JPH01193284A

JPH01193284A - 生理活生物質ｐｉ−０８類

Info

Publication number: JPH01193284A
Application number: JP63018977A
Authority: JP
Inventors: Akira Kawashima; 朗川嶋; Yuko Yoshimura; 吉村　祐子; Michio Yamagishi; 山岸　三千男; Kunio Kamigoori; 神郡　邦男; Taku Mizutani; 卓水谷; Sadafumi Omura; 大村　貞文
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-01-29
Filing date: 1988-01-29
Publication date: 1989-08-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は医薬の分野で有用な新規生理活性物質ＰＩ−０
８類に関する。

［従来の技術］本発明の生理活性物質ＰＩ−０８類に類似の化合物とし
てはビネオマイシンＡ　、　（Ｖｉｎｅｏｍｙｃｉｎ　
Ａ　＋　）［ザジャーナルオプアンチバイオティックス
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃｓ）、第３０巻、第１１号、第９０８頁（１９７７年
）、ケミカルファーマシューティカルオンブリテイン（
Ｃｈｅａｐ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕ↓１）。

第３２巻、第１１号、第４３５０頁（１９８４年）］及
びウルダマイシン（Ｕｒｄａｍｙｃｉｎ）　［ザジャー
ナルオプアンチバイオティックス、第３９巻、第１２号
、第１６５７頁（１９８６年）］が知られている。

［発明が解決しようとする問題点］本発明の目的は、血小板凝集に対して強い抑制作用を有
し、かつ制癌作用を有する新規な物質を提供することに
ある。

［問題点を解決するための手段］本発明者らは、新規な生理活性物質の探索を目的として
多数の菌株を土壌より分離し、その菌株の培養物につい
て種々検討した結果、ある種の菌株が血小板凝集に対す
る強い抑制作用及び制癌作用を有する新規な物質を生産
することを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、式［式中、Ｘは下記構造式で示されるＡ、Ｂ及びＣからな
る群より選ばれる基のいずれか一つであり、Ｙは下記構
造式で示されるＤ又はＥのどちらかの基である。但し、
ＹがＤのときＸはＡである。

基Ｂ基Ｃコで示される生理活性物質ＰＩ−０８類である。

本発明の生理活性物質ＰＩ−０８類を生産する菌株は、
本発明者が埼玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌株
であり、微生物の表示１ストレプトマイセス・マテンシ
スＡ　−６６２１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ−ｙｃｅｓ　ｍａ
ｔｅｎｓｉｓ　Ａ　−６６２１）Ｊ、及び微生物受託番
号「微工研条寄第１４２２号（ＦＡＲＭ　ＢＰ　−１４
２２）　Ｊとして工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

１）形態栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則に分枝するが通常は隔壁を有しない０泊
子はオートミール寒天培地、グリセリン・アスパラギン
寒天培地、スターチ無機塩培地などで中程度に形成され
る。顕微鏡で観察すると、気菌糸はよく分枝した栄養菌
糸より伸長し形成されその分枝方法は単純分枝で胞子は
開放ラセン状に形成されるが、まれにはループ状も認め
られる。胞子は通常１０個以上の連鎖が認められ表面は
とげ状である。胞子の形状は円筒形で、その太ききは０
．６〜０．９Ｘ　Ｏ，８〜１．２μｍである。菌核、砲
子のう、べん毛胞子は観察されない。砲子柄の着生位置
は気菌糸上である。

２）培地上での生育状態各種培地上に３０℃で１４日間培養したときの肉眼的観
察結果を第１表に示す。

［３］生理的性質（１）生育温度範囲オートミール寒天培地上において２５〜３７℃の範囲で
良好に生育する。

１０°Ｃ以下、４０°Ｃ以上の温度範囲では生育しない
。

（２）生化学的性質ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化；　　　　　陰性Ｃ）脱詣乳の凝固；　　　　　　陰性ｄ）脱詣乳のペプトン化；　　　陽性ｅ）スターチの加水分解；　　　陽性ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性Ｏ）炭素源の利用（ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地）利用する＝Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース。

Ｌ−ラムノースわずかに利用する：イノシトール、Ｄ−マンニット利用しない：シュクロース、ラフィノース以上の性状か
ら本菌株が放線菌に属することは明らかであり、上記諸
性状を１．Ｓ、Ｐ、’ジ・インターナショナル・ストレ
プトマイセス・プロジェクト」、バージ−著「マニュア
ル・才ブ・ディターミナテイブ・バクテリオロジー」第
８版（１９７４年）及びワックスマン著「ジ・アクチノ
マイセス」第２巻（１９６１年）に報告されている多く
の既知菌種と比較した結果、本菌株はストレプトマイセ
ス・マテンシス、マルガリッタ・ベレタアンドテンバル
（５ｔｒｅｐｔｏｎ１１ｙｃｅｓ　ｍａｔｅｎｓｉｓ　
、　Ｍａｒｇａｌｉｔａ　Ｂｅｒｅｔｔａａｎｄ　１’
ｉｎ＋ｂａｌ）に最も近い性状を示していた。

以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・マテン
シス、マルガリッタ・ベレタアンドテンバルと種を同じ
くするものと判定し、本菌株をストレプトマイセス・マ
テンシスＡ−６６２１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍ
ａｔｅｎｓｉｓ　Ａ　−６６２１）と命名した。

本発明の生理活性物質ＰＩ−０８類の生産は、大略一般
の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を
含む培地で本菌株を好気的条件下で培養することにより
行なう。

培地は主として液体培地を用い、次素源としてはグルコ
ース、シュクロース、廃糖蜜、スターチなどを単独又は
混合して用いる。窒素源としては肉エキス、オートミー
ル、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトンなどを単独また
は混合して用いる。

その他、本菌株の生育を助は生理活性物質ＰＩ−０８類
の生産を促進する有機物及び無機塩を必要により添加す
ることができる。消泡剤としては、アデカノール、シリ
コンなどを用いることができる。

培養方法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気培養が
適しており、ｐＨ４〜８．２５〜３５℃で３〜６日間、
望ましくはｐＨ６〜７．２８〜３０℃で４日間培養する
。

この培養により生産された生理活性物質Ｐｌ−０８類を
単離するには発酵生産物を採取する一般的な方法に準じ
て行えばよい、生理活性物質ＰＩ−０８類は主に菌体内
に蓄積きれるので、例えば、次の方法が効果的である。

すなわち、培養終了後、遠心分離又は濾過により分離し
た菌体から生理活性物質ＰＩ−Ｏ８＠を低級アルコール
、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この抽出液を濃縮
後、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムナトの非水溶
性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする
。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン
、エタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、
シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ワコーゲルＣ−
２００（商品名：和光紬薬工業（株）製］を用いたカラ
ムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー
に付すことにより、生理活性物質ＰＩ−０８類を精製、
単離することができる。

［発明の効果］本発明の生理活性物質ＰＩ−０８類は、アラキドン酸、
アデノシンニリン酸、コラーゲンによる血小板凝集に対
して強い抑制作用を有し、かつ制癌作用を有する。

［実施例］次に、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

（実施例）（１）グルコース２％、オートミール２％、肉エキス０
．３％、食塩０．３％、炭酸カルシウム０．３％、硫酸
第二鉄０．０４％、塩化マンガン０．０４％からなるｐ
ｔｔ７の無菌液体培地にストレプトマイセス・マテンシ
スＡ−６６２１株を接種し、３０℃で９６時間回転培養
し種培養液とした。

次に、内容量５１のジャーファーメンタ−を用いて、種
培養と同じ組成の無菌培地３１に前記種培養液１００ｍ
１を接種し、３０°Ｃで９６時間攪拌通気培養した。培
養終了後、１２基分３６１を遠心分離機で上澄液と菌体
に分けた。得られた菌体をメタノール５１で２回抽出し
、この抽出液を合わせ濃縮してメタノールを除去した。

残渣を残渣の半量の酢酸エチルで２回抽出し、この酢酸
エチル画分を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮
し、１２ｇの褐色シロップを得た。このシロップをクロ
ロホルム１５ｍ１ｌに溶解し、クロロホルムで調製した
シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ワコーゲルＣ−
２００（商品名：和光紬薬工業（株）製］の１１カラム
に吸着させた。クロロホルム２１で洗浄後、クロロホル
ム−メタノール（９９：１）で溶出ヲ行ない、その区分
を除いた６次いで、クロロホルム−メタノール（９８：
２）で溶出を行ない、フラクションコレクターを用い１
フラクション２０ｇずつ分画し、２７〜６０番までのフ
ラクションを集めて濃縮乾固し、粗粉末３．２７ｇを得
た。

（２）上記（１）で得られた粗粉末３．２７　ｇをアセ
トニトリル３ｍＱに溶解し、以下の条件で行なった高速
液体クロマトグラフィーの試料とした。

カラムサイズ　　２０φＸ　２５Ｇｍｓｉ担体　　　　
　　ＯＤＳシリカゲル（デイベロジル　骨材化学社製）溶媒組成　　　　アセトニトリル６４％テトラヒドロフ
ラン１％水３５％流速　　　　　　２１　ＩＩＩ＋！／　ａｋｉｎ温度　
　　　　　５０℃ 検出波長　　　　２１５ｎｍ装置　　　　　　ウォーターズ　Ｍ　−６００保持時間
７．２〜８．３分の画分を分取して、式ＩにおいてＸ−
Ａ　、Ｙ−Ｄである生理活性物質（以下、この物質をＰ
Ｉ−０８３と称する。　）１３０ｍｇを得た。

また、保持時間１２．９〜１５．３分の画分を分取して
、式ＩにおいてＸ−Ｂ、Ｙ−Ｅである生理活性物質（以
下、この物質をＰＩ−０８５と称する。　　）　１８５
ｍｇを得た。

更に、保持時間１０．４〜１１．８分の画分を分取して
、式■においてＸ−Ｃ，Ｙ−Ｅである生理活性物質（以
下、この物質をＰＩ−０８７と称する−）１６０ｍｇを
得た。

これらの生理活性物質ＰＩ−０８類の理化学的性質を第
２表に示した。

第　　　２　　　表＊ＩＳＸＭＳマススペクトル測定による＊２　Ｇ＝０．
２５．クロロホルム中で測定また、ＰＩ−０８３，ＰＩ
−０８５及びＰＩ−０８７の紫外部及び可視部吸収スペ
クトル［メタノール中（０，０５ｍｇ／ｗｎｌ　）で測
定］をそれぞれ第１図、第５図及び第９図に、赤外線吸
収スペクトル（クロロホルム中で測定）をそれぞれ第２
図、第６図及び第１０図に、’Ｈ−ＮＭＲスペクトル（
重クロロホルム中４００ＭＨｚで測定）をそれぞれ第３
図、第７図及び第１１図に、”Ｃ−ＮＭＲスペクトル（
重クロロホルム中１００ＭＨｚで測定）をそれぞれ第４
図、第８図及び第１２図に示した。

（試験例１）　血小板凝集阻害作用（１）血小板の調製法体重２．０〜２．５ｋｇの雄家兎の総頚動脈より採血し
、血液量の１０分の１容の３．８％クエン酸ナトリウム
溶液を加えて軽く混和し、１３００Ｘｇで２分間遠心分
離した上清を多血小板血漿（以下、’ＰＲＰ」という）
とした、沈渣を更に１６００Ｘｇで１０分間遠心分離し
て得られた上清を乏血小板血漿（以下、　’Ｐ　Ｐ　Ｐ
Ｊという）とした。

（２）凝集惹起剤の調製法あらかじめアラキドン酸（シグマ社製）はエタノールで
、アデノシンニリン酸又はコラーゲン（京都第一化学社
製、アグリバック）は生理食塩水で所要濃度に希釈し、
前記成分を個別に含む凝集惹起剤を調製した。

（３）血小板凝集阻害活性測定法２００＃１１１のＰＲＰを採り、ＰＰＰとの吸光度の差
を一定にした後、メタノールにて所要濃度に調製した。

被験液をＰＲＰに加え、攪拌した。

対照はメタノールのみを使用した０次いで、上記凝集惹
起剤（最終濃度：アラキドン酸の場合０．１ｅｅＭ、ア
デノシンニリン酸の場合１０μＭ、コラーゲンの場合１
０ｐｇ／ｍ１ｌ）を添加し、吸光度の変化を二光バイオ
サイエンス社プレイドレットアグリゲーション　トレー
サー４Ａ型血小板凝集計を用い、ボーン等の比濁法［Ｂ
ｏｒｎ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、第１６８巻第１
７８ページ（１９６８年）］により測定し、５０％血小
板凝集阻害濃度（ＩＣ８゜値）を求めた。

各凝集惹起剤に対する結果を第３表に示した。

第　　３　　表（試験例２）　制癌作用６穴プレート（ファルコン社製、　３５ｍｍ径）にＫＢ
ｍ胞（ヒドロ腔癌細胞）　Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ
／ｍ１ｌ（７）細胞浮遊液２　ｍｌｌ　／　ｃｕｌｔｕ
ｒｅを添加し、３７°Ｃ，５％炭酸ガス培養器中で２４
時間培養した。メタノールにて所要濃度に溶解した被験
液１０−を添加して更に７２時間培養した。培養終了後
培地を除去し、０．２５％トリプシン−エチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム塩（ギブコ社製）０．５ｍｌ＋を添
加し５分間放置した。２％牛脂児血清−１．５ｍＭリン
酸緩衝液１ｍｌを添加し混合した後、その０．５ｍｌを
イソトン（商品名９８科機社製）９．５ｔｄに添加し、
細胞数をコールタ−カウンターで測定した。

５０％阻害濃度（ｘｃｓａ値）は、リッチフィールドー
ウィルコックソン（Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ−Ｗｉｌｃｏ
ｘｏｎ）法により算出した。

この結果を第４表に示した。

第　　４　　表

【図面の簡単な説明】

第１図はメタノール中（０，０５ｍｇ／ｍＱ　）で測定
したＰＩ−０８３の紫外部及び可視部吸収スペクトル、
第２図はクロロホルム中で測定したＰＩ−０８３の赤外
線吸収スペクトル、第３図は重クロロホルム中４００Ｍ
Ｈｚで測定したＰＩ−０８３のＩ　Ｈ−ＮＭＲスペクト
ル、第４図は重クロロホルム中１００ＭＨｚで測定した
ＰＩ−０８３の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第５図はメタノール中（０，０５ｅｍｇ／ｍ１１　）で
測定したＰＩ−０８５の紫外部及び可視部吸収スペクト
ル、第６図はクロロホルム中で測定したＰＩ−０８５の
赤外線吸収スペクトル、第７図は重クロロホルム中４０
０ＭＨｚで測定したＰＩ−０８５のＩ　ｎ　−ＮＭＲス
ペクトル、第８図は重クロロホルム中１００ＭＨｚで測
定したＰＩ−０８５の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第９図はメタノール中＜０．０５ｍｇ／ｍｕ　）で測定
したＰＩ−０８７の紫外部及び可視部吸収スペクトル、
第１０図はクロロホルム中で測定したＰＩ−０８７の赤
外線吸収スペクトル、第１１図は重クロロホルム中４０
０ＭＨｚで測定したＰＩ−０８７のＩＨ−ＮＭＲスペク
トル、第１２図は重クロロホルム中１００ＭＨｚで測定
したＰＩ−０８７の”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは下記構造式で示されるＡ、Ｂ及びＣからな
る群より選ばれる基のいずれか一つであり、Ｙは下記構
造式で示されるＤ又はＥのどちらかの基である。但し、
ＹがＤのときＸはＡである。基Ａ ▲数式、化学式、表等があります▼ 基Ｂ ▲数式、化学式、表等があります▼ 基Ｃ ▲数式、化学式、表等があります▼ 基Ｄ ▲数式、化学式、表等があります▼ 基Ｅ ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される生理活性物質ＰＩ−０８類。