JPH02202867A - α，β―不飽和アゾキシ化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はα、β−不飽和アゾキシ化合物に関する。

従来の技術 本発明の化合物に近似の化合物としては、エライオマイ
シン（Ｅｌａｉｏｒｎｙｃｉｎ）　［ザ・ジャーナル・
才ブ・アメリカン・ケミカル・ソザエテイー（ＴｈｅＪ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）　、第７８巻、第３２２９ペー
ジ（１９５６年）］及び］ＬＬ−ＢＨ８７２αザ・ジャ
ーナル・才ブ・オーガニック・ケミストリー（Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）　。

第３７巻、第６号、第９０２ページ（１９７２年）］が
知られている。

発明が解決しようとする課題 しかしながら、これらの化合物に肝障害に対する保護作
用があるという報告はない。

本発明の目的は肝障害に対する保護作用を有する新たな
化合物を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明者らは新規な生理活性物質の探索を目的として多
数の菌株を土壌より分離し、その菌株の培養物について
種々検討した結果、ある種の菌株が肝障害に対する保護
作用を有する新規な化合物を生産することを見いだし、
本発明を完成した。

すなわち、本発明は、式 （式中、Ｒは水素原子又は水酸基を示す。）で表される
α、β−不飽和アゾキシ化合物である。

本発明の化合物を生産する菌株は、本発明者らが新潟県
刈羽郡高柳町の土壌より新たに分離した菌株であり、微
生物の名称「ストレプトミセス・ミシオネンシス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍ１ｓｉｏｎｅｎｓｉｓ）　Ａ
６４５０　、及び微生物寄託番号「微工研菌寄第１０４
９５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４９５）　Ｊとして工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。この菌株
を培養して本発明の化合物が得られるが、以下、式（Ｉ
）においてＲ＝Ｈの化合物をＭ　Ｈ−０７１、式（Ｉ）
においてＲ＝ＯＨの化合物をＭ　Ｈ−０７２という。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

１）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則に分岐する。また隔壁はは認められない
。胞子はグリセリン・アスノくラギン寒天培地、イース
ト・麦芽寒天培地及びオートミール寒天培地などで栄養
菌糸より伸長した気菌糸の先端に良好に形成される。顕
微鏡で観察すると、胞子形成菌糸の分枝方法は単純分枝
で、胞子は螺旋状を呈する。胞子は通常１０個以上連鎖
し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で、その大
きさは０．９５〜１．０４μｍ　Ｘ　１．２５〜１．４
５μｍである。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察され
ない。

２）培地上での生育状態 各種培地上で２８°Ｃ１１４日間培養したときの肉眼的
観察結果を第１表に示す。

第　　１　　表 ３）生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・麦芽エキス培地で１８〜４３°Ｃの範囲で良
好に生育する。１０°Ｃ以下、４８°Ｃ以上の温度範囲
では生育しない。

（２）生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ〉ゼラチンの
液化；　　　　　陽性 Ｃ〉脱脂乳の凝固；　　　　　　陰性 ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陽性 ｅ）スターチの加水分解；　　　陽性 ｆ〉メラニン様色素生成；　　　陰性 ｇ）細胞壁の型；　　　　　　　Ｉ型 （３）炭素源の利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地上）利用する：Ｌ−
アラビノース、Ｄ−グルコース。

Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース。

イノシトール、Ｄ−マンニット。

利用しない：シュクロース、Ｌ−ラムノース。

ラフィノース 以上の性状から本菌株がストレプトミセス属に属するこ
とは明らかであり、上記諸性状をＩ　Ｓ。

Ｐ、′ジ・インターナショナル・ストレプトミセス・プ
ロジェクト」、バージ−著「マニュアル・オブ・ディタ
ーミナティブ・バクテリオロジー」第８版（１９７４年
）及びワックスマン著１ジ・アクチノミセテス」第２巻
（１９６１年）に報告されている多くの既知菌株と比較
した結果、本菌株はストレプトミセス・ミシオネンシス
に最も近い性状を示していた。

以上の結果より本菌株はストレプトマイセス・ミシオネ
ンシスと種を同じくするものと判断し、本菌株はストレ
プトマイセス・ミシオネンシスＡ６４５０と命名した。

本発明の化合物の生産は、大略一般の発酵生産物を生産
する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地で本菌株を
好気的条件下で培養することにより行なう。培地は主と
して液体培地を用い、炭素源としてはグルコース、廃糖
蜜、スターチなどを単独又は混合して用いる。窒素源と
しては肉エキス、酸Ｎエキス、大豆粉、ポリペプトンな
どを単独または混合して用いる。その他、本菌株の生育
を助けＭ　Ｈ−０７１及びＭ　Ｈ−０７２の生産を促進
する有機物及び無機塩を必要により添加することができ
る。消泡剤としては、アデカノール、シリコンなどを用
いることができる。

培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気培養が
適しており、ｐＨ４〜８．２４〜３０°Ｃで３〜６日間
、望ましくはｐＨ６〜７．２５〜２８℃で４日間培養す
る。

この培養により生産されたＭ　Ｈ−０７１及びＭＨ０７
２を単離するには発酵生産物を採取する一般的な方法に
準じて行えばよい。Ｍ　Ｈ−０７１及びＭＨ−０７２は
主に培養上清中に見いだされるので、例えば次の方法が
効果的である。

すなわち、培養終了後、遠心分離又は濾過により分離し
た培養上清からＭ　Ｈ−０７１及びＭ　Ｈ−０７２を吸
着剤に吸着許せ、低級アルコール、アセトンなどの有機
溶媒でＭ　Ｈ−０７１及びＭ　Ｈ−０７２を溶出する。

溶出液を濃縮してシロップ状とし、再度、クロロホルム
低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒に溶解し、シ
リカゲルやＯＤＳを用いたカラムクロマトグラフィー及
び高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、Ｍ　
Ｈ−０７１及びＭＨ０７２を精製、単離することができ
る。

発明の効果 本発明の化合物は、後記試験例からも明らかなように肝
障害に対する強力な保護作用を有する。

実施例 次に、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

（実施例１） （１）グルコース２％、オートミール２％、肉エキス０
．３％、食塩０．３％、炭酸カルシウム０．３％、硫酸
第二鉄０．０４％、塩化マンガン０．０４％からなるｐ
Ｈ７の無菌液体培地にストレプトミセス・ミシオネンシ
スＡ−６４５０株を接種し、２８°Ｃで９６時間回転培
養し種培養液とした。

次に、内容量５０ｊ２のジャーファーメンタ−を用いて
、種培養と同じ組成の無菌培地３０１に前記種培養液５
００屁を接種し、２８°Ｃで９６時間撹拌通気培養した
。

培養終了後、３基分９０Ｉｌを遠心分離機で上澄液と菌
体に分離した。得られた上澄液をＨＰ−２０（商品名、
三菱化成社製）の５！カラムに通過吸着させた。水５ｆ
１．でカラムを洗浄後、メタノールＩＦＩで溶出し、こ
れを濃縮し１！の濃縮液とした。この濃縮液を酢酸エチ
ル１！で３回抽出し、酢酸エチル層を合わせ、無水硫酸
すトリウムで乾燥後濃縮乾固し１２．３ｇのシロップを
得た。このシロップをクロロホルム２Ｍに溶解し、クロ
ロホルムで調製したシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー［ワコーゲルＣ−２００（商品名；和光紬薬社製）］
の１！カラムに吸着させた。クロロホルム３１で洗浄後
、クロロホルム−メタノール（９９：１〜９８：２）で
溶出させた両分を集め、次いで、クロロホルム−メタノ
ール（９０：１０）で洗浄後、クロロホルム−メタノー
ル（６０：４０）で溶出させた両分を集めて濃縮し、シ
ロップＡ　８７５ｍｇ及びシロップＢ３．７ｇを得た。

（２）上記（１）で得られたシロップＡ　８７５ｍｇを
メタノール５−に溶解し、以下の条件で行った中圧液体
カラムクロマトグラフィーの試料とした。

カラムサイズ４６φＸ　３５０ｍｍ 担体　　　　　　ＯＤＳシリカゲル［ＦｕｊｉｇｅｌＲ
Ｑ−３プレバツクドカラム （商品名、富士ゲル社製）］ 溶媒組成　　　４５％メタノール、５５％水流速　　　
　　　Ｉ　Ｅｏｎｅ　／　ｍｉｎ検出波長　　　　２３
０ｎｍ 装置　　　　　　草野科学ＫＰ−６Ｈ 保持時間２１５〜２５５分の画分を分取し濃縮後、シロ
ップ９．８ｍｇを得た。このシロップをメタノール０、
５ｎ！！に溶解し、以下の条件で行った高速液体クロマ
トグラフィーの試料とした。

カラムサイズ’　　　１０ｊ　Ｘ　２５０ｍｍ担体　　
　　　　ＯＤＳシリカゲル［ＹＭＣ−ｐａｃｋＡＱ−３
２３（商品名、山村科学 研究所社製コ 溶媒組成　　　３５％メタノール、６５％水流速　　　
　　　４．５［ＩＬｅ／ｍｉｎ検出波長　　　　２３０
ｎｍ 装置　　　　　　Ｗａｔｅｒｓ、６０００Ａ型保持時間
３０〜３１分の画分を分取し、Ｍ　Ｈ−０７１３ｍｇを
得た。

（実施例２） 実施例１（１）で得られたシロップＢ３．７ｇをメタノ
ール１５ｎ！！に溶解し、以下の条件で行った中圧液体
カラムクロマトグラフィーの試料とした。

カラムサイズ’　　　４６Ｊ　Ｘ　３５０ｍｍ担体　　
　　　　ＯＤＳシリカゲル［ＦｕｊｉｇｅｌＲＱ−３プ
レパツクドカラムコ 溶媒組成　　　３５％メタノール、６５％水流速　　　
　　　１５＋＋！！　／　ｍｉｎ検出波長　　　　２３
０ｎｍ 装置　　　　　　草野科学ＫＰ−６Ｈ 保持時間８２．５〜９５．０分の画分を分取し濃縮後、
シロップ１０３．２ｍｇを得た。このシロップをメタノ
ール１ｄに溶解 体クロマトグラフ カラムサイズ′ 担体 溶媒組成 流速 検出波長 装置 し、以下の条件で行った高速液 イーの試料とした。

２０Ｊ　Ｘ　２５０ｍｍ ０ＤＳシリカゲル［ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＡＱ−３２３］ ２０％メタノール、８０％水 １５ａｅ　／　ｍｉｎ ３０ｎｍ Ｗａｔｅｒｓ、　Ｍ２Ｏ３型 第２表 保持時間３０〜４２分の画分を分取し、Ｍ　Ｈ−０７２
１，４＋ｎｇを得た。

これらのＭ　Ｈ−０７１及びＭ　Ｈ−０７２の理化学的
性質を第２表に示した。

※　ＣＩマススペクトル測定による また、Ｍ　Ｈ−０７１及びＭ　Ｈ−０７２の紫外部及び
可視部吸収スペクトル（メタノール中で測定）ヲそれぞ
れ第１図及び第５図に、赤外線吸収スペクトル（ニート
法で測定）をそれぞれ第２図及び第６図に、’Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトル（重クロロホルム中４００Ｍ１（ｚで測定
）をそれぞれ第３図及び第７図に、”Ｃ−ＮＭＲスペク
トル（重クロロホルム中１００ＭＨｚで測定）をそれぞ
れ第４図及び第８図に示した。

（試験例） 初代培養肝細胞保護作用 （１）中村らの方法［蛋白質・核酸・酵素、別冊第２４
巻、第５７〜６３ページ（１９８１年）コを用いてラッ
トの分離肝細胞を調製した。

（２）前培養 分離肝細胞は、１０％仔牛血清、１００ＩＵ／ｍｇペニ
シリン、１００■／−ストレプトマイシン、１０−’Ｍ
デキサメサゾン及び１０−”Ｍインシュリンを含むＷｉ
ｌｌｉａｍのＥ培地（ＰＨ７，４＞で５　Ｘ　１０’ｃ
ｅｌｌ／　ｎ！！に希釈し、１２穴デイツシユ（直径２
２．３ｍｍ　、コースタ社）へ１　ｍｉ！、　／　ｗｅ
ｌｌで播き、均一に分散させて、炭酸ガスインキュベー
ター（３７°Ｃ，５％Ｃｏ、／９５％空気、ファーマ社
製）で１．５時間培養した。

（３）ガラクトサミンと被験化合物の添加・培養ガラク
トサミン（０，５ｎ＋Ｍ）を上記培地に溶解し、ガラク
トサミン培地とした。被験化合物は、ジメチルスルホキ
シド１％に溶解した後、ガラクトサミン培地と混合して
試料液とした。前培養後、培地を試料液に交換しく０．
５ｍｅ　／　ｗｅｌｌ）、更に２０時間培養した。なお
、コントロールは被験化合物を加えずにジメチルスルホ
キシドのみを添加した。それを１回の測定の最初と最後
に置き、コントロール１及び２とした。

（４）　Ｇ　Ｐ　Ｔ活性測定 培養後、培地を０．３ｄずつサンプリングし、ＧＰＴ活
性を日立７１２型自動分析装置にて測定した。

（９算出式 下記式を用いて、ＧＰＴ漏出抑制率を算出した。

上記方法によるＭ　Ｈ−０７１及びＭ　Ｈ−０７２の肝
保護作用の検討結果を第３表に示した。

第　　３　　表 第５図はメタノール中（６，０ＸＩＯ−Ｉ′Ｍ＞で測定
したＭ　Ｈ−０７２の紫外部及び可視部吸収スペクトル
、第６図はニート法によるＭ　Ｈ−０７２の赤外線吸収
スペクトル、第７図は重クロロホルム中４００ＭＨｚで
測定したＭ　Ｈ−０７２の’Ｈ−ＮＭＲスペクトル、第
８図は重クロロホルム中１００ＭＨｚで測定したＭＨ０
７２の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素原子又は水酸基を示す。）で表される
   α，β−不飽和アゾキシ化合物。