JP2663294B2

JP2663294B2 - ビタミンｄ類の製造方法

Info

Publication number: JP2663294B2
Application number: JP1052609A
Authority: JP
Inventors: 貞文大村; 冗二佐々木; 明子三上; 一敏溝上
Original assignee: MERUSHAN KK
Current assignee: MERUSHAN KK
Priority date: 1989-03-04
Filing date: 1989-03-04
Publication date: 1997-10-15
Anticipated expiration: 2012-10-15
Also published as: JPH02231089A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒドロキシビタミンＤ類の微生物を利用す
る製造方法に関する。

従来の技術有機化学的方法によりビタミンＤ類の１α及び／又は
25位に直接水酸基を導入することは極めて困難で、その
例は未だ報告されていない。

一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により原料の
ビタミンＤ類の１α及び／又は25位に直接水酸基を導入
することは、従来から可能であった。すなわち、１α位
の直接水酸基を導入する場合、ニワトリなどの動物の腎
のホモジネートやミトコンドリア画分を用いる方法［ネ
ーチャー（Nature）、第230巻、第228頁（1971年）、ジ
ャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J.Bi
o.Chem.），第247巻、第7528頁（1972年）、バイオケミ
ストリー（Biochemistry）、第25巻，第5512頁（1986年
など］が知られている。また、25位に直接水酸基を導入
する場合、ラットの動物の単離した肝臓にビタミンＤ類
を含む溶液を灌流させる方法［ジャーナルオブクリ
ニカルインベスティゲーション（J,Clin.Invest.），第
48巻，第2032頁（1969年）、バイオケミカルアンド
バイオフィジカルリサーチコミュニケーション（Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.），第66巻，第632頁（1975
年）］やラットなどの動物の肝のホモジネートを用いる
方法［バイオケミカルアンドバイオフィジカルリ
サーチコミュニケーション（Biochem.Biophys.Res,Co
mmun.），第36巻，第251頁（1969年）］が知られてい
る。

発明が解決しようとする課題しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方法で
は、多量の動物の腎又は肝が必要であり、しかもその調
製に手間がかかり、非効率的で実用的な製造法ではな
い。

本発明は、より容易な操作による１α−及び／又は25
−ヒドロキシビタミンＤ類を得る方法を提供することを
目的とする。

課題を解決するための手段本発明者らは、特定の微生物を利用することにより、
ビタミンＤ類の１α及び／又は25位に直接水酸基を導入
できることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（Am
ycolata）属に属する放線菌菌体又はその産生する酵素
を含有する溶液中に１α又は25位に水素原子を有するビ
タミンＤ類を加えて、それぞれその水素原子を水酸基に
変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ
類又は25−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法、並びに
ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（Amcolata）属に
属する放線菌菌体又はその産生する酵素を含有する溶液
中に１α及び25位に水素原子を有するビタミンＤ類を加
えて、その水素原子を水酸基に変換することを特徴とす
る１α−ヒドロキシビタミンＤ類又は１α,25−ジヒド
ロキシビタミンＤ類の製造方法である。すなわち、本発
明によれば、１α位又は25位に水素原子を有するビタミ
ンＤ類は、それぞれその水素原子が水酸基に変換され
る。また、１α及び25位に水素原子を有するビタミンＤ
類は、まずその25位水素原子が水酸基に変換され、次い
で、１α位が水酸基に変換される。

本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の１α及び／又は
25位に直接、１工程で水酸基を導入する方法であり、１
α又は25位以外にいずれの置換基を有していてもよい。
従って、本発明においてビタミンＤ類とは、たとえば、
ビタミンD₂系及びビタミンD₃系の化合物であり、その17
位側鎖の水素原子又は水酸基がフッ素などのハロゲン原
子、水酸基、低級アルキル基などで置換されていてもよ
い。原料のビタミンＤ類の１α又は25位は、これが水素
原子以外のときは水酸基であること好ましい。それら
は、たとえば、ビタミンD₂、ビタミンD₃、１α−ヒドロ
キシビタミンD₃、１α,24−ジヒドロキシビタミンD₃、2
5−ヒドロキシビタミンD₃、25−ヒドロキシビタミン
D₂、24,25−ジヒドロキシビタミンD₃、23,25−ジヒドロ
キシビタミンD₃、25,26−ジヒドロキシビタミンD₃、23,
24,25−トリヒドロキシビタミンD₃、24,24−ジフルオロ
−25−ヒドロキシ−26,27−ジメチルビタミンD₃、25−
ヒドロキシ−26,26,26,27,27,27−ヘキサフルオロビタ
ミンD₃などである。

本発明に使用されるアミコラタ（Amycolata）属に属
する放線菌菌体でとは本発明者らが埼玉県大宮市の土壌
により新たに分離したものであり、微生物の名称及び記
号「アミコラタ・サツルネアＡ−9783（Amycolata satu
rnea A−7983）」及び「微生物の保管受託番号第2307号
（FERM BP−2307）」として工業技術院微生物工業研究
所に寄託されている。本菌株の菌学的性状を以下に示
す。

１）形態栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよ
く発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められな
い。胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地及びスタ
ーチ無機寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観
察すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で胞子は直
鎖状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認めら
れ、培養の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑であ
る。胞子の形状は円筒形で、その大きさは0.5〜0.8×2.
0〜4.0μｍである。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察
されない。

２）培地上での生育状態各種培地で30℃、14日間培養したときの肉眼的観察結
果を第１表に示す。

３）生理的性質（１）生育温度範囲栄養寒天培地上において20〜30℃の範囲で良好に生育
する。

10℃以下、40℃以上の温度範囲では生育しない。

（２）生化学的性質ａ）好気性、嫌気性の区別；好気性ｂ）ゼラチンの液化；陰性ｃ）脱脂乳の凝固；陰性ｄ）脱脂乳のペプトン化；陽性ｅ）スターチの加水分解；陰性ｆ）メラニン様色素生成；陽性ｇ）硝酸還元能；陽性（３）炭素源の利用（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地）利用する:D−グルコース，シュクロース,D−キシロー
ス,L−イノシトール,D−マニトール,D−フラクトースわずかに利用する:L−アラビノース，ラムノース，ラフ
ィノース（４）細胞壁のミコール酸含有の有無無（５）細胞膜のリン脂質タイプ P III 以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らか
であり、上記諸性状をI.S.P.「インターナショナル・ス
トレプトマイセス・プロジェクト」，バージー著「マニ
ュアル・オブ・ディターミナティブ・バクテリオロジ
ー」第８版（1974年）及びワックスマン著「ジ・アクチ
ノミセテス」第２巻（1961年）及び「インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・シスマティック・バクテリオロ
ジー」第36巻，第29〜37ページ（1986年）に報告されて
いる多くの既知菌種と比較した結果、本菌株はアミコラ
タ・サツルネアに最も近い性状を示していた。

以上の結果より、本菌株はアミコラタ・サツルネアと
種を同じくするものと判断し、本菌株はアミコラタ・サ
ツルネアＡ−7983と命名した。

本発明の方法は、放線菌の菌体又はその産生する酵素
を含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下
で反応させることによって行うものである。

反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気条件
下で本菌の培養を培地中で行う。

培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコ
ース，マルトース，デキストロース，スターチ，アラビ
ノース．キシロースを単独又は混合して用いる。窒素源
としては、ポリペプトン，カザミノ酸，酵母エキス，肉
エキス，コーンスチープリカー及びソイビーンミールな
どを単独又は混合して用いる。その他、本菌株の生育を
助け、１α−及び／又は25−ヒドロキシビタミンＤ類に
生産を促進する有機物及び無機塩を必要により添加する
ことができる。培養方法は振とう培養、通気撹拌培養な
どの好気培養が適しており、pH6〜7.4、28〜30℃で２〜
８日間培養する。

この培養により得られた菌体を含有する溶液を、１α
−及び／又は25−ヒドロキシビタミンＤ類を生産する反
応に用いる。すなわち、培養中の菌体を含む培養液をそ
のまま用いるか、培養終了後、遠心分離又は濾過により
分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また、培養後に
得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除い
た溶液を用いることができる。さらにまた、菌体は光架
橋性樹脂プレポリマー、たとえばENT3400［商品名；関
西ペイント（株）製］などや、ウレタン・プレポリマ
ー、たとえばPU−９［商品名；東洋ゴム（株）製］など
やκ−カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液に
添加してもよい。

また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同様に用
いることもできる。

本発明において用いられる反応溶液は、前記培地を用
いて培養した培養液であるか、あるいはトリス−酢酸、
トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク
酸カリウム−コハク酸、クエン酸ナトリウム−クエン
酸、リン酸塩（カリウム塩、ナトリウム塩など）、カコ
ジル酸ナトリウム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ線
−ホウ砂などの緩衝液を単独又は混合したものである。
その他、溶液には、目的のビタミンＤ類の生産を促進す
る界面活性剤、有機物及び無機塩を必要により添加する
ことができる。

本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液中で振
とう操作、通気撹拌操作などに付して好気条件下で行う
ことが適しており、pH5〜８、20〜37℃で５分間〜96時
間撹拌振とうする。また、酸素気流下で反応することが
できる。基質のビタミンＤ類は撹拌振とう開始時に適量
添加する。

また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は、基
質ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で24〜96時間培
養して本反応を行う。

なお、１α及び25位に水素原子を有するビタミンＤ類
を原料とする場合、後記の高速液体クロマトグラフィー
等で生成物を確認して反応時間をきめ、25−ヒドロキシ
ビタミンＤ類又は１α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類
をそれぞれ製造することができる。

これらの反応により製造されたビタミンＤ類を単離す
るには、血液中からビタミンＤ類を採取する一般的な方
法に準じて行えばよい。たとえば、反応終了後、反応液
を有機溶媒により抽出し、濃縮乾固する。これを２−プ
ロパノール−ｎ−ヘキサンなどの適当な溶媒に溶解し、
遠心分離により不溶物を除いた後、シリカゲル順層カラ
ム（たとえば、ゾルバックスSIL,米国デュボン社製）を
用いた高速液体クロマトグラフィー又はシリカゲル逆層
カラム（たとえば、ゾルバックスODS,米国デュボン社
製）を用いた高速液体クロマトグラフィーに付すること
により目的のヒドロキシビタミンＤ類を単離することが
できる。

また、セファデックスLH−20（ファルマシア社製、ス
ウェーデン）等を用いた分配クロマトグラフィーやロー
バーカラム（メルク社製、スイス）等を用いたシリカゲ
ルクロマトグラフィーによっても目的のヒドロキシビタ
ミンＤ類を単離することができる。

発明の効果本発明の方法により、ビタミンＤ類の１α及び／又は
25位へ直接水酸基を導入することが可能になった。すな
わち、本発明の微生物を用いる方法では、微生物や反応
溶液などの調製に手間がかからず、しかも１段階で短時
間に行うことができ、極めて容易かつ能率的である。

実施例以下、実施例及び試験例をあげて本発明をさらに詳細
に説明する。

実施例１グルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コーンス
チープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5％、炭酸カルシ
ウム0.2％、pH7.0の無菌液体培地（以下、培地Ａと称
す）50mlの入った500mlの三角フラスコ１本にアミコラ
タ・サツルネアＡ−7983株を１白金耳接種し、28℃で48
時間撹拌振とう培養した。この培養液を上記と同じ無菌
液体培地100mlの入った500mlの三角フラスコ20本のそれ
ぞれに2mlずつ接種し、28℃で48時間撹拌振とう培養し
た。対数増殖期中にあるこのアミコラタ・サツルネアＡ
−7983のそれぞれのフラスコ培養液中に500μのエタ
ノールに溶解した基質ビタミンD₃20mg及び0.2mlのツイ
ーン80を添加し、これを再び28℃で72時間撹拌振とう培
養した。培養終了後、この培養液をブライ・アンド・ダ
イヤー（Bligh ＆ Dyer）法で抽出し、クロロホルム層
を40℃以下で減圧乾固後、直ちにクロロホルム:n−ヘキ
サン＝65:35の混合溶媒10mlに溶解し、セファデックスL
H−20（ファルマシア社製、スウェーデン）クロマトグ
ラフィーに付した。

溶出溶媒：クロロホルム:n−ヘキサン＝65:35,（溶出量
約２）カラム容積;400ml 生成物の確認はシリカゲル（キーゼルゲル60F254,メ
ルク社製，スイス）の薄層クロマトグラフィーで行なっ
た。標準化合物として市販の25−ヒドロキシビタミンD₃
（デュファー社製，オランダ）をこれに用いた。

展開溶媒：クロロホルム：メタノール＝30:1紫外線吸収
にてスポットを検出。

溶出後、25−ヒドロキシビタミンD₃を含む画分を集め
た。こをを40℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮
乾固した後、直ちに２−プロパノール:n−ヘキサン＝3:
47の混合溶媒2mlに溶解し、同じ混合溶媒で調製したシ
リカゲル・カラム（ローバーカラム・サイズB,リクロプ
レップSi60:商品名、メルク社製、スイス）に吸着させ
た。

このシリカゲル・カラムを調製したものと同じ混合溶
媒１でこれを溶出し、25−ヒドロキシビタミンD₃溶出
画分をシリカゲル（キーゼルゲル60F254,メルク社製，
スイス）の薄層クロマトグラフィーで確認し、25−ヒド
ロキシビタミンD₃を含む画分を集め、窒素ガス気流下で
濃縮乾固した。

この濃縮乾固した画分に0.5mlのｎ−ヘキサンを加
え、更に窒素ガスで封入した後、０℃以下で２日間静置
し、白色板状結晶として25−ヒドロキシビタミンD₃40mg
を得た。これは市販の25−ヒドロキシビタミンD₃（デュ
ファー社製，オランダ）の標品と液体クロマトグラフィ
ー［（１）ゾルバックスSIL及び（２）ゾルバックスOD
S、デュボン社製、米国］の保持時間、紫外線吸収スペ
クトラム、マススペクトル開裂パターン、¹³C−NMRスペ
クトラム及び¹H−NMRスペクトラムが完全に一致した。

（１）ゾルバックスSIL液体クロマトグラフィーカラム
サイズ;4.6mmφ×25mm, 溶出溶媒;2−プロパノール:n−ヘキサン＝3:22, カラム温度;25℃，溶出速度;1.5ml/分，フォトダイオー
ドアレイ検出器（ウォーターズM990,日本ミリポア・リ
ミテッド社製）で測定。

標品の保持時間;4.0分（２）ゾルバックスODS液体クロマトグラフィーカラム
サイズ;4.6mmφ×25cm, 溶出溶媒；水：メタノール＝1:9, カラム温度;40℃，溶出速度;10ml/分，フォトダイオー
ドアレイ検出器（ウォーターズM990,日本ミリポア・リ
ミテッド社製）で測定。

標品の保持時間;8.0分（３）最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール） EI−MS（m/z）： 400（M⁺）,382（M⁺−H₂O）,271,253,136,118,59 実施例２培地A50mlの入った500mlの三角フラスコ１本にアミコ
ラタ・サツルネアＡ−7983株を１白金耳接種し、28℃で
48時間撹拌振とう培養した。次に内容量５の培養ジャ
ーを用いて、培地A3に前記種培養液50mlを接種し、28
℃で48時間撹拌振とう培養した。対数増殖期中にあるこ
のアミコラタ・サツルネアＡ−7983のそれぞれのフラス
コ培養液中に15mlのエタノールに溶解した基質ビタミン
D₃600mg及び15mlのツイーン80を添加し、これを再び28
℃で72時間撹拌振とう培養した。培養終了後、この培養
液を濾過し、菌体と濾液に分け、菌体はブライ・アンド
・ダイヤー法で抽出し、濾液はクロロホルム１で抽出
した。菌体と濾液それぞれのクロロホルム抽出画分を集
め約２とした後、窒素ガス気流下、40℃以下で減圧濃
縮し、約20mlとした。これにｎ−ヘキサン10mlを加え、
セファデックスLH−20（ファルマシア社製、スウェーデ
ン）クロマトグラフィーに付した。

溶出溶媒；ジクロロメタン:n−ヘキサン＝70:30,（溶出
量約２）カラム容積;400ml 生成物の確認はシリカゲル（キーゼルゲル60F254,メ
ルク社製，スイス）の薄層クロマトグラフィーで行なっ
た。標準化合物として市販の25−ヒドロキシビタミンD₃
（デュファー社製，オランダ）をこれに用いた。

展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝30:1紫外線吸収
にてスポットを検出。

溶出後、25−ヒドロキシビタミンD₃を含む画分を集め
た。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮
乾固した後、直ちに２−プロパノール:n−ヘキサン＝3:
47の混合溶媒3mlに溶解し、同じ混合溶媒で調製したシ
リカゲル・カラム（ローバーカラム・サイズB25mmφ×3
10mm,リクロプレップSi60:商品名、メルク社製、スイ
ス）に吸着させた。

このシリカゲル・カラムを調製したものと同じ混合溶
媒１でこれを溶出し、25−ヒドロキシビタミンD_D溶出
画分をシリカゲル（キーゼルゲル60F254,メルク社製，
スイス）の薄層クロマトグラフィーで確認し、25−ヒド
ロキシビタミンD₃を含む画分を集め、窒素ガス気流下で
濃縮乾固した。

この濃縮乾固した画分に1.0mlのｎ−ヘキサンを加
え、更に窒素ガスで封入した後、０℃以下で２日間静置
し、白色板状結晶として25−ヒドロキシビタミンD₃100m
gを得た。これは市販の25−ヒドロキシビタミンD₃（デ
ュファー社製，オランダ）の標品と液体クロマトグラフ
ィー［ゾルバックスSIL及びゾルバックスODS、デュボン
社製、米国］の保持時間、紫外線吸収スペクトラム、¹H
−NMRスペクトラム及び¹³C−NMRスペクトラムが完全に
一致した。

最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール） EI−MS（m/z）： 400（M⁺）,382（M⁺−H₂O）,271,253,136,118,59 実施例３培地A50mlの入った500mlの三角フラスコ５本それぞれ
にアミコラタ・サツルネアＡ−7983株を１白金耳接種
し、28℃で72時間撹拌振とう培養した。培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体を集め、この菌体を15mMトリス
−酢酸、25mMコハク酸ナトリウム及び2mM酢酸マグネシ
ウムからなるpH7.4の緩衝液（以下、緩衝液Ｂと称す）2
00mlに懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそれぞれ40m
lずつ分注し、28℃で５分間保温した。その三角フラス
コ５本のそれぞれに400μのエタノールに溶解した400
μｇの基質25−ヒドロキシビタミンD₃を添加し、28℃で
45分間撹拌振とうした。各三角フラスコの反応液を集
め、塩化メチレン400mlで抽出し、塩化メチレン層を40
℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール:n−ヘキ
サン＝3:22の混合溶媒2mlに溶解し、−20℃で一夜放置
した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得
た。この上清液を40℃以下で減圧下濃縮し、高速液体ク
ロマトグラフィー［ゾルバックスSIL,米国デュボン社
製］に付した。

カラムサイズ;4.6mmφ×25cm, 溶出溶媒;2−プロパノール:n−ヘキサン＝3:22, カラム温度;25℃，溶出速度;1.5ml/分，フォトダイオー
ドアレイ検出器（ウォーターズM990,日本ミリポア・リ
ミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間14.5分付近のピークの画分を集めた。次にこ
れを40℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラフィ
ー［ゾルバックスODS,米国デュボン社製］に付した。

カラムサイズ;4.6mmφ×25cm, 溶出溶媒；水：メタノール＝1.9, カラム温度;40℃，溶出速度;1.0ml/分，フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズM990,日
本ミリポア・リミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。これを4
0℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固するこ
とにより、１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃を200μｇ
得た。これは市販の１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃
（デュファー社製，オランダ）の標品と液体クロマトグ
ラフィーの保持時間［ゾルバックスSIL］、紫外線吸収
スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。

最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール） EI−MS（m/z）： 416（M⁺）,398（M⁺−H₂O）,380（M⁺−2H₂O）,287,269,2
51,152,134,129,116,111,59 また、１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃リセプター
を用いた本調製標品のラジオリセプターアッセイ試験の
結果は１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃（デュファー
社製，オランダ）の標品のそれと一致した（試験例に示
す）。

実施例４培地A50mlの入った500mlの三角フラスコ５本それぞれ
にアミコラタ・サツルネアＡ−7983株を１白金耳接種
し、28℃で72時間撹拌振とう培養した。その三角フラス
コ５本のそれぞれに400μのエタノールに溶解した400
μｇの基質25−ヒドロキシビタミンD₃を添加し、28℃で
45分間撹拌振とうした。各三角フラスコの反応液を集
め、塩化メチレン400mlで抽出し、塩化メチレン層を40
℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール:n−ヘキ
サン＝3:22の混合溶媒2mlに溶解し、−20℃で一夜放置
した。これを遠心分離して不溶性画分を除き、上清液を
得た。この上清液を40℃以下で減圧下濃縮し、高速液体
クロマトグラフィー［ゾルバックスSIL,米国デュボン社
製］に付した。

カラムサイズ;4.6mmφ×25cm, 溶出溶媒;2−プロパノール:n−ヘキサン＝3:22, カラム温度;25℃，溶出速度;1.5ml/分，フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズM990,日
本ミリポア・リミテッド社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間14.5分付近のピークの画分を集めた。次にこ
れを40℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラフィ
ーゾルバックスODS,米国デュホン社製］に付した。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。これを4
0℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固するこ
とにより、１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃を150μｇ
得た。これは市販の１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃
（デュファー社製，オランダ）の標品と液体クロマトグ
ラフィーの保持時間［ゾルバックスSIL］、紫外線吸収
スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。

最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール） EI−MS（m/z）： 416（M⁺）,398（M⁺−H₂O）,380（M⁺−2H₂O）,287,269,2
51,152,134,129,116,111,59 実施例５培地A50mlの入った500mlの三角フラスコ５本それぞれ
にアミコラタ・サツルネアＡ−7983株を１白金耳接種
し、28℃で72時間撹拌振とう培養した。その三角三フラ
スコ５本のそれぞれに400μのエタノールに溶解した5
00μｇの基質１α−ヒドロキシビタミンD₃を添加し、28
℃で60分間撹拌振とうした。各三角フラスコの反応液を
集め、塩化メチレン400mlで抽出し、塩化メチレン層を4
0℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール:n−ヘ
キサン＝3:22の混合溶媒2mlに溶解し、−20℃で一夜放
置した。これを遠心分離して不溶性画分を除き、上清液
を得た。この上清液を40℃以下で減圧下濃縮し、高速液
体クロマトグラフィー［ゾルバックスSIL,米国デュボン
社製］に付した。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間5.6分付近のピークの画分を集めた。これを4
0℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固するこ
とにより、１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃を500μｇ
得た。これは市販の１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃
（デュファー社製，オランダ）の標品と液体クロマトグ
ラフィーの保持時間［ゾルバックスSIL］、紫外線吸収
スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。

最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール） EI−MS（m/z）： 416（M⁺）,398（M⁺−H₂O）,380（M⁺−2H₂O）,287,269,2
51,152,134,129,116,111,59 実施例６実施例３と同様にして、24,25−ジヒドロキシビタミ
ンD₃から１α,24,25−トリヒドロキシビタミンD₃を得
た。

（１）ゾルバックスSIL液体クロマトグラフィーカラムサイズ;4.6mmφ×25cm, 溶出溶媒;2−プロパノール:n−ヘキサン＝1:9, カラム温度;25℃，溶出速度;1.5ml/分，フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズM990,日
本ミリポア・リミテッド社製）で測定，生成標品の保持時間;29.4分（２）最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール）（３）EI−MS（m/z）： 432（M⁺）,414（M⁺−H₂O）,396（M⁺−2H₂O）,287,269,2
51,152,134,116,59 実施例７実施例３と同様にして、25−ヒドロキシビタミンD₂か
ら１α,25−ジヒドロキシビタミンD₂を得た。

（１）ゾルバックスSIL液体クロマトグラフィーカラムサイズ;4.6mmφ×25cm, 溶出溶媒;2−プロパノール:n−ヘキサン＝1:9, カラム温度;25℃，溶出速度;1.5ml/分，フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズM990,日
本ミリポア・リミテッド社製）で測定，生成標品の保持時間;14.4分（２）最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール）（３）EI−MS（m/z）： 428（M⁺）,410（M⁺−H₂O）,392（M⁺−2H₂O）,287,269,2
51,152,134,116,59 実施例８実施例３と同様にして、24,24−ジフルオロ−25−ヒ
ドロキシ−26,27−ジメチルビタミンD₃から１α,25−ジ
ヒドロキシ−24,24−ジフルオロ−26,27−ジメチルビタ
ミンD₃を得た。

（１）最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール）（２）EI−MS（m/z）： 480（M⁺）,287,269,251,152,134,116 実施例９実施例３と同様にして、25−ヒドロキシ−26,26,26,2
7,27,27−ヘキサフルオロビタミンD₃から１α,25−ジヒ
ドロキシ−26,26,26,27,27,27−ヘキサフルオロビタミ
ンD₃を得た。

（１）最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール）（２）EI−MS（m/z）： 524（M⁺）,287,269,251,152,134,116 実施例10 実施例１と同様にして、ビタミンD₂から25−ヒドロキ
シビタミンD₂を得た。

（１）最大紫外部吸収： λ_max＝265nm（エタノール）（２）EI−MS（m/z）： 412（M⁺）,394,271,253,136,118,59 試験例１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃リセプターを用いた
標品ラジオリセペターアッセイ試験ニワトリの胎児の腸管より調製された１α,25−ジヒ
ドロキシビタミンD₃リセプター［ヤマサ醤油（株）］を
10mMトリス塩酸、0.5mM EDTA、1mMジチオスレイトー
ル、10mMモリブデン酸ナトリウム、pH7.4の緩衝液に懸
濁させ、これをリセプター溶液（プロティン約0.5mg/m
l）として使用した。

このリセプター溶液に、50％エタノールに溶解した被
検薬［１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃の標品（デュ
ファー社製，オランダ）］及び実施例３で得られた１
α,25−ジヒドロキシビタミンD₃を３又は10μ、10^-9
〜10^-5Mになるように添加した。次いで³H−１α,25−ジ
ヒドロキシビタミンD₃（約0.4μＭ）を添加し、０℃で
３時間インキュベーションして反応を行った。リセプタ
ー結合物と非結合物の分離はチャコール法を用いた。特
異的結合量は、上記反応より得られる総結合量から10μ
Ｍの１α,25−ジヒドロキシビタミンD₃存在下に得られ
る非特異的結合量を差し引いて求めた。非検薬の結合能
は、リセプターへの³H−１α,25−ジヒドロキシビタミ
ンD₃の結合を50％阻害する濃度（IC₅₀）示した。

結果を下記第２表に示した。

以上、実施例３で得られた１α,25−ジヒドロキシビ
タミンD₃は、ラジオリセプターアッセイ試験において、
市販の標品と同一の活性を示した。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（Am
ycolata）属に属する放線菌菌体又はその産生する酵素
を含有する溶液中に１α又は25位に水素原子を有するビ
タミンＤ類を加えて、それぞれその水素原子を水酸基に
変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ
類又は25−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法
【請求項２】ビタミンＤ類を水酸化するアミコラタ（Am
ycolata）属に属する放線菌菌体又はその産生する酵素
を含有する溶液中に１α及び25位に水素原子を有するビ
タミンＤ類を加えて、その水素原子を水酸基に変換する
ことを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ類又は25
−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造方法