CZ284121B6

CZ284121B6 - Seskviterpeny, způsob jeho přípravy a farmeceutické nebo veterinární přípravky je obsahující

Info

Publication number: CZ284121B6
Application number: CZ951646A
Authority: CZ
Inventors: Didier Vincent Renno; Gerard Bernard O´Beirne; Brent Raymond Copp
Original assignee: Xenova Limited
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1998-08-12
Also published as: GB9503413D0; CZ164695A3; IL108140A; NZ258986A; GB2284603B; MX9400174A; AU5709694A; HUT71859A; TW242141B; IL108140A0; BR9307712A; EP0675888A1; BG99736A; CA2151251A1; HU9501840D0; NO952483D0; JPH08504804A; KR950704324A; FI953081A; US5565486A

Abstract

Seskviterpeny připravitelné z plísňového kmene Acremonium strictum X06/15/458 a jejich farmaceuticky a veterinárně přijatelné soli jsou inhibitory vazby benzodiazepinu k ionomorfnímu receptorovému komplexu GABA-benzodiazepin-Cl.sup.-.n.. Tyto sloučeniny se připraví (i) fermentací ve zdroji uhlíku, dusíku a anorganických solí plísňovým kmenem X/15/458 (IMI 354451) nebo jeho mutantem, který produkuje příslušné seskviterpeny, (ii) izolací seskviterpenů z fermentačního média a (iii) je-li to žádoucí, převedením uvedeného seskviterpenu na farmaceuticky nebo veterinárně přijatelnou sůl.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nové skupiny seskvisterpenů, tj. benzodiazepinů vyznačujících se schopností vázat receptory. Vynález se dále týká způsobu přípravy těchto sloučenin, farmaceutických a veterinárních přípravků obsahujících tyto sloučeniny a mikroorganizmu, tj. biologicky čisté kultury plísně je produkující.

Dosavadní stav techniky

Benzodiazepin (Bz) je obecný termín pro popis strukturně příbuzných sloučenin se základní benzo-l,4-diazepinovou strukturou (Haefely a kol., Advances in Drug Res. 14. 165-322 (1985)). Farmakologickým výzkumem některých dřívějších syntetických analogů tohoto nového kruhového systému bylo zjištěno, že benzodiazepiny vykazují trankvilizační a antikonvulzantní účinky. Další zkoumání vedlo k objevení chlordiazepoxidu (Librium) pro farmaceutické použití v r. 1960.

Rozsáhlé elektrofýziolosické a návazné studie prokázaly, že mechanizmus benzodiazepinů spočívá v allosterické modulaci hlavního inhibičního neuropřenašeče, gama-aminobutanové kyseliny (GABA). Přesněji, tento účinek vedl k hyperpolarizaci neuronů zvýšením Cl“ iontů pomocí komplexního ionomorfního receptorového komplexu GABA-Bz-Cl“. Tento receptorový komplex byl označen jako subtyp A nebo GABA_a.

Většina běžně popsaných benzodiazepinů jsou agonisty a působí zesílením GABA inhibičního efektu. Proto způsobují sedativní, hypnotické, antikonvulzantní a anxiolytické účinky. Parciální (s nízkou účinností) agonisty jsou také zajímavé jelikož snižují nežádoucí účinky léčby benzodiazepinem, jako jsou sedativní účinek, tolerance a návyk, při udržení jejich klinického účinku. Inverzní agonisty mající biologické účinky které jsou opačné než účinky běžných benzodiazepinů, tj. konvulzanty . mají také význam při zlepšování paměti. Antagonisty postrádají biologickou účinnost, působí však proti zvýšeným shora uvedeným účinkům, tj. při předávkování.

Spojitost mezi strukturou a účinností je u benzodiazepinů plně charakterizována a farmaceuticky identifikována. Důraz se přenesl na identifikaci endogenních receptorových ligandů nebo na nové struktury jako na potenciální nová léčiva. Byly nalezeny různé třídy chemických sloučenin (např. benzazepiny, β-karboliny, cyklopyrrolony, fenylchinoliny, triazolpyridaziny a imidazopyridiny), které jsou v tomto směru aktivní. Zopiklon (derivát cyklopyrrolonu) a zolpidem (imidazopyridin) vykázaly hypnotickou účinnost.

Nyní bylo zjištěno, že fermentace živného prostředí kmenem plísní Acremonium strictum (Xenova organismus X06 15/458, IMI 354451) produkuje nové sloučeniny, které inhibuji vazbu benzodiazepinů k benzodiazepinovému receptoru přítomném v ionoformním receptorovém komplexu GABA-Bz-Cl“. Tyto sloučeniny jsou nové a společně se svými syntetickými deriváty tvoří novou třídu sloučenin.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou seskviterpeny obecného vzorce I

(I) ve kterém - - a - - a - - b - - znamená jednoduchou vazbu nebo jeden znamená jednoduchou vazbu a druhý znamená dvojnou vazbu; A, společně s - - a - - , - - b - - a atomy uhlíku ke kterým

jsou vázány tvoří kruh vybraný ze skupiny
				R
	r.			^0H
	T-X				=\
(a)		(b)		a	z*⁰
			-
5					OH
ve kterém R znamená H nebo OH

a Y znamená dvojnou vazbu nebo, jestliže A znamená kruh (a) jak je definován výše, Y znamená buď dvojnou vazbu, nebo tvoří společně s atomy uhlíku, ke kterým je vázán epoxidovou vazbu,

a jejich farmaceuticky nebo veterinárně přijatelné soli.

V jednom provedení mají seskviterpeny obecného vzorce I následující strukturu II

(Π) ve které -Y- znamená dvojnou vazbu nebo tvoří společně s atomy uhlíku ke kterým je vázán epoxidovou vazbou

V dalším provedení seskviterpeny obecného vzorce I mají následující strukturu III

(III) ve které R znamená H nebo OH.

V dalším provedení mají seskviterpeny obecného vzorce I následující struktury IV

- j CZ 284121 B6

(IV) ve které X znamená nebo

Seskviterpen obecného vzorce II, ve kterém Y znamená dvojnou vazbu je zde definován jako 10 sloučenina A. Seskviterpen obecného vzorce II ve kterém Y tvoří s atomy uhlíku ke kterým je vázán epoxidovou skupinu je zde uváděn jako sloučenina A'. Seskviterpen obecného vzorce III ve které R znamená OH je zde uváděn jako sloučenina B. Seskviterpen obecného vzorce III ve kterém R znamená H je zde uváděn jako sloučenina C. Sodná sůl (15-ONa) sloučeniny A je sloučenina D. Seskviterpen obecného vzorce IV ve kterém X znamená

je sloučenina E. Seskviterpen obecného vzorce IV ve kterém X znamená

-4 CZ 284121 B6

je sloučenina F. Sloučenina F je 15,16 ortochinonový derivát sloučeniny E. Termín „sloučeniny pole vynálezu” je zde použit pro všechny seskviterpeny obecného vzorce I a pro jejich farmaceuticky a veterinárně použitelné sole.

Seskviterpen obecného vzorce I byl izolován z mikroorganismu který jsme označili X06/15/458 a který byl identifikován jako kmen plísní Acremonium strictum na základě následujících morfologických dat:

Při pěstování na 2% agaru ze sladového extraktu po dobu 10 dnů kolonie kmene měly v průměru 15 až 20 mm ve srovnání s 37 až 40 mm, tvořily výtrusy čistě bílé spíše než v odstínech šedé, tvořily husté, kompaktní, spíše než rozvlněné mycelium. Většinou sametové a vločkovité pouze ve středu a ne plstnaté ve středu, okraje nepravidelné, průzračné, ostře neohraničené a zapadlé. Konidiofory plektonematozní až synematozní a povrchové, spíše než zapadlé. Převážně ortofialidické, vzácně komplexnější, rovné, postupně zúžené, průsvitné, spíše než chromofilní, 40 až 54 pm dlouhé a 1.5 pm široké při základně ve srovnání s 20 až 40 x 1,5 až 2,0 pm. Konidia v slizovité bílé hmotě jsou válcového tvaru 3,0 až 7,0 x 1,5 pm.

Předmětem vynálezu je tudíž též biologicky čistá kultura plísně kmene X06/15/458 (IMI 354451), která produkuje seskviterpeny shora uvedeného obecného vzorce I.

Organizmus vykazuje následující rozdíly od typických kmenů Cremonium strictum: pomalejší růst, čistě bílé kompaktní kolonie, vzdušné okraje, nepravidelné a difuzní, konidiofory vzdušné a směřující k synematozním, střední konidiofomí délka je delší.

Z výše popsaných mikroskopických a morfologických rysů je plísňový izolát X06/15/458 nejlépe klasifikován W. Gamsem. jako Acremonium c.f. strictum. jak je popsáno v Gams, W (1971) Cephalosporium-artige Schimmelpilze, vydáno Gustavem Fischerem.

Kmen X06/15/458 byl 7. října 1992 uložen na základě mezinárodní dohody z Budapešti v Intemational Mycological Institute, Egham, Suney, V. Británie, pod číslem IMI 354451.

Výše uvedený popis ilustruje kmen Acremonium strictum. který se může použít při přípravě seskviterpenů podle vy nálezu. Vynález také zahrnuje mutanty výše popsaného mikroorganismu. Např. ty. které se získají přirozenou selekcí nebo které jsou produkovány mutačními činidly za použití ionizačního ozařování, jako je ultrafialové záření nebo chemickými mutageny, jako je nitrosoguanidin nebo podobným zpracováním, jsou také zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu.

Vynález se dále týká způsobu přípravy sloučenin podle vynálezu, který zahrnuje (i) fermentaci ve zdroji uhlíku, dusíku a anorganických solí, plísňového kmene X06/15/458 (IMI 354451). který produkuje seskviterpen obecného vzorce I, (ii) izolaci uvedeného seskviterpenů zfermentačního média, (iii) je-li to žádoucí, oxidaci seskviterpenů obecného vzorce I, kde A znamená kruh (c) na seskviterpen obecného vzorce I, kde A znamená kruh (d) a/nebo (iv) je-li to žádoucí, převedení uvedeného seskviterpenů na jeho farmaceuticky nebo veterinárně použitelnou sůl.

Seskviterpeny obecného vzorce I se typicky připravují aerobní fermentaci vodného živného média za podmínek popsaných výše, produkčním kmenem Acremonium strictum X06/15/458 nebo produkčním mutantním kmenem X06/15/458. Jako vodná média se používají obvyklá média používaná při přípravě antibiotik. Tato média obsahují zdroje uhlíku a dusíku

- 5 CZ 284121 B6 asimilovatelné mikroorganismem. Je-li to žádoucí, mohou se přidat v malém množství anorganické sole. Fermentační média mohou obsahovat stopy kovů nezbytných pro růst mikroorganismů a pro vznik žádaných sloučenin. Obvykle se používají v dostatečných koncentracích ve formě komplexních zdrojů uhlíku a dusíku, které mohou být použity jako živné zdroje nebo mohou být, je-li to žádoucí, přidány odděleně k médiu. Biologicky čistá kultura plísňového kmene X06/15/458 nebo mutantu která produkuje seskviterpen obecného vzorce I je další aspekt vynálezu. Tyto kultury v podstatě neobsahují další mikroorganismy.

Asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a minerálů jsou buď v jednoduché formě, nebo e formě komplexních výživných preparátů. Jako zdroje uhlíku se používají obvykle glukóza, maltoza, škrob, glycerol, melaza, dextrin, laktoza, sacharosa, fruktoza, karboxylové kyseliny, aminokyseliny, glyceridy, alkoholy a rostlinné oleje. Zdroje uhlíku obvykle tvoří 0,5 až 10 % hmotn. fermentačního média.

Jako zdroje dusíku se obvykle používají sojová moučka, kukuřičné nápoje, moučka z bavlníkových semen, směs polypeptidů, rozemleté ořechy, sladový extrakt, kasein, směsi aminokyselin, amoniak (plynný nebo roztok), amonné soli nebo dusičnany. Mohou být rovněž použity močovina a ostatní amidy.

Zdroje dusíku obvykle tvoři 0,1 až 10 % fermentačního média.

Živné minerální sole, které se mohou přidávat do kulturního média zahrnují obvy kle používané sole, které jsou schopné uvolňovat sodík, draslík, amoniak, železo, hořčík, zinek, kobalt mangan, vanad, chrom, vápník, měď. molybden, bor, fosforečnany, sírany, chloridy a uhličitany.

V případě potřeby se přidávají za účelem regulace přebytku pěny protipěnivá činidla.

Fermentace používající Acremonium strictum X06/15/458 se provádí při teplotě 20 až 35 °C, výhodně při teplotě 24 až 30 °C. Optimální výsledky se získají při fermentaci prováděné při teplotě 24 až 26 °C. Vhodné pH živného média je v intervalu 5,0 až 8,5, výhodně 6.0 až 7,5.

Fermentace v malém rozsahu se obvykle provádí umístěním vhodného množství živného média do nádoby známými sterilními technikami, očkováním obsahu nádoby buď sporami, nebo vegetativními buňkami Acremonium strictum, uzavřením nádoby vatou a udržováním průběhu fermentace při konstantní teplotě okolo 25 °C v rotační třepačce při otáčkách 25 až 300/min. po dobu 2 až 10 dnů.

Pro větší rozsahy je výhodné fermentaci provádět ve vhodných nádobách opatřených míchadlem a prostředky pro provzdušňování fermentačního média. Živné médium se v nádobě po sterilizaci očkuje vegetativními buňkami Acremonium strictum. Fermentace se nechá probíhat po dobu 1 až 8 dnů za míchání a/nebo provzdušňování živného média při teplotě v rozsahu 24 až 30 °C. Stupeň provzdušňování je závislý na několika faktorech, jako je velikost fermentoru a rychlost míchání. Obvykle se fermentace provádějí při otáčkách 95 až 500/min a při provzdušňování 0,1 až 1,0 obj./obj./min.

Seskviterpen obecného vzorce I se nachází po skončení fermentace zejména v myceliu, izoluje se a čistí. Separace a čištění sloučeniny z fermentační živné půdy a její získání se provádí za použití extrakce rozpouštědly následované dělením do frakcí obvyklými chromatografickými technikami a způsoby používajícími rozpouštědel. Seskviterpen se získá v podstatě čisté formě.

Seskviterpeny obecného vzorce I jsou rozpustné v organických rozpouštědlech, jako je ethylacetát, metanol a aceton. Tato vlastnost se využívá při jejich získávání z fermentačního mycelia. Fermentační mycelium se vhodně kombinuje s přibližně stejným objemem organického rozpouštědla, např. acetonem. Vznikající surový extrakt se potom koncentruje za sníženého tlaku

-6CZ 284121 B6 a získá se vodná suspenze, která se extrahuje organickým rozpouštědlem a získá se surový organický extrakt. Extrakt se filtruje (nebo odstřeďuje) a rozpouštědlo se koncentruje za sníženého tlaku. Organický zbytek se čistí nejprve chromatograficky, např. za použití kolonové chromatografie Sephadex LH-20 s metanolem jako eluentem.

Žádaný produkt a některé nečistoty jsou zadržovány v koloně, zatímco mnoho dalších nečistot (zejména nepolární nečistoty) nejsou zadržovány. Kolona se promyje nepolárním organickým rozpouštědlem, jako je hexan nebo toluen, čímž se odstraní další nečistoty, poté postupně směsí dichlormetanu nebo chloroformu a dalšími organickými rozpouštědly, jako je metanol nebo 10 etylacetát. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se dále chromatografuje, např. kolonovou chromatografií, chromatografií na tenké vrstvě, preparativní chromatografií na vrstvě nebo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Ve výhodném provedení tyto další chromatografické postupy zahrnují chromatografií s reverzní fází C18 HPLC (25 x 10 cm, gradient CH₃CN:H₂O).

Vhodné adsorbenty zahrnují silikagel a oktadecyl vázaný na oxid křemičitý, přičemž mohou být použity jako eluenty různá rozpouštědla nebo kombinace rozpouštědel. Frakce eluátu se poté zkoumají chromatografií na tenké vrstvě, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií nebo ostatními známými technikami na přítomnost a k izolaci žádané sloučeniny. Použitím výše uvedených technik se získají rafinované kompozice obsahující žádaný seskviterpen, jehož 20 přítomnost se stanoví analýzou chromatografických frakcí z hlediska fyzikálně chemických charakteristik a/nebo vazebné aktivity komplexu benzodiazepinu s receptorem.

Seskviterpen obecného vzorce I, ve kterém A znamená kruh (c) (sloučenina E) se může oxidovat na svůj 15,16-ortochinonový derivát, který-je seskviterpenem obecného vzorce I, ve kterém A 25 znamená kruh (d) (sloučenina F).

Sloučenina F má následující strukturu

(F)

Oxidace se provádí tak, že se nechá stát roztok sloučeniny E na vzduchu. Oxidace se může alternativně provádět nebo vzdušná oxidace jak byla uvedena výše může být urychlena, přidáním

- 7 CZ 284121 B6 oxidačního činidla do roztoku sloučeniny E. Vhodným příkladem oxidačního činidla je jodistan sodný NaJO₄.

Seskviterpeny obecného vzorce I se mohou převádět na farmaceuticky nebo veterinárně použitelné soli.

Dalším předmětem vynálezu jsou proto farmaceutické nebo veterinární přípravky, které jako účinné látky obsahují seskviterpeny shora uvedených obecných vzorců I až IV ve spojení s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly.

Jako příklady vhodných solí se používají sole s alkalickými kovy, např. sole sodné, draselné a amonné. Sloučenina D, sodná sůl sloučeniny A, se např. připraví zpracováním sloučeniny A s hydroxidem sodným v metanolu.

Sloučeniny podle vynálezu jsou účinné při léčení nemocí modulovaných ligandy benzodiazepinreceptor obsažené v ionoformním receptorovém komplexu GABA-Bz-CE. Pacient je podle vynálezu léčen tak, že se mu podá terapeuticky účinné množství jedné ze sloučeniny podle vynálezu. Sloučeniny podle vynálezu mající agonistickou aktivitu se používají k regulaci stavů způsobených vázáním benzodiazepinu k benzodiazepinovému receptoru obsaženém v ionoformním receptorovém komplexu GABA-Bz-Cl“. Mohou být proto použity např. jako protikřečová léčiva, anxiolytika. uvolňovače svalového napětí a hypnotika. Stav lidí a zvířat se tak zlepší.

Sloučeniny podle vynálezu vykázaly účinnost ve zkoušce benzodiazepin-receptor, která využívá tritiovaný ligand specifický pro receptor přítomný ve vyčištěném ionomorfním receptorovém komplexu GABA-Bz-Cf. Podrobnosti zkoušky jsou uvedeny v příkladu 5, který následuje.

Sloučeniny podle vynálezu se podávají v různých formách pro dávkování, např. orálně jako jsou tablety, kapsle, cukrem nebo tenkou vrstvou povlečené tablety, kapalné roztoky nebo suspenze nebo parenterálně, např. intramuskulámě, intravenozně a subkutánně. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podány injekcí nebo infuzí.

Dávka je závislá na řadě faktorů, jako je věk, hmotnost a stav pacienta a na cestě podání. Typická dávka pro všechny cesty podání činí u dospělých pacientů 0,001 až lOmg/kg, nejobvykleji 0,01 až 5 mg/kg tělesné hmotnosti. Dávka se podává např. 1 až 5 x denně orálně nebo bolusovou infuzí, několikahodinovou infuzí a/nebo opakovaným podáním.

Sloučeniny podle vynálezu jsou formulovány pro použití jako farmaceutické nebo veterinární přípravky a také obsahují farmaceuticky nebo veterinárně použitelný nosič nebo ředidlo. Přípravky jsou typicky připravovány následujícími známými způsoby a jsou podávány ve farmaceuticky nebo veterinárně vhodné formě.

Např. pevné formy pro orální podání mohou obsahovat společně s aktivní sloučeninou, ředidla, jako jsou laktoza, dextroza, sacharoza, celulóza, kukuřičný škrob nebo bramborový škrob, mazadla, jako je oxid křemičitý, talek, kyselina stearová, stearát hořečnatý nebo vápenatý' a nebo polyetylenglykoly, pojivá, jako jsou škrob, arabská guma, želatina, metylceluloza, karboxymetylceluloza nebo polyvinylpyrrolidon, dezintegrační činidla, jako jsou škrob, kyselina alginová, algináty, sodné glykoláty škrobu, šumivé směsi, barviva, sladidla, smáčedla, jako je lecitin, polysorbáty, laurylsírany. Tyto přípravky se připraví známými způsoby, např. smícháním, granulováním, tabletováním, povlékáním cukrem nebo tenkou vrstvou.

Kapalné disperze pro orální podání mohou být ve formě sirupů, emulzí nebo suspenzí. Sirupy mohou obsahovat jako nosiče např. sacharozu nebo sacharozu s glycerolem a/nebo manitolem a/nebo sorbitolem. Zvláště sirup pro diabetiky obsahuje jako nosič pouze takové látky, např.

-8CZ 284121 B6 sorbitol, které nemetabolizují na glukózu nebo které metabolizují pouze v malém množství na glukózu. Suspenze a emulze mohou obsahovat jako nosiče, např. přírodní pryskyřici, agar, alginát sodný, pektin, metylcelulozu, karboxymethylcelulozu nebo polyvinylalkohol.

Suspenze nebo roztoky pro intramuskulámí injekce mohou obsahovat, společně s aktivní sloučeninou, farmaceuticky použitelný nosič, jako je sterilní voda, olivový olej, etyloleát, glykoly, jako je propylenglykol a je-li to žádoucí, vhodné množství hydrochloridu lidokainu. Roztoky pro intravenozní injekce mohou obsahovat nosič, např. sterilní vodu. Výhodně jsou ve formě sterilního, vodného izotonického solného roztoku. Alternativně, sloučeniny podle vynálezu mohou být zapouzdřeny v lypozomech.

Vynález bude blíže objasněn pomocí následujícím příkladů:

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kultura X06/15/458 v kapalném médiu

Výchozí látka kmene X06/15/458 se vytvořila suspendováním zralé bakteriální kultury pěstované na MEA (2% sladový extrakt. 1,5% agar) v 5 ml 10% vodného glycerolu. 1 ml této suspenze v 1,5 ml ochlazené baňce obsahuje výchozí látku, která byla uskladněna při -135 °C. Předkultura se získala aseptickým uložením 0,5 ml výchozí látky do 10 ml živného roztoku S (1,5 % sojového peptonu, 1 % D-glukozy, 0,5 % sladového extraktu, 0,3 % NaCl, 0,1 % CaCO₃, 0,1 % Tween 80, 0,1 % Junlon PW110 (výrobce Honeywell & Stein Ltd., Time House, Throwley Way, Sutton, Surrey, SMI 4AF), upraveno na pH 6) ve zkumavce (25 mm x 200 mm) a protřepáváním při 240 otáčkách za minutu po dobu 4 dnů při 25 °C.

Mezikultura se získala aseptickým přenesením předkultury do 300 ml živného roztoku S v 2 1 Erlenmeyerově baňce a inkubací na rotačním šejkru při 240 otáčkách za minutu po dobu 3 dnů při 25 °Č.

Produkční kultura se získala aseptickým přenesením mezikultury do 14 1 míchaného fermentoru obsahujícího 10 1 živného roztoku P (2,38% trehalozy, 0,69% kvasničného extraktu, 0,1 % karboxymetylcelulozy, 0,1 % Tween 80, 0,98 % MES, upraveno na pH 6). Nádoba se míchala při 340 otáčkách/min. a provzdušňovala při 0,7 obj./obj./min., pH se neupravilo, zůstávalo v rozsahu 6,0 až 7,0. V průběhu fermentace se fermentor udržoval při konstantní teplotě 25 °C. Po 7 dnech se fermentace zakončila a produkt se extrahoval.

Fermentace většího množství se prováděla v 75 1 fermentorech následovně. 40 ml předkultury se připravilo způsobem popsaným výše (čtyři 25 x 200 mm zkumavky) a přeneslo se do 2 1 živného roztoku S v 3 1 fermentoru. Nádoba se míchala při 500 otáčkách/min. a provzdušňovala se při 0,25 obj./obj./min., pH se neupravovalo a teplota se udržovala na 25 °C. Po 4 dnech se tato mezikultura asepticky přenesla do 75 1 fermentoru obsahujícího 50 1 živného roztoku P. 75 I nádoba se provzdušňovala při 0.5 obj./obj./min. a při 350 otáčkách/min. za účelem udržení tenze rozpuštěného kyslíku v průběhu fermentace na hodnotě vyšší než 70 %, pH se neupravovalo ale zůstávalo na hodnotě 6.0 až 7.0 a teplota se udržovala konstantní na 25 °C. Po 7 dnech se fermentace zastavila a biomasa se sebrala.

-9CZ 284121 B6

Příklad 2

Extrakce a čištění sloučeniny A

1 fermentační živné půdy se odstředilo a mycelium (-344 g) se extrahovalo acetonem (3x5 1). Extrakt se koncentroval do sucha (8,0 g) a znovu se rozpustil v čistém metanolu. Čištění se provedlo preparativní HPLC s reverzní fází za použití Waters Delta-Pak C18 (100 Á, 15 pm) kolona (ID 10,0 mm, délka 25,0 cm) s gradientem mobilní fáze 4 minuty (80% vodný acetonitril, průtok 12 ml/min), stoupání lineární na 20 minut (100% acetonitril, průtok 12 ml/min.).

Monitorování vlnové délky při 280 nm.

Pík sebraný při 17 až 18 minutách se dále čistil za použití stejné kolony ale s gradientem mobilní fáze 15 minut (40% vodný acetonitril, průtok 12 ml/min), stoupání lineární na 20 minut (100% acetonitril, průtok 12 ml/min).

Pík sebraný mezi 9 a 10 minutami byl seskviterpen obecného vzorce II, ve kterém Y znamená dvojnou vazbu: Sloučenina měla následující fyzikální charakteristiky:

Molekulový vzorec: CjiHjoOí

Molekulová hmotnost: 358

Rozpustnost v metanolu, acetonu, etylacetátu

UV: [λ^ (nm) (ε)]:

276.6 (4900) MeOH

207.6 (30000) MeOH-KOH

311,2 (4100)

Hmot, spektr.: [m/z intenzita (%)]:

DEI 358 (Ml· 100), 233 (55), 203 (15), 155 (20)

DCI (NH₃) 359 (ΜΙΓ, 100), 233 (10), 203 (20), 155 (20)

Vysoké rozlišení Cl: 359.2270, C22H31O4 předpokládá 3589,2214

IČ(KBr) [yvcm“¹]:

3395,2.2930,2, 1730,4 ¹HNMR: [400 MHz, CD₃OD, δ (m, J, poloha)]:

1,13 (3H, s, 3H-21), 1,14 (3H, s, 3H-20), 1,37 (1H, m, H-lOa), 1,51 (3H, s, 3H-19), 1,58 (1H, šdd, 13,2, 10,1, 6,8. H-lOa), 1,72 (3H, s, 3H-22), 1,85 (1H, šdd, 13,0, 4,5, H-6a), 2,08 (1H, šdd, 12,5, 7,1, H-9a). 2,22 (1H, šdd, 9,8, 5,2, H-l 1), 2,23 (1H, šdd, 11,6, 11,6, H-9b), 2,33 (1H, šdd, 12,7, 12,7, H-6b), 2,38 (1H, dd, 14,5, 9,9, H-2a), 2,70 (1H, šddd, 14,5, 2,2, 1,6, H2b), 3.02 (1H, ddd, 7,8, 5.6. 1,5, H-l7), 3,67 (1H, d, 5,8, 5,8, H-l3), 3,80 (1H, dd, 9,3, 7,9, H18a), 3,83 (1H, šdd, 6,0. 6,0. H-12), 4,03 (1H, šdd, 9,3, 1,5, H-18b), 5,17 (1H, m, H-7), 5,24 (1H. dd, 15,9, 1,5, H-4), 5,32 (1H, ddd, 15,9, 10,0, 2,2, H-3).

¹³C-NMR: [100 MHz, CD_?OD, δ (m, poloha)]:

17,66 (q, C-22), 23,71 (q, C-19), 24,92 (q, C-20), 30,85 (q, C-21), 32,24 (t, C-10), 37,37 (t, C-9), 39,37 (s, C—5), 42,22 (d, C-13), 43,11 (t, C-6), 45,01 (d, C-l 1), 45,17 (t, C-2), 48,97

-10CZ 284121 B6 (d, C—17), 70,86 (t, C—18), 83,70 (d, C-12), 88,94 (s, C-l), 121,90 (d, C-3), 124,68 (d, C-7), 135,25 (s, C-l 5), 137,39 (s, C-8), 144,73 (d, C^l), 166,96 (s, C-14), 200,99 (s, C-16).

Příklad 3

Extrakce a čištění sloučeniny B

Obsah 75 1 fermentoru se centrifugoval a mycelium se extrahovalo etylacetátem (5x10 1). Tento extrakt se koncentroval do sucha a znovu se rozpustil v metanolu a čistil preparativní HPLC v reverzní fázi za použití Waters Delta-Pak Cl8 (100 A, 15 pm), kolona ID 10,0 mm, délka 25,0 cm) a mobilní fáze 5 minut v 80% acetonitrilu (průtok lOml/min.). Vlnová délka byla zjišťována při 280 nm. Sloučenina, která byla eluována mezi 23 a 25 minutami byla sloučeninou B, seskviterpen obecného vzorce III, kde R znamená OH.

Sloučenina měla následující fyzikální charakteristiky:

Molekulový vzorec: C24H30O6

Molekulová hmotnost: 414

Rozpustnost v metanolu, etylacetátu, chloroformu a acetonu

UV:	[^„(nmjfe)]: 200 268 368	HPLC, rozpouštědlo (H2O-CH3CN)
	277,0(29500) 353,5 (3900)	MeOH
	289,8 (32100) 344,4 (3800)	MeOH-KOH
	271,6 (47000) 324.8 (3400)	MeOH-TFA

Hmotové spektroskopie: [m/z (intenzita (%)]:

DEI 414 (M~, 100),331 (45),277(20),211 (50)

DCI (NHj) 415 (MH, 100)

Vysoké rozlišení El: 414,2059, C24H30O6 předpokládá 414,2034

211,0240, C9H7O6 předpokládá 211,0240

IČ(KBr): [v v cm']:

3265,2960,2930,2855, 1735, 1625 'H-NMR: [400 MHz, CDC1₃, δ (m, J, poloha)]:

1,4 (t), 1,7 (dd), 1,75 (dd), 2,05 (dd), 2,16 (d+dd), 2,3 (t), 2,4 (dd). 2,7 (dt), 4,9 (d+td), 5,05 (d+d), 5,2 (dd), 5,25 (dd) ¹³C-NMR: [ 100 MHz, CDCI3, δ (m, poloha)]:

-11CZ 284121 B6

160,4, 150, 146,1, 144,2, 144, 142,1, 136, 126,9, 123,7, 123, 118,7, 86,9, 84,3, 72,3, 43,5, 41,4, 40,7, 38,2, 37,7, 29,4, 28,2. 24,2, 22,7, 17

Příklad 4

Extrakce a čištění sloučeniny C

Obsah 75 1 fermentoru se centrifugoval a mycelium se extrahovalo etylacetátem (5x10 1). Tento extrakt se koncentroval do sucha a znovu se rozpustil v metanolu a čistil preparativní HPLC v reverzní fázi za použití Waters Delta-Pak PrepPak 3000 patrona (Cl8, 100Á, 15 pm, ID 47 mm, délka 30,0 cm) a gradient mobilní fáze 0,5 minut v 80% vodném acetonitrilu (průtok 50 ml/min.), stoupání lineární do 30 minut v 100% acetonitrilu (průtok 50 ml/min.). Sloučenina která byla eluována mezi 18 a 19 minutami byla sloučenina C, seskviterpen obecného vzorce II. kde R znamená H. Tento pík se dále čistil za použití stejné kolony ale gradientu mobilní fáze 5 minut v 30% acetonitrilu (průtok 50 ml/min.) stoupání lineární do 10 minut v 15% vodném acetonitrilu (průtok 50 ml/min). Tento roztok se udržoval 15 minut v 15% vodném acetonitrilu (průtok 50 ml/min) a potom stoupal lineárně 5 minut do 100% acetonitrilu (průtok 50 ml/min). Pík žádané sloučeniny (sloučenina C) eluoval mezi 22 a 24 minutami pod tímto gradientem. Sloučenina měla následující fyzikální charakteristiky:

Molekulární vzorec: C;₄H₃o05

Molekulární hmotnost: 398

Rozpustnost v metanolu, acetonu etylacetátu

[/-max (nm) (ε)]. 270,6 (41700) 338,4 (3800)	MeOH
209.3 (13300) 282.3 (41400) 326.4 (3200) 342,8 (3900) 390,0 (3000)	MeOH-KOH
271,2(52200) 316,6 (4300)	MeOH-TFA

Hmot, spektrum.: [m/e (intenzita (%)]:

DEI 398 (Ml· 100), 315 (90), 256 (100), 233 (95), 195 (40)

DC1 (ΝΗ0 399 (MH‘, 100), 222 (10), 205 (90), 195 (20), 172 (70)

Vysoké rozlišení El: 398,2093, C24H30O6 předpokládá 398,2095

IČ (KBr): [v v cm“]:

3400 (sh), 3200, 2928, 1750, 1600, 1380 ‘H-NMR: [400 MHz, C₆D₆, vztaženo k 7,16 ppm, δ (m, J, pozice)]:

0,75* (3H, s, 3H-23), 0,93* (3H, s, 3H-22), 1,01 (3H, s, 3H-21), 1,11 (1H, t, 11,7, H-lOa), 1,40 (1H, šdd, 14,9, 7,6, H-lOb), 1,45 (3H, šš, 3H-24), 1,63 (1H, dd, 13,0, 5,0, H-6a), 2,05

-12CZ 284121 B6 (1H, št, 11,5, H-6b), 2,10 (1H, m, H-2a), 2,11 (1H, m, H-9a), 2,17 (1H, dd, 11,0, 3,8, H-ll), 2,60 (1H, t, 12,1, H-9b), 2,74 (1H, šd, 14,5, H-2b), 4,37 (1H, dd, 12,9, 1,6, H-20a), 4,44 (lH,dd, 13,0, 3,2, H-20b). 4,59 (1H, šdt, 11,2, 3,0, H-12), 5,01 (1H, dd, 15,8, 1,5, H-4), 5,11 (1H, dd, 15,8, 2,8, H-3), 5,15 (1H, šdd, 10,0, 3,2, H-7), 6,57 (1H, s, H-18).

¹³C-NMR: [400 MHz, C₆D₆, vztaženo k 7,16 ppm, δ (m, J, pozice)]:

17,20 (q, C-24), 22,82 (q, C-21), 24,21* (q, C-23), 28,61 (t, C-10). 29,55* (q, C-22), 38,28 (t, C-9), 38,33 (s, C-5), 41,44 (d, C-ll), 41,93 (t, C-6), 43,98 (t, C-2), 75,35 (t, C-20), 85,28 (d, C-12), 86,75 (s, C-l), 108,49 (d, C-l 8), 120,05 (d, C-3), 124,20 (d, C-7), 127,94 (s, C-l3), 136,22 (s, C-8), 137,45 (s, C-19), 143,74 (d, C-4), 147,96 (s, C-14), 149,71 (s, C-15), 160,00 (s, C-l 7), 165,58 (s, C-16).

Příklad 5

Extrakce a čištění sloučeniny A

Biomasa X06/15/458 se sebrala filtrací a postupně se extrahovala acetonem (25 1) a extrakt se oddělil od biomasy filtrací. Aceton se odstranil rotačním odpařováním a zbývající vodná kaše se suchým vymrazováním převedla na gumu. Tato guma se rozpustila v metanolu (250 ml), filtrovala a potom odpařila. Vzorek se chromatografoval HPLC v reverzní fázi za použití 47 x 100 mm C^ (oktadecylsilica) Delta-Pak patrony s 15 mikronovou náplní. Byl použit průtok 100 ml/min. s gradientem 80 % voda - 20 % acetonitril až 20 % voda - 80 % acetonitril během periody 30 minut. Sloučenina A byla stanovena při 278 nm. Aktivní frakce byla znovu chromatografována za použití téže kolony a průtoku s gradientem 60 % voda - 40 % acetonitril až 35 % voda - 65 % acetonitril během 40 minut. Aktivní frakce se koncentrovala na rotační odpařovačce k odstranění acetonitrilu a suchým vymrazováním se získala pevná látka (sloučenina A, dávka 1).

Další čištění se provedlo chromatografii s normální fází za použití mžikové kolony naplněné do hloubky 16 cm silikageiem (MERCK, 230-400 mesh, částice 0,040 - 0,063 mm) a izokratickou elucí směsí 40 % hexanu - 60 % etylacetátu - 1 % kyseliny octové. Těkavé rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a získal se bezbarvý olej a odstraněním zbytku rozpouštědla suchým vymrazováním se získaly bílé krystaly (sloučenina A, dávka 3).

Produkt se uložil do mrazicího boxu na dobu 6 týdnů. Pak se provedla HPLC v reverzní fázi na Prep 3000 za použití 25 x 100 mm patrony naplněné C_Ig-Nova-Pak HR (6 mikronů). Byl použit průtok 20 ml/min. a gradient 70 % voda - 30 % acetonitril až 100 % acetonitril během 20 minut. Kromě sloučeniny A byla izolována druhá polárnější složka, která byla identifikována jako 7,8-epoxid sloučeniny A, sloučenina A'. K oddělení sloučeniny A od jejího 7,8 epoxidu se použil Delta-Prep s gradientem 60 % vody - 40 % acetonitrilu až 40 % vody - 60 % acetonitrilu během 20 minut.

Identifikace sloučeniny A' se provedla porovnáním UV, HS a NMR dat s odpovídajícími daty získanými pro sloučeninu A (viz příklad 2).

Sloučenina A' má následující fyzikální charakteristiky:

Molekulový vzorec C22H30O5

Molekulová hmotnost: 374

Rozpustnost: MeOH (dobrá)

-13CZ 284121 B6

UV: [Amax(nm)]

278 (metanol)

Hmot, spektr.: Technika

CIMH“

MNH/

El M“

m/z	intenzita (%)
375	100
392	2
374
219	20
153	40
43	100

IČ (KBr): v v cm“': 3383 š, 2959 š, 1624, 1387.

'H-NMR: δ/ppm v CD₃OD: 1,13 (3H, s), 1,29 (3H, s), 1,39 (3H, s), 1,45 (1H, m), 1,49 (3H, dd), 1,53 (2H, m), 1,82 (1H, dd), 2,00 (1H, m), 2,10 (2H, m), 2,55 (1H, m), 2,75 (1H, m), 2,80 (1H, m), 3,00 (1H, m), 3,70 (1H, dd), 3,75 (1H, dd), 3,80 (1H, dd), 5,55 (2H, d).

¹³C-NMR: δ/ppm v CD₃OD: 200,7 (C₁₆), 165,9 (C,₄) 143,4 (C₄), 135,0 (C₁₅), 122,6 (C₃), 87,6 (C,), 82,6 (C₁₂), 70,7 (C₁₈), 63,7 (C₈), 62,3 (C₇), 47,6 (C_lt), 44,9 (C₂), 42,1 (C₁₃), 41,4 (C₆), 36,6 (C₅), 36,5 (C₉), 31,2 (C₂), 27,4 (C₁₀), 24,7 (C₂₀), 23,1 (C₁₉), 17,6 (C₂₂), 48,6 (C_l7) - zastíněno rozpouštědlem.

Příklad 6

Extrakce a čištění sloučeniny E

1 fermentační živné půdy X06/15/458 se odstředilo a micelium se extrahovalo etylacetátem (5x10 I). Extrakt se koncentroval do sucha a opět se rozpustil v čistém metanolu. Čištění bylo provedeno preparativní HPLC v reverzní fázi za použití Waters Delta-Pak PrepPak 3000 patrony (Cl8, 100Á, 15 mp, ID 47 mm, délka 30,0 cm) a izokratickou mobilní fází 40% vodného acetonitrilu (průtok 50 ml/min.) po dobu 50 min. a poté propláchnutím acetonitrilem po dobu 10 minut. Sloučenina která eluovala mezi 44 a 48 minutami byla sloučenina E. Vlnová délka byla stanovována při 200 nm. Tento pík byl dále čištěn semipreparativní HPLC v reverzní fázi za použití Waters Delta-Pak kolony (Cl8, 100 Á, 15 pm, ID 10,0 mm, délka 25,0 cm) a s izokratickou mobilní fází 55% vodným acetonitrilem (průtok 15 ml/min.) po dobu 20 minut a poté propláchnutím acetonitrilem po dobu 10 minut. Sloučenina eluující mezi 23 a 28 minutami byla sloučeninou E. Vlnová délka byla stanovena při 20 nm.

Sloučenina E má následující fyzikální charakteristiky:

Molekulový vzorec: C^HsoCL

Molekulová hmotnost: 370

Rozpustnost: metanol, etylacetát

(nm)	(ε)	rozpouštědlo]
213,4	24400	MeOH
230,0_SH	7500
277,3	9200
215,6	6900	MeOH-KOH

-14CZ 284121 B6

228,2_sh

5400

286,1 5200

Hmot, spektr.:	[m/z (intenzita (%)]:
El DCI (NH₃):	370 (M~, 2%), 167 (80), 166 (100) 371 (MET, 30%), 205 (100), 167 (100), 149 (40), 135 (25), 123 (40), 121

(30), 109 (40)

IČ(KBr): [v v cm'¹]:

3333,4, 2932,2, 2862,7, 1720,7, 1622,3, 1496,9, 1381,2, 1239,1, 1286,7, 1167,1 ‘H-NMR: [400 MHz C₆D6/CD₃OD (vztaženo na CD₃OD při 3,40 ppm, δ (m, J, poloha)]:

0,86* (3H, s, 3H-22), 1,07* (3H, s, 3H-21), 1,26 (3H, s, 3H-20), 1,36 (1H, dd, 13,6, 11,3, H10a), 1,62 (3H, šs, 3H-23), 1,68 (1H, m, H-lOb), 1,75 (1H, m, H-6a), 2,09 (1H, dd, 9,8, 8,6, H11), 2,21 (1H, t, 12,3, H-6b), 2,27 (1H, dd, 12,7, 7,1, H-9a), 2,34 (1H, dd, 14,5, 10,3, H-2a), 2,70 (1H, št, 11,7, H-9b), 2,84 (1H, dt, 14,5, 2,1, H-2b), 4,81 (1H, dd, 11,4, 1,2, H-19a), 4,88 (1H, šddd, 10,2, 2,3, 1,5, H-12), 5,02 (1H, ddd, 11,3, 2,5, 0,9, H-19b), 5,19 (1H, dd, 15,9, 1,7, H-4), 5,24 (1H, šddd, 11,9, 4,5, 1,2, H-7), 5,33 (1H, ddd, 15,9, 10,3, 2,4, H-3), 6,64 (1H, šs, H17).

^1JC-NMR: [100 MHz CňDe/CDsOD (vztaženo na CD₃OD při 49,00 ppm, δ (m, poloha)]:

17,8 (q, C-23), 22,20 (q, C-20), 24,11* (q, C-22), 29,56 (t, C-10), 30,32* (q, C-21), 38,33 (s, C-5), 38,35 (t. C-9), 42,12 (t, C-6), 43,72 (d, C-l 1), 43,89 (t, C-2), 73,50 (t, C-19), 83,12 (d, C-12), 86,05 (s, C-l), 101,43 (d, C-17), 119,23 (s, C-13), 121,10 (d, C-3), 123,84 (d, C-7). 131,08** (s, C—15), 131,08** (s, C-18), 136,89 (s, C-8), 140,31 (s, C-14), 143,02 (d, C-4). 147,54 (s, C-l6).

*, **: přiřazení může být zaměněno.

Příklad 7

Příprava a identifikace sloučeniny F

Roztok sloučeniny E popsaný v příkladu 6 v metanolu se oxidoval na vzduchu za přídavku NaIO₄k urychlení oxidace.

Čištění sloučeniny se provádělo preparativní HPLC v reverzní fázi za použití Waters Delta-Pak kolony (Cl8, 100 Á, 15 pm, ID 10,0 mm, délka 25,0 cm) se stupňovým gradientem 25% vodného acetonitrilu (12ml/min.) po dobu 5 minut, stoupající do 80% vodného acetonitrilu (12 ml/min) po dobu 35 minut. Sloučenina eluující mezi 30 a 32 minutami byla sloučeninou F. Vlnová délka byla stanovena při 200 nm.

Sloučenina F má následující fyzikální charakteristiky:

Molekulový vzorec: C₂₃H_2SO4

Molekulová hmotnost: 368

Rozpustnost: metanol

UV: [Ámaxfnrn) (ε) rozpouštědlo]

204 CH₃CN:H₂O hplc

-15CZ 284121 B6

300

482 'H-NMR: [400 MHz, CD3OD (odkaz na CD3OD při 3,40 ppm, δ (m, J)J:

6,03 (1H, šs), 5,24 (1H, dd, J=l,8, 15,9), 5,07 (1H, šdd), J=3,4, 10,9), 5,0 (1H. ddd, J=2,5, 10,6, 15,9), 4,79 (1H, dd, J=l,2, 15.6), 4,65 (1H, dd, J=2,2, 15,5), 4,55 (1H, d, 9,7), 2,63 (1H, dt, J=2,1, 14,8), 2,44 (1H, dd, J=10,5, 14,7), 2,27 (2H, m), 2,11 (1H, dd, J=7,2, 12,9), 1,88 (1H, d, J=9,0), 1,77 (1H, m), 1,65 (3H, s), 1,50 (1H, št,J=ll,O), 1,27 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,04 (3H, s).

^I3C-NMR: [100 MHz, CD3OD (odkaz na CD₃OD při 49,00 ppm, δ (m)J:

180,16 (s), 175,03 (s), 159,46 (s), 144,57 (d), 137,71 (s), 124,25 (d), 120,6 (d), 114,37 (d), 88,75 (s), 81,63 (d), 71,91 (t), 43,40 (t), 42,68 (t), 42,58 (t), 39,19 (s), 38,96 (t), 30,52 (q), 30,22 (t), 24,50 (q), 21,90 (q), 17,21 (q).

Příklad 8

Testování sloučeniny podle vynálezu ve zkoušce vazby benzodiazepin-receptor

Receptorový extrakt byl ve formě synaptosomálního preparátu izolován z hovězí mozkové kůry způsobem popsaným Langem a kol. (FENS Lett, 104 149-153, 1979). Vázající receptor byl stanoven za použití modifikace popsané CTBeimem a Williamsem (Eur. J. Biochem., 175 413421, 1988) metodou Braestrup and Squires (PNAS 74 3805-3809, 1977). Receptorový preparát byl inkubován v 50 mM Tris/Cl, pH 7,4 se sloučeninou A a [³H]-fIunitrazepamem (agonist) při finální koncentraci 1 nM. Vázebný radioaktivní ligand byl umístěn na filtry se skleněnou vatou a měřen kapalným scintilačním čítačem. Nespecifická vazebnost byla stanovena vytěsněním ligandu diazepamem (1 μΜ).

Vazebná data byla vpravena do jednoho nebo dvou polohových modelů hmotnostní nelineární regresní analýzou za použití počítačových programů LIGAND (Munson a Rodbard: Analytic Biochem 107 220-239, 1980) a EBDA (McPherson-Computer Prog. in Biomed. 17 107-114, 1983).

Metoda popsaná výše byla opakována za použití sloučenin B a C popsaných v příkladech 3 a 4 a také za použití sloučeniny D, která je sodnou solí sloučeniny A.

Hodnoty IC₅₀ byly také stanoveny pro sloučeninu A’, E a F popsané v příkladech 5 až 7.

Získané výsledky byly následující:

Tabulka 1: Inhibice vazby benzodiazepinu k benzodiazepinovému receptoru sloučeninami podle vynálezu

Sloučenina Koncentrace % inhibice IC50

93 μΜ	107	40nM
28	106
9	99
	93
930 nM	92

-16CZ 284121 B6

Tabulka 1 - pokračování

Sloučenina	Koncentrace	% inhibice	IC50
	280	80
	93	65
	28	44
	9	35
	3	11

B	177 μΜ	78	5μΜ
	53	92
	18	82
	5	69
	2	53
	530 nM	42
	177	36
	53	21
	18	21

C	242 μΜ	88	20μΜ
	80	77
	24	54
	8	35
	2	12
	800 nM	9
	240	-3
	80	9

D	100 μΜ	92	10 nM
	50	103
	10	100
	5	98
	1	86
	500 nM	81
	100	65
	50	70
	10	45
	5	45

A'	2,8.10’⁵ M	104	85nM
	9,3.10’⁶	103
	2,8.10’⁶	85
	9,3.10'⁷	83
	2,8.10'⁷	79
	9,3.10⁸	51
	2,8.10’⁸	32
	9,3.10’⁹	19

-17CZ 284121 B6

Tabulka 1 - pokračování

Sloučenina	Koncentrace	% inhibice	IC₅₀
	2,8.10’⁹	8

E	8,5.10’⁵ M	104	500nM
	4,8.10⁵	101
	9,5.10-⁶	93
	4,8.10-⁶	88
	9,5.10⁷	65
	4,8.10'⁷	52
	9,5.10⁸	42
	4,8.10⁸	37
	9,5.10’⁹	27
	4,8.10’⁹	22

F	2,7.10-⁴ M	94	3,0μΜ
	9,0.10'⁵	89
	2,7.10’⁵	77
	9,0.10-⁶	65
	2,7.10’⁶	48
	9,0.10-⁷	41
	2,7.10’⁷	33
	9,0.10⁸	27
	2,7.10’⁸	24
	9,0.10‘⁹	15

Příklad 9

Farmaceutický přípravek ío Tablety, každá o hmotnosti 0,15 g a obsahující 25 mg jedné ze sloučenin podle vynálezu se připraví následovně:

Přípravek pro 10 000 tablet:

sloučenina podle vynálezu (250 mg) laktoza (800 g) kukuřičný škrob (415 g) práškový talek (30 g) stearát hořečnatý (5 g)

Sloučenina podle vynálezu, laktoza a polovina škrobu se smíchají. Směs se poté protlačí přes síto s průměrem ok 0,5 mm. Kukuřičný škrob (10 g) se suspenduje v horké vodě (90 ml). Vzniklá pasta se granuluje na prášek. Granulát se suší a roztírá se na sítu s průměrem ok 1,4 mm. Přidá se zbývající část škrobu, talek a stearát hořečnatý, pečlivě promíchá a zpracuje se na tablety.

Claims

1. Seskviterpeny obecného vzorce I (I) ve kterém - - a - - a - - b - - znamená jednoduchou vazbu nebo jeden znamená jednoduchou vazbu a druhý znamená dvojnou vazbu; A, společně s - - a - - , - - b - - a atomy uhlíku ke kterým jsou vázány tvoří kruh vybraný ze skupiny (b) ve kterém R znamená H nebo OH a (d) a Y znamená dvojnou vazbu nebo, jestliže A znamená kruh (a) jak je definován výše, Y znamená buď dvojnou vazbu, nebo tvoří společně s atomy uhlíku, ke kterým je vázán epoxidovou vazbu.

-19CZ 284121 B6 nebo jejich farmaceuticky a veterinárně přijatelné soli.

2. Seskviterpeny podle nároku 1, obecného podskupinového vzorce II ve kterém -Y- znamená dvojnou vazbu nebo tvoří společně s atomy dusíku ke kterým je vázán io epoxidovou vazbu nebo jeho farmaceuticky nebo veterinárně přijatelná sůl.

3. Seskviterpeny podle nároku 1 obecného podskupinového vzorce III

-20CZ 284121 B6 (III) ve kterém R znamená H nebo OH nebo jeho farmaceuticky nebo veterinárně přijatelná sůl.

4. Seskviterpeny podle nároku 1 obecného podskupinového vzorce IV (IV) ve kterém X znamená

-21CZ 284121 B6 nebo nebo jeho farmaceuticky nebo veterinárně přijatelná sůl.

5. Způsob přípravy seskviterpenů nebo jejich solí, obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se i) fermentuje ve zdroji uhlíku, dusíku a anorganických solí plísňový kmen X06/15/458 (1MI 354451), ii) vzniklý seskviterpen se izoluje z fermentačního prostředí, iii) je-li to žádoucí, seskviterpen obecného vzorce I, ve kterém A znamená kruh (c), se oxiduje na seskviterpen obecného vzorce I, v němž A znamená kruh (d), a/nebo iv) je-li to žádoucí, převede se uvedený seskviterpen na farmaceuticky nebo veterinárně přijatelnou sůl.

6. Seskviterpeny nebo jejich soli podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití k léčení lidského nebo živočišného těla.

7. Seskviterpeny nebo jejich soli podle nároku 6 pro použití k léčení poruchy, která je modulovaná ligandy pro benzodiazepinový receptor v ionomorfním receptorovém komplexu gama-aminobutanová kyselina-benzodiazepin-Cr.

8. Seskviterpeny nebo jejich soli podle nároku 7 pro použití jako antikonvulzantum, anxiolytikum, uvolňovač svalového napětí nebo jako hypnotikum nebo pro zlepšení paměti nebo při terapii předávkování léčivy.

9. Farmaceutické nebo veterinární přípravky, vyznačující se tím, že jako aktivní látky obsahují seskviterpeny nebo jejich soli podle kteréhokoliv z nároků I až 4 a farmaceuticky přijatelné nosiče nebo ředidla.

10. Biologicky čistá kultura plísně kmene X06/15/458 (IMI 354451), která produkuje seskviterpeny obecného vzorce I podle nároku 1.