PT569998E

PT569998E - Reducao estereosselectiva microbiana ou enzimatica de esteres de grupo 3,5-dioxo para se obter esteres de grupos 3-hidroxi-5-oxo-5-hidroxi e 3,5-di-hidroxi

Info

Publication number: PT569998E
Application number: PT93107876T
Authority: PT
Inventors: Ramesh N Patel; Laszlo J Szarka; Clyde G Mcnamee; Amit Banerjee
Original assignee: Squibb & Sons Inc
Priority date: 1992-05-15
Filing date: 1993-05-14
Publication date: 2001-03-30
Also published as: DE69329719D1; ES2152234T3; EP0569998A2; DE69329719T2; CA2094191A1; DK0569998T3; EP0569998A3; EP0569998B1; ATE197963T1; US5324662A; JPH0630783A; CA2094191C; GR3035316T3; JP3476860B2

Description

1Sé>°) 32¾

Descrição “Redução estereosselectiva, microbiana ou enzimática, de ésteres de grupo 3,5-dioxo para se obter ésteres de grupos 3-hidroxi-5-oxo, 3-oxo-5-hidroxi e 3,5-di-hidroxi” A presente invenção diz respeito à preparação de intermediários quirais necessários para a síntese química de agentes redutores do colesterol. O documento CH-A-675 882 descreve a redução microbiana de ésteres do ácido β-ceto-carboxílico para a formação de ésteres de ácidos hidroxi-carboxílicos opticamente activos, mediante a utilização de leveduras, v.g. Saccharomyces cerevisiae. O documento GB-A-2 132 614 descreve um processo para a redução de ésteres y~ -substituído-acetoacéticos para a formação de ésteres do ácido hidroxi-carboxílico por meio de uma operação enzimática fermentativa na qual podem ser utilizados fungos ou leveduras.

De acordo com a presente invenção efectua-se o tratamento de um diceto-éster de fórmula estrutural I

O O O

com um microrganismo fornecedor de redutases ou com uma reductase resultante de um tal microrganismo para formar um enantiómero de um composto de grupo 3,5-di-hidroxi que satisfaz à fórmula estrutural IV

OH OH O

2 τ em que o símbolo X1 representa um grupo fenilo e o símbolo X2 representa um grupo etilo.

Ainda de acordo com a presente invenção, faz-se reagir o enantiómero do composto de fórmula estrutural IV com um composto de grupo dialcoxi que satisfaz à fórmula estrutural V

por tratamento com um ácido orgânico (v.g. ácido p-tolueno-sulfónico) para formar uma dioxina de fórmula estrutural VI

em que cada um dos substituintes X3 e X4 representa independentemente um átomo de

hidrogénio ou um grupo alquilo, cicloalquilo ou arilo ou então, considerados em conjunto, formam um grupo alquileno com 4 a 6 átomos de carbono, formando um anel hidrocarbonado conjuntamente com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados. O composto de fórmula estrutural VI é hidrogenado (v.g. com H2 na presença de paládio sobre carvão) para formar um álcool de fórmula estrutural VII

Efectua-se a oxidação do álcool de fórmula estrutural VII (v.g. oxidação de Swem com dimetilsulfóxido, cloreto de oxalilo e trietilamina em cloreto de metileno) para se obter um

aldeído de fórmula estrutural VIII 3 1 *S<rx4 o <rN) ο ΟΧ2 ,ΛΛΛΛ Ο aldeído de fórmula estrutural VIU pode ser utilizado para a preparação de agentes redutores do colesterol, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 897 490, depositada a 30 de Janeiro de 1990, e nas patentes de invenção aí referidas.

É possível acoplar o aldeído de fórmula estrutural VDI a um fosfoéster ou a um sal de fórmula estrutural IX

num solvente orgânico inerte (v.g. tetra-hidrofurano ou dimetilformamida) na presença de uma base forte (v.g. n-butil-lítio) a uma temperatura compreendida entre cerca de -50°C e -78°C para se obter um composto de fórmula estrutural X

em que: 4 cada um dos símbolos R1 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou haíogénio ou um grupo trifTuorometilo ou grupos alquilo ou alcoxi que possuam entre 1 e 4 átomos de carbono; cada um dos símbolos R2, R3, R5 e R6 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou de haíogénio ou um grupo alquilo ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono; o símbolo Z representa um grupo de uma das fórmulas estruturais f

•ΡΌRn-OU »P emento X

cada um dos símbolos R7 eR8 representa independentemente um grupo alquilo; cada um dos símbolos R9, R10 e Rn representa independentemente um grupo fenilo facultativamente substituído cóm um ou dois substituintes seleccionados entre átomos de cloro e grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; e o símbolo X representa um átomo de cloro, bromo ou iodo.

O composto de fórmula estrutural X pode ser hidrolisado (v.g. com hidróxido de lítio, hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio) para formar um sal de fórmula estrutural XI

R2

Ns=N em que o símbolo M representa lítio, sódio ou potássio.

Definição de termos 5

As definições a seguir apresentadas são aplicáveis ao longo da presente memória descritiva, salvo quando indicado de outro modo em casos concretos.

Os termos “alquilo” e “alcoxi” designam grupos de cadeia linear ou ramificada São preferíveis os grupos que possuam entre 1 e 10 átomos de carbono. As expressões “alquilo inferior” e “alcoxi inferior” designam grupos com 1 a 4 átomos de carbono. O termo “cicloalquilo” refere-se a grupos que possuem 3,4,5,6 ou 7 átomos de carbono. O termo “arilo” designa grupos fenilo e fenilo substituído. Como exemplos de grupos fenilo substituídos refere-se os que possuem 1,2 ou 3 substituintes seleccionados entre átomos de halogénio e grupos amino (-NH2), alquilamino, dialquilamino, nitro, hidroxilo, trifluorometilo, alquilo inferior, alcoxi inferior, alcanoiloxi, carbamoílo, carboxilo ou carboxi-(alquiIo inferior). O termo “alcanoíío” designa grupos de fórmula geral -C(0)-aíquiIo que possuam entre 1 e 5 átomos de carbono. O termo “halogénio” refere-se a átomos de flúor, cloro, bromo e iodo.

Processo de preparação O processo da presente invenção pode ser executado por um procedimento de fermentação e transformação numa só fase ou em duas fases.

No processo em fase única, deixa-se crescer os microrganismos num meio adequado contendo fontes de carbono e de azoto. Depois de os microrganismos terem crescido o suficiente, adiciona-se um composto de fórmula estrutural I às culturas microbianas, podendo a transformação prosseguir até se atingir a conversão completa.

No processo em duas fases, faz-se crescer os microrganismos num meio adequado por fermentação, revelando a actividade oxido-redutase pretendida na primeira fase. Depois efectua-se 6 a colheita das células por centrifugação. A preparação de suspensões celulares microbianas realiza-se colocando as células colhidas em suspensão numa solução tampão adequada. É possível utilizar tampões, tais como tris-HCl, fosfatos, acetato de sódio e semelhantes. Também é possível utilizar água para preparar suspensões de células microbianas para a execução do processo de transformação. O composto de fórmula estrutural I é misturado com as suspensões celulares microbianas, sendo a transformação do composto de fórmula estrutural I catalisada pelas suspensões celulares microbianas. A reacção pode prosseguir até praticamente todo o composto de fórmula estrutural I ter sido transformado.

Os microrganismos podem ser utilizados em estado livre enquanto células húmidas, células liofilizadas ou células secas ao calor. Neste processo também é possível utilizar células imobilizadas sobre suportes, por adsorção física ou retinência. As oxidorredutases obtidas por via microbiana podem ser utilizadas em estado livre ou imobilizadas sobre um suporte.

Os meios adequados para o crescimento de microrganismos são aqueles que fornecem os nutrientes necessários para o crescimento das células microbianas. Um meio típico de crescimento inclui necessariamente fontes de carbono, fontes de azoto e elementos raros (oligoelementos). Também é possível adicionar indutores. O termo “indutor”, conforme aqui utilizado, designa quaisquer compostos que contenham grupos ceto, por forma a que a enzima oxidorredutase desejada seja produzida dentro da célula microbiana Os compostos de fórmula estrutura] I podem ser acrescentados como indutores durante o crescimento do microrganismo.

Como fontes de carbono refere-se as seleccionadas entre açúcares, tais como maltose, lactose, glicose, ffutose, glicerol, sorbitol, sacarose, amido, manitol, propileno-glicol e não só; ácidos orgânicos, tais como acetato de sódio, citrato de sódio e semelhantes; aminoácidos, tais como glutamato de sódio e quejandos; álcoois, tais como etanol, propanol e outros que tais. y

Como fontes de azoto refere-se as seleccionadas entre N-Z amina A, licor de infusão de milho, farinha de soja, extractos de came, extractos de levedura, melaços, fermento de padeiro, triptona, ‘nutrisoy’, peptona, aminas de leveduras, nitrato de sódio, sulfato de amónio e semelhantes.

Como elementos raros refere-se os seleccionados entre fosfatos e sais de magnésio, manganês, cálcio, cobalto, níquel, ferro, sódio e potássio.

Os meios adequados podem conter mais do que uma fonte de carbono ou azoto e podem mesmo incluir uma mistura de várias fontes.

Os meios típicos preferidos são os seguintes:

Meiol

Extracto de malte 1% Extracto de levedura 1% Peptona 1% Glicose 2% pH7,0. Meio 2 Peptona 0,3% Glicerol 4% Extracto de malte 1% Extracto de levedura 1% pH 7,0. Meio 3 Peptona 0,3% 8

Frutose 2% Extracto de malte 1% Extracto de levedura 1% pH 7,0. Meio 4 Succinato de sódio 2% Extracto de malte 1% Extracto de levedura 1% Peptona 0,3% PH 7,0. Ο ρΗ do meio deve ser ajustado para um valor compreendido entre cerca de 6 e 8, de preferência para 6,5, antes da esterilização a 121°C durante 30 minutos, e para um valor compreendido entre cerca de 6,5 e 7,5, de preferência para 7,0, após a esterilização. O pH do meio pode ser mantido entre 4,0 e 9,0 e de preferência entre 6,0 e 8,0 durante o crescimento dos microrganismos e durante o processo de transformação. A temperatura da mistura de reacção deve ser mantida para assegurar que irá haver energia suficiente para a execução do processo. A temperatura é uma medida da energia térmica disponível para o processo de transformação. Um intervalo adequado de temperaturas vai desde cerca de 15°C até 60°C. O intervalo preferido de temperaturas vai desde cerca de 25°C até40°C. A agitação e o arejamento da mistura de reacção afectam a quantidade de oxigénio disponível durante o processo de transformação nas culturas efectuadas em balões agitados ou 9 em tanques de fermentação durante o crescimento dos microrganismos, respectivamente num processo de uma só fase ou de duas fases. E preferível que o intervalo de agitação esteja compreendido entre 50 r.p.m. e 1000 r.p.m., mas é ainda mais preferível um intervalo entre 50 r.p.m e 500 r.p.m.. Ê preferível um arejamento entre cerca de 0,1 e 5 volumes de ar por volume de meio por minuto (isto é, entre 0,1 e 10 v/vt). É ainda mais preferível um arejamento de cerca de 5 volumes de ar por volume de meio por minuto (isto é, 5 v/vt). O período necessário para a conversão completa do composto de fórmula estrutural I está compreendido entre cerca de 12 e 48 horas, de preferência entre 4 e 24 horas, medido a partir do momento em que tem início o tratamento do composto de fórmula estrutural l com o microrganismo ou com a enzima. A transformação pode ser efectuada utilizando o dinucleótido de nicotinamida-adenina (NADH) como co-factor. O NADH pode ser depois regenerado e reutilizado, conforme descrito adiante no exemplo 3.

Os microrganismos utilizáveis neste processo são seleccionados entre Picha methcmolica ATCC 58403, Picha pastoris ATCC 28485, Geotrichum candidum ATCC 34614, Nocardia globerula ATCC 21505 e Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305 ou então uma redutase obtida a partir de qualquer um destes microrganismos. A transformação do composto de fórmula estrutural I também pode ser realizada utilizando reductases isoladas a partir de microrganismos. O isolamento pode ser efectuado por homogeneização de suspensões celulares, seguindo-se as operações de desintegração, centrifugação, cromatografia em DEAE-ceíulose, ffaccionamento com sulfato de amónio, cromatografía em ‘Sephacryl’ e cromatografia ‘Mono-Q’. No exemplo 5 estão descritos mais pormenores sobre os procedimentos de isolamento. 10

Para cada um dos processos da presente invenção é preferível que 05 símbolos X3 e X4 representem grupos metiío. De preferência o composto de fórmula estrutural IV possui a estereoquímica seguinte: IVa

A estereoquímica do composto de fórmula estrutural IVa vai depois propagar-se através dos compostos de fórmulas estruturais V-VHI e X. De preferência, o composto de fórmula estrutural IX satisfaz à fórmula estrutural IXa

O produto final de fórmula estrutural X satisfaz de preferência à fórmula estrutural Xa

e mais preferencialmente satisfaz à fórmula estrutural Xb

11 F F

ΟΧ2

Para a preparação dos estereoisómeros prefendos de fórmulas estruturais ITa a Xa, efectua--se o tratamento do composto de fórmula estrutural I de preferência com Pichia methanolica, Pichia pastoris, Geotrichum candidum, Nocardia globerula, Acinetobacter calcoaceticus ou então com uma redutase obtida a partir de qualquer um destes microrganismos. A espécie mais preferida é a Acinetobacter calcoaceticus. As estirpes preferidas estão agrupadas no quadro 1 do exemplo 1.

Os exemplos experimentais seguintes descrevem o modo e o processo de preparação e de utilização da invenção. Estes exemplos constituem variantes preferíveis e são ilustrativos sem contudo serem limitativos.

Exemplo 1

Utilização de células intoctas; diversas estirpes O substrato para este processo (composto A) é o composto de fórmula estrutural

que possui a designação de éster etílico do ácido 3,5-dioxo-6-(benziIoxi)-hexanóico. O produto desejado (composto B) é o composto de fórmula estrutural 12 12

OC2H5 que possui a designação de éster etílico do ácido (R,S)-3,5-di-hidroxi-6-(benziloxi)--hexanóico.

Os outros produtos são o composto C que satisfaz à fórmula estrutural

com a designação de éster etílico do ácido R-3-hidroxi-5-oxo-6-(benziIoxi)-hexanóico, e 0 composto D que satisfaz à fórmula estrutural

com a designação de éster etílico do ácido S-5-hidroxi -3-oxo-6-(benzi loxi)-hexanóico. Os microrganismos foram mantidos num frasco em azoto líquido. Para o desenvolvimento rotineiro de inóculos, foi utilicado como inoculo o conteúdo de um frasco acrescentado a 100 mL de meio 1 contido num balão com a capacidade de 500 mL, tendo a incubação decorrido a 28°C e a 280 r.p.m. num dispositivo de agitação durante 48 horas. Após o crescimento do microrganismo, utilizou-se como inoculo 10 mL da cultura que foram introduzidos num balão com a capacidade de 500 mL que continha 100 mL de meio 1, tendo a incubação decorrido a 28°C e a 250 r.p.m. num dispositivo de agitação.

Efectuou-se a colheita das células que foram depois colocadas em suspensão em tampão de fosfato de potássio 10 mM a pH 6,8. Preparou-se 10 mL de suspensões de células a 20% p/v. 13

As suspensões de células foram enriquecidas com 25 mg de substrato (composto A) e 750 mg de glicose, tendo as operações de transformação sido executadas a 28°C e a 150 r.p.m. durante 48 horas. Retirou-se 1 volume de amostra, extraiu-se com 2 volumes de uma mistura de hexano:n--butanol a 65:35, a fase orgânica separada foi então filtrada através de um filtro ‘LID/x’ de 0,2 pm e recolheu-se o produto obtido.

Efectuou-se a análise das amostras (numa mistura de hexano:n-butanol a 65:35) para pesquisar a concentração de produto e substrato, tendo para tal sido utilizado o sistema de CLER da ‘Hewlett Packard 1070’. Foi utilizada uma coluna (200 x 4,6 mm) ΉΡ-hypersíl ODS’ (5 μτη). A fase móvel era constituída por uma mistura de 50% de água e 50% de acetonitrilo. O débito foi de 1 mL/minuto à temperatura ambiente. O comprimento de onda de detecção foi de 220 nm. Os tempos de retenção dos compostos A e B foram respectivamente de 6,74 e 3,17 minutos. A separação dos compostos C e D foi realizada por CLER. Foram utilizadas duas colunas 08 (‘Polispher RP-18’, 150 x 0,4 mm, e ‘Chiralcel OD’, 250 x 0,4 mm) em série. A coluna 1 foi mantida a uma temperatura de aproximadamente 25°C e a coluna 2 a uma temperatura de aproximadamente 0°C. A fase móvel era constituída por uma mistura de metanol :n--butanol:hexano a 5:1:94 e foi utilizada com um débito de 0,8 mL/minuto. O comprimento de onda de detecção foi de 220 nm. Os tempos de retenção dos compostos C e D foram respectivamente de 9,4 e 11,3 minutos.

Depois cada um dos compostos C e D foi separado dos seus respectivos enantiómeros indesejáveis, tendo para tal sido utilizada uma coluna ‘Chiralcel OD’. A fase móvel era constituída por uma mistura de metanol: l-propanol:hexano a 2:1:97 com 0,01 mol de β-ciclo-dextrina. O débito foi de 0,5 mL/minuto e o comprimento de onda de detecção foi de 220 nm. Os tempos de retenção dos compostos C e D foram respectivamente dè 19,1 e 23,5 minutos. A separação dos dois enantiómeros do racemato do produto B foi realizada utilizando uma coluna ‘Chiralcel OB’. A fase móvel era constituída por uma mistura de hexanoin-butanol: :isopropanol a 63,5:31,5:5. O débito foi de 1 mL/minuto e o comprimento de onda de detecção foi de 230 nm. O tempo de retenção do enantiómero desejado (composto B) foi de 14,2 minutos e do enantiómero indesejado foi de 19,8 minutos.

No quadro 1 estão ilustrados os resultados experimentais obtidos quando são utilizados diversos microrganismos que crescem em meio leem conformidade com o exemplo 1.

Alguns organismos reduziram estereosselectivamente o composto A, dando origem ao composto B desejado, e alguns organismos converteram o composto A no composto E que satisfaz à fórmula estrutural

Microrganismos Ouadro 1 Rendimento da reacção Composto B Composto E Pichia methanolica ATCC 58403 56 89 . Hansenula potymorpha ATCC 26012 52 90 Pichia pastoris ATCC 28485 48 92 Microrganismos Ouadro 1 Rendimento da reacção Composto B Composto E Cunninghamella echinalate ATCC 9244 15 89 15

Saccharomyces cerevisiae ATCC 12341 18 - 75 Geotrichum candidum ATCC 34614 40 78 MortiereUa alpina ATCC 16266 78 85 Nocardta globerula ATCC 21505 48 91 . Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305 85 97

Exemplo 2

Utilização de células intactas: estudo da duração O substrato para este processo (composto A) e o produto desejado (composto B) são os mesmos que foram descritos no exemplo 1.

Deixou-se crescer células de Acmetobacter calcoaceticus ATCC 33305 em 100 mL de meio 1 combinado em balões com a capacidade de 500 mL. O crescimento decorreu a 25°C e a 280 r.p.m. durante 48 horas. Foram utilixados 100 mL de culturas que serviram de inóculos para 15 L de meio 2 combinado num fermentador. O crescimento no fermentador decorreu a 25°C, com um arejamento de 151.p.m. e uma agitação de 500 r.p.m. durante 30 horas. Efectuou--se a colheita das células a partir do fermentador, tendo sido então utilizadas para a biotrans-formação do composto A em composto B.

Colocou-se 300 g de células em suspensão em 3 L de tampão de fosfato de potássio 10 mM a pH 6,0, tendo sido preparadas suspensões homogéneas de células. Adicionou-se 6 g de composto A e 75 g de glicose às suspensões celulares e efectuou-se a biotransformação do composto A em composto B à temperatura de 28°C e a 160 r.p.m. durante 24 horas. Os 16 resultados estão resumidos no quadro 2. Realizou-se a preparação de amostras e determinou-se o rendimento de produto e a pureza óptica conforme descrito no exemplo 1.

Quadro 2

Tempo de reacção Composto B Rendimento Pureza óptica (horas) g/L (%) % 4 068 38 - 20 1,54 87 23 1,66 86 99%

Exemplo 3

Utilização de extractos celulares e de co-factor O substrato para este processo (composto A) e o produto desejado (composto B) estão descritos no exemplo 1.

Deixou-se crescer células de Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305 em meio 1 e meio 2, conforme descrito no exemplo 2.

Colocou-se 150 g de células em suspensão em 1,5 L de tampão de fosfato de potássio 2,0 M a pH 6,0. As suspensões celulares homogeneizadas foram desintegradas a 4°C num microíluidifícador à pressão de 89,6 MPa (13000 psi). A suspensão celular desintegrada foi centrífugada a 12000 r p.m. durante 30 minutos. O sobrenadante límpido (“extractos celulares”) foi utilizado para a biotransformação do composto A em composto B.

Enriqueceu-se 1 L de extracto celular com 10 g de substrato (composto A), 3500 unidades de glieose-desidrogenase, NAD+ 0,7 mM (dinucleótido de nicotinarmda-adenina) e 100 g de glicose. Efectuou-se a reacção a pH 6,0 num sistema com estabilizador do pH, com agitação a 150 r.p.m. e à temperatura de 30°C. Periodicamente foram retiradas amostras que 17 Ί foram depois analisadas para pesquisa do rendimento da reacção e da pureza óptica do composto B, conforme descrito no exemplo 1. Os resultados estão ilustrados no quadro 3.

Quadro 3 Tempo de reacção Composto B Rendimento Pureza óptica (horas) g/L (%) % 24 8,2 82 >99%

Na experiência anterior, o co-factor NADH utilizado para a biotransformação do composto A em composto B foi regenerado utilizando glicose-desidrogenase, ΝΑΕΓ e glicose, conforme a seguir ilustrado.

composto B

composto A

NADH NAD glicose glicose- -desidrogenase ácido glucómco

Depois da conversão total do composto A em composto B, ajustou-se o valor do pH da mistura de reacção para 7,0 e extraiu-se três vezes com volumes iguais de diclorometano. Separou-se a fase orgânica e lavou-se duas vezes com bicarbonato de sódio 0,7 M. Secou-se sobre sulfato de sódio anidro a camada orgânica separada e removeu-se o diclorometano sob pressão reduzida. Secou-se o resíduo oleoso resultante, in vacuo e à temperatura ambiente, para se recuperar um sólido amarelo ténue com um rendimento de 85% e uma pureza óptica de 99%.

Exemplo 4 18

Utilizarão de extractos celulares: estudo da duração O substrato e os produtos desejados são os descritos no exemplo 1. O crescimento das células de Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305 teve lugar em meio 1 e meio 2, conforme descrito no exemplo 2. As operações de preparação dos extractos celulares e de biotransformação do composto A em compostos B, C e D foram realizadas conforme descrito no exemplo 3. A reacção foi interrompida ao fim de 16 horas. Os resultados estão ilustrados no quadro 4. As concentrações dos produtos foram analisadas por CLER, conforme descrito no exemplo 1. O co-factor NADH foi regenerado conforme descrito no exemplo 3.

Ouadro 4 Tempo de reacção Composto B Mistura de compostos C e D (horas) g/L 16 2,61 4,8

Os compostos C e D foram isolados em conformidade com o procedimento a seguir descrito.

Extractos celulares centrifugados (1 L, 4,8 g de compostos C e D) pH ajustado para 7,0; extracção realizada três vezes com volumes iguais de diclorometano, separação da camada orgânica (centrifugação necessária para fraccionar a emulsão); 19 lavagem da camada orgânica duas vezes com cloreto de sódio a 7%; secagem da camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro; remoção do diclorometano sob pressão reduzida; Líquido oleoso viscoso (4*8 g) secagem in vácuo à temperatura ambiente;

T Líquido castanho-escuro (2,1 g de compostos C e D) aplicado a uma coluna de sílica neutralizada (35 x 2,0 cm); lavagem com misturas a 80:20, 70:30 e 60:40 de hexano:acetato de eti lo (100 mL de cada mistura); recolha das fracções rr5 34-39 (ffacções de 2 mL) remoção do solvente sob pressão reduzida;

Líquido amarelo ténue, 0,6 g de mistura de compostos C e D CLER Hl 90%.

Os compostos C e D foram então separados por CLER preparativa, conforme descrito no exemplo 1.

Exemplo 5

Utilização de redutase purificada O substrato para este processo (composto A) e o produto desejado (composto B) estão descritos no exemplo 1. O crescimento das células de Acmetobacter calcoaceticus ATCC 33305 teve lugar em meio 1, conforme descrito no exemplo 2. Os extractos celulares de Acmetobacter calcoaceticus ATCC 33305 foram preparados conforme descrito no exemplo 3.

Carregou-se uma coluna de DEAJE-ceiulose (DE-52) com 700 mL de extractos celulares e efectuou-se a eluição com tampão que continha cloreto de sódio num gradiente linear entre 20 0 M e 0,5 M. As fracções que continham actividade de redutase foram reunidas e concentradas por precipitação com sulfato de amónio (saturação de 70%). Recolheu-se por centrifugação o material precipitado, dissolveu-se em tampão e carregou-se numa coluna de ‘Sephacryl S-200’. As fracções que continham actividade de redutase foram reunidas após a cromatografia e carregadas numa coluna ‘Mono-Q’. Efectuou-se a eluição das proteínas ligadas na coluna ‘Mono-Q’, com um tampão que continha cloreto de sódio num gradiente linear entre 0 M e 0,5 M. As fracções que continham actividade de redutase foram reunidas e analisadas por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio (DSS). A enzima purificada era homogénea e possuía um peso molecular de 35000 ± 3000 Da. As actividades específicas reveladas durante os procedimentos de purificação estão agrupadas no quadro 5.

Quadro S

Passos Volume (mL) Actividade total gmol/minuto Proteína total (mg) Actividade específica pnxMninutc/nigde proteína Purificação (if de vezes) 1. Extractos celulares 700 147,2 4480 0,033 - 2. Cromatografia em coluna de DE AE-celulose 700 141,6 1120 0,126 3,8 3.Fraccionamentocom sulfato de amónio (0-70%) 30 134,4 568,8 0,23 6,95 4. Cromatografia em coluna ‘Sephacryl S-200’ 15 19,2 4,04 4,75 144 5. Coluna ‘Mono-Q’ 20 3,92 0,536 7,31 222 A transformação de composto A em composto B foi efectuada pela enzima purificada (fracção da coluna ‘Mono-Q’). A mistura de reacção em 20 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 6,0) continha 10 unidades de enzima redutase purificada, 200 mg de substrato (composto A), 100 unidades de glicose-desidrogenase, 1 g de glicose e 50 mg de NAD+. Efectuou-se a reacção a pH 6,0, num sistema com estabilizador de pH, com agitação a 100 r.p.m. 21 e à temperatura de 25°C durante 16 horas. Calculou-se as concentrações de produto (composto B) e de substrato (composto A) utilizando os procedimentos descritos no exemplo 1. Decorrido um período de reacção de 16 horas, obteve-se um rendimento de reacção de 89% e uma pureza óptica do composto B superior a 99%.

Lisboa, 22 de Dezembro de 2000

0 AGENTE OFICIAL DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL

Claims

1 Reivindicações 1. Processo para a preparação de um enantiómero de grupo 3,5-di-hidroxi que satisfaz à fórmula estrutural OH OH O XV JQ

OX1 2 o qual consiste em efectuar o tratamento de um dicetoéster de fórmula estrutural O O O vaU. com um microrganismo seleccionado entre Pichia methanolica ATCC 58403, Pichia pastoris ATCC 28485, Geotrichiun cantãdum ATCC 34614, NocartBa globerula ATCC 21505 e Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305, ou com uma redutase obtida a partir de qualquer um destes microrganismos, e em recuperar depois o enantiómero de grupo 3,5-di-hidroxi; em que o símbolo X1 representa um grupo fenilo e o símbolo X1 representa um grupo etilo. X3 X3

Oalquil Oalquil para formar um éter dioxínico de fórmula estrutural 1 Processo de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende ainda os passos seguintes: 2 (a) acoplar o enantiómero de grupo 3,5-di-hidroxi a um composto de grupo dialcoxi de 3 fórmula estrutural 2

Ο

οχ2 (b) hidrogenar ο éter dioxínico para formar um álcool de fórmula estrutural x\.x‘ rS5 ;e QX2 (c) oxidar o álcool para se obter um aldeído de fórmula estrutural

em que cada um dos substituintes X3 e X4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, cicloalquilo ou arilo ou então, considerados em conjunto, formam um grupo alquileno com 4 a 6 átomos de carbono, formando um anel hidro-carbonado conjuntamente com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados, em que o termo “cicloalquilo” designa os grupos que possuem 3,4, 5,6 ou 7 átomos de carbono e o termo “arilo” designa os grupos fenilo e fenilo substituído com 1, 2 ou 3 substituintes seleccionados entre átomos de halogénio e grupos amino, alquilamino, di-alquilamino, nitro, hidroxilo, trifluorometilo, alquilo inferior, alcoxi inferior, alcanoiloxi, carbamoílo, carboxilo ou carboxi-(alquilo inferior). Processo de acordo com a reivindicação 2, o qual compreende ainda o passo que consiste em acoplar o aldeído a um fosfoéster ou a um sal de fórmula estrutural 3. 3

para formar um produto de fórmula estrutural

em que: cada um dos substituintes X3 e X4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, cicloalquilo ou arilo ou então, considerados em conjunto, formam um grupo alquileno com 4 a 6 átomos de carbono, formando um anel hidrocarbonado conjuntamente com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados; cada um dos símbolos R1 e R4 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou halogénio ou um grupo trifluorometilo ou grupos alquilo ou alcoxi que possuam entre 1 e 4 átomos de carbono; cada um dos símbolos R2, R3, R5 e R6 representa independentemente um átomo de hidrogénio ou de halogénio ou um grupo alquilo ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono; 4 o símbolo Ζ representa um grupo de uma das fórmulas estruturais 4 Jè OÒr* •P —R1® ^R” cada um dos símbolos R1 e R2 representa independentemente um grupo alquilo; cada um dos símbolos R3, R4 e R11 representa independentemente um grupo fenilo facultativamente substituído com um ou dois substituintes seleccionados entre átomos de cloro e grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; e o símbolo X representa um átomo de cloro, bromo ou iodo. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que os símbolos X3 e X4 representam grupos metilo.

5. Processo de acordo com uma das reivindicações 3 ou 4, em que: um dos símbolos R1, R2 e R3 representa para-flóor e os outros dois símbolos representam átomos de hidrogénio, e um dos símbolos R4, R5 e R5 representa para-flúor e os outros dois símbolos representam átomos de hidrogénio. 1 1 2 2 o símbolo X representa um grupo fenilo e o símbolo X representa um grupo etilo; 3 os símbolos X3 e X4 representam grupos metilo; 4 um dos símbolos R1, R2 e R3 representa para-flúor e os outros dois símbolos representam 5 Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 5, em que: 5 átomos de hidrogénio; e um dos símbolos R4, R5 e R6 representa para-flúor e os outros dois símbolos representam átomos de hidrogénio. Lisboa, 22 de Dezembro de 2000 0 AGENTE OFICIAL DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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