JPS608117B2 - 新生理活性物質エステラスチンおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はェステラーゼに対して阻害作用を示す新しい生
理活性物質、ェステラスチン及びその製造法に係り、特
に微生物を培養して培養物からェステラスチンを採取す
ることによってェステラスチンを製造する方法に関する
ものである。

更に本発明はェステラスチンを有効成分とする免疫抑制
剤にも関する。本発明者等は、微生物化学研究所の構内
の土壌試料より分離された放線菌ＭＤ４−ＣＩの番号が
付された菌株を培養して得られる培養物中にェステラー
ゼ阻害作用を有する物質が存在することを発見し、その
培養物から該物質を採取することに成功した。

しかも研究の結果、該物質が新規な物質であることを知
見し、これをェステラスチンと命名した。本発明者らは
ェステラスチンの医薬としての有用性について種々検討
した結果、本物質が液性抗体産生細胞を減少せしめ、ま
た細胞性免疫に対しても抑制作用のあることを明らかに
した。叢性の低い物質であることから、本物質は免疫反
応によって誘起される多くの難病、即ち関節炎、リウマ
チ、多発生硬化症などの治療薬として、また臓器移植な
どにも安全に使用し得る新生理活性物質である。さらに
本物費は抗ェステラーゼ活性を有することから、補体系
の活性化を阻害し、抗炎症剤としての効果も期待される
。ヱステラスチンは本発明者らが、パラニトロフェニル
アセテートのェステラーゼによる分解を阻止する作用を
有する活性物質を系統的探索するに当って、前述の通り
放線菌の培養液中に発見した新化合物である。

従って、第１の本発明の要旨とするところはェステラー
ゼに対して阻害作用を示す白色粉末状で中性の物質であ
って、しかも下記の物理化学的性状を有する、すなわち
９０〜９５ｑ○の融点をもち、ピリジン、ジメチルスル
ホキサイド、・エタノール、アセトン、酢酸ブチル、ク
ロロホルム、ベンゼンに易漆で水、石油エーテル、ヘキ
サンに雛溶であり、比旋光度〔Ｑ〕客十１ｒ（ｃｌ、ク
ロロホルム）を示し、質量分析法で測定して５０６の分
子量をもち、元素分析値がＣ６７．０４％，日９．２１
％，Ｎ５．５６％，０１７．９０％であり、９５％メタ
ノール溶液中で測定して紫外部吸収スペクトルで入ｍａ
ｘ２３肌（Ｅ手孫２２．５）に吸収ピ‐クを示し・且つ
赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠）で３４７０，
３３５０，２９５０，１８４０，１７３０，１６４５，
１６１０，１５４５，１４１５，１３７５，１３２５，
１２６０，１２２５，１１８５，１１１５，１０４０，
１０２０，９７５，９２０，９００，８８０，８４０，
８１０および６９０伽−，に特異吸収帯を示し、しかも
添附図面の第３図に示される核磁気共鳴吸収スペクトル
を有することを特徴とする、抗ェステラーゼ活性物質、
ェステラスチンにある。

このェステラスチンは次の構造式を有すると認められる
。

また、第２の本発明の要旨とするところは、ストレプト
ミセス属に属するェステラスチン生産菌を培養してヱス
テラスチンを培養物中に生産、蓄積させ、さらにェステ
ラスチンを採取することを特徴とする、抗ェステラーゼ
活性物質、ェステラスチンの製造法にある。

ェステラスチンを生産する菌株について記述する。

本発明の方法で使用されるェステラスチン生産菌の一例
には、本発明者らによって前述の通り微生物化学研究所
の構内の土壌から初めて分離されたストレプトミセスＭ
Ｄ４一ＣＩ株がある。本菌株は工業技術院微生物工業技
術研究所に昭和５１年９月２５日保管委託し、徴工研菌
寄第３７２３号で保管されてある。ＭＤ４−ＣＩ株の菌
学的性状は次の通りである。

１ 形態 ＭＤ４−ＣＩ株は顕微鏡下で、分枝した基中菌糸より螺
旋状の気菌糸を形成し、輪生枝はみとめられない。

成熟した胞子鎖は１の固以上の胞子の連鎖をみとめ、胞
子の大きさは０．６〜０．８×０．８〜１．２ミクロン
位で胞子の表面は平滑である。２ 各種培地における生
育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準はコンテイナー・
コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニ
イ・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎｏｆ ＡｍｅｒｉｃａのＣｏｌｏｒｈａｒｍｏ
ｎｙｍａｎｕａｌ）を用いた。

○｝ シュクロース・硝酸塩寒天塔地（２４ｑｏ培養）
無色の発育上に、灰味赤〔６繋，ＲｏｓｅＧｒａｙ〕〜
赤味灰〔５袋，Ｒｏｓｅｗｏｏｄ〕の気菌糸を着生し、
熔解性色素はみとめられない。

■ グルコース・アスパラギン寒天塔地（２７０培養）
無色の発育上に、うす赤茶〔鷺ｃ，Ｄ雌ｔｙＰｅａｃｈ
〕〜明るい茶灰〔＄ｅ，ＳｉｌｖｅｒＧｒａｙ）の気菌
糸を着生し、溶解性色素はみとめられない。

‘３’グリセリン・アスパラギン寒天塔地（ＩＳＰ−培
地５，２で０培養）無色〜うす黄の発育上に、培養後１
４日目頃から白〜ピンク白の気菌糸を着生し、溶解性色
素はみとめられない。

（４｝ スターチ・無機塩寒天塔地（ＩＳＰ−培地４，
２７０培養）無色の発育上に、明るい茶灰〔＄ｅ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｇｒａｙ〕〜ピンク灰の気菌糸を着生し
、溶解性色素はみとめられない。

‘５）チロシン寒天塔地（ＩＳＰ−培地７，２７０培養
）うす黄の発育上に、培養後１４日目頃からピンク白〜
赤味灰〔滋ｅ，Ｒｏｓｅｗ肌ｄ〕の気菌糸を着生し、溶
解性色素はみとめられない。

■ 栄養寒天培地（２７０培養）発育はうす黄、気菌糸
は着生せず、溶解性色素はみとめられない。

【７）イースト・麦芽寒天塔地（ＩＳＰ−塔地２，２７
ｏ０培養）うす黄茶〜黄茶の発育上に、明るい茶灰〜ピ
ンク灰〔７ｉｇ，ＲｏｓｅＴａｕｐｅ〕の気菌糸を着生
し、溶解性色素はみとめられない。

■ オートミル寒天塔地（ＩＳＰ−培地３，２７００培
養）無色〜うす黄あるいはにふく黄の発育上に、灰味赤
〔舷ｅ，Ｒｏｓｅ Ｃｒａｙ〕〜赤味灰〔舵ｅ，Ｒｏｓ
ｅ ｗｏｏｄ〜５ｉｇ，Ｒｏｓｅ Ｔａｕｐｅ〕の気菌
糸を着生し、溶解性色素はみとめられない。

‘９｝ グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７０培養）う
す黄〜うす黄茶〔３ｉｅ，Ｃａｍｅｌ〜４１ｅ，Ｃｏｒ
ｋＴａｎ〕の発育上に、白〜茶白の気菌糸を着生し、溶
解性色素はみとめられない。

（１０ スターチ寒天塔地（２７０培養）寒色の発育上
に、茶白〜明るい茶灰 〔幻ｃ，ＰｕｓｓｙＭＩｌｏｗＧｒａｙ〕〜ピンク灰の
気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられない。

（１１）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）無色の発
育上に、白〜うす赤茶〔＆ｃ，Ｄ聡ｔｙＰｅａｃｈ〕〜
赤味灰〔頭ｅ，Ｒｏｓｅｗｏｏｄ〕の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。

（１２）セルロース（２７０培養）発育は無色、気菌糸
は着生せず、溶解性色素もみとめられない。

（１３）ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地（２０℃培養）では無色の発育上に白
色の気菌糸を着生し、茶の溶解性色素を産生する。

グルコース・ベプトン・ゼラチン塔地（２７０培養）で
は、うす黄〜うす黄茶の発育上に、わずかな白色の気菌
糸を着生し、暗い茶の溶解性色素を産生する。（１０
脱脂牛乳（３７０培養） 発育は無色〜うす黄、わずかな白色の気菌糸を着生し、
溶解性色素は、培養後１９日目でわずかに茶色味をおび
る程度である。

３ 生理的性質 ｛１｝ 生育温度範囲 スターチ・イースト寒天（可溶性澱粉１．０％，イース
ト・エキス０．２％紐寒天３．０％冊７．０〜７．２）
を用い、２０ｏ○，２４ｑｏ，２７℃，３０ｑｏ，３７
Ｃ，５０ｑｏの各温度で試験の結果、５０ｏｏを除いて
、そのいずれの温度でも生育したが、最適温度は２０ｑ
ｏ〜３７℃付近と思われる。

■ ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン、２０ｏｏ培
養；グルコース・ベプトン・ゼラチン、２７０培養）単
純ゼラチン培地の場合は、液化はみとめられなかったが
、グルコース・ベプトン・ゼラチン塔地では、培養後５
日目頃から液化が始まり、その作用は中等度〜弱い方で
ある。

糊 スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒夫培地及
びスターチ寒天培地、何れも２７０培養）培養後５日目
頃から水解性がみとめられ、その作用は中等度である。

‘４ー 脱脂牛乳の凝固・ベプトン化（脱脂牛乳、３７
ｑＣ培養）凝固しないで、培養後１２日目頃からべブト
ン化が始まり、その作用は中等度である‘５｝ メラニ
ン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス，ＩＳ
Ｐ−培地１：べプトン・イースト・鉄寒天、ＩＳＰ−塔
地６：チロシン寒天ＩＳＰ−培地７，何れも２７０培養
）トリプトンリイースト・プロス及びべプトン・イース
ト・鉄寒天培地ではメラニン様色素の生成がみとめられ
るが、チロシン寒天培地ではみとめられない。

‘６） 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーフ寒天
培地、ＩＳＰ−培地９、２７０培養）グルコースを利用
して発育し、Ｌーアラビノース、Ｄーキシロース、Ｄ−
フラクト−ス、シユクロース、イノシトール、Ｌーラム
ノース、ラフイノース、Ｄーマンニトールは利用しない
。

【７｝ リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、２７
０培養）培養後１０日目頃から発育周辺のリンゴ酸石灰
を溶解し、その作用は中等度〜強い方である。

｛８｝ 硝酸塩の還元反応（１．０％硝酸カリ含有べプ
トン水、ＩＳＰ−培地８、２７０培養）陰性である。

以上の性状を要約するとＭＤ４−ＣＩ株はストレプトミ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、気菌糸は
螺旋形成をみとめ、輪生枝はみられず、胞子の表面は平
滑である。

種々の培地で無色〜うす黄、あるいはうす黄茶の発育上
に、赤味灰〜ピンク灰〜明るい茶灰の気菌糸を着生し溶
解性色素はみとめられない。メラニン様色素はトリプト
ン・イースト・フロス及びべプトン・イースト・鉄寒天
塔地では陽・性、チロシン寒天塔地では陰性、蛋白分解
力、スターチの水解性はともに中等度である。これらの
性状より既知菌種を検索するとストレプトミセス・ラベ
ンドレ−（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓｌａｖｅｎ−ｄｕｌ
ｌａｅ文献１）ＪｏｕｍａｌｏｆＳ＄ｔｅｍａｔｊｃＢ
ａｃにｒ−ｉｏｌｏ期、１舞巻、１３８頁、１９総；文
献２）ＷａｋｓｍａｎのＴｈｅＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ，２券，２３４頁）およびストレプトミセス・アビ
デイニー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｌ文
献１＞Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｓｙｓにｍａｔｉｃ母ｃｔ
ｅｒｉｏｌｏ勘、２２巻、２７６頁、１９７２：文献２
）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．
、２０頁、１９６３）がもっとも近緑の種としてあげら
れる。次に実際にこれら２種の菌株を入手し、ＭＤ４−
ＣＩ株と比較検討した成績の大要を示すと次の如くなる
。Ｓ 肘 亀 心 Ｓ り べ Ｒ 薫 Ｓ 〇 ○ ，巷 〉的 奪還 蓮ヰ ・十２ 三− ＊ 舵 表にみられる如くＭＤ４一ＣＩ株とストレプトミセス・
ラベンドレーＩＳＰ５０６鱗朱及びストレプトミセス・
アビディニーＩＳＰ５５２８珠とは極めてよく類似して
いる。

ストレプトミセス・アビデイニーは抗生物質ＭＳＤ−２
３５を生産する菌株中、気菌糸の色が灰色系統である点
で、ストレプトミセス・ラベンドレーと区別された菌種
であるが、この比較実験及び文献１）の記載においては
気菌糸の色が異なる点よりアビディニーをラベンドレー
と区別することは出釆ない。両者の主たる相異点ＩＳＰ
−培地７におけるメラニン様色素の生成及び牛乳の凝固
の有無である。しかし、これらの相異点のみで種を区別
することは難かしく、両者は極めて近綾の種と考えられ
る。ＭＤ４−ＣＩ株はすでに抗生物質ストレプトスライ
シン（Ｓｔｒｅｐｔｏｔｈｒｉｃｉｎ）を生産すること
がみとめられており、ＩＳＰ−培地７におけるメラニン
様色素の生成が異なる点を除いては、ストレプトミセス
・ラベンドレーとよく一致し、一方ストレプトミセス・
アビディニ−ともＭＤ４一ＣＩ株が牛乳を凝固しない点
が異なる他は合致している。

これらの点より前述の如くストレプトミセス・アビデイ
ニーをストレプトミセス・ラベンドレーグループに属す
ると判断して、ＭＤ４−ＣＩ株をストレプトミセス・ラ
ベンドレー（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕｌ
ａｅ）ＭＤ４−ＣＩと同定した。なお放線菌は人工的に
、又自然界で変異をおこしやすいが、本発明にいうスト
レプトミセス・ラベンドレーＭＤ４−ＣＩはそれらの変
異菌のすべてを包括する。本発明にいうこれらの菌種は
ェステラスチン（Ｅｓｔｅｒａｓｔｉｎ）を生産し、本
菌種およびその変異菌と明確に区別されない菌はすべて
これを包含する。第２の本発明の方法を実施するに当っ
て、ェステラスチンを生産するために、ェステラスチン
生産菌を培養するに用いる栄養源としては、放線菌の栄
養源として公知のものを使用することができる。

例えば市販されているグリセリン、グルコース、ラクト
ース、シユクロース、でんふミん、マルトース、糠密、
などの炭水化物、脂肪などを炭素源として、市販されて
いるべブトン、肉エキス、綿実粉（フアルマメデァ）、
落花生粉、大豆粉、酵母エキス、Ｎ−Ｚーアミン、カゼ
イン、Ｌ−アスパラギン、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムなど窒素源として、食塩、燐酸塩
、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、などを無機の栄
養源としてそれぞれ使用できる。その他必要に応じて徴
量の金属塩を添加する。これらのものはェステラスチン
生産菌が利用し、またェステラスチンの生産を妨害しな
いものであれば良い。公知の放線菌の培養材料はすべて
使用できる。特に好ましい培地成分としては炭素源とし
てグリセリン、窒素源として綿実粉、Ｌ−アスパラギン
などがある。グリセリン１．５％、綿実粉１．５％、Ｌ
ーアスパラギン０．２％、食塩０．３％を含む組成の培
地を用いるのが好ましいと認められた。ヱステラスチン
の大量生産には液体培養が好ましい。培養温度としては
、ヱステラスチン生産菌が発育し、ヱステラスチンを生
産する範囲の温度を適用しうるが、特に好ましい培養温
度は２５００〜３５００である。培養は普通はェステラ
スチンが培養物中に生産され、充分に蓄積するまで継続
される。例えば、グリセリン１．５％、綿実粉（フアル
マメディア）１．５％、Ｌ−アスパラギン０．２％、食
塩０．３％を含む培地をｐＨ７．４に調整して滅菌した
のち、これにェステラスチン生産菌の斜面培養から胞子
及び菌糸を接種し、２７０で好気的に振縁培養を行った
ところ、培養２日〜４日目にェステラスチンの蓄積がみ
とめられた。ヱステラスチンは抗ェステラーゼ活性の測
定で定量された。

ェステラーゼ活性の測定は小林靖典生化学３６，３３５
（１９６４）記載の方法を改良しておこなった。即ち、
米国、ニュトリショナル・バイオケミカル社より市販さ
れている。ブタの蹄臓より得た粗酵素リパーゼを０．２
％トリトン（Ｔｒｉｔｏ政一１００）含有０．０８Ｍ燐
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で０．５％濃度に熔解した。こ
の酵素溶液を０．０３叫，０．０９ Ｍ燐酸緩衝液を２
．９２の‘，および定量されるべき検体を含む溶液０．
０２５の‘とを互に混合した混合溶液（２．９７５の【
）を２０ｏｏ、３分間加溢した後、これに１０爪９／叫
のパラニトロフヱニルアセテートのメタノール溶液０．
０２５机上を加えることにより反応を開始させる。２０
ｑｏで３０分間反応した後、反応液の４０仇血における
吸光度ａを測定した。同時にェステラスチンを含まない
緩衝液のみを用いた盲検の吸光度ｂを測定し、ェステラ
ーゼ阻害率を式〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×１００により計算
した。この定量法で０．０００２ｈｃｇノの【の白色粉
末ェステラスチン（実施例７の生成物）は５０％阻害（
ＩＤ５ｏ）を示した。ＭＤ４−ＣＩ株を各種の組成を有
する培養基で振縁培養してェステラスチンの生産をしら
べた。

この際の振糧培養は５００の‘のフラスコにｌ００の‘
の培地を入れ、２７℃の培養温度で毎分１８０回転の振
鰹機にのせて行なわれた。培養２日目からェステラスチ
ンの生産がみとめられた。なお、ＰＨ２．０およびｐＨ
９．０に調整した培養液を６０℃で３０分間加溢しても
抗ェステラーゼ活性の低下は認められなかった。ェステ
ラスチンはタンク培養法でも振縄培養と同様によく生産
される。

例えば５７０その醗酵槽に２５０〜３００夕の培地を入
れて滅菌し、毎分２５０〜３００その無菌空気を通気し
、毎分２００回転で婿拝した。このときのェステラスチ
ンの生産は４８〜７幼時間で最高に達した。ェステラス
チンは生産菌の培養液中及び菌体に存在する。

菌体を含む固形分中のェステラスチンはメタノール、エ
タノールアセトン等の如き、水と混和しうる有機溶剤に
より抽出される。ュステラスチンを菌体から採取するに
当っては、菌体の５〜１０若量のメタノールを用いて２
回抽出を行うことにより菌体中のェステラスチンはメタ
ノール層に抽出される。メタノールを減圧下に濃縮乾固
し、その乾固物から、ェステラスチンをよく溶かす溶媒
、例えばクロロホルム、アセトン、ベンゼン、酢酸ブチ
ル、酢酸エチル等でェステラスチンを抽出することが出
来る。大量の菌体中よりメタノール抽出したェステラス
チンの粗粉末は酢酸ブチルと水による液相分配法を用い
れば酢酸プチル層に抽出出来る。また、ェステラスチン
を培養液から採取するにあたっては、菌体を含む培養液
を減圧濃縮、乾燥してからェステラスチンをよく溶かす
溶剤、例えばメタノール、エタノール、ジメチルスルホ
キサイド、アセトン、酢酸ブチル、クロロホルムなどで
ヱステラスチンを抽出し採取することができる。

また大量の培養炉液中からェステラスチンを採取すると
きはェステラスチンが良く溶け「水と混和しない溶剤、
例えば酢酸プチルと培養炉液とを混合することにより、
ェステラスチンを該有機溶剤、例えば酢酸ブチル層に抽
出することができる。通常、培養炉液の１／２量の酢酸
プチルで２回抽出を行なうことにより培養炉液中のェス
テラスチンは殆んど酢酸ブチル層に抽出される。なお向
流分配法もヱステラスチンの抽出、精製に利用される。
以上の如くして得た酢酸ブチル抽出液を減圧下に濃縮乾
固することによって、ェステラスチンを含む粗粉末を得
ることができる。ェステラスチンはこれを含む溶液から
、吸着剤に吸着および脱着により好収率に採取するこが
できる。

吸着情としては、活性炭、アンバーライトＸＡＤなどの
有機性吸着剤、アルミナ、シリカゲル、フロリジルなど
の無機性吸着剤が使用できる。例えば、ヱステラスチン
はシリカゲルで吸着され、クロロホルムーメタノール（
８０：１容量比）で溶出される。例えば菌体よりメタノ
ール抽出、及び酢酸ブチル抽出及び濃縮乾団で得たェス
テラスチン組粉末についてシリカゲルのクロマトグラフ
ィーを行ない、クロロホルムーメタノール（８０：１）
の混合溶媒系を用いて展開すると、９０％以上の収率で
ェステラスチンが溶出される。特に、シリカゲルのクロ
マトグラフィーは最終的なェステラスチンの精製法とし
て有効である。例えば乾式法シリカゲルクロマトグラフ
ィーにおいて溶出溶媒として酢酸エチルを用いて展開を
行うことにより、殆んど純粋なェステラスチンを採取す
ることができる。このようにして得られたェステラスチ
ンは適当な溶媒例えば、クロロホルム一石油エーテルか
ら再沈澱することにより更に精製して、白色粉末として
得られる。ェステラスチンの精製法としてセフアデツク
ＬＨ−２０を用いたクロマトグラフィーも有効な方法で
ある。次に本発明のヱステラスチンの物理化学的及び生
理的性質を詳述する。

白色粉末のヱステラスチンの融点は、９０〜９５００で
比旋光度〔ｑ〕名ｏ＋１ｒ（ｃｌ、クロロホルム）、元
素分析値はＣ６７．０４％，日９．２１％，Ｎ５．５６
％，０１７．９０％を与えた。０．１雌／泌の濃度にお
けるェステラスチンのメタノール溶液中の紫外線吸収ス
ペクトルは第１図に示される通りであり、２３仇ｍに極
大吸収を示した（Ｅ三孫２２．５）。

ェステラスチンの赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム
錠）は第２図に示す通りであり、次の波数（仇‐１）：
３４７０，３３５０，２９５０，１８４０，１７３０，
１６４５，１６１０，１５４５，１４１５，１３７５，
１３２５，１２６０，１２２５，１１８５，１１１５，
１０４０，１０２０，９７５，９２０，９００，聡０，
８４０，８１０，６９０に特異吸収帯を有する。

バリアンＨＡ−１００を用いて１０瓜けＨｚで重クロロ
ホルム溶液中でテトラメチルシランを内部規準として測
定された核磁気共鳴スペクトルは第３図に示される通り
である。ヱステラスチンは質量分析計でｍ／ｅ５０６に
分子イオンピークを示した。

分子イオンピーク及び元素分析値よりェステラスチンの
分子式としてＣ２８日４６Ｎ２０６が考えられ、この式
は高分解熊マススベクトルの結果からも支持された（実
測値ｍ／ｅ５０６，３３６４：計算値ｍ／ｅ５０６，３
３５４）。ェステラスチンを６規定塩酸中で１００℃、
１８時間加水分解した水解物についてアミノ酸分析を行
うと、アスパラギン酸が検出された。エステラスチンは
ピリジン、ジメチルスルホキサィド、メタノール、アセ
トン、酢酸エチル、クロロホルムおよびベンゼンなどに
良く溶けるが水、石油エーテルおよびへキサンなどには
殆んど溶けない。

エステラスチンはライドンスミス、ドラーゲンドルフ、
ヨウ素蒸気反応では腸性、エールリッヒ、ニンヒドリン
、坂口反応では陰性であった。

ェステラスチンの薄層クロマトグラフィーはシリカゲル
Ｇを用い、展開溶媒としてクロロホルムーメタノール−
水（ｌｃ：１：０．０５）の系でＲｆｏ．ん酢酸エチル
の系でＲｆｏ．２を与えた。ギ酸一酢酸−水（２５：７
５ご９００）を用いた３５００Ｖ、１５分の高圧炉紙電
気泳動でェステラスチンは泳動されなかつた。マウスに
対する毒性試験でヱステラスチン２５０双９／ｋ９（１
．ｐ．）の投与量では全く毒性が認められなかった。

ェステラスチンはブタの隣勝のェステラーゼに対して０
．０００２ｈｃｇ／の【で５０％の阻害（ｍ籾）を示し
た。従釆ェステラーゼの阻害物質として知られているの
は、パラオキソン（ｐａｒａｏｘｏｎ、すなわちジェチ
ルパラニトロフェニルホスホエート）、ジイソプロピル
フルオロホスフエート（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｎ肌ｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａ＄）などの毒性の強い化合物であるが
、ェステラスチンは毒性がなく、パラニトロフヱノール
アセテートを基質として用いた時、ェステラーゼ活性を
ｍ５ｏ＝４．１×１０‐１１Ｍの低濃度で強く阻害する
従来未知の新物質であることが確認された。

ェステラスチンは免疫応答に対する作用を有することが
認められた。

免疫反応に対するェステラスチンの作用は次の如くして
調べた。

０１ 級性抗体産生に対する効果 羊赤血球を抗原として１０８個をマウスｄｄ／Ｙ、雌性
）に静脈注射して免疫を施し、同時に１雌、２５仇ｈＣ
ｇ、６２．５ｈＣｓおよび１５．６ｈｃｇのエステラス
チンを各々腹腔注射して、抗原接種後４日目にマウス隣
臓細胞中の抗体産生細胞液をィェルネの方法（Ｎ．Ｋ．
Ｊｅｒｎｅ．ＡＡ．ＮｏｒｄｉｎａｎｄＣ．Ｈｅｎひ：
Ｔｈｅ ａｇａｒ ｐｌａｑ肥 にｃｈｎｉｑ雌 ｆｏ
ｒｒｅｃｏｇｎｌｚｌｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ−ｂｏｕｎｄ Ａｎ
ｔｉｂｏ − ｄｉｅｓｅｄ．Ｂ．Ａｍｏｓ ａｎｄ
日．Ｋｏｐｒｏｗｓｋｊ．ｐｐ．１０９一１２２，Ｗｉ
ｓｔｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰｒｅｓｓ．Ｐｈｉｌａ
ｄｓｌｐｈｉａ，１９６３）によって検討した。

その結果を表１に示す。表 １ ェステラスチンの液
性抗体産生に対する効果ＳＲＢＣ：主赤血球（Ｓｈｅｅ
ｐ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ即ち、上表の結果か
ら、ェステラスチン１の９一６２．５ムタの投与は箸明
な抗体産生細胞数の減少をもたらすことが認められた。

‘２１ 細胞性免疫に対する効果 細胞性免疫に対するェステラスチンの作用を羊赤血球を
抗原に用い、これをマウス足藤に接種して得られる遅延
型過敏症（Ｄ．Ｔ．Ｈ）を指標〔Ｐ．日．Ｌａｇａｎｇ
ｅ，Ｇ．Ｂ，Ｍａｃｋａｎｅｓｓ ａｎｄ Ｔ．Ｅ．Ｍ
ｉｌｌｅ：Ｊ．Ｅ×ｐ．Ｍｅｄ，１３９，１５２９−
１５３９（１９７４）〕として本物質の効果を検討した
。

羊赤血球１ぴを０．０５の‘の生理食塩水に浮遊させ、
ｄｄ／Ｙ磁性６通令マウスの後肢足嫌に皮下注射して免
疫を施し、この免疫注射と同時に、本物質を１秘／マウ
ス、２５仇ｈｃｇ／マウス、６２．５ｍｃｇ／マウスお
よび１５．ａｈｃｇノマウスの各量を腹腔内注射した。
４日後、各マウスの他の一方の後肢足願に羊赤血球１ぴ
個を皮下注射して２小馬間後、その足藤にみられる腫張
の程度を（足蹄の厚さ）ノギヌで測定することにより判
定した。

この結果を表２に示す。表 ２ェステラスチンのマウス
における 羊赤血球による遅延性過敏症 （Ｄ．Ｔ．Ｈ）成立に対する効果 ＳＲＢＣ：羊赤血球（Ｓｈｅｅｐ ｒｅｄ ｂｌｏのＣ
ｅ１１）即ち、本物質を１の９−２５仇ｈｃｇの量で投
与することは遅延型過敏症形成に対し顕著な抑制を示し
、本物質が細胞性免疫に対しても抑制作用のあることが
上表の結果から示される。

以上の結果はェステラスチンが１仇ｈｃｇ／地でも組織
培養細胞に細胞毒性を示さず、またマウスに対する急性
毒性が２５０の９ノＸ９（ｉＪａ）で毒性徴候を示さな
いことから、従来の免疫抑制剤の如く、細胞叢性によっ
て免疫抑制をもたらす各物質とは全く作用を異にし、極
めて安全に用いられる免疫抑制剤として有用であること
が明らかである。

本物費は免疫反応によって誘起される多くの難病、即ち
、関節炎、リウマチ、多発生硬化症などに有効であり、
更に臓器移植などにも安全に使用しうる物質であると考
えられる。従って第３の発明の要旨とするところは、ヱ
ステラスチンを有効成分として含むことを特徴とする、
免疫抑制剤にある。

次に本発明のェステラスチンの製造に関して実施例を示
すが、ェステラスチンの理化学的性状並びに生産方法、
その抽出精製法が本発明者らによって明らかにされたの
で、本明細書に示された方法を修飾することは容易であ
り、本発明は以下に記載する実施例のみに限定されるも
のではない。

実施例 １ェステラスチン生産菌としてストレブトミセ
スＭＤ４一ＣＩ株（徴工研菌寄第３７２３号）の斜面培
養から一白金耳量をとり、あらかじめ１２０００、２０
分間の条件で滅菌した５００ｃｃ容量のロータリーフラ
スコに１００ｃｃづつ分注したグリセリン１．５％、綿
実粉（フアルマメディア）１．５％、Ｌ−アスパラギン
０．２％、および食塩０．３％から成る組成を有する培
地（１５そ）に接種した。

ェステラスチンの産生の経過をみるために、、２７ｑ０
において毎分１８ｑ伝の培養条件を用い、１０日間培養
を継続して経時的に隆生量を検討したところ、、培養２
日目に産生量はピークに達した５日目まで阻害物質の培
地中における濃度は保たれ、５日目以後は徐々に減少す
ることが見られた。培地の培養中のｐＨ変化は１日目６
‐８，２日目７‐２，３日目７‐３，４日目７‐５，５
日目６．４であり、６日目以後の対は８．０〜９．０の
間であつた。培養３日目における培養液に炉過助剤（ハ
ィフロスーパーセル）を加えて炉過を行い、清澄な病液
１２６００の上を得た。

この培養炉液のェステラーゼ活性を５０％阻害する濃度
（ＩＤ５ｏ）は０．００１７の‘／汎‘であった。この
培養炉液に酢酸ブチル５００の‘を加えて阻害活性を有
する物質を抽出し、さらに水層を２５０机上の酢酸ブチ
ルで抽出して酢酸ブチル層を合わせ、減圧濃縮乾適して
褐色の粉末２００の９を得た。この粗粉末のＩＤ５ｏは
０．０３ｈｃｇ／の‘であった。酢酸ブチルによる培養
炉液からの抽出効率は約８０％であった。実施例 ２ 実施例１に記載した培地と培養条件でストレブトミセス
ＭＤ４−ＣＩ株を３日間培養した培養液より菌体を炉別
した。

得られた菌体２８０のまメタ／ール１５００私，５００
泌で２回抽出した。メタノール抽出液を合わせて減圧濃
縮乾固した。この濃縮乾燥物を５００の‘の水と５００
泌，２００の‘の酢酸ブチルに溶かした。この液相分配
によりェステラスチンは酢酸ブチル層に約９０％以上転
溶された。酢酸ブチル抽出液を合わせて減圧濃縮乾燥し
て褐色の粉末３夕を得た。この粉末はェステラーゼに対
する５０％阻害濃度（ｍ弧）が０．０７ｍｃｇノ似であ
った。実施例 ３実施例１と同様な渚地、培養条件でス
トレプトミセスＭＤ４−ＣＩ株を培養して得られた培養
炉液１０そをアンバーライトＸＡＤ−４（米国ロームア
ンドハース社）１その塔を通過させると、ェステラスチ
ンは吸着され、通過液中に活性は認められなかった。

この吸着されたェステラスチンは２そのメタノールを用
いて熔出された。メタ／ール溶出液の活性分画を減圧濃
縮乾固すると９０％以上の収率でェステラスチンの粗粉
末１６０雌（ＩＤ５ｏ＝０．０３ｈｃｇ／の【）が得ら
れた。実施例 ４ 実施例１において示ごれた培地と培養条件でストレプト
ミセスＭＤ４−ＣＩ株を３日間培養した培養物を無菌的
に、あらかじめ滅菌しておいた、グリセリン１．５％、
綿実粉（フアルマメディア）１．５％、Ｌ−アスパラギ
ン０．２％、食塩０．３％を含む培地１５そを入れた容
量３０そのジャー培養器１基あたり４００私づつ分注し
、楯菌する。

このようにしてジャー培養を毎分通気量１５そ、回転数
２５０回転、２７０で３日間行うと、ェステラーゼ５０
％阻害ＩＤ５ｏを０．００１７叫／奴で示す培養液が得
られた。ジャー培養を２基行なうことによって３０その
培養液が得られた。この培養液を炉過することにより菌
体７８０夕を得た。この菌体をメタノール４そで２回抽
出を行った。抽出液８夕を減圧下で濃縮乾固して粗粉末
１７．５タ得た。この粗粉末を水１夕と酢酸ブチル１そ
で２回抽出し液相分配を行った。酢酸プチル抽出液２夕
を減圧濃縮して乾団すると粗粉末６．５夕（ＩＤ則ご０
．ｌｍｃｇノの‘）が得られた。実施例 ５実施例４に
おいて得られたェステラーゼ阻害活性を示す粗粉末６．
５夕（ＩＤ５ｏ＝０．１ｍｃｇ／の‘）をクロロホルム
２００叫，１００地で抽出し減圧下で１００叫に濃縮し
た後、シリカゲル（ワコーゲルＣ−１００）１０夕を加
えて減圧濃縮乾固するとェステラスチンはシリカゲルに
吸着された。

このェステラスチンを含むシリカゲルを、あらかじめク
ロロホルムで洗ったシリカゲルのクロマト塔３００の‘
にかけ上記溶剤３そで洗ったのち、クロロホルム−メタ
ノール（８０：１）の混合溶剤で溶出し２０タづつのフ
ラクションに分画してとると、フラクション６の蚤から
１６０番の付近にエステラーゼを阻害する清性ピ−クが
みとめられた。この活性分画を減圧濃縮乾団することに
より１５０爪９の淡赤色粉末が得られた。この粉末はｍ
５ｏ＝０．００２４ｍｃｇ／の‘を示した。実施例 ６ 実施例５において得られたェステラスチンの淡赤色粉末
１５０の９をメタノール２の‘に溶解し、メタノールで
膨潤させたセフアデックスＬＨ−２０，４００の‘の塔
にかけメタノールで溶出して５タづつのフラクションに
分画すると、フラクション５４番から６母蚤の付近にェ
ステラーゼを阻害する活性ピークがみられた。

この活性分画を減圧濃縮乾固することにより３０の夕の
黄色粉末が得られた。この粉末はｍ則＝０．０００７ｍ
ｃｇノの‘を示した。実施例 ７実施例６において得ら
れたェステラーゼ阻害活性を示す黄色粉末３０の９を酢
酸エチル１の‘に溶解し、シリカゲル（ワコーゲルＣ−
２００）５００の９を加えて減圧濃縮乾固するとェステ
ラスチンはシリカゲルに吸着される。

これを乾燥したシリカゲルのクロマト塔（直径１．２伽
×長さ２０肌）にのせ酢酸エチルにより溶出するとェス
テラスチンはフラクション単品として熔出された。この
フラクションを１疎蚤から１方蚤の付近にかけて減圧下
に濃縮乾固することにより７の９の白色粉末のェステラ
スチン、融点９０〜９５０○（ＩＤ５ｏ＝０．００２ｈ
ｃｇ／の上が得られた。実施例 ８ グリセリン１．５％、綿実粉（フアルマメディア）１．
５％、食塩０．３％、Ｌ−アスパラギン０．２％、消泡
剤（アデカノール）０．００５％からなる培地３００そ
を５７０そのステンレス製タンクに仕込み、１２０℃，
２０分滅菌後、ストレプトミセスＭＤ４−ＣＩ株（徴工
研菌寄第３７２３号）の種培養液（通気濃伴培養２７ｑ
０２日）３０夕を楯菌し「 鷹梓は毎分２００回転、通
気量は毎分３００そで、２７０，４斑時間培養を行った
。

この培養液を炉過して菌体を含む間型物３４．２ｋ９を
得た。この固型物をエタノール１００そで２回抽出し、
抽出液を減圧下に６〆迄濃縮した。これを酢酸ブチル５
そで２回抽出し、抽出液を減圧下に濃縮して１２８．２
夕の粗粉末を得た（ｍ別＝〇．〇８ｈＣｇノのＺ）。実
施例 ９実施例８で得られた粗粉末は次の方法によつて
、精製した。

すなわち、粗粉末１２８．２夕をクロロホルム５００肌
に溶解し、シリカゲル（ワコーゲルＣ−１００）１．５
ｋ９を充填した塔に通してェステラスチンを吸着させた
。次いで塔をクロロホルム１０そ、クロロホルムーメタ
ノール（１００：１）１０そで洗浄後、クロロホルムー
メタノール（８０：１）で溶出した。活性分画２５００
泌を減圧下に濃縮乾固すると４．班夕の褐色粗粉末が得
られた（ＩＤ５ｏ＝０．００狐ｃｇ／の‘）。次いでこ
の粗粉末をメタノール２０の‘に溶解し、メタノールで
膨潤させたセフアデツクスＬＨ−２０，２その塔に通し
、４そのメタノールで展開溶出した。活性分画を減圧下
に濃縮乾固することにより６５６花９の淡黄色の粉末が
得られた（ｍ別＝０．０００４ｍｃｇ／の‘）。この粉
末を酢酸エチル５の乙に溶解し、シリカゲル（ワコーゲ
ルＣ−３）２５０夕の塔に通してヱステラスチンを吸着
させた。更に塔を酢酸エチルで展開し、活性分画１００
０の‘を減圧下に濃縮乾固して白色粉末のェステラスチ
ン３５Ｍ９を得た（ｍ斑＝０．０００２ｈｃｇノの‘）
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のェステラスチンの紫外部吸収スペクト
ル図、第２図はェステラスチンの赤外部吸収スペクトル
図、第３図はェステラスチンの核磁気共鳴吸収スペクト
ル図である。 帯ｌ図 精２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エステラーゼに対して阻害作用を示す白色粉末状で
   中性の物質であって、しかも下記の物理化学的性状を有
   する、すなわち９０〜９５℃の融点をもち、ピリジン、
   ジメチルスルホキサイド、メタノール・エタノール、ア
   セトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ベン
   ゼンに易溶で水、石油エーテル、ヘキサンに難溶であり
   、比旋光度〔α〕＾２＾０＿Ｄ＋１１＾ｏ（ｅｌ、クロ
   ロホルム）を示し、質量分析法で測定して５０６の分子
   量をもち、元素分析値がＣ６７．０４％，Ｈ９．２１％
   ，Ｎ５．５６％，Ｏ１７．９０％であり、９５％メタノ
   ール溶液中で測定して紫外部吸収スペクトルでλｍａｘ
   ２３０ｎｍ（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ２２．５）に吸収
   ピークを示し、且つ赤外部吸収スペクトル（臭化カリウ
   ム錠）で３４７０，３３５０，２９５０，１８４０，１
   ７３０，１６４５，１６１０，１５４５，１４１５，１
   ３７５，１３２５，１２６０，１２２５，１１８５，１
   １１５，１０４０，１０２０，９７５，９２０，９００
   ，８８０，８４０，８１０および６９０ｃｍ＾−＿１に
   特異吸収帯を示し、しかも添附図面の第３図に示される
   廃核磁気共鳴吸収スペクトルを有することを特徴とする
   、抗エステラーゼ活性物質、エステラスチン。 ２ ストレプトミセス属に属するエステラスチン生産菌
   を培養してエステラスチンを培養物中に生産、蓄積させ
   、さらにエステラスチンを採取することを特徴とする、
   抗エステラーゼ活性物質、エステラスチンの製造法。 ３ エステラスチン生産菌としてストレプトミセスＭＤ
   ４−Ｃ１株（微工研菌寄第３７２３号）を使用する特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ グリセリン、綿実粉、Ｌ−アスパラギン及び食塩を
   含む組成の培地でエステラスチン生産菌を培養する特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。 ５ 抗エステラーゼ活性物質、エステラスチン有効成分
   として含有することを特徴とする免疫抑制剤。