entsteht. Hierbei kann es zweckmässig sein, einen Teil der aus dem Reaktor abgeführten Biomasse abzutrennen und wieder in den Reaktor zurückzuführen.
Hierzu können an sich in der Biotechnologie bekannte Reaktoren mit Zellrückführungssystemen verwendet werden.
Ein bevorzugtes Kulturmedium ist eine Modifikation des an sich bekannten Mediums D, dessen üblicher Glucoseanteil durch eine äquivalente Menge an Ethanol ersetzt ist, und zwar in dem Masse, dass die theoretische Ausbeute an Biomasse derjenigen eines Glucosemediums entspricht.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird nachfolgend anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert.
Beispiel
Es wurden Medien folgender Zusammensetzung verwendet:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Title: (A) Kulturmedium
<tb>Title: Komponente
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: Menge
<tb>SubHead Col 02 AL=L>(g/l):
<tb>SubHead Col 03 AL=L>(mg/l):
<tb> <SEP>(A<1>: Glucose <SEP>30)
<tb> <SEP>(A<2>: Ethanol <SEP>21)
<tb> <SEP>(NH4)2SO4 <SEP>6
<tb> <SEP>(NH4)2HPO4 <SEP>1,92
<tb> <SEP>KCl <SEP>0,87
<tb> <SEP>MgSO4 . 7H2O <SEP>0,45
<tb> <SEP>CaCl2 . 2H2O <SEP>0,28
<tb> <SEP>Polypropylenglycol (antischaum) <SEP>0,1-0,0
<tb> <SEP>CuSO4 . 5H2O <SEP>2,34
<tb> <SEP>FeCl3 . 6H2O <SEP>14,6
<tb> <SEP>ZnSO4 . 7H2O <SEP>9,0
<tb> <SEP>MnSO4 .
H2O <SEP>10,5
<tb> <SEP>Ca-Pantothenat <SEP>30
<tb> <SEP>Mesoinosit <SEP>60
<tb> <SEP>Thiaminchlorid (B1) <SEP>6
<tb> <SEP>Pyridoxalhydrochlorid (B6) <SEP>1,65
<tb> <SEP>Biotin <SEP>0,03
<tb> <SEP>entmineralisiertes Wasser <SEP>(als Rest)
Sterilisation: durch Sterilfiltration
pH-Werteinstellung: mit H2SO4 oder H3PO4
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: (B) Erhaltungsmedium (Maintenance-M)
<tb>Head Col 01 AL=L: Komponente
<tb>Head Col 02 AL=L: Menge (g/l)
<tb> <SEP>Glucose <SEP>20
<tb> <SEP>Hefeextrakt <SEP>10
<tb> <SEP>Pepton <SEP>20
<tb> <SEP>Agar <SEP>12
<tb> <SEP>entmineralisiertes Wasser <SEP>(als Rest)
Sterilisieren: durch Hitze
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: (C) Vorkulturmedium
<tb>Head Col 01 AL=L: Komponente
<tb>Head Col 02 AL=L:
Menge (g/l)
<tb> <SEP>Glucose <SEP>20
<tb> <SEP>Hefeextrakt <SEP>10
<tb> <SEP>Pepton <SEP>20
<tb> <SEP>entmineralisiertes Wasser <SEP>(als Rest)
Sterilisieren: durch Hitze
<tb></TABLE>
Saccharomyces cerevisiae (Stamm H 1022; ATCC 32 167) wird in einer zum Animpfen ausreichenden Menge unter sterilen Bedingungen aus Medium (B) in das Vorkulturmedium (C) überführt (Inokulum 12 h bei 30 DEG C). Mit dem so erhaltenen Material wird der zuvor während 20 min bei 121 DEG C sterilisierte Bioreaktor unter sterilen Bedingungen angeimpft.
Zum Anlaufen wird das Medium A<1> (pH = 5) verwendet und der Bioreaktor mit unlimitierender Sauerstoffzufuhr als Batchkultur betrieben bis die Zellzahl nicht mehr zunimmt und die Batchkultur die stationäre Phase erreicht hat.
Dann wird fortlaufend steril filtriertes Medium A<2> (pH SIMILAR 2) aus einem Vorratstank in den Reaktor eingespeist.
Als Ausgangsverbindung (2) wird Acetessigsäure in Form des Methyl- bzw. Ethylesters (chemisch rein) verwendet und in einer Menge von 1-20 g/l dem Medium A<2> im Vorratsbehälter zugeführt.
Der Bioreaktor (4 Liter; Typ COLOR) wurde unter folgenden Kulturparametern betrieben:
Verdünnungsrate: </= 0,1 (h<-><1>)
pH: 2.2/2.6/3.0/4.0/5.0 (-)
Zufuhr an Verbindung (2): 50 mMol/l
Begasung: 1 (Vol pro Vol pro min)
Der Produktstrom wurde in an sich bekannter Weise unter Abtrennung von Biomasse und Zielprodukt (1), d.h. 3-(S)-Hydroxybuttersäuremethyl- bzw. ethylester aufgearbeitet.
Die Reinheit des Zielproduktes wurde mit einem Kapillar-Gaschromatographen geprüft. Es wurde eine GC-Reinheit von > 99,9% gemessen. Die chemische Ausbeute betrug bis zu 99%.
The invention relates to a process for the preparation of optically active hydroxycarboxylic acid esters which are suitable as starting or intermediate products for the production of stereospecific compounds with biological activity, in particular pharmacological substances.
The production of ethyl (S) -3-hydroxybutanoate and (S) -2-hydroxymethylbutanoate by stereospecific microbiological reduction of corresponding starting beta-keto compounds with the aid of yeasts under growth conditions is described by Ehrler, J. et al. in Chimia 40 (1986), pages 172-173. This method uses shake cultures, i.e. worked in batches.
The experiments leading to the present invention showed that a transfer of the discontinuous method described to continuous operation does not lead to success, or at most only with very unsatisfactory results in terms of product purity and yield or productivity.
Surprisingly, it was found that it is essential for continuous production with satisfactory results to adhere to certain parameters.
The inventive method has the features specified in claim 1.
Preferred embodiments of the method have the features mentioned in claims 2-9.
A device for carrying out the method according to the invention has the features specified in claim 10.
The invention is described below in particular with reference to the production of a preferred product, namely 3- (S) -hydroxybutyric acid esters, in particular the methyl and ethyl esters, from the corresponding beta-keto compounds, i.e. Methyl acetoacetate or methyl acetoacetate.
In general, however, correspondingly substituted derivatives of the formula (1) given in claim 1 can also be prepared from compounds of the formula (2), provided the respective substituents R <1>, R <2>, R <3> and R <4> are microbial are inert, ie are not toxic to the yeasts used and do not significantly hinder the metabolic conversion of the respective beta-ketocarboxylic acid compound into that at the keto group and only at this reduced beta-hydroxycarboxylic acid ester compound.
In general, the starting compound (2) should be soluble in the culture medium used at working temperatures in the range from 20-38 ° C., preferably at 30 ° C., in an amount of at least 1 g / liter, preferably at least 5 g / liter. However, this is not critical, since suspended or emulsified starting compounds can also be reacted by the yeasts, in particular under the turbulence conditions prevailing in the preferred bioreactors.
Typical examples of microbial inert substituents are hydrocarbon radicals, such as C1-18-alkyl radicals, in particular C1-6-alkyl radicals, C1-3-alkyl radicals being preferred for R <1> and R <2>.
R 3 and R 4 are preferably hydrogen atoms; it is also preferred that at least one of the groups R 3, R 4 is hydrogen and the other is a C1-3 group, in particular the methyl group.
Any halogen atoms as substituents in the groups R <1> and R <2> preferably only occur in terminal C atoms. Examples are terminal groups of the formulas -CCl3 and -CH2Br, such groups preferably occurring only in R <1>.
Suitable starting compounds of the formula (2) are known as such or can be prepared from known compounds by customary methods.
Examples of preferred yeasts are Saccharomyces cerevisiae, e.g. B. the strain ETH 1022, and Candida utilis, e.g. the strain CBS 621.
In general, the process according to the invention enables the reduction of beta-keto acid derivatives of the formula (2) to form the corresponding 3- (S) -hydroxycarboxylic acid derivatives with high optical purity, high chemical yield and high productivity.
For carrying out the process according to the invention, commercially available bioreactors (chemostats) can be used for multi-stage, preferably single-stage, continuous operation and can be used in a conventional manner for the cultivation of the microorganisms (yeasts) used in a continuous culture under practically sterile growth conditions. Synthetic media are preferably used to limit the growth of the yeasts; Ethanol is a preferred carbon source for this. The growth conditions (preferably based on the specific growth rate) are generally controlled under defined and controlled parameters of the aerobically grown yeast culture (temperature, fumigation and oxygen partial pressure); it is expedient to work without oxygen limitation.
It is essential to the invention to maintain a practically constant pH in the acidic range, usually from 1 to 5 and preferably from 2 to 3, because surprisingly only then can the desired high productivity values be maintained. In particular, it was found that the preferred target compounds in these pH ranges can be achieved both with production yields (%) and optical purity values (%) of 85 to 99% in each case, yields of 98 to in the pH range from 2 to 3 99% can be achieved.
The pH values given are based on the working temperature and can be measured using conventional, e.g. potentiometric methods can be measured in the bioreactor. The pH is preferably controlled by adding acidic or basic material to the culture.
The starting compound (2) is fed continuously into the reactor, easiest together with the medium; at the same time, a product stream of biomass is carried out of the reactor together with the target compound (1) formed and with the medium serving as the liquid carrier. The removal of the biomass is controlled in such a way that it is discharged with the same amount / time unit as it is generated in the reactor. In this case, it may be expedient to separate part of the biomass removed from the reactor and to return it to the reactor.
Reactors with cell feedback systems known per se in biotechnology can be used for this.
A preferred culture medium is a modification of the medium D known per se, the usual glucose content of which is replaced by an equivalent amount of ethanol, to the extent that the theoretical yield of biomass corresponds to that of a glucose medium.
The method according to the invention is explained below using a preferred exemplary embodiment.
example
Media of the following composition were used:
<tb> <TABLE> Columns = 3
<tb> Title: (A) culture medium
<tb> Title: component
<tb> Head Col 02 to 03 AL = L: quantity
<tb> SubHead Col 02 AL = L> (g / l):
<tb> SubHead Col 03 AL = L> (mg / l):
<tb> <SEP> (A <1>: glucose <SEP> 30)
<tb> <SEP> (A <2>: ethanol <SEP> 21)
<tb> <SEP> (NH4) 2SO4 <SEP> 6
<tb> <SEP> (NH4) 2HPO4 <SEP> 1.92
<tb> <SEP> KCl <SEP> 0.87
<tb> <SEP> MgSO4. 7H2O <SEP> 0.45
<tb> <SEP> CaCl2. 2H2O <SEP> 0.28
<tb> <SEP> polypropylene glycol (anti-foam) <SEP> 0.1-0.0
<tb> <SEP> CuSO4. 5H2O <SEP> 2.34
<tb> <SEP> FeCl3. 6H2O <SEP> 14.6
<tb> <SEP> ZnSO4. 7H2O <SEP> 9.0
<tb> <SEP> MnSO4.
H2O <SEP> 10.5
<tb> <SEP> Ca pantothenate <SEP> 30
<tb> <SEP> Mesoinosit <SEP> 60
<tb> <SEP> thiamine chloride (B1) <SEP> 6
<tb> <SEP> pyridoxal hydrochloride (B6) <SEP> 1.65
<tb> <SEP> Biotin <SEP> 0.03
<tb> <SEP> demineralized water <SEP> (the rest)
Sterilization: through sterile filtration
pH adjustment: with H2SO4 or H3PO4
<tb> </TABLE>
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Title: (B) Maintenance medium (Maintenance-M)
<tb> Head Col 01 AL = L: component
<tb> Head Col 02 AL = L: quantity (g / l)
<tb> <SEP> Glucose <SEP> 20
<tb> <SEP> yeast extract <SEP> 10
<tb> <SEP> Peptone <SEP> 20
<tb> <SEP> Agar <SEP> 12
<tb> <SEP> demineralized water <SEP> (the rest)
Sterilize: by heat
<tb> </TABLE>
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Title: (C) preculture medium
<tb> Head Col 01 AL = L: component
<tb> Head Col 02 AL = L:
Quantity (g / l)
<tb> <SEP> Glucose <SEP> 20
<tb> <SEP> yeast extract <SEP> 10
<tb> <SEP> Peptone <SEP> 20
<tb> <SEP> demineralized water <SEP> (the rest)
Sterilize: by heat
<tb> </TABLE>
Saccharomyces cerevisiae (strain H 1022; ATCC 32 167) is transferred from the medium (B) to the preculture medium (C) in an amount sufficient for inoculation under sterile conditions (inoculum 12 h at 30 ° C.). The bioreactor previously sterilized at 121 ° C. for 20 min is inoculated with the material thus obtained under sterile conditions.
The medium A <1> (pH = 5) is used for start-up and the bioreactor is operated as a batch culture with unlimited oxygen supply until the cell number no longer increases and the batch culture has reached the stationary phase.
Then, sterile-filtered medium A <2> (pH SIMILAR 2) is fed continuously into the reactor from a storage tank.
Acetoacetic acid in the form of the methyl or ethyl ester (chemically pure) is used as the starting compound (2) and fed to the medium A 2 in an amount of 1-20 g / l in the storage container.
The bioreactor (4 liters; type COLOR) was operated under the following culture parameters:
Dilution rate: </ = 0.1 (h <-> <1>)
pH: 2.2 / 2.6 / 3.0 / 4.0 / 5.0 (-)
Supply of compound (2): 50 mmol / l
Fumigation: 1 (vol per vol per min)
The product stream was separated in a manner known per se with the separation of biomass and target product (1), i.e. 3- (S) -Hydroxybuttersäuremethyl- or ethyl ester worked up.
The purity of the target product was checked with a capillary gas chromatograph. A GC purity of> 99.9% was measured. The chemical yield was up to 99%.