JPH04128296A - 生理活性物質ｐｉ―２００，２０１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は血小板凝集抑制作用を有する生理活性物質に関
する。

従来の技術 本発明の生理活性物質と同一の理化学的性質を有する物
質の存在は現在まで知られていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、血小板凝集抑制作用を有する新規な生
理活性物質を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明者らは前記目的の達成のために多数の菌株を土壌
より分離し、その菌株の培養物について種々検討した結
果、ある種の菌株の生産する化合物が強い血小板凝集抑
制作用を有することを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は下記の理化学的性質を有する生理活
性物質である（以下、生理活性物質ＰＩ２００と称する
。）。

（ａ）元素分析値 Ｃ７６，４８％、　Ｈ１０，１６％、　０１３．３６％
（ｂ）分子量　：２６２ （ＦＡＢマススペクトルによる） （ｃ）比旋光度 ［α］二　＝＋１０．３°（ｃ＝０．５．クロロホルム
）（ｄ）紫外線吸収スペクトル （ｅ＞赤外線吸収スペクトル クロロホルム中で測定した結果を第１図に示す。

（ｆ’）’Ｈ−ＮＭＲスペクトル 重クロロホルム中、２００ＭＨｚで測定した結果を第２
図に示す。

（ｇ）溶剤に対する溶解性 不溶：　水 可溶：メタノール、エタノール、酢酸エチル、ベンゼン
、クロロホルム （ｈ）呈色反応 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄反応 陽性：ヨード反応、硫酸 （ｉ）塩基性、酸性、中性の区別：中性（ｊ）物質の色
と形状：淡黄色油状物質また、本発明は下記の理化学的
性質を有する生理活性物質である（以下、生理活性物質
ＰＩ−２０１と称する。）。

（ａ）融点＝１３８〜１４０℃ （ｂ）元素分析値 Ｃ７２，１７％、　Ｈ１０，００％、　０１７．８３％
（ｃ）分子量＝２８０ （ＦＡＢマススペクトルによる） （ｄ）比旋光度 ［αコニ’＝−９８，４°（Ｃ＝０．５．クロロホルム
）（ｅ）紫外線吸収スペクトル （ｆ’）赤外線吸収スペクトル クロロホルム中で測定した結果を第３図に示す。

（ｇ）’Ｈ−ＮＭＲスペクトル 重クロロホルム中、２００ＭＨｚで測定した結果を第４
図に示す。

（ｈ）溶剤に対する溶解性 不溶二　水 可溶：メタノール、エタノール、酢酸エチル、ベンゼン
、クロロホルム （ｉ）呈色反応 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄反応 陽性：ヨード反応、硫酸 （ｊ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性（ｋ）物質の色
と形状：白色粉末状物質本発明の生理活性物質ＰＩ−２
００及びＰＩ−２０１を生産する菌株は、本発明者らが
埼玉県浦和市の土壌より新たに分離した菌株であり、微
生物の名称’　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−ｓｐ、　Ａ
−７４９８Ｊ及び微生物寄託番号１微工研菌寄第１１５
３７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５３７）　、として、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

（１）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則に分枝する。また、隔壁は認められない
、胞子はイースト・麦芽寒天培地及びオートミール寒天
培地などで栄養菌糸より伸長した気菌糸の先端に良好に
形成される。顕微鏡で観察すると、胞子形成菌糸の分枝
方法は単純分枝で胞子は螺旋状を呈する。胞子は通常１
０個以上連鎖し、表面はこぶ状である。胞子の形状は、
球形から亜球形でその大きさは０．９〜１．１μｍであ
る。

菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察されない。

（り培地上での生育状態 各種培地上で、２８℃、１４日間培養した場合の肉眼に
よる観察結果を第１表に示した。

第 表 （３）生理的性質 ■生育温度範囲 イースト・麦芽エキス培地で２４〜３３℃の範囲で良好
に生育する。　１８℃以下、３７°Ｃ以上の温度範囲で
は生育しない。

■生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別； ｂ）ゼラチンの液化； Ｃ脱脂乳の凝固； ｄ脱脂乳のペプトン化； ｅスターチの加水分解； ｆメラニン様色素生成； ｇ細胞壁の型； ■炭素源の利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地上）利用する：Ｌ−
アラビノース、Ｄ−グルコース。

Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース。

イノシトール、Ｄ−マンニット。

シュクロース、Ｌ−ラムノース。

ラフィノース 以上の性状から本菌株がストレプトミセス属に属するこ
とは明らかであり、上記諸性状を１．ＳＦ３「ジ・イン
ターナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト１．
バージ−著「マニュアル・才ブ・シスマチック・バクテ
リオロジー」第４巻（１９８９好気性 陽性 陽性 陽性 陽性 陰性 Ｉ型 年）及びワックスマン著１シ・アクチノミセテス。

第２巻（１９６１年）に報告されている多くの既知菌株
と比較した結果、本菌株はストレプトミセス・アンチマ
イコテックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｍ
ｙｃｏｔｉ−ｃｕｓ）に最も近い性状を示していた。し
かし、文献値と培地上での生育状態などで若干の相違が
認められ種を決定するまでには至らなかったので、本菌
株をストレプトマイセス・エスピー・Ａ−７４９８（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−ｓｐ、　Ａ−７４９８）と命
名した。

生理活性物質ＰＩ−２００及びＰＩ−２０１の生産は、
大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄
養物質を含む培地で本菌株を好気的条件下で培養するこ
とにより行なう。

培地は主として液体培地を用い、戻素源としてはグルコ
ース、シュクロース、廃糖蜜、スターチなどを単独又は
混合して用いる。窒素源としては肉エキス、オートミー
ル、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトンなどを単独また
は混合して用いる。

その他、本菌株の生育を助は生理活性物質ＰＩ−２００
及びＰＩ−２０１の生産を促進する有機物及び無機塩を
必要により添加することができる。

消泡剤としては、アデカノール、シリコンなどを用いる
ことができる。

培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養
が適しており、ｐＨ４〜８．２５〜３５℃で２〜５０間
、望ましくはｐＨ６〜７．２５〜２８℃で３日間培養す
る。

この培養により生産きれた本発明の生理活性物質を単離
するには発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行
えばよい。本発明の生理活性物質は主に培養液中に蓄積
されるので、例えは次の方法が効果的である。

すなわち、培養終了後、遠心分離又は濾過により培養液
を得、ポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコー
ル、アセトンなどの有機溶媒で本発明の生理活性物質を
溶出させる。菌体はアセトンなどの有機溶媒で溶出する
。

次いでこの菌体抽出液及び吸着樹脂からの溶出液を合わ
せて濃縮後、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムなど
の非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ
状とする。

このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、
メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲルＦＡカラムク
ロマトグラフィー及び高速液体カラムクロマトグラフィ
ーに付すことにより、本発明の生理活性物質を精製、！
！離することができる。

発明の効果 本発明の生理活性物質は、血小板凝集に対し優れた抑制
作用を有するので、血栓症などの治療薬として有用であ
る。

実施例 次に、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

（実施例） （１）クルコース２％、オートミール２％、肉エキス０
．３％、食塩０．３％、硫酸第二鉄０．０４％、塩化マ
ンガン０．０４％からなるｐＨ７の無菌液体培地にスト
レプトミセス・エスピー・Ａ−７４９８株を接種し、２
８°Ｃで７２時間回転培養し種培養液とした。

次に、内容−ｆｆｉ５ｊ２のジル−ファーメンタ−を用
いて、種培養と同じ組成の無菌培地３１に前記種培養液
１００ｄを接種し、２８°Ｃで７２時間撹拌通気培養し
た。

培養終了後、６基分１８１を遠心分離機で上清と菌体に
分け、菌体は１０Ｉｌのアセトンを加え抽出した。上清
は、ダイヤイオンＨＰ−２０（ポリスチレン樹脂の商品
名、三菱化成社製）のカラム（容量９００ｍ４！　）に
吸着させた後、精製水１．８Ｊ２で洗浄後、アセトン１
．８１で活性物質を溶出した。菌体由来のアセトン抽出
液と上清由来のアセトン溶出液を合わせ、アセトン留去
後、残渣を残渣の半量の酢酸エチルで２回抽出した。こ
の酢酸エチル画分を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮
乾固し、褐色の油状物質１８．７　ｇを得た。

（２）前項（１）で得られた油状物質をクロロホルム２
Ｍに溶解し、シリカゲルを充填したカラム（容量ｏ、ｓ
ｔｔ、溶媒：クロロホルム）に吸着させた。

クロロホルム１．６にで洗浄後、クロロホルム−メタノ
ール（９９：１）の混合溶媒で溶出される区分を除いた
０次いで、クロロホルム−メタノール（９８：２）の混
合溶媒で溶出を行い、濃縮乾固することにより７００ｍ
ｇの褐色油状物質を得た。得られた試料をｎ−ヘキサン
−クロロホルム−メタノール（５：５：１）で調製した
セファデックスＬＨ−２０（商品名、ファルマシア社製
）にてゲルＦＡを行い、活性区分を集めて濃縮乾固し、
淡褐色油状物質１３５ｍｇを得た。

（３）前項（２）で得られた油状物質１３５ｓｎｇをア
セトニトリル１３５−に溶解し、以下の条件で行った高
速液体カラムクロマトグラフィーの試料とした。

カラムサイズ　　１０＜ｉ！　Ｘ　２５０ｍｍ担体　　
　　　　ＯＤＳシリカゲル （ＭＭＣ−ＡＱ　、山村化学社製） 溶媒組成　　　　７５％アセトニトリル、２５％水流速
　　　　　　４．５ｍｅ　／　ｍｉｎ。

温度　　　　　　５０℃ 検出波長　　　　２１５ｎｍ 装置　　　　　　ウォーターズ　Ｍ　−６００保持時間
５．０〜６．１分の画分を分取し、９ａ＋ｇの生理活性
物質ＰＩ−２０１を得た。

また、保持時間１１．４〜１３．１分の画分を分取し、
２２ｍｇの生理活性物質ＰＩ−２００を得た。

（試験例）　血小板凝集阻害作用 （１）血小板の調製法 体重２．０〜２．５ｋｇの雄家兎の総頚動脈より採血し
、血液量の１０分の１容の３．８％クエン酸ナトリウム
溶液を加えて軽く混和し、１３００Ｘ　ｇで２分間遠心
分離した上清を多血小板血漿（以下、’ＰＲＰ」という
）とした、沈渣を更に１６００Ｘ　ｇで１０分間遠心分
離して得られた上清を乏血小板血漿（以下、’Ｐ　Ｐ　
Ｐ、という）とした。

（２）凝集惹起剤の調製法 あらかじめアラキドン酸（シグマ社製）はエタノールで
、アデノシンニリン酸又はコラーゲン（京都第一化学社
製、アグリバック）は生理食塩水で所要濃度に希釈し、
前記成分を個別に含む凝集惹起剤を調製した。

（３）血小板凝集阻害活性測定法 ２００ＰｆｌのＰＲＰを採り、ＰＰＰとの吸光度の差を
一定にした後、メタノールにて所要濃度に調製した本発
明の生理活性物質をＰＲＰに加え、撹拌した。対照はメ
タノールのみを使用した。次いで、上記凝集惹起剤（最
終濃度：アラキドン酸の場合０．１ｍＭ、アデノシンニ
リン酸の場合５μＭ。

コラーゲンの場合１０Ｐｇ／ｍｅ）を添加し、吸光度の
変化を二元バイオサイエンス社プレイドレットアグリゲ
ーション　トレーサー　４Ａ型血小板凝集計を用い、ボ
ーン等の比濁法［Ｂｏｒｎ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
　、第１６８巻第１７８ページ（１９６８年）コにより
測定し、本発明の生理活性物質の５０％血小板凝集阻害
濃度（ｒｃｉｓ値）を求めた。

その結果を第２表に示す。

第 表

【図面の簡単な説明】

第１図はクロロホルム中で測定した生理活性物質ＰＩ−
２００の赤外線吸収スペクトル、第２図は重クロロホル
ム中、２００Ｍ）ｌｚで測定した生理活性物質ＰＩ−２
００の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第３図はクロロ
ホルム中で測定した生理活性物質ＰＩ−２０１の赤外線
吸収スペクトル、第４図は重クロロホルム中、２００Ｍ
Ｈｚで測定した生理活性物質ＰＩ−２０１の’Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する生理活性物質 （ａ）元素分析値 Ｃ７６．４８％、Ｈ１０．１６％、Ｏ１３．３６％ （ｂ）分子量：２６２ （ＦＡＢマススペクトルによる） （ｃ）比旋光度 ［α］＾２＾５＿Ｄ＝＋１０．３°（ｃ＝０．５、クロ
   ロホルム） （ｄ）紫外線吸収スペクトルＵＶλ＾Ｍ＾ｅ＾Ｏ＾Ｈ＿
   ｍ＿ａ＿ｘｎｍ（ε）；２１２（２０２５） （ｅ）赤外線吸収スペクトルクロロホルム中で測定した
   結果を第１図に示す。 （ｆ）＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル重クロロホルム中、２
   ００ＭＨｚで測定した結果を第２図に示す。 （ｇ）溶剤に対する溶解性 不溶：水 可溶：メタノール、エタノール、酢酸エチ ル、ベンゼン、クロロホルム （ｈ）呈色反応 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄反応 陽性：ヨード反応、硫酸 （ｉ）塩基性、酸性、中性の区別：中性 （ｊ）物質の色と形状：淡黄色油状物質
2. （２）下記の理化学的性質を有する生理活性物質 （ａ）融点：１３８〜１４０℃ （ｂ）元素分析値 Ｃ７２．１７％、Ｈ１０．００％、Ｏ１７．８３％ （ｃ）分子量：２８０ （ＦＡＢマススペクトルによる） （ｄ）比旋光度 ［α］＾２＾５＿Ｄ＝−９８．４°（ｃ＝０．５、クロ
   ロホルム） （ｅ）紫外線吸収スペクトル ＵＶλ＾Ｍ＾ｅ＾Ｏ＾Ｈ＿ｍ＿ａ＿ｘｎｍ（ε）；２１
   ０（２０４４） （ｆ）赤外線吸収スペクトルクロロホルム中で測定した
   結果を第３図に示す。 （ｇ）＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル重クロロホルム中、２
   ００ＭＨｚで測定した結果を第４図に示す。 （ｈ）溶剤に対する溶解性 不溶：水 可溶：メタノール、エタノール、酢酸エチル、ベンゼン
   、クロロホルム （ｉ）呈色反応 陰性：ニンヒドリン、塩化第二鉄反応 陽性：ヨード反応、硫酸 （ｊ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性 （ｋ）物質の色と形状：白色粉末状物質