JP3123428B2 - 微生物によるクロロヒドリンの光学分割方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物によるクロロ
ヒドリンの光学分割方法、さらに詳しくは、医薬、農
薬、生理活性物質および強誘電性液晶などの光学活性化
合物の合成において有用なキラルビルディングブロック
および中間体となりうる光学活性クロロヒドリン化合物
を微生物を用いて対応するラセミ体から生物学的光学分
割方法により製造する方法に関する。本発明は、また、
このようなラセミ体クロロヒドリンの生物学的光学分割
により、光学活性クロロヒドリン化合物と共に、用いる
微生物の種類により、また、出発化合物のクロロヒドリ
ン化合物の置換基の種類によっては、光学活性１,２−
ジオール化合物および／または光学活性３−ヒドロキシ
−γ−ブチロラクトンを製造する方法も提供する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】光学
活性化合物の製法としては、対応する光学活性出発物質
から目的物へ変換する化学的合成法のほか、対応するラ
セミ体を光学分割剤で処理して光学活性体に分割する方
法が一般的であるが、最近、微生物または酵素を用いて
不斉還元や不斉加水分解反応を利用する生物学的方法に
より光学活性体を分離する方法が報告されている。たと
えば、微生物菌体または酵素を用いるβ−ケトエステル
体の不斉還元法が知られており、中でもパン酵母を用い
た４−クロロアセトアセテイトの不斉還元法により光学
活性４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトへの不斉還
元法が知られている（C. J. Sih et al., Ann. N.Y. Ac
ad. Sci., Vol. 434,pp.186-193,1984; C. J. Sih, BE8
98386）。また、サンタニエロ（E. Santaniello）らは
エチル ４−クロロ−３−オキソブチレイトからパン酵
母を用いた不斉還元法によるＳ体エチル ４−クロロ−
３−ヒドロキシブチレイトの製法を報告している（J.Ch
em. Research（S），pp.132-133, 1984）。また、高橋
らも、エチル ４−クロロ−３−オキソブチレイトの微
生物を用いた不斉還元により光学活性エチル４−クロロ
−３−ヒドロキシブチレイトの製法を報告している（特
開昭６１−１４６１９１号）。酵素を用いた製法では、
ピーターズら（Peters et al.）はロドコッカス・エリ
スロポリス（Rhodococcus erythropolis）のカルボニル
リダクターゼを用いた不斉還元法によりメチル３−オキ
ソブチレイトあるいはエチル４−クロロ−３−オキソブ
チレイトからのＳ体メチル３−ヒドロキシブチレイトお
よびＲ体エチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイ
トの製法を報告している（J．Peters et al., Appl. Mi
crobiol. Biotechnol., Vol. 38，pp.334-340，1992；
T．Zelinski et al., J．Biotechnol., Vol. 33，pp.28
3−292、1994）。さらに、清水らはスポロボロマイセス
・サルモニカラー（Sporoboromyces salmonicolor）AKU
4429株のアルデヒドリダクターゼを用いたＲ体エチル４
−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトの不斉還元法によ
る生産法を報告している（S．Shimizu et al., Biotech
nol. Lett., Vol. 12., No. 8, pp.593-596，1990；App
l.Environ. Microbiol., Vol. 56，No. 8, pp.2374-237
7，1990）。しかし、これら微生物あるいは酵素を用い
る不斉還元法によるプロキラルβ−ケトエステル体から
の光学活性β−ヒドロキシエステル体の生産法において
は、その反応に高価なＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）あるいはＮＡＤＰＨ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸）等の補酵素を必要と
し、さらにその酸化体から再度還元体へ変換する反応を
必要とするためグルコースオキシダーゼあるいは蟻酸デ
ヒドロゲナーゼ等の酵素を別途必要とするうえ、その反
応工程が律速反応となるなどの観点から工業的製法とは
言い難い。

【０００３】また、中村らは、基質として１,３−ジク
ロロ−２−プロパノールまたはエピクロロヒドリンを用
い、ＫＣＮ存在下でコリネバクテリウム（Corynebacter
ium）sp.N-1074株のデハロゲナーゼで処理してＲ体４−
クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法
を報告している（特開平３−５３８８９号、特開平３−
５３８９０号）。またラセミ体４−クロロ−３−ヒドロ
キシブチロニトリルと脂肪酸エステルの存在下でリパー
ゼを作用させ、光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブ
チロニトリルあるいは対応するエステル体を得る方法も
報告されている（特開平２−２７９９５号）。しかしな
がら、これらの方法では得られる光学活性体の光学純度
が低く、工業的製法には適さない。

【０００４】さらに、リーら（L.G.Lee，G.M.Whiteside
s）はグリセロールデヒドロゲナーゼを用いて１−ヒド
ロキシ−２−プロパノンおよび１−ヒドロキシ−２−ブ
タノンから還元反応によってＲ体１,２−プロパンジオ
ールおよびＲ体１,２−ブタンジオールを製造する方法
を報告している（J.Org.Chem.,Vol.51,pp.25-36,(198
6)）。また、１−ヒドロキシ−２−ケトン化合物に微生
物菌体を作用させ、Ｓ体１,２−ジオールに変換する製
法も知られている（特開平１−３２０９８８号）。しか
しながら、これらの方法は酵素または微生物による不斉
還元反応を利用して１,２−ジオールを製造する方法で
あり、本発明における微生物菌体を用いてラセミ体クロ
ロヒドリンから一方の光学活性クロロヒドリンのみを
１,２−ジオール体に変換する方法とは区別される。ま
た、医薬品等の光学活性化合物の合成中間体として有用
な光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造
には、化学的合成法のほか、生物学的方法として、酢酸
ビニル存在下、有機溶媒中において３−ヒドロキシ−γ
−ブチロラクトンにリパーゼを作用させ、エステル交換
反応において光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラク
トンと対応するエステル体を得る方法（ＥＰ０４３９７
７９）; エチル ４−ｔ−ブトキシ−３−オキソ酪酸エ
ステルをパン酵母により不斉還元し、得られたＲ−４−
ｔ−ブトキシ−３−ヒドロキシ酪酸エステルからフルオ
ロ酢酸存在下においてＲ−３−ヒドロキシ−γ−ブチロ
ラクトンを誘導する方法（Synthesis(1)，pp.37-40，19
86）が知られている。しかし、これらの方法は、その操
作が煩雑であったり、高価な試薬を用いる必要性あるい
は高価な光学活性体を出発原料としたり、またその入手
が困難であったり、一方の光学異性しか製造できない等
の解決すべき問題点を有している。従って簡便かつ安価
な光学活性な３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製
法とは言い難い。

【０００５】本発明者らは、先に、一方の光学異性体を
分解資化してそれを単一炭素源として生育増殖しうる微
生物を用いて対応するラセミ体から光学活性体を製造す
る方法を見い出した。例えば、アルカリゲネス属（Alca
ligenes）の細菌を用いたＳ−（＋）−３−ハロゲノ−
１,２−プロパンジオールの製法（特開平３−１９１７
９５号、および J. of Fermentation & Bioengineerin
g, Vol. 73, No. 6, 443-448, 1992）；シュードモナス
属（Pseudomonas）細菌を用いたＲ−（−）−３−ハロ
ゲノ−１,２−プロパンジオールの製法（特開平３−１
９１７９４号、および Applied Microbiology and Biot
echnology, Vol. 40, 273-278, 1993）；アルカリゲネ
ス属の細菌を用いた光学活性ジクロロプロパノール（Ｒ
体）の製法（特開平３−１８０１９７号、および J. of
Industrial Microbiology, Vol. 10, 37-43, 1992）；
シュードモナス属細菌を用いた光学活性ジクロロプロパ
ノール（Ｓ体）の製法（特開昭６１−１３２１９６号、
および Agric. Biol. Chem.,Vol. 54, No. 12, 3185-31
90, 1990）；さらに上記シュードモナス属細菌を用いて
得られた光学活性ジクロロプロパノールからアルカリ処
理によって光学活性エピクロロヒドリンを製造する方法
（特開平１−５５８７９号、および有機合成化学協会誌
第５１巻、第５号、３８８−３９８、１９９３）などが
挙げられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラセミ体
クロロヒドリンから光学活性クロロヒドリンを工業的に
製造する方法を見い出すべく種々研究を重ねた結果、あ
る種の微生物、とくにシュードモナス属、エンテロバク
ター属、キトロバクター属およびバチルス属のある種の
細菌がラセミ体クロロヒドリンの一方の光学活性体のみ
を分解し、あるいはその分解活性により光学活性１,２
−ジオール体に変換し、場合によりさらに光学活性３−
ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換し、したがっ
て、光学活性体クロロヒドリンと共に、場合により、光
学活性１,２−ジオール体および／または光学活性３−
ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを分離採取し得ること
を見い出した。本発明者らの研究によれば、それらの微
生物は、前記ハロゲノプロパンジオールやジクロロプロ
パノールの場合と違って、該出発化合物の一方の光学活
性体を資化することはできないため反応系中でその微生
物を増殖しながら光学活性体を製造することはできない
が、その微生物を増殖させて得られる菌体をラセミ体ク
ロロヒドリンに作用させるとその一方の光学活性体のみ
を分解し、他方の光学活性体が系中に残存するため、こ
れを回収することにより所望の光学活性クロロヒドリン
が得られることを知り、また微生物や出発化合物の種類
によっては、一方の光学活性クロロヒドリンのみを１,
２−ジオール体および／または３−ヒドロキシ−γ−ブ
チロラクトンに変換するため、残存する他方の光学活性
クロロヒドリンと共に光学活性１,２−ジオール化合物
および／または３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを
製造し得ることを知り、本発明を完成するにいたった。

【０００７】すなわち、本発明は、微生物の作用によ
り、安価なラセミ体クロロヒドリンから一方の光学異性
体を立体選択的に分解し、残存するもう一方の光学活性
異性体を回収することを特徴とする光学活性クロロヒド
リンの製法を提供するものである。本発明は、また、ラ
セミ体クロロヒドリンから微生物の作用により一方の光
学異性体を立体選択的な分解反応により脱クロル化して
光学活性１,２−ジオール化合物、さらには光学活性３
−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに導き、残存する他
方の光学活性クロロヒドリンと共に該１,２−ジオール
化合物および／または３−ヒドロキシ−γ−ブチロラク
トンを回収することを特徴とする光学活性クロロヒドリ
ンおよび１,２−ジオール化合物あるいは３−ヒドロキ
シ−γ−ブチロラクトンまたは両光学活性化合物の製法
を提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明によれば、一般式

【化６】 ［式中、Ｒ¹は水素原子または低級アルキル基；Ｒ²は、
Ｒ¹が水素原子のときは、置換または非置換低級アルキ
ル基（ただしヒドロキシメチル基（−ＣＨ₂ＯＨ）を除
く）、またはＲ¹が低級アルキル基のときは、水素原子
である］で示されるラセミ体クロロヒドリンに微生物を
作用させて、光学異性体の一方を選択的に分解し、その
反応系に残存するもう一方の光学異性体を回収すること
により、所望の光学活性クロロヒドリンが製造される。

【０００９】上記方法において、用いられる出発物質お
よび微生物の種類によっては、一方の光学異性体は、下
記一般式

【化７】 ［式中、Ｒ³は置換または非置換低級アルキル基であ
る］で示される対応する光学活性１,２−ジオール化合
物ならびに下記一般式

【化８】 で示される光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクト
ンに変換されるため、残存する他方の光学活性クロロヒ
ドリンと共に該生成した光学活性１,２−ジオール化合
物および光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン
が製造される。

【００１０】本明細書において、Ｒ¹基の低級アルキル
基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ルなどの炭素数１〜４個のアルキル基が挙げられる。Ｒ
²基およびＲ³基における置換または非置換低級アルキル
基における低級アルキル基としては、メチル、エチル、
プロピルなどの炭素数１〜３個のアルキル基が挙げら
れ、置換基としては、シアノ基、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルなど
の炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル基であ
る）の低級アルコキシカルボニル基または−ＯＲ''
（Ｒ''はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チルなどの炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル
基である）の低級アルコキシ基から選ばれる。好ましい
置換低級アルキル基としては、シアノメチル、低級アル
コキシカルボニルメチル、低級アルコキシメチルが挙げ
られる。

【００１１】本発明で用いられる微生物としては、式
［１］で示されるラセミ体クロロヒドリンの一方の光学
異性体を選択的に分解し得るものであればいずれの微生
物も含まれるが、好ましくはシュードモナス（Pseudomo
nas）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、キト
ロバクター（Citrobacter）属およびバチルス（Bacillu
s）属に属する細菌が挙げられる。これらのうち、とく
に好ましい菌株として、シュードモナス sp. OS-K-29
株、シュードモナス sp. DS-K-NR818株、エンテロバク
ター sp. DS-S-75株、キトロバクター・フレウンディー
（Citrobacter freundii）DS-S-13株、キトロバクター
・フレウンディーDS-K-40株、およびバチルス・スペリ
カス（Bacillus sphaericus）DS-ID-819株が挙げられ
る。これらの微生物は式［１］で示されるクロロヒドリ
ンを資化する能力はないため、増殖して得られる菌体を
用いてラセミ体クロロヒドリンの立体選択的分解に供す
る。

【００１２】しかして、本発明の好ましい一態様は、下
記反応式−１で示される方法である（ただし、化合物
［１ａ］中のＲ³が低級アルコキシカルボニルメチル基
である場合のみ、３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン
［３ａ］が生成する）。

【化９】 ［式中、Ｒ³は前記に同じ］ 上記反応式で示される方法のうち、さらに好ましい方法
はＲ³がシアノメチルまたは低級アルコキシカルボニル
メチルである化合物の製法である。上記反応式−１にお
いて、Ｒ³が低級アルコキシカルボニルメチルの場合に
は、光学活性クロロヒドリン［１ａ'］と共に、光学活性
１,２−ジオール化合物［２ａ］に加えて、光学活性３
−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン［３ａ］が製造され
るが、これら光学活性１,２−ジオール化合物［２ａ］
および光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン
［３ａ］は、通常、いずれもＲ体であって、それらはそ
れぞれ下記の式で示される。

【化１０】 ［式中、Ｒ³'は低級アルコキシカルボニルメチル基であ
る］

【００１３】本発明の他の好ましい態様は、下記反応式
−２で示される方法である。

【化１１】 ［式中、Ｒ³'は前記に同じ］ 上記反応式−２の方法には、他のエンテロバクター属、
キトロバクター属およびバチルス属に属する前記例示の
細菌も好適に用いられる。またこの方法で得られる光学
活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン［３ｂ］は通
常Ｓ体であって、下記式で示される構造を有する。ただ
し、バチルス・スペリカスDS-ID-819株を用い、また出
発物質として化合物［１ｂ］（式中、Ｒ³'がｎ−ブチル
オキシカルボニルメチル基以外の基である）を用いた場
合は、Ｒ体が得られる。

【化１２】

【００１４】本発明のさらに他の好ましい態様は、下記
反応式−３で示される方法である。

【化１３】 ［式中、Ｒ¹'は低級アルキル基である］

【００１５】本発明で用いられる微生物の具体例である
シュードモナス sp. OS-K-29株は本発明者らが土壌から
分離した細菌であり、一方、シュードモナス sp. DS-K-
NR818株はその変異菌株である。それら両菌株の形態学
的、生理学的諸性質に基づいて、バージェイズ・マニュ
アル・オブ・システマチック・バクテリオロジー第８版
および第９版に従い分類した結果、これらは、グラム陰
性、好気性桿菌、極鞭毛を有し、オキシダーゼ陽性、カ
タラーゼ陽性を示すことからシュードモナス属の一菌株
であると同定し、さらにこれら菌株は公知の菌株と一致
するものがないため、上記のごとく命名し、それぞれ、
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−９９４およびＦＥＲＭ ＢＰ−５４９１として寄
託されている。

【００１６】上記シュードモナス sp. OS-K-29株の菌学
的性質は特開平１−５５８７９号に記載されている。こ
のシュードモナス sp. OS-K-29株を培養するための培地
組成としては通常この微生物が生育する培地ならばいず
れも使用することができる。例えば炭素源としてグルコ
ース，ガラクトース、シュークロース等の炭水化物、グ
リセロール、ラセミ体３−ハロゲノ−１,２−プロパン
ジオール、ＲあるいはＳ体３−ハロゲノ−１,２−プロ
パンジオール、ラセミ体２,３−ジクロロ−１−プロパ
ノール、Ｒ体２,３−ジクロロ−１−プロパノール等の
アルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン
酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類などの有機酸、ま
たはそれらの混合物を、窒素源として硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒
素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキ
ス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合
物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無
機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マ
ンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、更に必要に応じて
ビタミン類を加えてもよい。また、高酵素活性を持った
菌体を得るために、本菌株を培養する際に上記培地およ
びペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地にラセミ体
３−ハロゲノ−１,２−プロパンジオール、Ｒあるいは
Ｓ体３−ハロゲノ−１,２−プロパンジオール、ラセミ
体２,３−ジクロロ−１−プロパノール、Ｒ体２,３−ジ
クロロ−１−プロパノールを添加してもよい。ラセミ体
２,３−ジクロロ−１−プロパノールまたはＲ体２,３−
ジクロロ−１−プロパノール、ラセミ体３−ハロゲノ−
１,２−プロパンジオールを単一炭素源とする完全合成
培地で培養するのも有効である。上記微生物の培養は常
法によればよく、例えばpＨを６〜９、好ましくは６.５
〜７.５、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜
３７℃の範囲で好気的に１０〜９６時間行うことが好ま
しい。

【００１７】またシュードモナス sp. DS-K-NR818株の
菌学的性質は下記に示すとおりである。 Ａ．形態 細胞の形 桿菌 細胞の大きさ ０.４〜０.６×１.２〜１.６μｍ 細胞の多形性 無 運動性の有無 有、極鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 − 坑酸性 − Ｂ．各培地における生育状態 １．肉汁寒天培地（３０℃、３日間培養） 1)コロニー形状の遅速 普通 2)コロニーの形状 円形 3)コロニー表面の形状 平滑 4)コロニーの隆起状態 凸状 5)コロニーの周辺 全縁 6)コロニーの内容 均質 7)コロニーの色調 乳白色 8)コロニーの光沢 鈍光 9)コロニーの透明度 半透明 10)可溶性色素の生成 無 ２．肉汁寒天斜面培地（３０℃、３日間培養） 1)生育の良否 良 2)生育状態 糸状 3)コロニーの表面 平滑 4)コロニー断面の形状 偏平状 5)コロニーの光沢 鈍光 6)コロニーの色調 乳白色 7)コロニーの透明度 半透明 ３．肉汁液体静置培養（３０℃、３日間培養） 1)生育状態 少濁 2)ガスの発生 無 3)培地の着色 無 ゼラチン液化テスト 液化せず リトマスミルク 凝固せず、無変化 Ｃ．生理学的試験 リジン脱炭酸テスト ＋ ＶＰテスト − ＭＲテスト − 硝酸塩の還元 − インドールの生産 − ＰＰＡ反応 − 硫化水素の生成 − クエン酸の利用 ＋ でんぷん分解テスト − 脱窒反応 − 無機塩の利用 ＋ 色素の生成 1)キングＡ培地 − 2)キングＢ培地 − 3)Pseudomonas P 培地 − 4)Pseudomonas F 培地 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ ウレアーゼテスト ＋ OF-テスト(Hugh Leifson法による。なお、ガスの生成は
認められなかった。) 1)Ｄ−グルコース − 2)グリセリン Ｏ 3)Ｄ−ガラクトース − 4)Ｄ−フラクトース − 5)Ｄ−トレハロース − ＰＨＢの蓄積 ＋ 炭素源の利用 1)Ｄ−マンニトール − 2)Ｄ−フラクトース ＋ 3)Ｄ−グルコース − 4)Ｄ−グルコン酸 ＋ 5)Ｄ−ガラクトース − 6)グリセリン ＋ 7)p-ハイドロキシ安息香酸 ＋ 生育最適ｐＨ ５〜９ 生育最適温度 ２０〜４０℃

【００１８】上記シュードモナス sp. DS-K-NR818株を
培養するための培地組成としては、通常この微生物が生
育する培地であればいずれも使用することができる。例
えば、炭素源としてフラクトースのような炭水化物、グ
リセロール、ラセミ体３−ハロゲノ−１,２−プロパン
ジオール、ラセミ体２,３−ジクロロ−１−プロパノー
ル等のアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレ
イン酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類などの有機
酸、またはそれらの混合物を、窒素源として硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エ
キス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化
合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、
無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、
マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに必要に応
じてビタミン類を加えてもよい。また、高分解活性を持
った菌体を得るために、本菌株を培養する際に上記培地
およびペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地にラセ
ミ体３−ハロゲノ−１,２−プロパンジオール、２,３−
ジクロロ−１−プロパノールを添加してもよい。ラセミ
体３−ハロゲノ−１,２−プロパンジオール、２,３−ジ
クロロ−１−プロパノールを単一炭素源とする完全合成
培地で培養するのも有効である。上記微生物の培養は常
法によればよく、例えばｐＨを６〜９、好ましくは６.
５〜７.５、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３７℃の範囲で好気的に１０〜９６時間行うことが好
ましい。

【００１９】本発明で用いられる他の微生物の具体例で
あるエンテロバクター sp. DS-S-75株、キトロバクター
・フレウンディー DS-S-13株、キトロバクター・フレウ
ンディー DS-K-40株およびバチルス・スペリカス DS-ID
-819株も、本発明者らが土壌中より分離採取した菌株で
あって、これら菌株の形態学的、生理学的諸性質に基づ
いて、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジー第９版に従い分類した結果、上記
菌体のうちエンテロバクター sp. DS-S-75株は、グラム
陰性、通性嫌気性桿菌、周鞭毛を有し、V-P反応陽性、M
Rテスト陰性、DNase活性陰性を示すことからエンテロバ
クター属の一菌株であると同定した。さらに同定の結
果、本菌株は公知の菌株と一致するものがないため、上
記のごとく命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９４として寄託され
ている。同様にキトロバクター・フレウンディー DS-S-
13株とキトロバクター・フレウンディー DS-K-40株はグ
ラム陰性、通性嫌気性桿菌、周鞭毛を有し、V-P反応陰
性を示し、クエン酸を単一炭素源として利用することか
らキトロバクター属の一菌株であると同定した。さらに
同定の結果、本菌株は硫化水素を生成することからキト
ロバクター・フレウンディーであると同定し、それぞ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号 Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５４９２および ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
９３として寄託されている。同様にバチルス・スペリカ
ス DS-ID-819株はグラム陽性、周鞭毛を有し、好気性桿
菌で胞子を形成し、カタラーゼ陽性であることからバチ
ルス属の一菌株であると同定した。さらに生理的諸性質
より、本菌株をバチルス・スペリカスと同定し工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ
−５４９５として寄託されている。上記菌株の諸性質は
下記に示すとおりである。

【００２０】エンテロバクター sp. DS-S-75株の菌学的
性質は下記に示すとおりである。 Ａ．形態 細胞の形 桿菌 細胞の大きさ ０.６〜０.８×１.５〜２.８μｍ 細胞の多形性 無 運動性の有無 有、周鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 − Ｂ．各培地における生育状態 １．肉汁寒天培地（３０℃、３日間培養） 1)コロニーの大きさ ３〜４ｍｍ 2)コロニーの形状 不規則 3)コロニー形状の遅速 速い 4)コロニー表面の形状 平滑、粘性 5)コロニーの隆起状態 凸円状 6)コロニーの周辺 波状 7)コロニーの色調 乳白色 8)コロニーの光沢 鈍光 9)コロニーの透明度 不透明 10)可溶性色素の生成 無 ２．肉汁寒天斜面培地（３０℃、３日間培養） 1)生育の良否 良 2)生育状態 糸状 3)コロニーの光沢 鈍光 4)コロニーの色調 乳白色 ３．液体静置培養（３０℃、３日間培養） 1)生育状態 混濁 2)培地の着色 無 3)沈澱の有無 有 Ｃ．生理学的試験 インドールの生成 − カタラーゼ ＋ ウレアーゼ ＋ オキシダーゼ − β-ガラクトシダーゼ ＋ リジンデカルボキシラーゼ ＋ 硫化水素の生成 − クエン酸の利用 ＋ でんぷんの分解 − ゼラチンの液化 − ＭＲ − ＶＰ ＋ 硝酸塩の還元 ＋ 脱Ｎ反応 ＋ ＤＮase活性 − ＮＰＴase ＋ Ｏ-Ｆテスト（グルコース） Ｆ Ｄ-グルコース、酸 ＋ Ｄ-グルコース、ガス ＋ 生育最適温度 ３０−３７℃ 生育最適ｐＨ ５〜９

【００２１】またキトロバクター・フレウンディー DS-
S-13株の菌学的性質は下記に示すとおりである。 Ａ．形態 細胞の形 桿菌 細胞の大きさ ０.５〜０.７×１.８〜３.６μｍ 細胞の多形性 無 運動性の有無 有、周鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 − Ｂ．各培地における生育状態 １．肉汁寒天培地（３０℃、３日間培養） 1)コロニーの大きさ ２〜４ｍｍ 2)コロニーの形状 円形 3)コロニー形状の遅速 速い 4)コロニー表面の形状 平滑 5)コロニーの隆起状態 凸円状 6)コロニーの周辺 全縁 7)コロニーの色調 乳白色 8)コロニーの光沢 有 9)コロニーの透明度 半透明 10)色素の生成 無 ２．肉汁寒天斜面培地（３０℃、３日間培養） 1)生育の良否 良 2)生育状態 疾状 3)光沢 有 4)色調 乳白色 ３．液体静置培養（３０℃、３日間培養） 1)生育状態 混濁 2)培地の着色 無 3)沈澱の有無 有 Ｃ．生理学的試験 インドールの生成 − カタラーゼ ＋ ウレアーゼ ＋ オキシダーゼ − β-ガラクトシダーゼ ＋ リジンデカルボキシラーゼ − 硫化水素の生成 ＋ クエン酸の利用 ＋ でんぷんの分解 − ゼラチンの液化 − ＭＲ ＋ ＶＰ − 硝酸塩の還元 ＋ 脱Ｎ反応 ＋ ＤＮase活性 − ＮＰＴase − Ｏ-Ｆテスト（グルコース） Ｆ Ｄ-グルコース、酸 ＋ Ｄ-グルコース、ガス ＋ 生育最適温度 ２５−３０℃ 生育最適ｐＨ ５〜９

【００２２】またキトロバクター・フレウンディー DS-
K-40株の菌学的性質は下記に示すとおりである。 Ａ．形態 細胞の形 桿菌 細胞の大きさ ０.５〜０.７×１.８〜３.６μｍ 細胞の多形性 無 運動性の有無 有、周鞭毛 胞子の有無 無 グラム染色性 − Ｂ．各培地における生育状態 １．肉汁寒天培地（３０℃、３日間培養） 1)コロニーの大きさ ２〜４ｍｍ 2)コロニーの形状 円形 3)コロニー形状の遅速 速い 4)コロニー表面の形状 平滑 5)コロニーの隆起状態 凸円状 6)コロニーの周辺 全縁 7)コロニーの色調 乳白色 8)コロニーの光沢 有 9)コロニーの透明度 半透明 10)色素の生成 無 ２．肉汁寒天斜面培地（３０℃、３日間培養） 1)生育の良否 良 2)生育状態 疾状 3)光沢 有 4)色調 乳白色 ３．肉汁液体静置培養（３０℃、３日間培養） 1)生育状態 混濁 2)培地の着色 無 3)沈澱の有無 有 Ｃ．生理学的試験 インドールの生成 − カタラーゼ ＋ ウレアーゼ ＋ オキシダーゼ − β-ガラクトシダーゼ ＋ リジンデカルボキシラーゼ − 硫化水素の生成 ＋ クエン酸の利用 ＋ でんぷんの分解 − ゼラチンの液化 − ＭＲ ＋ ＶＰ − 硝酸塩の還元 ＋ 脱Ｎ反応 ＋ ＤＮase活性 − ＮＰＴase − Ｏ-Ｆテスト(グルコース） Ｆ Ｄ-グルコース、酸 ＋ Ｄ-グルコース、ガス ＋ 生育最適温度 ２５−３０℃ 生育最適ｐＨ ５〜９

【００２３】また、バチルス・スペリカス DS-ID-819株
の菌学的性質は下記に示すとおりである。 Ａ．形態 細胞の形 桿菌 細胞の大きさ ０.５〜０.７×２.０〜３.５μｍ 細胞の多形性 無 運動性の有無 有、周鞭毛 胞子の有無 有 グラム染色性 ＋ Ｂ．各培地における生育状態 １．肉汁寒天培地（３０℃、３日間培養） 1)コロニーの大きさ ２〜４ｍｍ 2)コロニーの形状 円形 3)コロニー形状の遅速 普通 4)コロニー表面の形状 しわ状 5)コロニーの隆起状態 扁平状 6)コロニーの周辺 全縁 7)コロニーの色調 乳白色 8)コロニーの光沢 鈍光 9)コロニーの透明度 半透明 10)色素の生成 無 ２．肉汁寒天斜面培地（３０℃、３日間培養） 1)生育の良否 良 2)生育状態 拡布状 3)光沢 鈍光 4)色調 乳白色 ３．液体静置培養（３０℃、３日間培養） 1)生育状態 少濁 2)培地の着色 無 3)沈澱の有無 無 Ｃ．生理学的試験 インドールの生成 − カタラーゼ ＋ ウレアーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ β-ガラクトシダーゼ − リジンデカルボキシラーゼ ＋ 硫化水素の生成 − クエン酸の利用 ＋ でんぷんの分解 − ゼラチンの液化 ＋ ＭＲ − ＶＰ − 硝酸塩の還元 − 脱Ｎ反応 − ＤＮase活性 ＋ ＮＰＴase − Ｏ-Ｆテスト（グルコース） Ｏ Ｄ-グルコース、酸 − Ｄ-グルコース、ガス − 生育最適温度 ３０−３７℃ 生育最適ｐＨ ６〜９

【００２４】上記微生物を培養するための培地組成とし
ては、通常この微生物が生育する培地であればなんでも
使用することができる。例えば、炭素源としてグルコー
ス、ガラクトース、フラクトースのような炭水化物、グ
リセロール等のアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ
酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類など
の有機酸、またはそれらの混合物を、窒素源として硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、
酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機
窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。そ
の他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに、
必要に応じてビタミン類を加えてもよい。上記微生物の
培養は常法によればよく、例えばｐＨを５〜９、好まし
くは６.５〜７.０、培養温度は２０〜４０℃、好ましく
は２５〜３７℃の範囲で好気的に１０〜９６時間行うこ
とが好ましい。

【００２５】ラセミ体クロロヒドリンに微生物を作用さ
せて光学活性クロロヒドリンならびに光学活性１,２−
ジオール化合物および／または光学活性３−ヒドロキシ
−γ−ブチロラクトンを得る方法としては、本発明によ
る微生物を１）上記培養方法により得た微生物の培養
液、あるいは２）遠心分離により得た菌体およびその菌
体処理物（菌体破砕物または菌体抽出液）、または３）
それらを常法により固定化したものとし、緩衝液に混合
した微生物菌体混合液に基質を添加する方法等がある。
反応温度は１５〜５０℃が好ましく、反応ｐＨは６〜９
で行うのが好ましい。反応液中の基質濃度は０.１〜１
５％（ｖ／ｖ）が好ましく、基質は初期に一括して添加
してもよいし、分割添加してもよい。反応は通常、攪拌
あるいは振とうしながら行い、反応時間は基質濃度、微
生物菌体量により異なるが、１〜１２０時間で終了する
のがよい。好ましくはガスクロマトグラフィー等の分析
により、生成する光学活性体の光学純度を測定し終点を
決定するのがよく、その生成物の光学純度が最大になっ
たときを終点とする。

【００２６】このようにして反応液中に残存した光学活
性クロロヒドリンならびに光学活性１,２−ジオール化
合物および／または光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチ
ロラクトンは一般的な方法により回収および精製でき
る。例えば、反応液から菌体を遠心分離で取り除いた
後、上清をエバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル等
の溶媒で抽出を行う。抽出液を無水硫酸マグネシウムに
より脱水した後、減圧下にて溶媒を除去し、光学活性ク
ロロヒドリンのシロップを得ることができる。また光学
活性１,２−ジオール化合物が生成する場合はそれらの
混合物として得られる。これらの化合物はさらに蒸溜あ
るいはカラムクロマトグラフィーにより精製してもよ
い。光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが生
成する場合は、菌体を遠心分離により除去した上清を酢
酸エチル等により抽出し、クロロヒドリンあるいは１,
２−ジオールを除去した後、その水層画分を濃縮するこ
とにより３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの粗シロ
ップを得ることができる。あるいは常法により上記水層
画分を活性炭により回収・精製してもよい。さらに活性
炭やシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーによ
り精製してもよい。

【００２７】以下実施例をもって、本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。な
お、実施例中の％は特に記載のない限り（ｗ／ｖ％）で
表す。

【００２８】実施例１ ペプトン，酵母エキス，グリセロールをそれぞれ１.０
％含む栄養培地（pＨ７.２）２.５リッターを入れた５
リッタージャーファーメンター（培養器）を１２１℃，
１５分間、高圧滅菌した。予め供試菌であるシュードモ
ナス sp.OS-K-29株をペプトン，酵母エキス，グリセロ
ールをそれぞれ１.０％含む栄養培地（pＨ７.２）で３
０℃、１６時間振とう培養して種菌を調製し、上記培地
に２％（v／v）量を無菌的に接種した。そして温度３０
℃，通気量１.０Ｌ／min，回転数５００rpmの条件で約
２４時間、通気撹拌培養を行った。培養終了後、培養液
を取り出し遠心分離にて集菌し、２mＭの硫酸マグネシ
ウムを含む２０mＭリン酸緩衝液（pＨ７.２）で３回洗
浄し、休止菌体を調製した。その菌体を１.０％の炭酸
カルシウムを含む同緩衝液１００mlを入れたバッフル付
きの５００ml容三角フラスコにけん濁し、そのけん濁液
に１.０（v／v）のラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキ
シブチロニトリルを加え、３０℃で撹拌しながら９０時
間反応させた。その時の反応液中に残存する４−クロロ
−３−ヒドロキシブチロニトリルをガスクロマトグラフ
ィー（カラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ，６０−８０メッシ
ュ）で分析した結果、その残存率は４０.１％であっ
た。反応終了後、反応液を遠心分離操作により菌体を除
き、ついで約１mlまで濃縮し、酢酸エチルで抽出した。
無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧化で溶媒を除
去し、３８０mgの４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニ
トリルおよび基質に相当する１,２−ジオール３５０mg
を得た。本物質の同定および定量は同ガスクロマトグラ
フィーにより行い、リテンションタイムより確認した。

【００２９】このシロップ中の４−クロロ−３−ヒドロ
キシブチロニトリルをアステック社（Advanced Separat
ion Technologies Inc., NJ, USA）製のキャピラリーカ
ラムＧ−ＴＡ（０.２５mm×３０ｍ）を用いたガスクロ
マトグラフィーにより光学異性体の分析を行った。一
方、１,２−ジオール化合物は無水トリフルオロ酢酸に
よりトリフルオロ化した後、上記ガスクロマトグラフィ
ーにより光学異性体の分析を行った。その結果、回収し
た４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは光学純
度９４.５％eeのＳ体であることが判明した。また、回
収した１,２−ジオールは光学純度４２.２％eeのＲ体で
あることが判明した。なお、上記のガスクロマトグラフ
ィーによる光学異性体の分析条件は以下の通りである。
４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのリテンシ
ョンタイムはＳ体、６４.１分；Ｒ体、６６.５分で、
１,２−ジオールのリテンションタイムはＳ体、１１３.
１分；Ｒ体、１２５.３分であった。 分析条件：カラム温度、１２０℃；検出器温度、２００
℃；キャリアーガス、窒素；流速、０.５ｍｌ／ｍｉ
ｎ；検出器、ＦＩＤ；スプリット比、１００／１。

【００３０】実施例２−７ 基質をラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニト
リルから表１に示す基質に変えた以外は実施例１と同様
の方法で反応を行った。また、得られた種々の化合物を
実施例１と同様の方法で同定と定量分析を行い、光学異
性体の分析についても同様の方法で行った。なお、実施
例３〜５において生成した３−ヒドロキシ−γ−ブチロ
ラクトンは、菌体を除去した上清を等量の酢酸エチルに
よりクロロヒドリンおよび１,２−ジオールを抽出・除
去し、その水層画分を濃縮して３−ヒドロキシ−γ−ブ
チロラクトンの粗シロップを得た。本物質の同定および
定量は実施例１に示した同ガスクロマトグラフィーによ
り行い、リテンションタイムより確認した。このシロッ
プ中の３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度
の測定は、塩化アセチルによりアセチル化した後、実施
例１に示したアステック社製のキャピラリーカラムＧ−
ＴＡを装着したガスクロマトグラフィーにより行った。
３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンのリテンションタ
イムはＳ体、１１.３分；Ｒ体、１２.０分であった。 分析条件：カラム温度、１５０℃；検出温度、２００
℃；キャリアーガス、窒素；流速、０.７ｍｌ／ｍｉ
ｎ；検出器、ＦＩＤ；スプリット比；１００／１。 得られた３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの物性値
は文献値（SyntheticCommunications, 16(2)，pp.183-1
90，1986）とよく一致した。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣl₃, ２５０ＭＨz）, δppm: 2.54
(d, 1H, J=18Hz); 2.79(dd, 1H, J=18Hz, J=6Hz); 3.29
(s, 1H, OH); 4.34(d, 1H, J=10Hz); 4.46(dd, 1H, J=1
0Hz, J=4.5Hz); 4.6-4.7(m, 1H)¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣl₃）, δppm: 177, 76.3, 67.2,
37.7 上記実施例１〜７の生成物およびその収量等を表１に示
す。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【表２】

【００３３】実施例８ ペプトン、酵母エキス、グリセロールがそれぞれ１％か
らなる栄養培地（ｐＨ７.０）２.５リッターを５リッタ
ー容ジャーファメンター（培養器）に仕込み、１２１
℃、１５分間、高圧滅菌を行った。予め供試菌であるシ
ュードモナス sp.DS-K-NR818をペプトン、酵母エキス、
グリセロールをそれぞれ１.０％含む栄養培地（ｐＨ７.
０）で３０℃、１８時間振とう培養して種菌を調製し、
上記培地に２.０％（ｖ／ｖ）量を無菌的に接種した。
そして温度３０℃、通気量０.５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌回転
数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気撹拌培養を行
った。培養終了後、培養液を取り出し遠心分離にて集菌
し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７.２）にて３回洗浄し、休止菌体を調製し
た。その菌体を１.０％の炭酸カルシウムを含む２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）１００ｍｌを入れたバッ
フル付き５００ｍｌ容三角フラスコに懸濁した。懸濁液
に硫酸マグネシウム２ｍＭとなるように調製した。懸濁
液にラセミ体エチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチ
レイトを１.０％（ｖ／ｖ）となるように加え、３０℃
で４０時間反応させた。反応後、反応液中に残存するエ
チル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトをガスク
ロマトグラフィー（カラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ、６０−
８０メッシュ）で分析した。その結果、残存率は４１.
８％であった。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体
を除き、ついで約１.０ｍｌまで濃縮し、酢酸エチルで
抽出した。無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下
で溶媒を除去し、４０６ｍｇのエチル ４−クロロ−３
−ヒドロキシブチレイトを得た。本物質の同定および定
量は同ガスクロマトグラフィーにより行い、リテンショ
ンタイムより確認した。残存していたエチル ４−クロ
ロ−３−ヒドロキシブチレイトをアステック社製のキャ
ピラリーカラムＧ−ＴＡ（０.２５ｍｍ×３０ｍ）を用
いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を
行った。その結果、回収したエチル ４−クロロ−３−
ヒドロキシブチレイトは光学純度９８％ｅｅ以上のＲ体
であった。なお、上記のガスクロマトグラフィーによる
光学異性体の分析条件は以下の通りである。エチル ４
−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトのリテンションタ
イムはＲ体 ３９.５分；Ｓ体 ４１.０分であった。 分析条件：カラム温度、１１０℃；検出器温度、２００
℃；キャリアーガス、窒素；流速、０.７ｍｌ／ｍｉ
ｎ；検出器、ＦＩＤ；スプリット比、１００／１。 なお生成した３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、
菌体を除去した上清を等量の酢酸エチルによりクロロヒ
ドリンを抽出・除去し、その水層画分を濃縮して３−ヒ
ドロキシ−γ−ブチロラクトンの粗シロップを得た。本
物質の同定および定量は実施例３と同様の方法で行い、
光学異性体の分析についても同様の方法で行った。

【００３４】実施例９〜１２ 基質をラセミ体エチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブ
チレイトから表２に示す基質に変える以外は、実施例８
と同様な方法で反応を行った。また、得られた種々の化
合物を実施例８と同様な方法で同定と定量分析を行い、
光学異性体の分析についても同様の方法で行った。上記
実施例８〜１２の生成物および収量等を表２に示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】

【表４】

【００３７】実施例１３ （Ｓ）−３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンと（Ｒ）
−メチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトの製
造 ペプトン、酵母エキス、グリセロールがそれぞれ１％か
らなる栄養培地（ｐＨ７.０）１００ｍｌをバッフル付
き５００ｍｌ容三角フラスコに仕込み、１２１℃、１５
分間、高圧滅菌を行った。予め供試菌であるエンテロバ
クター sp. DS-S-75株をペプトン、酵母エキス、グリセ
ロールをそれぞれ１.０％含む栄養培地（ｐＨ７.０）で
３０℃、２０時間振とう培養して種菌を調製し、上記培
地に２．０％（ｖ／ｖ）量無菌的に接種した。そして温
度３０℃、撹拌条件下で約２４時間、培養を行った。培
養終了後、培養液を取り出し遠心分画にて集菌し、２ｍ
Ｍの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）にて３回洗浄し、休止菌体を調製した。その
菌体を１.０％の炭酸カルシウムを含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７.０）１００ｍｌを入れたバッフル付き
５００ｍｌ容三角フラスコに懸濁した。懸濁液に硫酸マ
グネシウムを２ｍＭとなるように調製した。懸濁液にラ
セミ体メチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイト
を１.０％となるように加え、３０℃で２４時間反応さ
せた。反応後、反応液中に残存するメチル ４−クロロ
−３−ヒドロキシブチレイトをガスクロマトグラフィー
（カラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ，６０−８０メッシュ）で
分析した。その結果、残存率は４８.０％であった。反
応終了後、反応液を遠心分離し、菌体を取り除いた後、
上清を活性炭カラムに付し、アセトンにて溶出した。溶
出液よりアセトンを減圧留去して得られた油状物を蒸留
することにより、３４２ｍｇの（Ｒ）−メチル４−クロ
ロ−３−ヒドロキシブチレイト（沸点７５−８０／１.
５ｍｍＨｇ）と２１４ｍｇの（Ｓ）−３−ヒドロキシ−
γ−ブチロラクトン（沸点１１０−１２０／０.５ｍｍ
Ｈｇ）を油状物として得た。得られたメチル ４−クロ
ロ−３−ヒドロキシブチレイトは光学純度９９％ee以上
のＲ体であった。また得られた３−ヒドロキシ−γ−ブ
チロラクトンを塩化アセチルと反応させて、アセチル化
した後、光学純度を測定した。３−ヒドロキシ−γ−ブ
チロラクトンは光学純度９５.９％eeのＳ体であった。
光学純度の分析は、アステック社製のキャピラリーカラ
ムＧ−ＴＡ（０.２５ｍｍ×３０ｍ）を用いたガスクロ
マトグラフィーにより行った。上記のガスクロマトグラ
フィーによる光学異性体の分析条件は以下の通りであ
る。 メチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトの分析
条件：カラム温度、１１０℃；検出器温度、２００℃；
キャリアーガス、窒素；流速、０.７ｍｌ／ｍｉｎ；検
出器、ＦＩＤ；スプリット比、１００／１。リテンショ
ンタイムはＲ体、１５.５分；Ｓ体、１６.３分。 ３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの分析条件：カラ
ム温度、１５０℃；検出器温度、２００℃；キャリアー
ガス、窒素；流速、０.７ｍｌ／ｍｉｎ；検出器、ＦＩ
Ｄ；スプリット比、１００／１。リテンションタイムは
Ｓ体、１１.３分；Ｒ体、１２.０分。 得られた３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの物性値
は文献値（SyntheticCommunications, 16(2)，pp.183-1
90，1986）とよく一致した。 ［α］_D ²⁰＝−７６.２°（Ｃ＝１.９５、ＥｔＯＨ）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣl₃, ２５０ＭＨz）, δppm: 2.54
(d, 1H, J=18Hz); 2.79(dd, 1H, J=18Hz, J=6Hz); 3.29
(s, 1H, OH); 4.34(d, 1H, J=10Hz); 4.46(dd, 1H, J=1
0Hz, J=4.5Hz); 4.6-4.7(m, 1H)¹³ Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣl₃）, δppm: 177, 76.3, 67.2,
37.7

【００３８】実施例１４〜３２ 基質をラセミ体メチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブ
チレイトから表１に示す基質に変えて、各基質に対して
供試菌株としてエンテロバクター sp. DS-S-75株、キト
ロバクター・フレウンディー DS-S-13株、キトロバクタ
ー・フレウンディー DS-K-40株、バチルス・スペリカス
DS-ID-819株を用いてそれぞれ実施例１３と同様の方法
で反応を行った。また、得られた種々の化合物について
実施例１３と同様の方法で定量分析を行い、光学異性体
の分析についても同様の方法で行った。得られた化合物
の収量と光学純度について表３に示す。得られた３−ヒ
ドロキシ−γ−ブチロラクトンの物性値はいずれの場合
も実施例１３と一致した。上記実施例１３〜３２におけ
る生成物およびその収量等を表３に示す。なお、表３中
の略語は下記の意味を有する。 ＭＨ： メチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイ
ト ＥＨ： エチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイ
ト ＩＰＨ：イソプロピル ４−クロロ−３−ヒドロキシブ
チレイト ＰＨ： プロピル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレ
イト ＢＨ： ブチル ４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイ
ト ＨＬ： ３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン

【００３９】

【表５】

【００４０】

【発明の効果】本発明によればシュードモナス属に属す
る微生物（シュードモナス sp.OS-K-29株またはシュー
ドモナス sp. DS-K-NR818株）、さらに、エンテロバク
ター属（エンテロバクター sp. DS-S-75株）、キトロバ
クター属（キトロバクター・フレウンディー DS-S-13
株、キトロバクター・フレウンディー DS-K-40株）、お
よびバチルス属（バチルス・スペリカス DS-ID-819株）
に属する微生物を利用して一般式［１］のラセミ体クロ
ロヒドリンの一方の光学異性体のみを分解し、他方の光
学異性体を系中に残存させ、また該一方の光学異性体を
脱ハロゲン化して光学活性１,２−ジオールあるいは光
学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンへと変換さ
せ、該残存する他方の光学異性体ならびに生成する光学
活性１,２−ジオールおよび／または光学活性３−ヒド
ロキシ−γ−ブチロラクトンを回収することにより、原
料的に安価で且つ工業的に簡便な方法によって光学活性
クロロヒドリンと光学活性１,２−ジオール化合物およ
び／または光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクト
ンを製造することができる。本発明方法で製造される光
学活性クロロヒドリンならびに光学活性１,２−ジオー
ル化合物および光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラ
クトンは、医薬、農薬、生理活性物質および強誘電性液
晶などの合成中間体として有用な化合物であり、特に、
光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルお
よびそのカルボン酸エステルである光学活性メチル ４
−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトやエチル ４−ク
ロロ−３−ヒドロキシブチレイトなどのＣ４骨格を持つ
化合物は、医薬分野で重要な光学活性カルニチン、４−
クロロ−３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ−２−ピ
ロリジノン、１,２,４−ブタントリオール等の前駆体化
合物として重要である。したがって、本発明はかかる重
要な化合物を安価かつ簡便に提供しうるものであって、
工業的にきわめて有用である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (56)参考文献 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍ ｅｔｒｙ（1992）Ｖｏｌ．３，Ｎｏ. ４，ｐ．521−524 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 41/00 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 ［式中、Ｒ¹は水素原子、Ｒ²は置換または非置換低級ア
   ルキル基（ただしヒドロキシルメチル基を除く）を表わ
   す。］で示されるラセミ体クロロヒドリン化合物に脱ク
   ロル化活性を有する、シュードモナス属に属する菌株、
   エンテロバクター属に属する菌株、キトロバクター属に
   属する菌株およびバチルス属に属する菌株から選ばれる
   １種の菌株の培養液または菌体もしくはその処理物を作
   用させて、光学異性体の一方を分解し、もう一方の光学
   異性体を残存させることを特徴とするクロロヒドリンの
   光学分割方法。
2. 【請求項２】 残存する光学活性クロロヒドリンを回収
   することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 Ｒ²がエチル基、またはシアノ、低級ア
   ルコキシカルボニルおよび低級アルコキシから選ばれる
   基で置換されたメチル基である請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 Ｒ²が低級アルコキシカルボニルメチル
   基である請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 Ｒ²がメトキシカルボニルメチル、エト
   キシカルボニルメチルまたはイソプロポキシカルボニル
   メチルである請求項２に記載の方法。
6. 【請求項６】 使用する菌株がシュードモナス属に属す
   る菌株である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】 使用する菌株がシュードモナス sp. OS-
   K-29株である請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】 使用する菌株がエンテロバクター属、キ
   トロバクター属またはバチルス属に属する菌株である請
   求項４または５に記載の方法。
9. 【請求項９】 光学活性クロロヒドリン化合物と共に下
   記式 【化２】 ［式中、Ｒ³は置換または非置換低級アルキル基であ
   る。］で示される光学活性１,２−ジオール化合物を製
   造する請求項７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 出発化合物のラセミ体クロロヒドリン
    化合物［１］中のＲ²が低級アルコキシカルボニルメチ
    ル基であり、使用する菌株がシュードモナスsp. OS-K-2
    9株(FERM BP-994)であって、光学活性クロロヒドリン
    化合物と共に、下記式 【化３】 ［式中、Ｒ^3'は低級アルコキシカルボニルメチル基であ
    る。］で示される光学活性１,２−ジオールと下記式 【化４】 で示される光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクト
    ンを製造することを特徴とする請求項２に記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ｒ^3'がメトキシカルボニルメチル、エ
    トキシカルボニルメチルまたはイソプロポキシカルボニ
    ルメチルである請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 使用する菌株がシュードモナス sp. D
    S-K-NR818株(FERMBP-5491)である請求項４または５に記
    載の方法。
13. 【請求項１３】 出発化合物であるラセミ体クロロヒド
    リン化合物［１］中のＲ²が低級アルコキシカルボニル
    メチル基であり、使用する菌株がシュードモナス sp. D
    S-K-NR818株(FERM BP-5491)、エンテロバクター sp. D
    S-S-75株(FERM BP-5494)、キトロバクター・フレウン
    ディーDS-S-13株(FERM BP-5492)、キトロバクター・フ
    レウンディーDS-K-40株(FERM BP-5493)、およびバチル
    ス・スペリカスDS-ID-819株(FERM BP-5495)から選ばれ
    る１種であって、光学活性クロロヒドリン化合物と共
    に、下記式 【化５】 で示される光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクト
    ンを製造することを特徴とする請求項２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 出発化合物［１］中のＲ²がメトキシ
    カルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、プロポ
    キシカルボニルメチル、イソプロポキシカルボニルメチ
    ルまたはブチルオキシカルボニルメチルである請求項１
    ３に記載の方法。