KR960004452B1 - 비타민 d 화합물의 제조 방법 - Google Patents

비타민 d 화합물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

비타민 D 화합물의 제조 방법
본 발명은 미생물을 이용하여 히드록시비타민 D 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
유기 합성 방법에 의해 비타민 D 화합물의 1α 및 (또는) 25위치에 직접 히드록실기를 도입시키기는 극히 어려워서 이와 같은 도입예는 아직 보고되지 않았다.
또한, 미생물을 이용한 효소 화학적 방법에 의해 비타민 D 화합물에 직접 히드록실기를 도입하는 방법도 아직까지 보고되지 않았다.
한편, 동물의 장기를 이용한 효소 화학적 방법에 의해 원료 비타민 D 화합물의 1α 및 (또는) 25위치에 직접 히드록실기를 도입하는 것은 종래부터 가능하였다. 즉, 1α 위치에 직접 히드록실기를 도입하는 경우, 닭과 같은 동물의 신장의 균등질 또는 사립체 분획물을 사용하는 방법[Nature, 제230권, 제228페이지(1971년), J. Biolog. Chem. 제247권, 제7528페이지(1972년) 및 Biochemistry, 제25권, 제5512페이지(1986년)참조]이 알려져 있다. 또한, 25위치에 직접 히드록실기를 도입하는 경우, 새앙쥐와 같은 동물로 부터 단리한 간에 비타민 D 화합물을 함유하는 용액을 환류시키는 방법[J. Clin. Invest., 제48권, 제2032페이지(1969년) 및 Biochem. Biophys. Res. Commun., 제66권, 제632페이지(1975년) 참조]또는 새앙쥐와 같은 동물의 간의 균등질을 이용하는 방법[Biochem. Biophys. Res. Commun., 제36권, 제251페이지(1969년) 참조]이 알려져 있다.
그러나, 동물의 장기를 이용한 효소 화학적 방법에는 다량의 동물 신장 또는 간이 필요하고, 그의 제조에 상당한 시간이 소모되므로 비효율적으로, 실용적인 제조법이 되지 못한다.
본 발명자들은 특정 미생물을 이용하여 비타민 D 화합물의 1α 및 (또는) 25위치에 직접 히드록실기를 도입할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비타민 D 화합물을 히드록실화할 수 있는 방선균(Actinomycetales) 균체 또는 이 균체로부터 생산되는 효소를 함유하는 반응 혼합물 중에 1α 또는 25위치에 수소 원자를 갖는 비타민 D 화합물을 가하여, 각각의 수소 원자를 히드록실기로 변환시킴을 특징으로 하는 1α- 또는 25-히드록시비타민 D 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 비타민 D 화합물을 히드록실화할 수 있는 방선균 균체 또는 이 균체로부터 생산되는 효소를 함유하는 반응 혼합물 중에 1α 및 25위치에 수소 원자를 갖는 비타민 D 화합물을 가하여, 그의 수소 원자를 히드록실기로 변환시킴을 특징으로 하는 25-히드록시비타민 D 화합물 또는 1α, 25-디히드록시 비타민 D 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 이하에 서술하는 본 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명에 의하면 1α 또는 25위치에 수소 원자를 갖는 비타민 D 화합물은 각각의 수소 원자가 히드록실기로 전환될 수 있다. 1α 및 25위치에 수소 원자를 갖는 비타민 D 화합물을 사용하는 경우에는, 먼저 25위치의 수소 원자를 히드록실기로 전환시키고, 이어서 1α 위치의 수소 원자를 히드록실기로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 비타민 D 화합물의 1α 및(또는) 25위치에 직접, 1단계로 히드록실기를 도입시키는 방법으로, 비타민 D 화합물은 1α 또는 25위치 이외에 임의의 위치에 임의의 치환체를 함유하여도 좋다. 따라서 본 발명에 있어서 비타민 D 화합물은 예를 들면, 비타민 D2계 및 비타민 D3계의 화합물로서, 그의 17위치 측쇄의 수소 원자 또는 히드록실기가 불소 등의 할로겐원자, 히드록실기, 저급 알킬기 등으로 치환될 수도 있다. 원료 비타민 D 화합물의 1α 또는 25위치가 수소 원자 이외의 기타 치환체인 경우에는 히드록실기인 것이 적합하다. 비타민 D 화합물의 예로는 비타민 D2, 비타민 D3, 1α-히드록시비타민 D3, 1α, 24-디히드록시비타민 D3, 25-히드록시비타민 D3, 25-히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3, 23,25-디히드록시비타민 D3, 25,26-디히드록시비타민 D3, 23,24,25-트리히드록시비타민 D3, 24,24-디플루오로-25-히드록시-26,27-디메틸비타민 D3, 25-히드록시-26,26,26,27,27,27-헥사플루오로비타민 D3등이 있다.
본 발명에 사용되는 방선균으로는 비타민 D 화합물의 1α-및(또는) 25위치에 히드록실기를 도입시키는 능력을 가진 방선균, 예를 들면 악티노마두라(Actinomadura)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 차이니아(Chainia)속, 스트렙토버티실륨(Streptoverticillium)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 악티노플라네스(Actinoplanes)속, 미크로모노스포라(Micromonospora)속, 노카르디아(Nocardia)속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로, 적합하기로는 본 발명자들이 일본국 사이따마현 오미야시의 토양에서 새로이 분리한 균주로서, 미생물의 명칭 및 기호 ＂스토렙토 마이세스 스클레로티알루스 T-JSI(Steptomyces scleroti-alus T-JSI)＂및 미생물 보관 수탁 번호 제1370호(FERM BP-1370)로 공업 기술원 미생물 공업 연구소에 기탁되어 있는 것과, 본 발명자들이 일본국 야마나시현 미나미쓰루궁 도리사와무라의 토양에서 새로이 분리한 균주로서, 미생물의 명칭 ＂스트렙토마이세스 로제오스포루스 A-5797(Streptomyces roseosporus A-5797)＂ 및 미생물 보관 수탁 번호 제1574호(FERM BP-1574)로 공업 기술원 미생물 공업 연구소에 기탁되어 있는 것과, 본 발명자들이 일본국 사이따마현 오미야시의 토양에서 새로이 분리한 균주로서, 미생물의 명칭 ＂노카르디아 아우토트로피카 N-102(Nocardia autotrophica) N-102＂ 및 미생물 보관 수탁 번호 제1573호(FERM BP-1573)로 공업 기술원 미생물 공업 연구소에 기탁되어 있는 것이 있다.
이들 균주의 균학적 성상을 이하에 나타낸다.
a. 스트렙토마이세스 스클레로티알루스 T-JSI
1) 형태
생장 균체는 합성 한천 배지 및 천연 한천 배지상에서 분지화하면서 잘 생장할 수 있다. 기 균체는 이스트-맥이 엑스 한천, 오트밀 한천, 무기염-전분 한천 및 글리세롤-아스파라긴 한천 상에서 빈약하게 발달된다. 기 균체의 분지 방법은 단순 분지법으로 나선상의 포자 연쇄 형태를 갖는다. 포자는 통상 10개 이상의 연쇄를 갖고 표면이 평활이다. 포자의 형상은 원통형으로, 그 크기는 0.57-1.0×0.64-1.4㎛이다. 나선상의 포자 연쇄는 무기염-전분 한천 배지에서 무분별하게 발달된다. 생장 균체에는 균핵이 관찰된다. 또한 이스트 맥아 엑스 한천 배지에서 2주간 배양된 경우에는 포자의 것과 유사한 형태를 갖는 포자의 유착 덩어리가 관찰된다. 편모 포자는 관찰되지 않는다.
2) 배지 상에서의 생육
각종 배지에서 28℃, 14일간 배양시켰을 때의 육안적 관찰 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure kpo00001
3) 생리적 성질
(1) 생육 온도 범위
무기염-전분 한천 상에서 최적 생장 온도는 25°-35℃이다.
10℃이하, 45℃ 이상의 온도 범위에서는 생육하지 않는다.
(2) 생화학적 성질
a) 호기성, 혐기성의 구별 : 호기성
b) 젤라틴의 액화 : 양성
c) 탈지유의 응고 : 음성
d) 탈지유의 펩톤화 : 양성
e) 전분의 가수분해 : 양성
f) 멜라닌 양상의 색소 생성 : 음성
(3) 탄소원의 이용
[프리드햄/고들리브(Pridham/Godlieb) 한천 배지]
이하의 탄소원 모두를 이용한다.
D-글루코오스, D-프럭토오스, 이노시톨, 갈락토오스, 전분, 슈크로오스, 람노오스, D-만니톨, L-아라비 노오스, D-크실로오스, 라피노오스.
이상의 성상으로부터 본 균주가 방선균에 속함이 명백하다. 상기한 성상을 I.P.S., The International Streptomyces project, 버지(Bergey)저의 Manual of Determinative Bacteriology, 제8판(1974년) 및 박스만(Waxman)저의 The Actinomycetes, 제2권(1961년)에 보고되어 있는 균종과 비교한 결과, 본 균주는 스트렙토 마이세스 스클레로티알루스와 가장 유사한 것으로 나타났다.
이상의 결과로서, 본 균주는 스트렙토마이세스 스클레로티알루스의 종과 동일한 종으로 판단하고, 본 균주를 스트렙토마이세스 스클레로티알루스 T-J51로 명명하였다.
b. 스트렙토마이세스 로제오스포루스 A-5797
1) 형태
생장 균체 합성 한천 배지 및 천연 한천 배지 상에서 잘 발달되고, 불규칙적으로 분지된다. 또한 격벽은 관찰되지 않는다. 포자 연쇄는 글리세롤-아스파라긴 한천, 무기염-전분 한천, 오트밀 한천 등에서 무분별하게 형성된다. 현미경으로 관찰하면 기 균체의 분지 방법은 단순 분지로 포자는 직쇄상으로 형성된다. 포자 연쇄는 통상 10개 이상의 포자를 가지고, 배양의 정지상에서는 긴 포자 연쇄가 발달되며, 포자 표면은 평활하다. 포자의 형상은 타원형으로, 그의 크기는 0.67-0.75㎛×1.30-1.58㎛이다. 균핵, 포자낭, 편모 포자는 관찰되지 않는다.
2) 배지 상에서의 생육
각종 배지에서 30℃, 14일간 배양시켰을 때의 육안적 관찰 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure kpo00002
3) 생리적 성질
(1) 생육 온도 범위
오트밀 한천 상에서 최적 생육 온도는 20°-30℃의 범위이다.
10℃이하, 40℃ 이상의 온도 범위에서는 생육하지 않는다.
(2) 생화학적 성질
a) 호기성, 혐기성의 구별 : 호기성
b) 젤라틴의 액화 : 양성
c) 탈지유의 응고 : 음성
d) 탈지유의 펩톤화 : 양성
e) 전분의 가수분해 : 양성
f) 멜라닌 양상의 색소 생성 : 음성
g) 세포벽 유형 : I형
(3) 탄소원의 이용
(프리드햄/고들리브 한천 배지)
이용가능한 것 : D-글루코오스, L-아라비노오스, D-크실로오스
약간 이용가능한 것 : D-프럭토오스, 람노오스
이용 불가능한 것 : 슈크로오스, 이노시톨, 라피노오스, D-만니톨
이상의 성상으로부터 본 균주가 방선균에 속함이 명백하다. 상기한 선상을 I.S.P., The International Streptomyces Project; 버지 저의 Manual of Determinative Bacteriology, 제8판(제1974년) 및 박스만 저의 The Actinomycetes, 제2권(1961년)에 보고되어 있는 균종과 비교한 결과, 본 균주는 스트렙토마이세스 로제오스 포루스와 가장 유사한 것으로 나타났다.
이상의 결과로서, 본 균주는 스트렙토마이세스 로제오스포루스의 종과 동일한 종으로 판단하여 스트렙토마이세스 로제오스포루스 A-5797로 명명하였다.
c. 노카르디아 아우토트로피카 N-102
1) 형태
생장 균체는 합성 한천 배지 및 천연 한천 배지에서 잘 발달하며, 불규칙적으로 분지된다. 격벽은 관찰되지 않는다. 포자 연쇄는 글리세롤 아스파라긴 한천, 무기염-전분 한천, 등에서 무분별하게 형성된다. 현미경으로 관찰하면 기 균체의 분지 방법은 단순 분지로 포자는 직쇄상 포자 연쇄로 형성된다. 포자 연쇄는 통상 3개 이상의 포자를 가지고, 배양의 정지상에서는 긴 포자 연쇄가 발달되며, 포자 표면은 평활하다. 포자의 형상은 원통형으로, 그의 크기는 0.5-0.8㎛×2.5-4.3㎛이다. 균핵, 포자낭 및 편모 포자는 관찰되지 않는다.
2) 배지 상에서의 생육
각종 배지에서 30℃, 14일간 배양시켰을 때의 육안적 관찰 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure kpo00003
3) 생리적 성질
(1) 생육 온도 범위
오트밀 한천 상에서 최적 생육 온도는 20°-30℃의 범위이다.
10℃이하, 40℃ 이상의 온도 범위에서는 생육하지 않는다.
(2) 생화학적 성질
a) 호기성, 혐기성의 구별 : 호기성
b) 젤라틴의 액화 : 음성
c) 탈지유의 응고 : 음성
d) 탈지유의 펩톤화 : 음성
e) 전분의 가수분해 : 음성
f) 멜라닌 양상의 색소 생성 : 음성
g) 질산염 환원능 : 음성
(3) 탄소원의 이용
(프리드햄/고들리브 한천 배지)
이용가능한 것 : D-글루코오스, L-아라비노오스, 슈크로오스, D-크실로오스, L-이노시톨, D-만티톨, D-프럭토오스, 람노오스.
약간 이용가능한 것 : 라피노오스
이상의 성상으로부터 본 균주가 방선균에 속함이 명백하다. 상기한 성상을 I.S.P., The Intermational Streptomyecs Project, 버지 저의 The Actinomycetes, 제2권(1961년)에 보고되어 있는 균종과 비교한 결과, 본 균주는 노카르디아 아우토트로피카와 가장 유사한 것으로 나타났다.
이상의 결과로서, 본 균주는 노카르디아 아우토트로 피카와 동일한 종으로 판단하고, 본 균주는 노카르디아 아우토트로피카 N-102로 명명하였다.
본 발명은 방법은 방선균에 속하는 균주의 균체 또는 이로부터 생산되는 효소를 함유하는 용액 중에서, 기질 비타민 D 화합물을 호기적 조건 하에서 반응시킴으로써 행할 수 있다.
반응에 필요한 방선균의 균체를 얻기 위해서는 호기적 조건 하에서 본 균의 배양을 배지 중에서 행할 수 있다.
배지는 주로 액체 배지를 사용하고, 배지용 탄소원으로서는 글루코오스, 말토오스, 덱스트로오스, 전분, 아라비노오스 및 크실로오스를 단독으로 또는 혼합하여 사용한다. 질소원으로서는 폴리펩톤, 카사미노산, 효모 엑스, 고기 엑스, 콘 스팁 리쿼 및 콩가루 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용한다. 그 외에 본 균주의 생육을 조장하고 1α-및(또는) 25위치에 히드록실기를 갖는 비타민 D 화합물의 생산을 촉진시키기 위해서 유기물 또는 무기염을 필요에 따라서 첨가할 수 있다. 균주의 배양 방법은 교반 배양 등의 호기 배양이 적합하고, pH 6-7.4, 28°-30℃에서 2-8일간 배양한다.
본 발명의 방법에서는 균체를 함유하는 반응 혼합물을 사용할 수 있다. 즉, 배지를 반응 혼합물에 계속 적용한다. 다른 방법으로서, 배양 완료 후 배양에서 얻은 균체를 원심분리 또는 여과에 의해 분리한 후, 반응 혼합물에 적용하기 위해서 완충액 중에 현탁시킨다. 또한, 균체를 초음파 처리하여 얻은 효소를 함유하는 상징액을 반응 혼합물을 적용한다. 이 상징액을 얻기 위해서는 초음파 처리 후 원심분리를 행하는 것이 적합하다. 또한 균체는 광 가교성 수지 프리폴리머, 예를 들면 ENT 3400[상품명 : 간사이 페이트 가부시기가이샤
Figure kpo00004
제품], 우레탄 프리폴리며, 예를 들면 PU-9[상품명, 도요고무 가부시기가이샤(東洋コム(株))제품] 및 - 카라기난 등의 다당류에 고정화한 후 용액에 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 균체를 동결건조한 것을 상기와 동일한 방법으로 사용할 수 있다.
본 발명에서 반응 혼합물에 사용되는 용액의 예로는 상기한 배지는 물론, 트리스-아세트산염, 트리스-염산염, 숙신산 나트륨-숙신산, 숙신산 칼륨-숙신산, 시트르산 나트륨-시트르산, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 인산 나트륨-인산 칼륨, 카코딜산 나트륨-염산, 이미다졸-염산, 붕산 나트륨-붕산 등의 완충액이 있으며, 이는 단독으로 또는 혼합해서 사용할 수 있다. 그 외에 반응 혼합물에는 균주의 생육을 조장하고 목적하는 비타민 D 화합물의 변환을 촉진시키는 세정제, 유기물 및 무기염을 필요에 따라서 첨가할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 전기 균체 또는 효소를 함유하는 반응 혼합물을 사용하는 경우, 진탕 또는 통기 교반 등에 첨가해서 호기 조건 하에 행하는 것이 적합하고, pH 5-8, 20°-37℃에서 5분-96시간 교반 또는 진탕시킨다. 또한, 산소 기류 하에서 반응을 행할 수도 있다. 기질 비타민 D 화합물은 반응 개시시에 적당량을 첨가할 수 있다.
또한, 배지 중의 균체를 함유하는 반응 혼합물을 사용하는 경우에는 기질을 첨가한 후, 상기와 동일한 조건하에서 24 내지 96시간 추가로 배양시켜서 본 반응을 행한다.
1α 및 25위치에 수소 원자를 함유하는 비타민 D 화합물을 기질로 하는 경우에는, 하기한 고속 액체 크로마토그래피 등으로 생성물을 확인해서 반응 시간을 결정하고, 이로써 최종 25-히드록시비타민 D 화합물 또는 1α, 25-디히드록시비타민 D 화합물을 각각 제조할 수 있다.
이 반응에 의해서 제조된 비타민 D 화합물의 단리는 혈액으로부터 비타민 D를 채취하고 단리하는 일반적인 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 반응 완료 후 반응 혼합물을 유기 용액으로 추출시키고, 농축 건조시킨다. 이것을 2-프로판올-n-헥산 등의 적당량 용매에 용해시키고, 원심분리에 의해 불용물을 제거한 후, 실리카겔 순층 컬럼[예를 들면, Zorbax SIL, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니(Du Pont Co.) 제품, 컬럼 크기 4.6mmø×25cm] 또는 실리카겔 역층 컬럼(예를 들면, Zorbax ODS, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품, 컬럼 크기 4.6mmø×25cm)을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 가함으로써 최종 히드록시비타민 D 화합물을 단리시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 비타민 D 화합물의 1α 및(또는) 25위치에 직접 히드록실기를 도입시키는 것이 가능하게 되었다. 즉, 본 발명의 미생물을 사용하는 방법에서는 미생물과 반응 혼합물 등의 제조에 시간이 소모되지 않고, 1단계로 단시간에 히드록실기의 도입을 행하기가 극히 용이하며, 효율적이다.
이하 실시예 및 시험예에 의해 본 발명을 좀더 상세히 설명한다.
[실시예 1]
전분 1%, 말토오스 1%, 덱스트린 1%, 콩가루 1.5%, 고기 엑스 0.3%, 카사미노산 0.5%와 탄산칼슘 0.4%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 스트렙토마이세스 스클레로티 알루스 T-JSI을 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 진탕 배양시켰다. 배양 종료 후 배지를 원심분리해서 균체를 모으고, 이 균체를 15mM 트리스-아세트산염, 25mM 숙신산 나트륨, 2mM 아세트산마그네슘 및 200mM 슈크로오스를 함유하는 pH 7.4의 완충액(이하, 완충액 A로 칭함) 200ml중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 다시 원심분리하여 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액 A 200ml 중에 충분히 교반시키면서 현탁시켰다. 이 현탁액 40ml를 5개의 500ml용 삼각 플라스크에 각각 넣고, 30℃에서 5분간 보온 시켰다. 이 5개의 삼각 플라스크 각각에 에탄올 400μl중에 용해시킨 기질 25-히드록시비타민 D3400μg의 용액을 첨가하고, 30℃에서 45분간 진탕시키면서 반응을 행하였다. 각 삼각 플라스크의 반응 혼합물을 모아서, 염화 메틸렌 1ℓ로 추출시켰다. 염화 메틸렌 층을 40℃ 이하에서 감압하에 농축 건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1 : 9 혼합 용매 7.5ml에 용해시키고, -20℃에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmø×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산=1 : 9
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기[MCPD 3500, 오쓰가 덴시가이샤
Figure kpo00005
제품]로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 15.4분 부군의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmø×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올=1 : 9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰가 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서1α, 25-디히드록시비타민 D3를 200μg 얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-디히드록시비타민 D3[네델란드 소재의 듀파사(Duphar Co.) 제품]의 표품과 고속 액체 크로마토그래피의 보지 시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmø×25cm),자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 258, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[실시예 2]
실시예 1과 유사한 방법으로 행하여 24,25-디히드록시비타민 D3로부터 1α, 24,25-트리히드록시비타민D3를 얻었다.
이 화합물의 경우 실시예 1과 동일한 조건의 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm)에 있어서의 보지 시간은 29.4분이었다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 432(M+), 414(M+-H2O), 396(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 116, 59.
[실시예 3]
실시예 1과 유사한 방법으로 행하여 25-히드록시비타민 D2로부터 1α, 25-디히드록시비타민 D2를 얻었다.
이 화합물은 실시예 1과 동일한 조건의 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm)에 있어서의 보지 시간은 14.4분이었다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 428(M+), 410(M+-H2O), 392(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 116, 59.
[실시예 4}
실시예 1과 유사한 방법으로 행하여 24,24-디플루오로-25-히드록시-26,27-디메틸비타민D3로부터 1α, 25-디히드록시-24,24-디플루오로-26,27-디메틸아민 D3를 얻었다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 480(M+), 287, 269, 251, 152, 134, 116.
[실시예 5]
실시예 1과 유사한 방법으로 행하여 25-디히드록시-26,26,26,27,27,27-헥사플루오로비타민 D3로부터 1α, 25-디히드록시-26,26,26,27,27,27-헥사플루오로비타민D3를 얻었다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 524(M+), 287, 269, 251, 152, 134, 116.
[실시예 6]
글루코오스 1.5％, 콩가루 1.5%, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화나트륨 0.5%와 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 스트랩토마이세스 로제오스포루스 A-5797을 백금 루프로 접종하고, 30℃에서 48시간 교반 진탕 배양시켰다. 배양 종료 후 배지를 원심 분리해서 균체를 모으고, 이 균체를 15mM 트리스-아세트산염, 25mM 숙신산 나트품, 2mM 아세트산마그네슘을 함유하는 pH7.4의 완충액(이하, 완충액 B로 칭함) 200ml 중에 현탁시켜서 스트랩토마이세스 로제오스포루스 A-5797의 균체 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 다시 원심분리하여 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액 B 200ml 중에 충분히 교반시키면서 현탁시켰다. 이 현탁액 40ml를 5개의 500ml용 삼각플라스크에 각각 넣고, 30℃에서 5분간 보온시켰다. 이 5개의 삼각 플라스크 각각에 에탄올 100μl중에 용해시킨 기질 25-히드록시비타민 D3200μg의 용액을 첨가하고, 30℃에서 90분간 진탕시키면서 반응을 행하였다. 반응 혼합물을 모아서, 염화 메틸렌 1l로 추출시켰다. 염화메틸렌 층을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1:9 혼합 용매 7.5ml에 용해 시키고, -20℃에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산=1 : 9
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 15.4분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음 조건 하에 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산=1 : 9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-디히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토그래피의 보지 시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 258, 251, 152, 134, 129, 116, 59.
[실시예 7]
글루코오스 1.5%, 콩가루 1.5%, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화나트륨 0.5%와 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 노카르디아 아우토트로피카 N-102를 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 진탕 배양시켰다. 배양 종료 후 배지를 원심분리해서 균체를 모으고, 이 균체를 완충액 B 200ml 중에 현탁시켜서 노카르디아 아우토트로피카 N-102의 균체 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 다시 원심분리하여 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액 B 200ml중에 충분히 교반시키면서 현탁시켰다. 이 현탁액40ml를 5개의 500ml용 삼각 플라스크에 각각 넣고, 30℃에서 5분간 보온시켰다. 이 5개의 삼각 플라스크 각각에 에탄올 100μl중에 용해시킨 기질 25-히드록시비타민 D3200μg의 용액을 첨가하고, 30℃에서 45분간 진탕시키면서 반응을 행하였다. 각 삼각 플라스크의 반응 혼합물을 모아서, 염화 메틸렌 1l로 추출시켰다. 염화 메틸렌 층을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축 건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1 : 9 혼합 용매 7.5ml에 용해시키고, -20℃에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고 생성된 상징액을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축시킨 후, 다음 조건 하에 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산=1 : 9
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 15.4분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 조건 하에 고속 액체 크로마토그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올=1 : 9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정. 용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-디히드록시비타민 D3를 100μg얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-디히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지 시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax : 265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 258, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[실시예 8]
전분 1%, 말토오스 1%, 덱스트린 1%, 콩가루 1.5%, 고기 엑스 0.3%, 카사미노산 0.5%와 탄산칼슘 0.4%를 함유하는 pH7.0의 무균 액체 배지 500ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 스트렙토마이세스 스클레로티알루스 T-JS1을 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 교반시키면서 진탕 배양시켰다. 배양 종료 후 배지를 원심분리해서 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액 A 200ml중에 현탁시켰다. 이 균체 현탁액을 다시 원심분리하여 균체를 모으고, 어어서 이 균체를 완충액 A 200ml 중에 충분히 교반시키면서 현탁시켰다. 이 현탁액 40ml를 5개의 500ml용 삼각 플라스크에 각각 넣고, 30℃에서 5분간 보온시켰다. 이 5개의 삼각 플라스크 각각에 에탄올 100μl 중에 용해시킨 기질 1α-히드록시비타민 D3200μg의 용액을 첨가하고, 30℃에서 90분간 교반시키면서 반응을 행하였다. 각 반응 혼합물을 모아서, 염화 메틸렌 1ℓ 추출시켰다. 염화 메틸렌 층을 40℃이하에서 감압 하에 농축건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1 : 9 혼합용매 7.5㎖에 용해시키고, -20℃에서 3시간 방치하였다. 이용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃이하에서 감압하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산 =1 : 9
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정. 용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 15.4분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-디히드록시비타민 D3를 20μg얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-디히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[실시예 9]
글루코오스 1.5%, 콩가루 1.5, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화나트륨 0.5%와 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 스트랩토마이세스 로제오스포루스 A-5797을 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 교반시키면서 진탕배양시켰다. 배양 종료 후 배지를 원심분리해서 균체를 모으고, 이 균체를 완충액 B 200ml 중에 현탁시켜서 스크랩토마이세스 로제오스로루프 A-5797의 균체 현탁액을 얻었다. 이 균체 현탁액을 다시 원심분리하여 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액 A 200ml 중에 충분히 교반시키면서 현탁시켰다. 이 현탁액 40ml를 5개의 500ml용 삼각 플로스크에 각각 넣고, 30℃에서 5분간 보온시켰다. 이 5개의 삼각 플라스크 각각에 에탄올 100μl 중에 용해시킨 기질 1α-히드록시비타민 D3200μg의 용액을 첨가하고, 30℃에서 180분간 교반시키면서 반응을 행하였다. 각 삼각 플라스크의 반응 혼합물을 모아서, 염화 메틸렌 1ℓ로 추출시켰다. 염화 메틸렌 층을 40℃이하에서 감압 하에 농축 건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1 : 9 혼합 용매 7.5ml에 용해시키고, -20℃에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃이하에서 감압하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피( Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산 =1 : 9
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시 가이샤 제품)로 측정. 용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 15.4분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-디히드록시비타민 D3를 50μg얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-디히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지 시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[실시예 10]
글루코오스 1.5%, 콩가루 1.5%, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화나트륨 0.5%와 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 노카르디아 아우토트로피카 N-102를 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 교반시키면서 진탕 배양시켰다. 배양 종료 후 배지를 원심분리해서 균체를 모으고, 이 균체를 완충액 B 200ml중에 현탁시켜서 노카르디아 아우토트로피카 N-102의 균체 현탁액을 얻었다. 이 균체 현탁액을 다시 원심분리하여 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액 B 200ml중에 충분히 교반시키면서 현탁시켰다. 이 현탁액 40ml를 5개의 500ml용 삼각 플라스크에 각각 넣고, 30℃에서 5분간 보온시켰다. 이 5개의 삼각 플라스크 각각에 에탄올 100μl중에 용해시킨 기질 1α-히드록시비타민 D3200μg의 용액을 첨가하고, 30℃에서 90분간 교반시키면서 반응을 행하였다. 각 삼각 플라스크의 반응 혼합물을 모아서, 염화 메틸렌 1ℓ추출시켰다. 염화 메틸렌 층을 40℃이하에서 감압하에 농축 건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산 1 : 9 혼합 용매 7.5ml에 용해시키고, -20℃에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃이하에서 감압하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산 =1 : 9
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 15.4분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시가이샤 제품)로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-디히드록시비타민 D3를 350μg얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-디히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지 시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[실시예 11]
상기 실시예 8과 유사한 방법으로 행하여 1α, 24-디히드록시비타민 D3로 부터 1α, 24, 25-트리히드록시비타민 D3을 얻었다.
이 화합물은 실시예 1과 동일한 조건의 고속 액체 크로마토 그래피에 의한 보지 시간이 29.4분이었다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 432(M+), 414(M+-H2O), 396(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 116, 59.
[실시예12]
글루코오스 1.5%, 콩가루 1.5%, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화나트륨 0.5%와 탄산칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 노카르디아 아우토트로피카 N-102를 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 진탕 배양시켰다. 대수증식기 중에 있는 노카르디아 아우토트로피카 N-102의 배지에 에탄올 250μl중에 용해시킨 기질 비타민 D35mg의 용액 및 Tween-80 0.5ml를 첨가하고, 이어서 이 혼합물을 30℃에서 48시간 진탕 배양시켰다. 반응 종료 후 배지를 염화 메틸렌 200ml로 추출시켰다. 염화메틸렌 층을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1 : 9 혼합 용매 3ml에 용해시키고, -20℃ 에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃이하에서 감압 하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산 =3 : 22
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기[Waters M990, 일본 밀리포어사(日本ミリホ一社)제품]로 측정.
용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 4.0분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(Waters M990, 일본 밀리포어사 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 8.0분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 25-히드록시비타민 D3를 500μg얻었다. 이것은 시판 중인 25-히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지 시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 400(M+), 382(M+-H2O), 271, 253, 136, 118, 59.
[실시예 13]
글루코오스 1.5%, 콩가루 1.5%, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화나트륨 0.5%와 탄산칼슘 0.2%와 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 5개의 500ml용 삼각 플라스크 각각에 노카르디아 아우토트로피카 N-102를 1백금 루프로 접종시키고, 30℃에서 48시간 교반시키면서 진탕 배양시켰다. 대수 증식기 중에 있는 노카르디아 아우토트로피카 N-102의 배지에 에탄올 250μl중에 용해시킨 기질 비타민 D35mg의 용액 및 Tween-80을 첨가하고, 이어서 이 혼합물을 30℃에서 60분간 교반 진탕 배양시켰다. 반응 종료 후 배지를 염화 메틸렌 200ml로 추출시켰다. 염화메틸렌 층을 40℃ 이하에서 감압 하에 농축건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 n-헥산의 1 : 9 혼합 용매 3ml에 용해시키고, -20℃ 에서 3시간 방치하였다. 이 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거하고, 생성된 상징액을 40℃이하에서 감압 하에 농축시킨 후, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산 =3 : 22
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(Waters M990, 일본 밀리포어사제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 14.5분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(Waters M990, 일본 밀리포어사 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-디히드록시비타민 D3를 500μg얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-디히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[실시예 14]
상기 실시예 12와 유사한 방법으로 행하여 비타민 D2로부터 25-히드록시비타민 D2를 얻었다.
이 화합물은 실시예 12와 동일한 조건하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL,컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 271, 269, 136, 118, 59.
[실시예 15]
실시예 13와 유사한 방법으로 행하여 비타민 D2로부터 1α, 25-디히드록시비타민 D2를 얻었다.
이 화합물은 실시예 13과 동일한 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax SIL,컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O), 380(M+-2H2O), 287, 269, 251, 152, 134, 129, 116, 59.
[실시예 16]
(1) 글루코오스 1.5%, 콩가루 1.5%, 콘 스팁 리쿼 0.5%, 염화 나트륨 0.5%와 탄산 칼슘 0.2%를 함유하는 pH 7.0의 무균 액체 배지 50ml를 넣은 500ml용 삼각 플라스크 노카르디아 아우토트로피카 N-102를 1백금 루프로 접종시키고, 28℃에서 96시간 교반시키면서 진탕 배양시켰다.
(2) 2°내지 8℃에서 다음과 같은 처리를 행하였다. (1)항에서 얻은 균체를 10mM 트리스-아세트산염, 2mM 아세트산마그네슘, 7mM 2-메르캅토에탄올 및 20% 글리세롤을 함유하는 pH7.4의 완충액(이하, 완충액 C로 칭함) 200ml 중에 현탁시켰다. 이 균체 현탁액을 원심 분리하여 균체를 모으고, 이어서 이 균체를 완충액(100mmol중에 다시 현탁시켰다. 이 현탁액을 분산기(
Figure kpo00006
: 상품명, IKA-WERK사 제품)로 2분간 처리해서 균체를 음파처리하고, 이 음파처리한 균체를 이어서 원심분리하여 상징액을 얻었다. 얻은 상징액을 폴리에틸렌 글리콜 6000을 최종 농도가 25%가 되도록 교반시키면서 적가하여 이것을 용해시킨 후 30분간 4℃에서 방치하였다. 이어서 이 용액을 원심분리하고, 상징액을 제거한 후, 조효소 침전물을 얻었다.
(3) (2)에서 얻은 조 효소 침전물을 약 500mg 단백질 함량에 상당하는 양으로 20mM 트리스-아세트산, 70mM 니코틴아미드, 2mM 아세트산 마그네슘, 100mM NADP, 5mM ATP 및 6mM 글루코오스-인산을 함유하는 pH 7.4의 용액에 첨가하였다. 생성되는 효소 반응액 15m1에 글루코오스-인산염 데히드로게나제 5단위 및 150μl의 에탄올 중에 용해시킨 비타민 D33mg을 첨가하고, 이 혼합물을 28℃에서 30분간 진탕시키고, 효소 반응을 행하였다.
(4) 클로로포름과 메탄올의 1 : 2 혼합 용매 45ml를 (3)의 효소 반응 용액에 첨가하여 반응을 정지시키후, 반응 생성물을 블라이 앤드 데이어 (Bligh and Deyer)법으로 추출시켰다. 추출 후 얻은 클로로포름층을 40℃이하에서 감압 농축 건조시킨 후, 즉시 2-프로판올과 N-헥산의 1 : 9 혼합 용매 250ml에 용해시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 2-프로판올 : n-헥산=3 : 22
컬럼 온도 : 25℃
용출 속도 : 1.5ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시 가이샤 제품)로 측정.
(5) (4)의 고속 액체 크로마토 그래피 용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 4.0분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 덴시 가이샤 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 8.0분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 25-히드록시비타민 D3를 116μg얻었다. 이것은 시판 중인 25-히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지시간(Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 400(M+), 382(M+-H2O), 271, 253, 136, 118, 59.
(6) (4)의 고속 액체 크로마토 그래피의 용출 후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 14.5분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃이하에서 감압 농축시키고, 다음과 같은 조건 하에 고속 액체 크로마토 그래피(Zorbax ODS, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm, 미합중국 소재의 듀우판 캄파니 제품)에 가하였다.
용출 용매 : 물 : 메탄올 : 1 :9
컬럼 온도 : 40℃
용출 속도 : 1.0ml/분
검출 : Photodiode 배열 검출기(MCPD 3500, 오쓰까 가이샤 제품)로 측정.
용출후 비타민 D 화합물의 자외부 흡수 패턴과 일치하는 보지 시간 5.6분 부근의 피크 분획물을 모아서, 40℃ 이하에서 질소 가스를 치환시키면서 감압 농축 건조시켜서 1α, 25-히드록시비타민 D3를 20μg얻었다. 이것은 시판 중인 1α, 25-히드록시비타민 D3(네델란드 소재의 듀파사 제품)의 표품과 고속 액체 크로마토 그래피의 보지 시간 (Zorbax SIL, 컬럼 크기 4.6mmψ×25cm), 자외선 흡수 스펙트럼, 질량 스펙트럼 분열 패턴이 완전히 일치하였다.
최대 자외부 흡수 : λmax=265nm(에탄올)
EI-MS(m/z) : 416(M+), 398(M+-H2O),380(M+-2H2O),287, 269, 251, 152, 134, 129, 116, 111, 59.
[시험예]
1α, 25-디히드록시비타민 D3의 시험관 내 라디오리셉터 분석법
닭의 태아의 장관으로 부터 제조한 1α, 25-디히드록시비타민 D3리셉터[아마사 쇼유 가부시기가이샤
Figure kpo00007
제품]를 10mM 트리스 -아세트산염, 0.5mM EDTA, 1mM 디티오트레이톨 및 10mM 몰리 브덴산 나트륨 10mM을 함유하는 pH7.4의 완충액에 현탁시켜서 이것을 리셉터용액(프로테인 약 0.5mg/l으로 사용하였다.
이 현탁액에 50%에탄올 중에 용해시킨 피검약[1α, 25-디히드록시비타민 D3의 표품(네델란드 소재의 듀파사 제품)] 및 실시예 1에서 얻은 4.6mmψ×25cm α, 25-디히드록시비타민 D3화합물 3μl 및 10μl를 각각 10-9-10-5M의 농도가 되도록 첨가하였다. 이어서 여기에3H-1α, 25-디히드록시비타민 D3(약 4μM)을 첨가하고, 0℃에서 3시간 인큐베이션해서 반응을 행하였다. 리셉터 결합물과 비결합물의 분리는 탄소법을 사용하였다. 특이적 결합 함량은 상기 반응에 의해 얻은 총 결합량으로 부터 10μM 1α, 25-디히드록시 비타민 D3존재 하에 얻은 비결합적 결합량을 감하여 구하였다. 피검약의 결합능을 리셉터 1α, 25-디히드록시 비타민 D3의 결합을 50%억제하는 농도 (IC50)로 표시하였다.
Figure kpo00008
이상, 실시예 1,6,7,8,13 및 16에서 얻어진 1α, 25-디히드록시비타민 D3는 시험관 내 라디오리셉터 분석법에서 시판 중인 표품과 동일한 활성을 나타내었다.

Claims (10)

  1. 비타민 D 화합물을 히드록실화할 수 있는 방선균 균체 또는 이로부터 생성되는 효소를 함유하는 반응 혼합물 중에 1α 또는 25 위치에 수소 원자를 함유하는 비타민 D 화합물을 첨가하여, 각각의 수소 원자를 히드록실기로 변환시킴을 특징으로 하는 1α-또는 25-히드록시비타민 D 화합물의 제조 방법.
  2. 비타민 D 화합물을 히드록실화할 수 있는 방선균 균체 또는 이로부터 생산되는 효소를 함유하는 반응 혼합물 중에 1α 및 25위치에 수소 원자를 함유하는 비타민 D 화합물을 첨가하여 각각의 수소 원자를 히드록실기로 변환시킴을 특징으로 하는 25-히드록시비타민 D 화합물 또는 1α, 25-디히드록시비타민 D 화합물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스속 또는 노카르디아속인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스속 또는 노카르디아속인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스 스클레로티알루스 T-JS1인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스 스클레로티알루스 T-JS1인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스 로제오스포루스 A-5797인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스 로제오스로푸스 A-5797인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 방선균이 노카르디아 아우토트로피카 N-102인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 방선균이 노카르디아 아우토트로피카 N-102인 방법.
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