JPH06506202A - 医薬用キサントン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬用キサントン誘導体 本発明は、ＣＤ４結合剤として、かつ酵素プロティンキナーゼＣ（Ｐ　Ｋ　Ｃ） およびコラ−ゲナーゼの阻害剤として有用な化合物、その化合物の調製方法、お よびそれらを含む医薬用および獣医学用組成物に関する。

ＣＤ４は、クラスＩＩＭＨＣ分子と結合した抗原を認識するＴリンパ球の表面上 に表現される細胞表面糖タンパク質である。クラス■ＭＨＣ−ＣＤ４相互作用の 阻害は、抗体応答、混合リンパ球反応、およびＣＤ４”Ｔリンパ球が関与する他 の免疫応答を抑止する。これらの応答は、自己免疫、器官移植片拒絶反応、アレ ルギーおよび対宿主移植片疾患なとの病理状態において重要である。ＣＤ４は、 またヒト免疫不全ビールス（ＨＩＶ）の細胞レセプターともなっている。

ＰＫＣは、Ｔリンパ球の活性化に臨界的な関係を有している。Ｔ細胞抗原レセプ ターとその基質との相互作用は、ホスファチジルイノシトール脂質の代謝回転増 加、およびＰＫＣを活性化するジアシルグリセロール（ＤＡＣ）の生成を引き起 こす。

フラーゲナーゼは、結合組織メタロブロティナーゼ族の酵素の一員である。コラ −ゲナーゼは、組織中において、コラーゲンの代謝回転、リモデリングおよび分 解を制御している。コラーゲンの分解は、関節炎、癌転移、歯周病、角嗅潰瘍、 および骨または皮膚コラーゲンの過剰分解などの幾つかの病理状態で起こる。

我々は、真菌類株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｌａｂｒｕｍによる栄養培地の発 酵で式±の新規キサントン誘導体が産生され、このキサントン誘導体が単離、精 製され得ることを発見した。これら化合物は、ＣＤ４−結合剤であるとともに、 ＰＫＣおよびコラ−ゲナーゼの阻害剤である。

したがって、本発明は、武士のキサントン誘導体：〔式中、二が単結合で、かっ Ｒが−ＣＯＯＨであるが、或いは＝が二重結合で、かっＲがＨまたは−ＣＯＯＨ である（以後、本発明化合物と記す）〕と、医薬的および獣医学的に許容される その塩、エステルおよびエーテルとを提供する。本発明の好ましい化合物は。

２．４−ジアセチル−３−（２’　、３’　−ジヒドロ−５゛　−カルボキシ− ６′、７°　−ジヒドロキシクロモン−３゛−イル）−６，７−ジヒトロキンキ サントンー８−カルボン酸（化合物（Ａ））；２．４−ジアセチル−３−（５’ 　−カルボキシ−６’、７’　−ジヒドロキシクロモン−３′−イル）−６，７ −シヒドロキシキサントンー８−カルボン酸（化合物〔Ｂ〕）およびその過メチ ル化誘導体：および ２．４−ジアセチル−３−（６’　、７°−ジヒドロキシクロモン−３°−イル ）−６，７−シヒドロキシキサントンー８−カルボン酸（化合物〔Ｃ〕）である 。

二が単結合、かっＲが−ＣＯＯＨである式±の誘導体、即ち化合物（Ａ）は、以 下の式又で示される異性体構造で表すこともできる。この異性体も、本発明の範 囲内に入る。したがって、本明細本発明化合物は、我々が株Ｘ８０６３と命名し 、以下の形態学上のデータに基づいて、真菌類Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｌａ ｂｒｕｍの菌株として同定した微生物から単離された： 真菌類株Ｘ８０６３は、５°Ｃ１２５℃および３０”Ｃの各温度にて、７日間、 以下の成長培地中でインキュベートされた（ＰＩＴＴ、　Ｊ、１．。

＋９７９；　Ｔｈｅ、　Ｇｅｎｕｓ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ 　Ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ　ＳｔａｔｅｓＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｎ ｄ　Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓによる）：酵母エキス含有ツアペック寒天（ＣｚＹａ　；蒸留水１リツトルに 対する組成・スクロース　３０ｇ＝酵母エキス　５ｇ、寒天　２０ｇ：ＫＨｔ　 ＰＯ，Ｉｇ：ＮａＮ０ｔ　０．３ｇ；Ｍｇ５Ｏ。

・７Ｈ，ＯＯ，０５ｇ；ＫＣＩ　Ｏ，０５ｇ；Ｆｅ５０．　７Ｈ、ＯＯ，ＯＯＩ ｇ）；グルコースおよびペプトン含有麦芽エキス寒天（ＭＥＡ、蒸留水１リツト ルに対する組成：麦芽エキス　２０ｇ、グルコース　２０ｇ、バクトーペブトン 　１ｇ、寒天　２０ｇ）：グリセロールニトレート寒天（０２５Ｎ：蒸留水７５ ０ｍ１に対する組成　酵母エキス　３．７ｇ；グリセロール　２５０ｇ；ＫＨ２ ＰＯ，０，７５ｇ：ＮａＮ０＝　０．２２５ｇ；ＭｇＳＯ４”７ＨｔＯ３７，５ ｍｇ；ＫＣＩ　３７．５ｍｇ；Ｆｅ５０．　・７）（ｔ　Ｏ０，７５ｍｇ）。

顕微鏡下の特徴は以下の通りであった１分生子柄は、表面菌糸から生しる。分生 子柄の国柄は、長さ２００μｍまで、幅４〜５μｍであり、平滑な壁によって頂 のう化（頂のう輻６〜７μｍ）する。

輪生は、末端（副末端ではない）に生じ、単輪生化し、１０〜１６の密着した梗 子からなる。梗子は、（１０）−１２−１３ｘ４〜５μｍのフラスコ型。分生子 は、直径３．５〜４．５μｍであり、かすかに痒／小皺を持つ壁を有した球形。

分生子は、長く、かっ極く明確な縦隊となって生じる。

各成長培地上における全体のコロニー形態は、以下の通りである（色彩は、Ｂｒ １ｔｉｓｈ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ　Ｂ５３８１Ｃ：１９８０；　Ｃｏ１ｏｕｒｓ　ｆｏｒ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ、ｃｏｄｉｎｇ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉａｌｐｕｒｐｏｓｅｓにしたが ってコード化した）：温度２５°でのＣｚＹａ　：コロニーは、直径３１〜４０ ｍｍ、偏平で放射状溝を有する。テクスチャーは、ベルベット性か低い。境界は 、浸され、完全であり、略１ｍｍに広がる。菌糸体は、白色からライトベージュ （３６６）で、偏平であり、胞子形成がなく、外周２〜４　ｍ　ｍ　ａ中央部は 、白色であるが場所によってはやや緑がかった色彩で、分生子発生が乏しい。浸 出液および菌核はない。ペイルクリアーイエローの拡散色素が産生される。拡散 領域は、直径時５０　ｍ　ｍ　ｏ裏面は、表面菌糸体と同色で、イエローイッシ ュベイルクリーム（３５２）。

温度２５°でのＭＥＡ　：コロニーは、直径３０〜３１ｍｍ、偏平で放射状溝を 有さない。テクスチャーは、ベルベット性が低い。境界は、浸されておらず、完 全。空気中で成長した菌糸体は、非常に疎らで、色彩は成熟胞子マスに依存する ：外周域（５ｍｍ縁部）は、略ペイルクリーム（３５２）からライトストロ−（ ３８４）であるが、ややより黄色、中央域はほぼライトグレー（６３１）からエ アクラフトグレー（６９３）であるが、ややより青色。分生子発生は緩やか。浸 出液および菌核はない。拡散色素は、直径時５０ｍｍの拡散領域で産生され、そ の色彩は、クリアーブライトペイルイエロー。裏面は、ペイルクリーム（３５２ ）からダークアース（４５０）の範囲で、中央に向かって暗色となる。

温度２５°てのＧ２５Ｎ　コロ＝−は、直径１２〜１３　ｍｍ、偏平て放射状溝 を存す。テクスチャーは、ベルヘット性が低い。境界は、浸され、完全。外周域 （１〜２ｍｍ）は、無色から白色。中央域は、白色からベリーペイルイエロー。

分生子発生は非常に乏しく、明確な胞子マス色はない。浸出液および菌核はない 。拡散色素はない。裏面は、白色からペイルブライトイエロー（キャナリーイエ ロー３０９よりやや青白い）。

温度５°でのＣｚＹａ　：微成長、コロニーは直径３から５　ｍ　ｍ　。

房毛のある分生子の産生は、明らかに、株Ｘ８０６３を族Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ ｍに位置づける。上記した株Ｘ８０６３の他の顕微鏡下での特徴および全体形態 学上の特徴から、Ｐｉｔｔ、　Ｊ、１．、１９７９．　ＴｈｅＧｅｎｕｓ　Ｐｅ ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ　５ｔａｔｅ ｓ　Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍある）の菌株とするのか最も適当な分類であろ う。

株Ｘ８０６３は、１９８７年に、Ｆｅｍｅｓ、　Ｌａｔ＋ｚａｒｏｔｅで採取さ れた土壌サンプルから単離され、ブタベスト条約に基づき、英国、サーリ州、リ ソチモント市、キューにあるＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ ｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅに、受託番号ＣＭ＋　３３６４５６として寄託された。

上記説明では、本発明化合物の生産に用いることか可能なＰｅｎ１ｃｉｌ！ｉｕ ｍ　ｇｌａｂｒｕｍの菌株が詳述されている。しかしながら、本発明は本発明の 化合物を産生ずる株Ｘ８０６３の突然変異体の使用をも包含している。例えば、 自然淘汰によって得られた突然変異体、或いは紫外線照射などの電離放射線の照 射、ニトロソグアニジンなとの化学突然変異誘発因子または同様の処置などを含 む突然変異化能因によって得られた突然変異体などもまた、本発明の範囲内に包 含される。

本発明は、さらに、式１のキサントン誘導体、または医薬的あるいは獣医学的に 許容されるその塩、エステルおよびエーテルの調製方法を提供し、この方法は、 （ｉ）炭素、窒素および無機塩源中で、真菌類株Ｘ８０６３　（ＣＭＩ　３３６ ４５６）または上記キサントン誘導体を産生し得るその突然変異体を発酵させ、 （ｉｉ）発酵培地から上記キサントン誘導体を単離し、（ｉｉｉ）所望により、 上記キサントン誘導体を、医薬的あるいは獣医学的に許容されるその塩、エステ ルおよびエーテルに転換することからなる。

本発明化合物は、典型的には、Ｐｅｎｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｌａｂｒｕｍの産生株 Ｘ８０６３、またはＸ８０６３の産生突然変異株を用いた、後述条件下での水性 栄養培地の好気性発酵の間に産生される。水性培地としては、多くの抗生物質の 産生に用いられる水性培地が適している。このような栄養培地は、微生物によっ て吸収可能な炭素源および窒素源を含んでいる。所望により、無機塩か、一般的 には低レベルで、加えられてもよい。加えて、発酵培地は、微生物の成長および 所望化合物の産生に必要な微量の金属を含んでいてもよい。これらは、通常、栄 養源として用いることができる炭素および窒素複合源中に充分な濃度で存在する か、所望により、別途培地に添加されてもよいことは、勿論である。

したかって、本発明はさらに、真菌類株Ｘ８０６３、または式１のキサントン誘 導体を産生ずるその突然変異体の生物学的純粋培養物を提供する。このような培 養物は、実質的に他の微生物を含んでいない。本発明は、また、真菌類株Ｘ８０ ６３、または式ｌのキサントン誘導体を産生ずるその突然変異体の発酵方法を提 供し、この方法は、真菌類株Ｘ８０６３、または式Ｉのキサントン誘導体を産生 ずる突然変異体を炭素、窒素および無機塩源中で発酵させることからなる。

吸収可能な炭素、窒素およびミネラル源は、単純栄養あるいは複合栄養によって 供給することができる。炭素源としては、一般的には、グルコース、マルトース 、スターチ、グリセロール、糖蜜、デキス１−リン、ラクトース、スクロース、 フラクトース、カルホン酸、アミノ酸、グリセリド、アルコール、アルカンおよ び植物油などを挙げることかできる。炭素源は、一般的には、発酵培地の０．５ 〜ｌＯ重量％である。

窒素源としては、一般的には、大豆ミール、コーンステイープリカー、ディステ ィラーズソリュブルズ、酵母エキス、綿実ミール、ペプトン、落花生ミール、麦 芽エキス、糖蜜、カゼイン、アミノ酸混合物、アンモニア（ガスまたは溶液）、 アンモニウム塩または硝酸塩を挙げることができる。尿素および他のアミドも用 いることか可能である。窒素源は、一般的には、発酵培地の０．１−１０重量％ である。

培養培地に加えてもよい栄養ミネラル塩としては、ナトリウム、カリウム、アン モニウム、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、コバルト、マンガン、バナジウ ム、クロム、カル７ウム、銅、モリブデン、はう素、リン酸塩、硫酸塩、塩化物 およびカーボネートなとのイオンを生成することが可能な、一般的に用いられる 塩を挙げることかできる。

消泡剤は、過剰発泡を制御するために存在していてもよく、必要な時間間隔て添 加される。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｌａｂｒｕｍを用いた発酵は、２０°Ｃ−４０°Ｃ １好ましくは２４°Ｃ〜３０°Ｃの温度範囲で行なうことかできる。最適の結果 を得るためには、これらの発酵を２４〜２６°Ｃの温度範囲で行なうことが最も 便利である。化合物を産生ずるのに適した栄養培地の出発ｐＨは、５０〜８．５ の間で変更させることかでき、好ましい範囲は５５〜７５である。

小規模発酵は、便利には、公知の滅菌技術によってフラスコ内に適正量の栄養培 地を入れ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｌａｂｒｕｍの胞子または栄養細胞成長 物をフラスコに接種し、綿毛でフラスコに緩く栓をし、そして２〜ｌＯ日間、９ ５〜３００ｒｐｍの回転攪拌機にて、約２５°Ｃの一定室温で発酵を進めさせる ことで行なわれる。発酵は、また、液体培地あるいは半固体培地上の静的培養で 行なうことも可能である。

大規模事業のためには、発酵は、攪拌機および発酵培地の曝気手段を備えた適正 なタンク内で行なわれることか好ましい。栄養培地は、滅菌後のタンク内に用意 され、そしてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｌａｂｒｕｍの栄養細胞成長物源か接 種される。発酵は、２４°Ｃ〜３７°Ｃの温度範囲て、栄養培地を攪拌および／ または曝気しながら、１〜８日間継続させられる。曝気の程度は、発酵器の大き さおよび攪拌速度等の幾つかの要因に依存している。一般的には、大規模発酵は 、約９５〜５００ｒｐｍで攪拌され、約０．５〜１．５ＶＶＭ（空気体積／培地 体積・分）の曝気率である。

本発明化合物は、主に株Ｘ８０６３の発酵リカー中に存在しており、以下に説明 するように除去、分取することができる。

発酵ブロス全体からの本発明化合物の分取、およびその回収は、溶媒抽出と、そ れに続く、様々なりロマトグラフィー技術および溶媒システムを用いたクロマト グラフィー分別とによって行なわれる。

純粋な本発明化合物は、このようにして単離された。

本発明化合物は、酸性であり、中性またはアルカリ性水性溶媒に溶解する。非イ オン化形態において、この化合物は、極性有機溶媒、例えばジメチルスルホキシ ドなとに溶解する。不純である場合、非荷電形態のこの化合物は、より広い範囲 の有機溶媒、例えばジクロロメタンおよび酢酸エチルなどに溶解する。したかっ て、ある回収方法では、発酵ブロス全体かｐＨ３まて酸性化され、水−不混和性 溶媒、例えば酢酸エチルと組合わされる。一般的には、最高の回収を達成するた めに、数回の抽出物が要求される。溶媒は所望の化合物を除去するが、他の物質 もまた除去する。

所望の化合物か酸である場合、それらは、酢酸アンモニウムまたはりン酸ナトリ ウムなとの塩の緩衝アルカリ水溶液で、水−不混和性溶媒抽出物を逆抽出するこ とて精製することかできる。この方法では、本発明化合物はイオン化され、水層 に抽出される。次いて、本発明化合物と他の酸性化合物は、水層をｐＨ３まで酸 性化し、新たな水−不混和性有機溶媒で再抽出することにより、回収することか できる。この溶媒抽出物は、次いて、減圧上濃縮される。

大規模発酵に特に有用な、所望化合物をリカーから回収する他の方法は、リカー をｐＨ３まで酸性化し、この酸性化リカーを多孔性疎水性樹脂、例えはダイヤイ オンＨＰ２０（三菱化成（株））を充填したクロマトグラフィーカラムに通すこ とである。この樹脂は、酸性水溶液、たとえば酢酸水溶液なとて洗浄された後、 メタノールなとの水−混和性を機溶媒て溶離される。メタノール溶離液は、酢酸 エチルまたは他の水−不混和性有機溶媒で希釈する前に、減圧濃縮され、前段落 に記載されるように、アルカリ性緩衝水溶液による逆抽出、水性逆抽出物の再酸 性化、有機溶媒への再抽出および濃縮によって精製される。

これら２つの抽出方法で生産された残留物は、次いで、オクタデシルシリカなと の吸着剤を含むカラムで、酸性条件下、逆相高速液体クロマトグラフィ＝（ｈｐ 　ｌ　ｃ）によってさらに精製される。カラムは、所望の化合物と他の酸性不純 物を保持する。これは、酢酸水溶液なとの酸性水溶液と、テトラヒドロフラン（ ＴＨＦ）なとの水−混和性有機溶媒との混合物によって溶出される。混合物中の 有機溶媒の割合か増加すると、殆との不純物が溶離した後、所望の化合物か溶離 する。次いで、溶離液のフラクションは、典型的には濃縮され、実施例４．６お よびｌＯに説明されるように、フォトダイオードアレイ検出を伴う分析用ｈｐｌ ｃによって所望の化合物の存在を検査される。本発明の化合物の各々は、次いて 、その紫外／可視スペクトルおよび保持時間から個々に同定することができる。

所望の化合物を含む溶離液は、酢酸エチルのような水−不混和性有機溶媒によっ て抽出され、所望の化合物はその抽出物の蒸発によって回収される。所望の化合 物は、上述のｈｐｌｃ精製段階で用いられたのと同し溶媒混合物を用い、定溶媒 組成で溶離されたオクタデシルノリ力力ラムでの逆相ｈｐｌｃによって、さらに 精製され、同様の方法で抽出することによって、溶離液から回収される。

分析的ｈｐｌｃあるいは他の公知技術の使用は、所望の化合物を含む精製組成物 をもたらすであろうし、その存在は、ＣＤ４結合活性、Ｐ　ＣＫ阻害活性および ／またはコラ−ゲナーゼ阻害活性、或いは物理化学的特徴について、種々のクロ マトグラフィーフラクションを分析することによって決定される。

式１のキサントン誘導体は、医薬的または獣医学的に許容されるその塩、エーテ ルおよびエステルに転換することができる。式１のキサントン誘導体は、従って 、その過（Ｃ，〜Ｃ，アルキル化）誘導体、例えはその過メチル化または過エチ ル化誘導体なとの過（０１〜Ｃ，アルキル化）誘導体に転換してもよい。好適な 塩としては、ナトリウムおよびカリウムなとのアルカリ金属の塩、およびアンモ ニウム塩を挙げることかできる。

好適なエーテルは、分岐または非分岐、飽和または不飽和、置換または未置換の Ｃ３〜Ｃ１の脂肪族エーテルであり、典型的には０１〜Ｃ，のアルキルエーテル である。好ましいアルキルエーテルは０１〜Ｃ４のアルキルエーテル、例えばメ チルおよびエチルエーテルである。典型的には、エーテルは、過アルキルエーテ ルである。

エーテル基は、水酸基、またはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素なとのハロゲン によって置換されていてもよい。

このようなエーテルは、好適な不活性溶媒中ての、ジアゾメタンなとのノアシア ルカンによるキサントン誘導体の処理、または塩基の存在下ての、適当なハロゲ ン化アルキル、スルフォン酸エステルまたはスルホン酸ジアルキルによる処理に よって調製することかできる。好ましい塩基としては、アルカリおよびアルカリ 土類金属水酸化物、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、およびアルカリおよ びアルカリ土類金属炭酸塩を挙げることができる。

好適なエステルとしては、分岐または非分岐、飽和または不飽和、置換または未 置換のＣ２〜Ｃ８のアルコールとで形成されるエステルを挙げることかできる。

メチル、エチルおよびビニルエステルか典ｕ例である。このようなエステルは、 上記エーテルと同様の方法で調製できる他、好適な酸触媒または活性化剤の存在 下、適当なアルコールでキサントン誘導体を処理することによって調製すること かできる。

本発明化合物およびその塩、エステルおよびエーテルは、ＣＤ４結合剤、ＰＫＣ またはコラ−ゲナーゼ阻害剤としての用途を有している。これらは、ＭＨＣクラ ス■分子とＣＤ４の相互作用を阻害することにより、ＣＤ４の生理学的機能をブ ロックすることかできる。

したかって、人間または動物、例えば哺乳類は、式１のキサントン誘導体、ある いはその医薬的および獣医学的に許容されるその塩、エステルまたはエーテルを 、治療法上価値な量で投薬することからなる方法によって治療され得る。

ＣＤ４結合剤は、ＭＨＣクラス■−制限応答を選択的に阻害する。

したかって、本発明化合物、その塩、エステルおよびエーテルは、免疫抑制剤と して、特に、例えばリューマチ様関節炎、全身性狼癒、真性糖尿病、多発性硬化 症および原発胆汁性硬変なとの自己免疫症、対宿主移植片（Ｇ　Ｖ　Ｈ）疾患お よび器官移植片拒絶反応の治療に用いることかできる。これらは、また、喘息な とのアレルギー症、および炎症性腸疾患なとの炎症性疾患の治療に用いることか できる。

ＣＤ４結合剤は、細胞中へのＨＩＶの進入を防止するのに効果的であり、したか って抗ＨＩＶ剤として治療法上価値かある。

本発明化合物は、可溶性組換えＣＤ４　（ｓＣＤ４　（Ｖｌ＋Ｖ２）：Ｅ、ｃｏ ｌｉより）と、モノクローナル抗体Ｌ　ｅ　ｕ　３　ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉ ｃｋｅｎｓｏｎ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ　）との相互作用に基づく エリサアッセイにおいて活性である。Ｍｅｒｋｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ　ｅｔ　ａ ｔ　（１９９０）が説明するように、Ｌｅｕ３ａは、ＣＤ４のＶｌドメイン上の エピトープに結合する（Ｍｅｒｋｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、　Ｍ、、　Ｂｕｃｋ、 　Ｄ、、　Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、　Ｐ、Ｃ，Ｌ、　ａｎｄＳａｔｔｅｎｔａｕ、　 Ｑ、Ｊ、　（１９９０）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ａｎａｌｙ ｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅＣＤ４　ｍｏｌｅｃｕｌｅ″、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 　１４５２８３９−２８４５）。本発明化合物は５ＣＤ４に結合してＬｅｕ３ａ の結合を阻害し、幾つかの実験の結果として計算されたＩＣ５゜値は、２．５μ Ｍ（化合物〔Ａ〕）、ｌＯｕＭ＜化合物〔Ｂ〕）および２２μＭ（化合物〔Ｃ〕 ）であった。表１〜３は、本発明化合物の様々な濃度において観察された阻害間 を示す。

化合物の濃度　ＭＸＩＯ”　％　阻害 化合物の濃度　Ｍｘ　Ｉ　Ｏ＠　％　阻害化合物の濃度　ＭＸＩＯ’　％　阻害 化合物（Ｂ）は、また、ＣＤ４−依存Ｔ細胞応答の阻害に基つく機能アッセイに おいて、そのＣＤ４への結合と相関関係を有する活性を示した。この化合物は、 血液から単離された正常Ｔリンパ球のＣＤ４依存−ストレブトリンン誘発性増殖 応答を阻害し、表４のデータに示されるように、９μｍの［Ｃｓ。を有した。こ の化合物は、おもにＣＤ２に依存するミトゲン誘発性（Ｐ　ＨＡ　）応答を、濃 度１００μＭまで阻害しない。

化合物の濃度　ＭＸＩＯ’　％　リンパ球増殖阻害５ＬＯ−刺激性　ＰＨＡ−刺 激性 化合物ＣＢ）は、ＣＤ４依存の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）をも阻害する。表５ に示されたデータは、化合物（Ｂ）が、ツーウェイＭ１．Ｒを、ＩＣ，，７μＭ で阻害したことを示している。同様の実験において、ＣＤ４Ｔ細胞癌系Ｈ３Ｂ− ２におけるこの化合物の細胞増殖抑制性／細胞毒性効果を示す証拠は、濃度１０ ０μＭまでなかった。

化合物の濃度　ＭｘｌＯ＠　％ＭＬＲ阻害　％Ｈ３Ｂ−２細胞増殖阻害 ＰＫＣ阻害剤としての役割において、本発明化合物、その塩、エステルおよびエ ーテルは、広範囲の癌様状態を軽減するために用いることかできる。したがって 、これらは抗癌剤としての用途を有している。これらは、したがって、乳癌、甲 状腺癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌および脳腫瘍などの癌、特にＰＫＣか原因因子と して関連する癌の治療に用いることかてきる。

本発明化合物、その塩、エステルおよびエーテルは、炎症状態を軽減するために 用いることかでき、したかって、抗炎症剤としての用途を有している。これらは 、炎症状態、例えば関節炎の治療方法に用いることかできる。

ＰＫＣの阻害剤は、Ｔ細胞活性化をも阻害し、自己免疫症の治療にも用いること ができる。本発明化合物、その塩、エステルおよびエーテルは、したかって、自 己免疫症の治療における用途を有しており、例えば、全身性狼癒、重症筋無力症 および糖尿病なとの治療に用いることかできる。

ＰＫＣの阻害剤は、また、免疫抑制剤としても作用する。したかって、本発明化 合物、その塩、エステルおよびエーテルは、免疫阻害剤どしての用途を有してお り、ヒトおよび動物における免疫反応を抑制する方法に用いることができる。例 えば、本発明化合物、その塩、エステルおよびエーテルは、器官移植片拒絶反応 を抑制する方法に用いることかできる。

本発明化合物は、実施例１２に示すように、ＰＫＣ阻害アッセイにおいて活性で ある。このアッセイによれば、本発明化合物が、ウノ脳から精製されたＰＫＣの 活性を阻害することが発見され、幾つかの実験の結果として計算されたＩＣ，。

値は、２μＭ（化合物〔Ａ〕および化合物ＣＢ））、６μＭ（化合物〔Ｃ〕）で あった。

コラーゲナーゼは、疾患の状態において広範な役割を果たす。コラ−ゲナーゼ阻 害剤としての役割において、本発明化合物、その塩、エステルおよびエーテルは 、リューマチ様の関節炎および骨形成不全症、癌転移、歯周病、角膜潰瘍、およ び骨または皮膚コラーゲンの過剰分解および池の疾患なとの状態を軽減するため に用いることかてきる。

コラ−ゲナーゼ阻害活性のアッセイは、ＨａｒｒｉｓおよびＶａｔｅｒによって 説明されるように、ヒトコラ−ゲナーゼによるラットタイプ■コラーゲンゲルの 分解に基づいている（Ｈａｒｒｉｓ、　Ｅ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｖａｔｅｒ。

Ｃ，Ａ、　（＋９８２）　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｘｙｍｏｌｏｇｙ 　（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｌ、Ｗ、ａｎｄＦｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ、Ｏ，Ｗ、 、ｅｄｓ）、Ｖｏｌ　８２　ｐａｒｔ　＾、ｐｐ　４２３−４５２゜Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）。

分解の程度は、クーマシーブリリアントブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌ ｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）て、残存基質を染色した後に評価される。ラット尾腿タイ プＩコラーゲンは、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ　（＋８２　）によって説 明された方法によって部分的に精製され（Ｍｉｌｌｅｒ、ε、Ｊ、　ａｎｄＲｈ ｏｄｅｓ、　Ｒ，に、（＋９８２）　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ　（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ。

Ｌ、Ｗ、　ａｎｄ　Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ、　Ｏ，Ｗ、、　ｅｄｓ）、　Ｖｏ ｌ　８２　ｐａｒｔ　Ａ、　ｐｐ　３３−６４゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、ヒトコラーゲナーゼは、ヒト組織球性悪性リンパ種 細胞系（Ｕ９３７）のならし培地から誘導される。

酵素産生はＰＭＡ　（ホルボールミリステートアセテート）の添加によって刺激 され、潜伏酵素はトリプシンで活性化される。

以上で説明されるようなコラ−ゲナーゼ阻害アッセイにおいて、本発明化合物か 、ラット尾麿タイプＩコラーゲンに対するヒトコラーゲナーゼ活性を阻害するこ とが発見され、そのＩＣ，。値は、２μＭ（化合物〔Ａ〕）および４μＭ（化合 物〔Ｂ〕）であった。２５μＭの濃度において、化合物（Ｃ）は５３％のコラ− ゲナーゼ阻害を引き起こした。以下の表６および７は、様々な濃度で観察された 阻害の程度を示す： 表６　化合物（Ａ）によるコラ−ゲナーゼ阻害の程度化合物の濃度　ＭＸＩＯ’ 　％　阻害 表７：化合物ＣＢ）によるコラ−ゲナーゼ阻害の程度化合物の濃度　ＭＸ　Ｉ　 Ｏ＠　％　阻害本発明化合物、その塩、エステルおよびＬ−チルは、様々な投薬 形態、例えば、タブレット、カプセル、糖あるいはフィルム被覆タブレット、液 状の溶液または分散体なとの形態にて経口で、あるいは、筋肉内、静脈内あるい は皮下なとに非経口で投与することができる。本発明化合物、その塩、エステル およびエーテルは、しだがって、注射および点滴によって投与することかできる 。

本発明化合物、その塩、エステルまたはエーテルの１種の投薬量は、年令、体重 および患者の状態、および投与経路なとの様々な要因に依存する。しかしなから 、典型的には、大人への各投薬経路に適用される投薬量は、０．００１〜＋ｏｍ ｇ／ｋｇ体重、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。このような 投薬量は、−日に１〜５回投与することかできる。本発明化合物、その塩、エス テルまたはエーテルは、治療薬量で無毒である。

本発明化合物、その塩、エステルまたはエーテルは、医薬的あるいは獣医学的に 許容される担体または希釈剤をも含む医薬用または獣医学用組成物として用いる ために調剤される。組成物は、典型的には、従来の方法にしたかって調製され、 医薬的あるいは獣医学的に適切な形態で投与される。

例えば、固体経口形態は、活性化合物とともに、ラクトース、デキストロース、 サッカロース、セルロース、コーンスターチあるいはポテトスターチなとの希釈 剤：ンリ力、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸 カルシウムおよび／またはポリエチレングリコールなとの潤滑剤、スターチ、ア ラビアゴム、セラキノ、メチルセルロース、カルボキノメチルセルロース、ある いはポリヒニルビロリドンなとの結合剤、スターチ、アルギン酸、アルギン酸塩 、あるいはナトリウムスターチグリコレートなとの崩壊剤、起泡混合物、染料、 甘味料、レシチン、ポリソルベート、硫酸ラウリルなとの湿潤剤を含んでいても よい。これら調剤は、例えは、混合工程、造粒工程、タブレット化工程、糖被覆 工程あるいはフィルム被覆工程なとの公知方法で製造することかできる。

経口投与のための液状分散体は、シロップ、エマルジョンおよびサスペンション であってもよい。ンロソブは、担体として、例えはサッカロース、あるいはサッ カロースとグリセロールおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトー ルとを含んでぃてもよい。

特に、糖尿病患者のためのシロップは、例えばソルビトールのような、グルコー スに代謝されないが、または単に非常に少量がグルコースに代謝される物質のみ を担体として含むことができる。サスペンションおよびエマルジョンは、担体と して、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロ ース、カルボキノメチルセルロースまたはポリビニルアルコールなどを含むこと かできる。

筋肉注射のためのサスペンションまたは溶液は、活性物質とともに、例えは、滅 菌水、オリーブオイル、オレイン酸エチル、プロピレングリコールなとのグリコ ール等の藁学的に許容される担体、および、所望により、適量の塩酸リドカイン なとを含んてぃてもよい。

静脈注射または点滴のための溶液は、担体として、例えば一般的な注射用水であ る滅菌水を含んでぃてもよい。しかしながら、好ましくは、滅菌された水性の等 張食塩溶液の形態をとることができる。

あるいは、化合物はリポソーム内にカプセル化されていてもよい。

以下の実施例によって、本発明を詳述する。

実施例１−液体培地（１）中ての株Ｘ８０６３の培養ＰＤＡ　（２％デキストロ ース、１５％寒天、０．４％ジャガイモエキス）上で成長させた成熟傾斜培養物 を、５ｍｌの１０％グリセロール水溶液中に懸濁することによって、株Ｘ８０６ ３の出発材料を調製した。−＋３５°Ｃての貯蔵から復帰させた、１．５ｍｌク ライオバイアル中のこのサスペンション１ｍｌは、出発材料を含んでいる。０． ５ｍｌの出発物質を、エーレンマイヤーフラスコ内の栄養溶液Ｓ（１５％グリセ ロール、１５％大豆ペプトン、１％グルコース、０５％麦芽エキス、０．３％Ｎ ａＣｌ、Ｏ，１％ＣａＣｏ、、０．１９６ツイーン８０，０．１％Ｊｕｎｌｏｎ 　ＰＷＩＩＯ，ｐ　Ｈ６）２０ｍｌ中に無菌的に維持して、２５°Ｃにて２日間 ２４０ｒｐｍで震盪することにより、プレカルチャーを製造した。この期間の後 、さらに２０ｍ１の栄養溶液Ｓが追加され、この第二プレ力ルチャーを、２４０ ｒｐｍのロータリーンニーカー内で、３日間２５°Ｃにてインキュベートした。

その後、第二ブレカルチャーを３リツトルの攪拌式発酵器内の栄養溶液３２．０ リツトル中に無菌的に移し、２５°Ｃにて３日間インキュベートして中間カルチ ャーを製造した。

中間カルチャーを７５す７）ルの攪拌式発酵器内の栄養溶液Ｐ（６，０４％糖蜜 、０３３９％カゼイン酵素加水分解物、０．１％ＣａＣＯ５，０，１％ツイーン ８０．０．００６％フィチン酸ナトリウム、ｐＨ６）５０リツトル中に無菌的に 移し、２５℃にてインキュベートして生産カルチャーを製造した。５日後、生産 物を抽出するためにリカーを収穫した。

また、株Ｘ８０６３は、２５℃にて８日間２４０ｒｐｍで震盪される試験管内の 栄養溶液Ａ（２，３５％スクロース、０．９７％ＭＥＳ緩衝液、０．９６７％グ ルタミン酸モノナトリウム、０．０５％Ｍ　ｇＳ　Ｏａ　・７Ｈ１０，０，０５ ％ＫＣＩ、０゜００３７％Ｋ。

ＨＰＯ，，０，００２％ＣａＣＬ−２Ｈ，０１２０ｍ１Ｌ−’ビタミン混合物Ｉ 、５ｍ１Ｌ−’微量元素混合物■、１ｍ１Ｌ−’ツイーン８０）中でインキュベ ートされたカルチャー内で良く成長した。

ビタミン混合物は、以下からなる（ｍｇＬ−’）：チアミン　２５、リボフラビ ン　２５、パントテン酸　２５、ナイアシン　２５、ピリドキシン　２５、チオ 酢酸　２５、葉酸　２，５、ビオチン　２゜５、ジアノコバラミン　２，５、パ ラアミノ安息香酸　２，５、ビタミンに、２．５゜ 微量元素混合物■は、以下からなる（１リットル当り）：１ｍｌＩＭ　Ｈｔ　Ｓ Ｏ，，２８７ｍｇ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ！　０１２２３ｍｇ　Ｍｎ５ＣＬ　・４Ｈ ２０、＋２５ｍｇ　Ｃｕ５Ｏａ　・５Ｈ＊０１８３ｍｇ　Ｋｌ、６２ｍｇ　Ｈ２ ＢＯｓ、４８ｍｇ　ＮａＭｏ０ａ’２Ｈ２０，４８ｍｇ　ＣＯＣ！２　・６Ｈｔ 　Ｏ。

−昼夜放置した。’Ｍ　ｍＷを濾過によって収集し、メタノール１０．　０５Ｍ 酢酸水溶液（１：Ｉ、５．０リツトル）にて洗浄し、メタノール（！０リットル ）で溶離した。メタノール溶離液をロータリーエバポレーションによって約１リ ツトルの体積まで濃縮し、次いで０゜状態まで濃縮し、目的のＣＤ４結合化合物 を含む褐色ガム（２０゜２ｇ）を得た。

実施例３−化合物（Ａ）の精製 実施例２て調製された酢酸エチル抽出物の一部（４ｇ）をメタノール（２０ｍｌ ）に溶解し、０．０５Ｍ酢酸水溶液（３０ｍｌ）で希釈した。この溶液を、Ｗａ ｔｅｒｓラジアルコンブレッジジンモジュールに含まれたＰｒｅｐＰａｋカート リッジカラム（内径２５ｍｍＸ長さ１００　ｍｍ、　Ｎｏｖａ−Ｐａｋ　ＨＲオ クタデシルシリカ、孔径６０人、粒径６μＭを充填、Ｗａｔｅｒｓ）において、 流速１５ｍ１／分にて４０分間にわたり１５％ＴＨＦから３０％ＴＨＦまで線状 に増加するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０．０５Ｍ酢酸水溶液の濃度勾配で 溶離する分離逆相ｈｐｌｃによって精製した。溶離液を３２０ｎｍでモニターし 、保持時間３２〜３７分でのピークを含むフラクションを収集して酢酸エチルで 抽出した。

この酢酸エチル抽出物を濃縮し、ＴＨＦｌｏ、０５Ｍ酢酸水溶液（ｌ　ｌ、６ｍ １）に再溶解し、次いて流速１２ｍ１／分にて、ＴＨＦｌｏ、０５Ｍ酢酸水溶液 （３：　７）で定溶媒組成て溶離される同様のＰｒｅｐＰａ１オクタデシルシリ カカラムての分離逆相ｈｐｌｃによって精製した。溶離液を４００ｎｍてモニタ ーし、１２〜１５分でのピークを含むフラクションを収集して酢酸エチルで抽出 した。

酢酸エチル抽出物を乾燥状態まて濃縮し、メタノール１０．０５Ｍ酢酸水溶液（ １１，６，０ｍ１）に再溶解した。

この溶液を、流速１２ｍ１／分にて、メタノール１０．０５Ｍ酢酸水溶液（４５ ：５５）て溶離される同様のＰｒｅｐＰａｋオクタデシルノリ力力ラムを用いた 第二定溶媒組成逆相ｈｐｌｃ工程によってさらに精製した。保持時間１０〜１２ 分でのピークの中心からの溶離液を収集して酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル 抽出物を乾燥状態まで濃縮し、本発明化合物の黄色固体（２９ｍｇ）を得た。

実施例３て説明された、株Ｘ８０６３の発酵物の粗製抽出物の第一分離用逆相ｈ ｐｌｃ分画から得た部分的精製フラクションを、分析用逆相ｈｐｌｃによって、 所望の化合物の存在につき検査した。

この分析は、Ｗａｔｅｒｓ　６００Ｅ多重溶媒供給システム、Ｗａｔｅｒｓ　ｌ Ｊ６に注射器およびＷａｔｅｒｓ　９９０フオトダイオ一ド整列検出器からなる ｈｐｌｃシステムにおいて、流速２ｍ１／分にて、ＴＨＦｌｏ、０５Ｍ酢酸水溶 液（３７）の定溶媒組成で溶離されるＷａｔｅｒｓラジアルコンブレソンヨンモ ランールに含まれたＷａｔｅｒｓラジアルＰａｋカートリッジ（内径８ｍｍＸ長 さｌ　００　ｍｍ５Ｎｏｖａ−Ｐａｋオクタデシルシリカ、孔径６０人、ｆ立径 ４μＭを充填、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行なわれた。本発明化合物は、フォトダ イオード検出器を用いたそのＵＶ／可視スペクトルによって同定した（酸性条件 下てのλｍａｘ：３６５±４ｎｍ、３１６±３ｎｍ、２４０ｎｍ（ｓｈ））、こ れは、７〜１０分の範囲の保持時間を典型的に有するピークとして現れた。

化合物（Ａ〕は、以下に示すような紫外（ＵＶ）　、赤外（ｉｒ）、核磁気共鳴 （ｎｍｒ）および質量スペクトル（ＭＳ）上の特徴を有していた。

化合物（Ａ）の１Ｈおよび”ＣＮＭＲスペクトルは、化合物（Ａ）の２つの異性 体型からの重複シグナルからなる。

ＡＢ／ＭＮＢΔスペクトルにおけるｍ／ｚ５７９でのイオンを測定した・ 観測質量　＝５７９．０７９０ （２測定値の平均） Ｃ２１Ｈ１ＩＯ１１とした計算質量　＝５７９．０７７５実施例５−化合物（Ｃ ）の精製 実施例２て調製された酢酸エチル抽出物の一部（８，４ｇ）をメタノール（４０ ｍｌ）に溶解し、０．０５Ｍ酢酸水溶液（４０ｍｌ）で希釈した。この溶液を、 ＷａｔｅｒＳラジアルコンプレッションモジュールに含まれたＰｒｅｐＰａｋカ ートリッジカラム（内径２５ｍｍＸ長さｌ　ＯＯｍｍ、　Ｎｏｖａ−Ｐａｋ　ｔ ｌＲオクタデシルシリカ、孔径６０人、粒径６μＭを充填、Ｗａｔｅｒｓ）にお いて、流速１５ｍ１／分にて４０分間にわたり１５％ＴＨＦから３０％ＴＨＦま て線状に増加するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０．０５Ｍ酢酸水溶液の濃度 勾配て溶離する分離逆相ｈｐｌｃによって精製した。溶離液を３６９ｎｍでモニ ターし、保持時間３１〜３７分でのピークを含むフラクションを収集して酢酸エ チルで抽出した。

この酢酸エチル抽出物を濃縮して褐色固体（１，０２ｇ）を得た。

これを、メタノール１０．０５Ｍ酢酸水溶液（ｌ：１．５ｏｍｌ）に再溶解し、 次いで流速１６ｍ１／分にて、ＴＨＦｌｏ、’０５Ｍ酢酸水溶液（３：　７）の 定溶媒組成て溶離される同様のＰｒｅｐＰａｋオクタデシルンリ力力ラムでの分 離逆相ｈｐｌｃによって精製した。溶離液を３２０ｎｍでモニターし、１０〜１ ４分でのピークを含むフラクションを収集して酢酸エチルで抽出した。酢酸エチ ル抽出物を乾燥状態まで濃縮して黄褐色固体（２５２ｍｇ）を得、これをメタノ ール−００５Ｍ酢酸水溶液（１：Ｌ　１５ｍ１）に再溶解した。

この溶液を、流速１８ｍ１／分にて、最初８分間の４５％メタノールから始まり 、次いで２分間にわたって４５％から５５％メタノールまて線状に増加するメタ ノール−０，０５Ｍ酢酸水溶液の濃度勾配て溶離される同様のＰｒｅｐＰａｋカ ラムを用いた第二定溶媒組成逆相ｈｐｌｃ工程によってさらに精製した。溶離液 を３２０ｎｍでモニターし、６．５〜９分でのピークの中心からの溶離液を収集 し、００５Ｍ酢酸水溶液でｌ：ｌまで希釈し、次いて酢酸エチルで抽出した。酢 酸エチル抽出物を乾燥状態まで濃縮し、黄褐色固体（３５ｍｇ）を得た。これを 、メタノール−０，０５Ｍ酢酸水溶液（ｌ：１．７ｍ１）に再溶解し、次いて流 速１８ｍ１／分にてメタノール−０，０５Ｍ酢酸水溶液（４５：５５）で溶離さ れる同様のＰｒｅｐＰａｋカラムを用いた定溶媒組成逆相ｈｐｌｃによって精製 した。

溶離液を３２５　ｎｍでモニターし、保持時間８．０〜９．２分でのピークを含 む溶離液を収集し、０．０５Ｍ酢酸水溶液で１・１まて希釈して酢酸エチルで抽 出した。酢酸エチル抽出物を乾燥状態まで濃縮し、メタノール−０，０５Ｍ酢酸 水溶液（１：１．６ｍ１）に再溶解した。この試料を、流速１８ｍ１／分にて、 メタノール−０，０５Ｍ酢酸水溶液（４５：５５）で溶離される同様のＰｒｅｐ Ｐａｋカラムを用いた他の定溶媒組成逆相ｈｐｌｃ精製工程に付した。溶離液を ３２５ｎｍで再度モニターし、７〜９分で溶離するピークを含む溶離液を収集し 、０．０５Ｍ酢酸水溶液でｌ：Ｉまで希釈して酢酸エチルで抽出した。酢酸エチ ル抽出物を乾燥状態まで濃縮し、本発明化合物の褐色固体（５，２ｍｇ）を得た 。

実施例６−分析用高速液体クロマトグラフィーによる化合物（Ｃ）の検出 実施例５て説明された、分離用逆相ｈｐｌｃ分画の各々からの部分的精製フラク ションを、分析用逆相ｈｐｌｃによって、所望の化合物の存在につき検査した。

この分析は、Ｗａｔｅｒｓ　６００Ｂ多重溶媒供給システム、Ｗａｔｅｒｓ　Ｕ ６に注射器およびＷａｔｅｒｓ　９９０）　ｔトダイオード検出器からなるｈｐ ｌｃシステムにおいて、流速２ｍ１／分にて、メタノール−０，０５Ｍ酢酸水溶 液（１：　Ｉ）の定溶媒組成で溶離されるＷａｔｅｒｓラジアルコンプレッショ ンモジュールに含まれたＷａｔｅｒｓラジアルＰａｋカートリッジ（内径８ｍｍ Ｘ長さ１００ｍｍ、Ｎｏｖａ−Ｐａｋオクタデシルシリカ、孔径６０人、粒径４ μＭを充填、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行なわれた。本発明化合物は、フォトダイ オード検出器を用いたそのＵＶ／可視スペクトルによって同定した（酸性条件下 てのλｍａｘ：３２２±３ｎｍ、２８７±５ｎｍ、２０６±３ｎｍ）。これは、 ３５〜４．５分の範囲の保持時間を典型的に有するピークとして現れた。

化合物（Ｃ）は、以下に示すような紫外（ＵＶ）　、赤外（ｉｒ）、核磁気共鳴 （ｎｍｒ）および質量スペクトル（ＭＳ）上の特徴を有する ＵＶ、　λＭｅＯＨ（ｌｏｇ＋Ｊ）　ｎｍ：　３８１（４，０５）、　２８５（ ４，１２）。

ｍａｘ　２３０（４，４０）、　２０８（４，４５）。

ＵＶ　λＭｅＯＨＯ，ＩＭ　１（ＣＩ　（ｌｏｇ＋ｏＥ）　ｎｍ：３２１（４， １１）、　２８５（４，１８）。

ｍａｘ　２０５（４，４５） 化合物（Ｃ）の”Ｃｎｍｒスペクトルは、２５炭素原子からのシグナルを示した 。はぼ２００ｐｐｍと予想される２つのアセチルカルボニルからのシグナルは、 シグナル対ノイズ比か低いために観測されなかった。

ＰＤＡ　（２％デキストロース、１５％寒天、０．４％ジャガイモエキス）上で 成長させた成熟傾斜培養物を、５ｍｌの１０％グリセロール水溶液に懸濁するこ とによって、株Ｘ８０６３の出発材料を調製した。−１３５°Ｃでの貯蔵から復 帰させた、１．５ｍｌクライオバイアル中のこのサスペンション１ｍｌは、出発 材料を含んている。０５ｍｌの出発物質を、試験官内の栄養溶液Ｓ（１，５％グ リセロール、１．５％大豆ペプトン、１％グルコース、０．５％麦芽エキス、０ ．３９６ＮａＣ１，０，１％ＣａＣ０１，０，１％ツイーン８０．０１％Ｊｕｎ ｌｏｎ　ＰＷＩＩＯ１ｐＨ６）２０ｍｌ中に無菌的に維持して、２５°Ｃにて２ 日間２４０ｒｐｍて震盪することによりプレカルチャーを製造した。

このインキュベーション期間に続いて、さらに２０ｍ１の栄養溶液Ｓを無菌的に 追加し、この新たな混合物を、さらに２日間２５℃にてインキュベートして、第 二成長段階を形成した。次いで、２リツトルアスピレータ中の栄養溶液３２５０ ｍ１に、第二プレカルチャーを無菌的に移し、２５°Ｃで３日間、５００ｒｐｍ にて攪拌することて第三プレカルチャーを製造した。

第三ブレカルチャーを、ｌＯリットルの栄養溶液Ｐ（６，０４％糖蜜、０．３３ ９％カゼイン酵素加水分解物、Ｏ１％ＣａＣＯ５，０，１％ツイーン８０．０． ００６％フィチン酸ナトリウム、ｐＨ６）を含む１４リットル無菌発酵器内に移 し、２５°Ｃにてインキュベートして生産カルチャーを製造した。５日後、抽出 のためにリカーを収穫した。

実施例８−株８０６３の発酵物からの化合物（Ｂ）の抽出実施例７のように調製 された株Ｘ８０６３の発酵物１０リツトルを遠心し、菌糸体を廃棄した。水性上 澄みのｐＨを氷酢酸で６．５から３０に調節し、酸性化上澄みを酢酸エチル（２ Ｘ４．５リツトル）で抽出した。その後、酢酸エチル抽出物（６，５リツトル） を、Ｏ，１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（３Ｘ１．６リツトル）で逆抽出した。第 一酢酸アンモニウム抽出物のｐＨを、濃縮オルトリン酸を加えることによって、 ４．９から２．６に調節し、次いで、この酸性化逆抽出物を酢酸エチル（２Ｘ１ ．０リツトル）で抽出した。

この酢酸エチル抽出物を乾燥状態（３，８ｇ）まで濃縮し、メタノール（ｌＱｍ ｌ）に再溶解した。第二水性逆抽出物（ｐＨ５，５）を同様に酸性化し、抽出し 、次いで濃縮して目的化合物をやや多く含む精製材料（１，５ｇ）をより多量に 得た。

１１縮第−逆抽出材料のメタノール溶液を、流速１５ｍ１／分にて４０分間にわ たり！５％ＴＨＦから３０％ＴＨＦまで線状に増加するテトラヒドロフラン（Ｔ ＨＦ）１０．５Ｍ酢酸水溶液濃度勾配で溶離されるラジアルコンプレッションモ ジュールに含まれたＮｏｖａＰａｃｋオクダデソルシリカカラム（内径２５ｍｍ Ｘ長さ１００ｍｍ）での分離逆相ｈｐｌｃによって精製した。溶離液を３５０ｎ ｍでモニターし、保持時間２３〜２７分でのピークを収集して酢酸エチルで抽出 した。

この酢酸エチル抽出物を濃縮し、ＴＨＦｌｏ、０５Ｍ酢酸水溶液（ｌ　３．２０ ｍ１）に再溶解し、次いで流速１５ｍ１／分にて、ＴＨＦ−０，０５Ｍ酢酸水溶 液（２・８）で定組成的に溶離される同様のＮｏｖａ　Ｐａｋオクタデシルシリ カカラムでの分離逆相ｈｐｌｃによって精製した。溶離液を３５０ｎｍでモニタ ーし、保持時間２０〜２１分でのピークを含む溶離液を収集して酢酸エチルで抽 出した。

酢酸エチル抽出物を乾燥状態まて濃縮し、粗製物１（４０ｍｇ）を得た。

実施例９−化合物ＣＢ）の精製 実施例８から得た粗製材料を、実施例８で説明されたカラムおよび定溶媒組成シ ステムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる第二精製工程に付した。保持 時間２０〜２１分でのピークの中心からの溶離液を収集し、次いで酢酸エチルで 抽出した。酢酸エチル抽出物を乾燥状態まで濃縮し、化合物（Ｂ）の黄色固体（ ２１ｍｇ）を得た。化合物ＣＢ）は、以下に示すような紫外（ＵＶ）、赤外（ｊ ｒ）、核磁気共鳴（ｎｍｒ）および質量スペクトル（ＭＳ）上の特徴を有する。

化合物ＣＢ）の正確な質量は、質量分析によって決定された。ＦＡＢ／ＭＮＢＡ 分析におけるｍ／ｚ５７７でのイオンを測定した。

観測質量　＝５７７．０７３０ Ｃ２ｓＨ＋＋０＋ｔ　とした計算質量　＝５７７．０６１２実施例１〇−分析用 高速液体クロマトグラフイーによる化合物〔Ｂ〕の検出 実施例９て説明された、分離用逆相ｈｐｌｃ分画からの部分的精製フラクション を、分析用逆相１’Ｎ）ｌｃによって、所望の化合物の存在につき検査した。こ の分析は、Ｗａｔｅｒｓ　６００Ｅ多重溶媒供給システム、Ｗａｔｅｒｓ　ｌＪ ６に注射器およびＷａｔｅｒｓ　９９０フオトダイオード検出器からなるｈｐｌ ｃシステムにおいて、流速２ｍｌ／分にて、メタノール−０，０５Ｍ酢酸水溶液 （４：　６）で定組成的に溶離されるＷａｔｅｒｓラジアルコンプレッションモ ジュールに含まれたＷａｔｅｒｓラジアルＰａｋカートリッジ（８ｍｍ内径ｘｌ ｏｏｍｍ長さ、Ｎｏｖａ−Ｐａｋオクタデソルシリ力、孔径６０人、粒径４μＭ を充填、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行なわれた。本発明化合物は、フォトダイオー ド検出器を用いたそのＵＶ／可視スペクトルによって同定した（酸性条件下ての λｍａｘ・３２２±４ｎｍ、２８６±４ｎｍ、２３７±４ｎｍ）。これた。

実施例１１−化合物ＣＢ）のメチル化 化合物ＣＢ）（５ｍｇ）をテトラヒドロアラン（２，５ｍ１）中に溶解し、Ｄｉ ａｚａｌｄ試薬（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−ｐ−）ルエンスルフォンアミト、 Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ）に対する濃水酸化ナトリ ウム水溶液の反応により生成するエーテル中の過剰ジアゾメタン溶液によって処 理した。１５分後、反応混合物を乾燥状態まで回転蒸発させ、褐色固体を得た。

この褐色固体は、以下の質量分析から化合物ＣＢ）の過メチル化誘導体として同 定された・実施例１２−ＰＫＣ阻害活性のアッセイＰＫＣ阻害活性を、酵素によ るＰＫＣ−特異基質のリン酸化を減少させる化合物の能力として定量化した。ア ッセイでは、ウシ脳から精製されたＰＫＣ１酵素活性の必要補序因子（カルシウ ム、リン脂質およびホルボールエステル）、ＥＧＦレセプターにおける自然−発 生ＰＫＣリン酸化部位から誘導されたペプチド基質、および供与基質［γ”Ｐ］ 　ＡＴＰが用いられた。

１０８ｍ　［γ”Ｐ］ＡＴＰ混合物（０，０４μＣｉ／アツセイ）の添加により 反応が開始される前に、Ｃａ”、フォスフアナジルセリン／ホルボールエステル のミセル、ペプチド基質および阻害剤を含むインキュベート用混合物７５μｌを 、２５°Ｃにて５分間ブレインキュベートした。２５°Ｃでの２時間のインキュ ベーションの後、５０μｍの希釈オルトリン酸を加えることによって、反応を終 了させた。１００μｍのアリコートを、リン酸セルロース紙正方形片（ｌ　ｃｍ ｘ　１　ｃｍ）上にスポットし、この結合紙を、７５ｍＭオルトリン酸中に、１ 枚に付き少なくともｌＱｍｌのこの洗浄剤が許容されるように置いた。２０分間 、間欠的かつ穏やかに攪拌した後、洗浄剤を、等量の新しい洗浄剤と置き換えた 。さらなる２０分間の洗浄期間の後、この紙を、各々シンチレーションバイアル 中に導入し、シンチレーションカウンター内で、ｓｓｐをカウントした。

ペプチドに組み込まれた２ｔｐは、結合紙によって定量的に測定された。得られ た結果は、適当なブランク（無酵素、無基質）を用いた非特異的効果によって訂 正された。ＰＫＣ活性の阻害は、以下の式を用いて決定された。

％　阻害　＝ 以下の表８および９は、様々な濃度で観察された阻害の程度を示している。

表８　化合物（Ａ）およびＣＢ）によるＰＫＣの阻害化合物の濃度　ＭＸＩＯ＠ 　％　阻害 （Ａ）　（Ｂ） 表９：化合物（Ｃ）によるＰＫＣの阻害化合物の濃度　ＭＸＩＯ＠　％　阻害 実施例１３−医薬用組成物 各々０．１５ｇであり、２５ｍｇの本発明化合物を含むタブレ・ノドが、下記方 法により製造可能である。

１０．０００タブレット分の組成物 本発明化合物（２５０ｇ） ラクトース（８００ｇ） コーンスターチ（４１５ｇ） タルクパウダー（３０ｇ） ステアリン酸マグネシウム（５ｇ） 本発明化合物、ラクトースおよび半量のコーンスターチを混合する。次いで、こ の混合物を、メツシュサイズ０．５ｍｍの網を通させる。コーンスターチ（１０ ｇ）を、温水（９０ｍｌ）に懸濁する。

得られたペーストを用いて、粉末を粒状化する。得られた粒質物を乾燥し、メツ シュサイズ１．４ｍｍの網の上で微粉砕する。残量のスターチ、タルクおよびス テアリン酸マグネシウムを加え、注意深く混合し、タブレットに加工する。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３１／３５　 ＡＣＶ　７４３１−４ＣＡＤＰ　７４３１−４Ｃ ＡＤＵ　７４３１−４Ｃ ＡＤＹ　７４３１−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　１／１４　Ａ　７２３６−４Ｂ（Ｃ１２Ｎ　１／１４ Ｃ１２Ｒ１：８０） （Ｃ１２Ｐ　１７１０６ Ｃ１２Ｒ１：８０） （３１）優先権主張番号　９１１６５９３．６（３２）優先日　１９９１年８月 １日 （３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９２０５３ ０１．６（３２）優先日　１９９２年３月１１日（３３）優先権主張国　イギリ ス（ＧＢ）Ｉ （７２）発明者　リグレイ、ステファン　キースゲレートプリテン及び北アイル ランド連合王国　パックス、エッチビー１０　０キユー（７２）発明者　チャン ドラ−、グレンダ　ルイーズグレートブリテン及び北アイルランド連合王国　バ ークス、ニスエル３９エッチェヌ、、ダチェット、ホートン　ロード （７２）発明者　コリンズ、マーク　アンドニー　デーピッド グレートプリテン及び北アイルランド連合王国　バークス、ニスエル１９ジェー ワイ、スラフ、シッペンハム、スカーボローウェイ　２３ （７２）発明者　フォックス、フランシスグレートプリテン及び北アイルランド 連合王国　パックス、エッチピー９２テイー（７２）発明者　ムーア、マイケル グレートプリテン及び北アイルランド連合王国　サーレイ　ジーニー１５１エヌ ジエー　キャンバ−レイ、フレラボロー　ヒル、フェアウェイ　ハイド　１１

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式Ｉを有するキサントン誘導体：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、−−−−が単結合で、かつＲが−ＣＯＯＨであるか、或いは−−−−が 二重結合で、かつＲがＨまたは−ＣＯＯＨである〕、および医薬的および獣医学 的に許容されるその塩、エステルおよびエーテル。
2. ２．２，４−ジアセチル−３−（２′，３′−ジヒドロ−５′−カルボキシ−６ ′，７′−ジヒドロキシクロモン−３′−イル）−６，７−ジヒドロキシキサン トン−８−カルボン酸；２，４−ジアセチル−３−（５′−カルボキシ−６′， ７′−ジヒドロキシクロモン−３′−イル）−６，７−ジヒドロキシキサントン −８−カルボン酸およびその過メチル化誘導体；および２，４−ジアセチル−３ −（６′，７′−ジヒドロキシクロモン−３′−イル）−６，７−ジヒドロキシ キサントン−８−カルボン酸から選択される請求項１記載の化合物。
3. ３．（ｉ）炭素、窒素および無機塩源中で、真菌類株Ｘ８０６３（ＣＭＩ３３６ ４５６）または上記キサントン誘導体を産生し得るその突然変異体を発酵させ； （ｉｉ）発酵培地から上記キサントン誘導体を単離し；（ｉｉｉ）所望により、 上記キサントン誘導体を、医薬的あるいは獣医学的に許容されるその塩、エステ ルおよびエーテルに転換することからなる請求項１で定義されるキサントン誘電 体、あるいは医薬的または獣医学的に許容されるその塩、エステルまたはエーテ ルの製造方法。
4. ４．治療により、ヒトまたは動物の処置方法において用いられる請求項１記載の 化合物。
5. ５．ＣＤ４結合剤として用いられる請求項４記載の化合物。
6. ６．自己免疫症、対宿主移植片疾患または器官移植片拒絶反応の処置に用いられ る請求項５記載の化合物。
7. ７．リューマチ様関節炎、全身性狼瘡、真性糖尿病、多発性硬化症または原発胆 汁性硬変の処置に用いられる請求項６記載の化合物。
8. ８．アレルギー症または炎症性疾患の処置に用いられる請求項５記載の化合物。
9. ９．抗ＨＩＶ剤として用いられる請求項５記載の化合物。
10. １０．プロテインキナーゼＣ阻害剤として用いられる請求項４記載の化合物。
11. １１．コラーゲナーゼ阻害剤として用いられる請求項４記載の化合物。
12. １２．抗癌剤、抗炎症剤、自己免疫処置剤または免疫抑制剤として用いられる請 求項１０または１１記載の化合物。
13. １３．医薬的あるいは獣医学的に許容される担体または希釈剤および、活性成分 としての、請求項１記載の化合物、その塩、エステルまたはエーテルを含む医薬 用または獣医学用組成物。
14. １４．請求項１で定義される式Ｉのキサントン誘導体を産生するＰｅｎｉｃｌｌ ｉｕｍ　ｇｌａｂｒｕｍ　Ｘ８０６３（ＣＭＩ３３６４５６）またはその突然変 異体。
15. １５．請求項１で定義される式Ｉのキサントン誘導体を産生する真菌類株Ｘ８０ ６３（ＣＭＩ３３６４５６）またはその突然変異体の生物学的に純粋な培養物。
16. １６．株Ｘ８０６３またはその突然変異体を、炭素、窒素および無機塩源中で発 酵させてなる、真菌類株Ｘ８０６３（ＣＭＩ３３６４５６）または請求項１で定 義される式Ｉのキサントン誘導体を産生するその突然変異体の発酵方法。