JPS6339591A - 新規生理活性物質ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリポキンゲナーゼ阻害活性及び抗腫瘍作用ン有
し、医薬品として期待される新規生理活性物質ＮＫ−Ａ
−１７−ｅ−２３３およびその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

リポキシゲナーゼはアレルギーの主要な病因物質と考え
られる遅反応性アナフィラキシ−物質（Ｓｌｏｗ　Ｒｅ
ａｃｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ａｎａｐｈ
ｙｌａｘｉａ、以下ｒｓＲ８−ＡＪと略す）の生合成に
関与する酵素である。そしてその阻害物質は５Ｒ８−Ａ
の生成を抑制し、それに基づくアレルギーの治療剤と〔
発明が解決すべき問題点〕 現在、抗アレルギー剤として種々のものが使われている
が、これら各種治療薬は各々一長一短があり、いずれも
尚充分な治療効果７奏し得て２らず、新規なりポキシゲ
ナーゼ阻害物質の出現が期待されている。又悪性腫瘍は
その性質が千差万別であるため、新しい抗腫瘍性活性物
質が要望される。

〔問題ヘビ解決するだめの手段〕

そ二で木発月者らは種々検討した結果、ホーマ属に萬す
る一菌株がリポキシゲナーゼ阻害活性及び抗ｊ！・ｎ　
鴎作用乞有する式（１）で表わされる新規生理活性物質
ＮＫ−Ａ−］　７−ｃ−２３３’Ｉｔ産生ずることを見
い出した。

°本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。

上記新規物質ＮＫ　Ａ　　１７　　ｅ　　２３３はホー
マ萬Ｇ（萬するＮＫ−Ａ−１７−ｅ　−２３３生産菌？
暗養し、生理活性物質ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３乞生
成蓄積せしめ、この培養物より生理活性物質ＮＫ−Ａ−
］　７−ｅ　−２３３を採取することより得られる。Ｎ
Ｋ−Ａ−１７−ｅ−２３３の生産菌の代表的なものとし
て昭和５９年７月群馬県赤城山山・猿の土１より分離し
たＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３（微工研菌寄第８７９６
号（ＦＥＲＭ　ｐ−８７９６）以下「ＮＫ−Ａ　−３７
−ｅ　−２３３株コと略すりがあげられる。

以下にＮＫ−Ａ、　　］　７−　ｅ　−２３３株の１学
的注状を示す。

バレイショ・ブドウ糖寒天培地上＜　２．１　’ｃ培養
〕の生育は良く集落の径は２１日間で約３Ｃ′ｍに達す
る。集落は平たんで、比較的薄い基底菌糸層が発達する
。気化菌糸の発達は弱く、尽日で薄く着生する集落の表
面裏面ともうす黄〜うす黄茶を呈する。

サブ、ロー寒天培地上（２４℃）の生育は良く集落の径
は２１日間で約を、　５　ｔｙｒＩに達する。

集落の表面は波状で、尽日の気化菌糸を薄く着生する。

集落の表面裏面ともう丁黄茶〜黄茶乞呈する。

麦芽エキス寒天培地上（２４°Ｃ）の生育は艮く、集落
の径は２１日間で約１．５　Ｃｒｎに達する。

集落の表面は、しわ状で、尽日の気化菌糸を着生する。

集落の表面裏面ともつす黄茶〜黄茶乞呈する。

ツァペンク寒天培地上（２４℃）の生育は弱る。集落の
表面裏面とも赤味柴乞呈する。

Ｙｌ）Ｓｓ寒天培地上（２４℃）の生育は極めて良好で
、集落の径は２１日間でＬ　５　ｃｍに達する。

集落は半レンズ状で、尽日の気生菌糸乞着生する集落の
表面裏面ともうす黄〜赤味紫ン呈する。

またわずかに茶味の可溶性色素を生ずる。

各種培地上におけるビロード状の気化菌糸は尽日乞呈し
、直状に分枝し、隔壁２有し、表面は平滑で、その太さ
は１．５〜２．０μである。

１だ基底角糸は黄味茶から赤味紫乞呈し、極くわずかに
薄い黄色の可溶性色素ケ示す。

なお１本菌はＹｐＳｓ寒天培地上で球形ないし亜球形の
分生子殻（Ｐｙｃｎｉｄｉｕｍ）を多数形成し、網目状
の表面？呈し、その大きさは２０〜５０μを有し、開孔
口より無色、平滑の１．０〜１．５μ×２．０〜２．５
μの卵形もしくは倒置形の分生子（Ｐｙｃｎｉｄｉａｓ
ｐｏｒｅ　）　７押し出すのが特長である。また生育温
度は５℃〜３２°Ｃで至適温度は２４℃前後である。生
育ｐＨは４〜］Ｏで生育し、至適ｐＩ−１は７〜９であ
る。

以上の菌学的性質より本菌はＡｉｎｓｗｏｒｔｈ　＆−
Ｂｉｓｂｙｓ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ｆｕｎｇｉ　、　５ｅｖｅｒ＋＋ｈ　Ｅｄ山ｏｎ　１９
８３年、８７〜８８頁およびＴｈｅ　Ｃｏｅｌｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ、　ＦｕｎｇｉＩｍｐｅｒｆｅｃｊｉ　ｗｉｔ
ｈ　Ｐｙｃｎｉｄｉａ、　Ａｃｅｒｖｕｌｉａｎｄ　Ｓ
ｔｒｏｍａｔａ　ｂｙ　　　　′Ｂｒ１ａｎ　Ｃ，５ｕ
ｔｔｏｎ　（１９８０年）３７８〜３９］頁、さらに菌
類図鑑（下）宇田用俊−１椿　啓介著（ｊ９７８）１１
６７〜１１９３頁記載の不完全１類の中、分生子果不完
全囚網（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｓ　）、スフより　７’　
シフ。目（５ｐｈａｅｒｏｐｓｉｄａｂｓ　）のホー７
（Ｐｈｏｍａ　）　、（’ＩＥに属する一菌株であるこ
とが明らかになり、本菌株Ｙ、＜　Ｐｈｏｍａ　ｓｐ−
ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３と命名した。

本発明に用いるホー７に４する菌株は他のホーマ属の菌
株と同様、その性状が変化しゃすく例えば紫外線、エッ
クス線および薬品など用いる人工的変異手段で容易：・
て変異１一つるものであり、どの様な変異味であっても
本発明の対象とする生匪活性物質ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−
２３３の生産能暑有するものはすべて本発明に使用する
ことができる。

本発明によりＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３’ｇ製造する
には、先ず前記菌株ｔカビが利用し得ろ栄養物を含有す
る培地で好気的に培養する。栄養源としては、従来から
カビの培養に利用されている公知のものが使用でき、例
えば炭素源としてはグルコース、フラクトース、グリセ
リン、シュークロース、デキストリン、ガラクトース、
有機酸などを単独かまたは組み合せて用いることができ
る。無機および有機窒素源としては塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コ
ーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実油カス、カザミ
ノ酸、バクトソイトン、ソリュブル・ベジタブル・プロ
ティン、オートミールなどを単独ｌたは組み合わせて用
いることができる。その他必要に応じて食塩、炭酸カル
シウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛
、塩化マンガン、燐酸塩などの無機塩類を加えることが
できるほか有機物５例えばアミノ酸類、ビタミン類、核
酸類や無機物を適当に添加することかできる。

培養法としては液体培巷法、特に深部攪拌培養法が最も
適している。培養温度は】５°Ｃ〜３５℃、ｐＨは中性
ないし微酸性で培養を行うことが望ましい。液体培養で
は通常２〜４日間培養乞行うとＮＫ−Ａ＝］　７−ｅ−
２３３物質が培養液中に生成蓄積される。培養液中の生
成量が最大に達したときに培養を停止し、菌体と培養液
ｔＦ別し、それぞれより目的物を精製単離する。

菌体及び培養Ｆ液から本物質の精製単離には一般に徽生
物代謝生産物乞その培養液から単離するために用いられ
る分離精製の方法が利用される。

即ち、培養液は通常の濾過法でＰ液と菌体部に分離され
、炉液はｐＨ８，０にてｎ−ブタノール又は酢酸エチル
で抽出される。菌体部はメタノール又はアセトンで抽出
後、抽出溶剤乞減圧で溜去し、残った水溶液’Ｙ　ｐｎ
　ｓ、　Ｏにてｎ−ブタノール又は酢酸エチルで抽出す
る。Ｆ　Ｗより抽出された抽出液と菌体部から得られた
抽出液を合せて減圧濃縮を行い乾固すると褐色のアメ状
物質が得られる。この物質’（＜ｎ−ヘキサンで洗い溶
解物を除くと褐色の粉末が得られろ。この粉末を少量の
クロロホルムに溶かしシリカゲルを用い、クロロホルム
で展開するカラムクロマトグラフィーを行い活性分画を
集め、さらにセファデックスＬＨ−２０”ａ？用い、メ
タノールで展開するカラムクロマトグラフィーを行い活
性分画を集め減圧濃縮を行い乾固すると黄褐色の粉末が
得られる。この粉末ケ少量のクロロホルムを用いて５０
℃で溶解し、室温で放置して結晶の析出を行う。結晶を
分離した母液は濃縮後シリカゲルを用い、クロロホルム
で展開するカラムクロマトグラフィーを行い活性分画を
集め減圧濃液ヲ行い乾固し、上記と同様な操作７行い結
晶を取り出す。必要に応じてこの操作２繰り返す。

以上のよってして得られたＮＫ−Ａ−１７−ｅ　−２３
３の理化学的性状乞次に示す。

１）外　観 乙 無傷、の針状結晶 実測値　　６４．４５　５．８０　２９．７５理論値　
　６５，２２　　５．８０　２８．９８３）分子量 ２７６　（質量分析） ４）分子式 ％式％ ６）紫外線吸収スペクトル メタノール、酸性メタノール、アルカリ性メタノール溶
液中の紫外吸収と吸光係数値はそれぞれ λＪｌ／−／′（８１％）＝２８１．Ｏｎｍ（１２５，
０）ｍａｘ　　　　　　　　　　Ｉ　Ｃｒｎ、１ア″カ
リ性メタノ−”　（Ｅ　；　二）　＝２４５　ｎｍ　（
４３２Ω）。

ｒｎａｘ ２９０　ｎｍ　ｓｈ　（９０，０）。

３９０ｎｍ（７８，０） ７）赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠にて測定した赤外吸収スベクにルタ第１
図に示す。

８）溶剤に対する溶解性 メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、
酢酸エチル、クロロホルムジエチルエーテル、ピリジン
に可溶でありトルエンに難溶であり、０−ヘキサン、水
に不溶である。

９）呈色反応 塩化第二鉄反応、５０％硫酸（、ｖＯ熱）各反応に陽性
ライドン・スミス反応、ニンヒドリン反応に陰性を示す
。

】０）薄層クロマトグラフィーのＲｆ（［シリカゲル薄
層（Ｋｉｅｓｅｌ　ｇｅｌ　６０　Ｆ２５４０．２５ｍ
ｍ　Ｍｅｒｃｋ　）　’！ａ’使用しりｏｏホルム：メ
タノールニ］０：］おヨヒトルエン二アセトニトリル＝
５：２の各展開溶媒系で展開するとＲｆ＝０．３５およ
びＲｆ　＝　Ｏ，・１１を示す。

１１）　’Ｈ−核磁気共鳴スベクトル 重クロりホルム中テトラメチルシランを内部基準にして
測定した’Ｈ−ｙ磁気共鳴スペクトル７第２図に示す。

１２）　　”’Ｃ−Ｃ−核磁気共鳴スペクトルロロホル
ム中テトラメチルシランな内部基準にして測定した＋３
ｃ−核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ−値）７次
９９．６３６（ｄ）、　］　０５．８４５（ｄｉ、　］
　０８．３４９（ｄ）。

］　１０．７］　７（ｄｌ、　１３０．０５５（ｓｌ、
　１３０．３５９（ｓ）。

１３２．１８０（ｓｌ、　１３３．４４０（ｓｌ、　］
　４．４．４３０（ｓｌ。

］　４４．５９７（ｓｌ、　］　４９．３３３ｆｓｌ、
　１５７．５２９（ｓ１以上のデータ及び結晶のＸ線回
折のデータよりＮＫ　　Ａ〜１７−ｅ−２３３の構造は
前記のとおりであることが決定された。

本発明のＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３は後記の如く抗ア
レルギー剤及び制癌剤などの医薬品として期待されるも
のである。

医薬品として使用する場合の製剤化および投与方法は従
来公知の種々の方法が適用できろ。

すなわち、投与方法としては注射、経口、直腸投与など
が可能である。製剤形態としては注吋剤、粉末剤、頂粒
剤、錠剤、坐剤などの形態がとり得る。

製剤化の際にはＮＫ−Ａ−１７−ｅ　　２３３に悪影響
を与えない限り、医薬用に用いられる種々の補助剤、す
なわち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、
無痛化剤、乳化剤等が必要に応じて使用されつる。

製剤において、ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３の含量は製
剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般
にはＮＫ　−Ａ−１７−ｅ−２３３’ａｊ０．０］〜１
００％（重量）、好１しぐは０１〜７０％（重量）含有
し、残りは通常医薬用に使用される担体その他の補助剤
からなる。

ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３の投与量は症状等により異
なるが、成人１人１日当りＯ，ＯＪ〜８００■程度であ
る。、連投乞必要とする場合には１日当りの使用量ンお
さえろことが好ましい。

〔作　用〕

１．５−リポキシゲナーゼ阻害活性 （１）　　モルモット腹腔細胞の調整 ハートレイ系モルモット（体重２５０〜３５０ｇ）に２
％カゼイン乞腹腔内投与し投与１８時間後の腹腔細胞乞
採取する。混在する赤血球乞浴血させた後、遠心し得ら
れた細胞分画に１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　Ｏ，１％ゼラチ
ン、１４ｍＭインドメタシン乞含む５０　ｍＭ　１７ン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて、腹腔細胞】×１０個
／ｍｌになるように調整した。

（２）酵素反応 上記細胞懸濁液１．　Ｑ　ｍｌに各種濃度の供試化合物
を加え、３７℃、５分間インキュベートする。イオノフ
オアＡ２３］８７（１μｇ）、アラキドン酸（］０μｇ
）乞加え反応を開始すル。２０分後玉タノール４．０　
ｍｌを加え反応を停止し、反応上清ン天野ら（ビタミン
５９　２１１〜２１９．１９８５）の方法に従ってＨＰ
ＬＣ分析し、アラキートン酸の代謝物〔５−ヒドロキシ
エイコサテトラエノイック酸（５−ＨＥＴＥ））”Ｙ検
出した。阻害活性の結果２表−１に示す。

この表から明らかのように本発明のＮＫ−Ａ−１７−ｅ
−２３３の５−リポキシゲナーゼ阻害活性値（ＩＣｓｏ
）は約０．２２　μｇ／ｍｌである。

２．１２−ＩＪポキシゲナーゼ阻害活性（１）酵素反応 モルモットよりＰＲＰ（多血小板皿漿）を採取し、血小
板数が約１００万／μｌ　となるように調製する。この
ＰＲＰｏ、２５ｍ１７こ各［ｌ濃度の供試化合物乞加え
、さらにアラキドン酸５０μｇを塀え、３７℃、］５５
分５インキユベーシヨンした。反応は、エタノール１、
　Ｏｍｌ　Ｙ加えて停止させ１反応上清を５−リポキシ
ゲナーゼ活性同様Ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析し、アラキド
ン酸の代謝物〔］］２−ヒドロキシエイコサテトラエノ
イノクｅ　１２−ＨＥＴＥ））を検出した。阻害活性の
結果を表−２に示′ｆ９ 表−２ この表から明らかのように本発明のＮＫ−Ａ−１７−ｅ
−２３３の１２−リポキシゲナーゼ阻害活性値（ＩＣｓ
ｏ）は約１４．４μｇ／ｍｌである。

３、抗Ｈｅ　Ｌａ　ＣｅＬＬ活性 次にＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３の抗Ｈｅ　Ｌａ　Ｃｅ
ｌ　１活性について調べた結果に表−３に示す。

表−３ この表から明らかのように本発明のＮＫ−Ａ−１７−ｅ
−２３３の）（ｅ　Ｌａ　Ｃｅｌ　Ｉ阻害活性値（ＩＣ
ｓｏ）は約１９．０μｇ／ｍｌである。

４、急性毒性 マウスに対するＮＫ−Ａ−１’７−ｅ−２３３の急性毒
性値（Ｌ　Ｄｓｏ）は２００１１１ｇ　／　ｋｇ　（ｉ
ｐ　）以上２示した。

〔発明の効果〕

−Ａ−１７−ｅ−２３３は５−リポキシゲナーゼおよび
】２−リポキシゲナーゼ乞阻害することより新規抗アレ
ルギー症治療薬として、１だ新規制癌剤として期待でき
る。

以下本発明の実施例を示すが、これは単なる１例示であ
って何等本発明を限定するものではなく、種々の変法が
可能である。

実施例１゜ 】）発酵 下記の組成を有する種培養培地′？：５００ｍ１容の三
角フラスコに］ＯＯ＋ｎｌｙ分注し、１２０℃、２０分
間オートクレーブ滅菌した。これにＮＫ−Ａ−１７−ｅ
−２３３株（微工研囚寄第８７９６号）の−白金耳を接
種し、２５℃、２００回転／分の条件下で３日間培養し
た。

種培養培地組成 （イ） ブドウ糖　　　　０．５ ショ糖　　２．０ パクト・マルトエキストラクト（Ｄｉ　Ｆ　Ｃｏ　Ｌａ
　Ｉ３ｏ　Ｒａ　ｔｏＲｉｃｓ）　０．２Ｃａ　ＣＯ３
０，２５ Ｍｇ　ＳＯ，＋　　　　　　　０．０５Ｚｎ　ＳＯ４０
，Ｏ］ 水道水 ｐＩ（６，０ 下記の組成２有する生産培地Ｙ５００ｍｌ容の三角７；
ｙス：＋Ｋ１００ｒｒｌｙ分注し、１２０”Ｃ。

２０分間オートクレーブ滅函した。前記の種培養物２四
を各三角フラスコに接種し、２５℃、２００回転／分の
条件下で４日間培養した。培養液は吸引濾過し１戸液と
国体乞分離した。

（％） ブドウ糖　　　５．０ シ　　ヨ　糖　　　　１．０ 綿実油カス（Ｔｒａｄｅｒｓ　ｏｉｌ　ｍ１ｌｌ　ｃｏ
ｍｐａｎｙ　Ｕ−３−Ａ　）　　２．０ＣａＣＯ３０，
２５ ＭｇＳＯ４０，０５ ＮａＮＯ３０，０５ ＺｎＳＯ４０，Ｏ１ 水道水 ｐｒ−１６，０ （２）情調 得られた培養Ｐ液８０００ｍｌ乞ＩＮ−水酸化ナトリウ
ム溶液でｐＨｓ、　Ｏとし、酢酸エチル４０００ｍ１で
抽出した。一方菌体はアセトン１５００ｍｌで抽出を行
いこの抽出液を減圧ａ縮しアセトンを除去後１Ｎ−水酸
化ナトリウム溶液でｐＨ８，０とし、酢酸エチル５００
ｍ１で２回抽出を行い、培養ＰＲからの酢酸エチル抽出
液と合せて減圧濃縮乾固し６．５ｇの褐色アメ状物質を
得た。この物質をｎ−ヘキサン］００ｍ１で洗い、ｎ−
ヘキサンに可溶部を除去すると４．３３ｇの褐色粉末を
得た。

この粉末を１．Ｏｇ取り、少量のクロロホルムに溶かし
シリカゲルカラム５０　ｍｌ　（和光紬薬工業Ｋ　Ｋ製
ワコーゲルＣ−２００）にかけ、クロロホルムで展開す
る２０ｇ分画のクロマトグラフィーを行い、５５分画か
ら１００分画に活性が認められたのでそれらを集め減圧
濃縮乾固すると２４３０ｍｇの褐色の粉末が得られた。

この粉末を少量のメタノールに溶かし、セファデックス
ＬＨ−２０を３５０ｍ１元てんしたカラムてかけ、メタ
ノールで展開する２０ｇ分画のクロマトグラフィーを行
い、２８分画から３２分画の活性部を集めて減圧濃縮乾
固し１２５．３ｍｇの黄褐色の粉末が得られた。

さらＳてこの粉末を少量のクロロホルムに浴かしシリカ
ゲルカラム］０ｍ１（和光紬薬工業Ｋ　Ｋ製ワコーゲル
Ｃ−２００）にかけ、クロロホルムで展開する５０ｇ分
画のクロマトグラフィーを行・、・、ｊＯ分画から２０
分両の活性部を集め５　ｍｌ　ｌこなろでで；’ｉ１ｉ
　Ｅ　＝ＪＲ縮を行い室温で１（５時間数１ｉｆ　ｊろ
ことにより・１６６■の無色の針状結晶を得１こ、

【図面の簡単な説明】

第１図は臭化力１ノウム抹としてｄｔｌｌ定しＴこＮ　
Ｋ−Ａ−］　］７−ｅ−２３３の赤外線吸収スペクトル
を示す。第２図はＮ１（Ａ　　１７−ｅ−２３３の重ク
ロロホルム中でテトラメチルシランを内部基ｎＫして４
００　Ｍｌ−Ｉｚの装置で測定したＩＨ−核磁気共鳴ス
ペクトル曲線を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる新規生理活性物質ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２
   ３３。
2. （２）ホーマ属に属し、生理活性物質ＮＫ−Ａ−１７−
   ｅ−２３３を生産する能力を有する微生物を培地に培養
   し、培養物中に生理活性物質ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３
   ３を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
   生理活性物質ＮＫ−Ａ−１７−ｅ−２３３の製造法。