SK77595A3

SK77595A3 - Pharmaceutical and veterinary agent containing the sesquiterpenes and method of their preparation

Info

Publication number: SK77595A3
Application number: SK775-95A
Authority: SK
Inventors: Didier V Renno; Gerard B O'beirne; Brent R Copp
Original assignee: Xenova Limited British Body Co
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1995-12-06
Also published as: TW242141B; GB2284603B; HU9501840D0; IL108140A0; CZ164695A3; BG99736A; RU95113350A; KR950704324A; CZ284121B6; GB9226724D0; AU677272B2; NZ258986A; MX9400174A; US5565486A; IL108140A; HUT71859A; NO952483D0; ZA939626B; NO952483L; GB2284603A

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových benzodiazepínov, ktoré sa vyznačujú schopnosťou viazať receptory. Vynález sa týka tiež spôsobu prípravy týchto zlúčenín, farmaceutických a veterinárnych prípravkov obsahujúcich tieto zlúčeniny a mikroorganizmu, z ktorého sa získavajú.

Doterajší stav techniky

Benzodiazepín (Bz) je všeobecný termín na popis štruktúrne príbuzných zlúčenín so základnou benzo-1,4-diazepínovou štruktúrou (Haefely a kol., Advances in Drug Res. 1A, 165-322 (1985)). Farmakologickým výskumom niektorých starších syntetických analógov tohoto nového kruhového systému sa zistilo, že benzodiazepíny majú trankvilizačné a antikonvulzantné účinky. Ďalším výskumom v roku 1960 sa zistilo, že chlórdiazepoxid (Librium) je vhodný na farmaceutické použitie.

Rozsiahlé elektrofyziologické a náväzné štúdie preukázali, že mechanizmus benzodiazepínu spočíva v allosterickej modulácii hlavného inhibičného neuroprenášača, gama—aminobutanovej kyseliny (GABA). Presnejšie, tento účinok viedol k hyperpolarizácii neurónov zvýšením Cl~ iónov pomocou komplexného iónomorŤného receptorového komplexu GABA—Bz-Cl^-. Tento receptorový komplex bol označený ako subtyp A alebo GABAq.

Väčšina bežne popísaných benzodiazepínov sú agonisty a pôsobia zosilenie GABA inhibičného efektu. Preto majú sedatívne, hypnotické, antikonvulzačné a anxiolytické účinky. Parciálne (s nízkou účinnosťou) agonisty sú tiež zaujímavé, pretože znižujú nežiaduce účinky liečenia benzodiazepínom, ako sú seda— tívny účinok, tolerancia a návyk, pri udržaní ich klinického účinku. Inverzné agonisty majú biologické účinky ktoré sú opačné ako účinky bežných benzodiazepínov, t.j. konvulzanty, majú tiež význam pri zlepšovaní pamäti. Antagonisty nemajú biologickú účinnosť, pôsobia však proti zvýšeným vyššie uvedeným účinkom, t.j. pri predávkovaní.

Spojitosť medzi štruktúrou a účinnosťou je u benzodiazepínov plne charakterizovaná a farmaceutický identifikovaná. Dôraz sa preniesol na identifikáciu endogenných receptorových ligandov alebo na nové štruktúry ako na potencionálne nové liečivá. Boli objavené rôzne triedy chemických zlúčenín (napr. benzazepíny, β-karbolíny, cyklopyrrolóny, fenylchynolíny, triazolpyridazíny a imidazopyridíny), ktoré sú v tomto smere aktívne. U zopiklonu (derivát cyklopyrrolónu) a zolpidemu (imidazopyridín) boli dokázané hypnotické účinky.

Teraz sa zistilo, že fermentácia živného prostredia kmeňom pliesní Acremonium strictum (Xenova organizmus X06/15/458, IMI 354451) produkuje nové zlúčeniny, ktoré inhibujú väzbu benzodiazepínu k benzodiazepínovému receptoru prítomnom v iónoformnom receptorovom komplexe GABA-Bz—Cl~. Tieto zlúčeniny sú nové a tvoria spoločne so svojimi syntetickými derivátmi novú triedu zlúčenín.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je seskviterpén všeobecného vzorca I

(D v ktorom —a— a —b— znamená jednoduchú väzbu alebo jeden znamená jednoduchú väzbu a druhý znamená dvojitú väzbu, A, spoločne s —a— , —b— a atómami uhlíka ku ktorým sú viazané tvoria kruh vybraný zo skupiny

(t>)

v ktorom R znamená H alebo OH

a (d) έ a Y znamená dvojitú väzbu alebo, keď A znamená kruh (a) ako je vyššie definované, Y znamená buď dvojitú väzbu alebo tvorí spoločne s atómami uhlíka, ku ktorým je viazaný epoxidovú väzbu ,

a ich farmaceutický alebo veterinárne prípustné soli.

V jednom spôsobe prípravy má seskviterpén všeobecného vzorca I nasledujúcu štruktúru II

II v kde —Y— znamená dvojitú väzbu alebo tvorí spoločne s atómami uhlíka, ku ktorým je viazaný, epoxidovú väzbu cr kJ

V ďalšom spôsobe prípravy seskviterpén všeobecného vzorca

I má nasledujúcu štruktúru III

III v ktorej R znamená H alebo OH.

V ďalšom spôsobe prípravy je seskviterpén všeobecného vzorca I zlúčenina nasledujúceho všeobecného vzorca IV t

(IV) v ktorom X znamená

a lebo

Seskviterpén všeobecného vzorca II, v ktorom Y znamená dvo— dvojitú väzbu je tu definovaný ako zlúčenina A.

Seskviterpén všeobecného vzorca II v ktorom Y tvorí s atómami u— hlíka, ku ktorým je viazaný epoxidovou skupinou, je tu uvádzaný ako zlúčenina A^z . Seskviterpén všeobecného vzorca III v ktorom R znamená OH je tu uvedený ako zlúčenina B.

Seskviterpén všeobecného vzorca III v ktorom R znamená H je tu uvádzaný ako zlúčenina C. Sodná soľ (15—ONa) zlúčeniny A je zlú— čenina D. Seskviterpén všeobecného vzorca IV v ktorom X znamená

je zlúčenina E. Seskviterpén všeobecného vzorca IV v ktorom X znamená

Je zlúčenina F. Zlúčenina F je 15,16 ortochinonový derivát zlúčeniny E. Termín zlúčeniny podľa vynálezu je tu použitý pre všetky seskviterpény všeobecného vzorca I a pre ich farmaceutický a veterinárne použiteľné soli.

Seskviterpén všeobecného vzorca I bol izolovaný z mikroorganizmu ktorý sme označili X06/15/458 a ktorý bol identifikovaný ako kmeň pliesní ftcremonium strictum na základe nasledujúcich morfologických údajov:

Pri pestovaní na 2 λ agare zo sladového extraktu počas 10 dní kolónie kmeňa mali v priemere 15 až 20 mm v porovnaní s 37 až 40 mm, tvorili výtrusy skôr čisto biele ako v odtieňoch šedej, tvorili husté, kompaktné, skôr ako rozvlnené mycélium. Väčšinou zametové a vločkovité len v strede a nie plstnaté v strede, okraje nepravidelné, priezračné, ostro neohraničené a zapadlé. Konidiofory plektomatózne až synematózne a povrchové, skôr ako zapadlé. Prevažne ortofialidické, vzácne komplexnejšie, rovné, postupne zúžené, priesvitné, skôr ako chromofilné, dlhé 40 až 54 um a široké pri základni 1,5 jjm v porovnaní s 20 až 40 x 1,5 až 2,0 pm. Konídie v slizovitej bielej hmote sú valcovitého tvaru 3,0 až 7,0 x 1,5 um.

Organizmus vykazuje nasledujúce rozdiely od typických kmeňov Arremonium strictum : pomalší rast, čisto biele kompakt né kolónie, vzdušné okraje, nepravidelné a difúzne kondiofory z vzdušné a smerujúce k synematóznym, stredná konidioforná dĺžka je dlhšia.

Z vyššie popísaných mikroskopických a morfologických rysov je pliesňový izolát X06/15/458 najlepšie klasifikovaný W. Gamsom, ako ftcremonium c.f.strictum. ako je popísané v Gams, W (1971) Cephalosporium-artige Schimmelpilze, vydané Gustávom Fischerom.

Kmeň X06/15/458 bol 7.októbra 1992 uložený na základe medzinárodnej dohody z Budapešti v International Mycological Inštitúte, Egham, Syrrey, V.Británia, pod číslom IMI 354451.

Vyššie uvedený popis ilustruje kmeň ftcremonium strictum. ktorý sa môže použiť na prípravu seskviterpénov podľa vynálezu. Vynález zahrňuje tiež mutanty vyššie popísaného mikroorganizmu. Napríklad tie, ktoré sa získavajú prirodzenou selekciou alebo ktoré sú produkované mutačnými činidlami použitím iónizačného ožarovania, ako je ultrafialové žiarenie alebo chemickými mutagénmi, ako je nitrozoguanidín alebo podobným zpracovaním, sú tiež zahrnuté do rozsahu tohoto vynálezu.

Vynález sa týka tiež spôsobu prípravy zlúčenín podľa vynálezu, ktorý zahrňuje (i) fermentáciu v zdroji uhlíka, dusíka a anorganických solí, pliesňového kmeňa Χ06/15/458 (IMI 354451) alebo jeho mutantu, ktorý produkuje seskviterpén všeobecného vzorca I, (ii) izoláciu uvedeného seskviterpénu z fermentačného média, (iii) keď je to potrebné, oxidáciu seskviterpénu všeobecného vzorca I, kde A znamená kruh (c) na seskviterpén všeobecného vzorca I, kde A znamená kruh (d) a/alebo (iv), keď je to potrebné, prevedenie uvedeného seskviterpénu na jeho farmaceutický alebo veterinárne použiteľnú soľ.

Seskviterpény všeobecného vzorca I sa typicky pripravujú aerobnou fermentáciou vodného živného média za podmienok vyššie popísaných, produkčným kmeňom ftcremonium strictum X06/15/458 alebo produkčným mutantným kmeňom X06/15/458. Ako vhodné média sa používajú obvyklé média používané na prípravu antibiotík. Tieto média obsahujú zdroje uhlíka a dusíka asimilovateľné mikroorganizrnom. Keď je potrebné, môžu sa pridať aj v malom množstve anorganické soli. Fermentačné média môžu obsahovať stopy kovov potrebných na rast mikroorganizmov a na vznik žiadaných zlúčenín. Obyčajne sa používajú v dostatočných koncentráciách vo forme komplexných zdrojov uhlíka a dusíka, ktoré môžu byť použité ako živné zdroje, alebo môžu byť, keď je to potrebné, pridané k médiu oddelene.

Biologicky čistá kultúra pliesňového kmeňa X06/15/458 alebo mutantu ktorá produkuje seskviterpén všeobecného vzorca I je ďalším aspektom vynálezu. Tieto kultúry neobsahujú v podstate ďalšie mikroorganizmy.

Asimilovateľné zdroje uhlíka, dusíka a minerálov sú buď v jednoduchej forme alebo vo forme komplexných výživných preparátov. Ako zdroje uhlíka sa používajú obvykle glukóza, maltóza, škrob, glycerol, meláza, dextrín, laktóza, sacharóza, fruktóza, karboxylové kyseliny, aminokyseliny, glyceridy, alkoholy a rastlinné oleje. Zdroje uhlíka tvoria zvyčajne 0,5 až 10 Z hmôt, fermentačného média.

Ako zdroje dusíka sa zvyčajne používajú sojová múčka, kukuričné nápoje, múčka z bavlníkových semien, zmes polypeptidov, pomleté orechy, sladový extrakt, kaseín, zmesi aminokyselín, amoniak (plynný alebo roztok), amónne soli alebo dusičňany. Taktiež môže byť použitá močovina a ostatné amidy. Zdroje dusíka tvoria zvyčajne 0, 1 až 10 7. fermentačného média.

Živné minerálne soli, ktoré sa môžu pridávať do kultúrneho média obsahujú zvyčajne používané soli, ktoré sú schopné uvolňovať sodík, draslík, amoniak, Železo, horčík, zinok, kobalt, mangán, vanád, chróm, vápnik, meď, molybdén, bór, fosforečňany, sírany, chloridy a uhličitany.

V prípade potreby , za účelom regulácie prebytku peny, sa pridávajú protipeniace činidlá.

Fermentácia pri ktorej sa používa ficremoniuín strictum X06/15/458 sa vykonáva pri teplote 20 až 35 °C, výhodne pri teplote 24 až 30 0C. Optimálne výsledky sa získavajú fermentáciou ktorá sa vykoná pri teplote 24 až 26 °C. Vhodné pH živného média je v rozsahu 5,0 až 8,5, výhodne 6,0 až 7,5.

Fermentácia v malom rozsahu sa zvyčajne vykoná umiestnením vhodného množstva živného média do nádoby známymi sterilnými technikami, očkovaním obsahu nádoby buď spórami alebo vegetatívnymi bunkami ftcremonium strictum, uzatvorením nádoby vatou. a udržiavaním priebehu fermentácie pri konštantnej teplote okolo 25 °C v rotačnej trepačke pri otáčkach 25 až 300/min. počas 2 až 10 dní.

Vo väčšom rozsahu je výhodné vykonať fermentáciu vo vhodných nádobách ktoré majú miešadlo a prostriedky na prevzdušnenie fermentačného média. Živné médium sa v nádobe po sterilizácii očkuje vegetatívnymi bunkami Acremonium strictum. Fermentácia prebieha počas 1 až 8 dní za miešania a/alebo prevzdušňovania živného média pri teplote v rozsahu 24 až 30 °C. Stupeň prevzdušňovania závisí na niekoľkých faktoroch, ako je veľkosť fermentora a rýchlosť miešania. Zvyčajne sa fermentácie vykonávajú pri otáčkach 95 až 500/min a pri prevzdušňovaní 0,1 až 1,0 obj./obj./min.

Seskviterpén všeobecného vzorca I sa nachádza po skončení fermentácie hlavne v mycéliu, izoluje sa a čistí. Separácia a čistenie zlúčeniny z fermentačnej živnej pôdy a jej získanie sa vykoná extrakciou použitím rozpúšťadiel, nasleduje delenie do frakcií zvyčajnými chromatografickými technikami a spôsobmi pri ktorých sa používajú rozpúšťadlá. Seskviterpén sa získa v podstate v čistej forme.

Seskviterpény všeobecného vzorca I sú rozpustné v organic— kých rozpúšťadlách, ako je etylacetát, metanol a acetón. Táto vlastnosť sa využíva pri ich získavaní z fermentačného mycélia. Fermentačné mycélium sa vhodne kombinuje s približne rovnakým objemom organického rozpúšťadla, napríklad s júci surový extrakt sa potom koncentruje pri acetónom. Vzniká— níženom tlaku a získa sa vodná suspenzia, ktorá sa extrahuje organickým rozpúšťadlom a získa sa surový organický extrakt. Extrakt sa je (alebo odstreďuje) a rozpúšťadlo sa koncentruje pri filtru— zn í lenom tlaku. Organický zvyšok sa čistí najprv chromatograficky, napr. použitím kolónovej chromatografie Sephadex LH-20 s meta nolom ako eluentom.

Žiadaný produkt a niektoré nečistoty sú zadržiavané v kolóne, avšak mnoho ďalších nečistôt (hlavne nepoláme nečistoty) nie sú zadržiavané. Kolóna sa premyje organickým nepolárnym rozpúšťadlom, ako je hexan alebo toluén, čím sa odstránia ďalšie nečistoty, potom postupne zmesou dichlórmetanu alebo chloroformu a ďalšími organickými rozpúšťadlami, ako je metanol alebo etylacetát. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa sa ďalej chromatografuje, napríklad kolónovou chromatografiou, chromatografiou na tenkej vrstve, preparatívnou chromatografiou na vrstve alebo vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou. Výhodne tieto ďalšie chromatografické postupy obsahujú chromatografiu s reverznou fázou C18 HF’LC (25 x 10 cm, gradient CFK CN : H2O).

Vhodné adsorbenty obsahujú silikagél a oktadecyl viazaný na oxid kremičitý, pričom sa môžu použiť ako eluenty rôzne rozpúšťadlá alebo kombinácia rozpúšťadiel. Frakcie eluátu sa potom skúmajú chromatografiou na tenkej vrstve, vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou alebo ostatnými známymi technikami na prítomnosť a na izoláciu požadovanej zlúčeniny. Použitím vyššie uvedených techník sa získajú rafinované kompozície, ktoré obsahujú seskviterpén, ktorého prítomnosť sa stanoví analýzou chromatografických frakcií z hľadiska fyzikálno chemických charakteristí k a/alebo väzbovej aktivity komplexu benzodiazepínu s receptorom.

Seskviterpén všeobecného vzorca I v ktorom A znamená kruh (c) (zlúčenina E> sa môže oxidovať na svoj

15,16-ortochinonový derivát, ktorý je seskviterpénom všeobecného vzorca I, v ktorom A znamená kruh (d) (zlúčenina F>.

Zlúčenina F má nasledujúcu štruktúru

(F) ny že

Oxidácia sa vykoná tak.,

E na vzduchu. Oxidácia sa vzdušná oxidácia ako bola že sa nechá stáť roztok zlúčenimôže vykonať alternatívne pretouvedená vyššie, môže byť urýchlená pridaním oxidačného činidla do roztoku zlúčeniny E. Vhod ným príkladom oxidačného činidla je jodistan sodný (NaI0₄).

Seskviterpén všeobecného vzorca I sa môže previesť na farmaceutický alebo veterinárne použiteľnú soľ.

Ako príklady vhodných solí sa používajú soli s alkalickými kovmi, napr. soli sodné, draselné a amónne.

Zlúčenina D, sodná soľ zlúčeniny

A, sa pripraví napríklad spracovaním zlúčeniny A s hydroxidom sodným v metanole

Zlúčeniny podľa vynálezu sú účinné na liečenie chorôb modulovaných ligandami benzodiazepín-receptor , ktoré sú v ióno rofmnom receptorovom komplexe GABA.Bz-Cl“. Pacient je podľa vymnožstvo jednej zo zlúčeniny podľa vynálezu. Zlúčeniny podľa vynálezu majú agonistickú aktivitu a používajú sa reguláciu stavov spôsobených viazaním benzodiazepínu k benzodiazepínovému receptoru ktorý je v iónoformnom receptorovom komplexe GABA-Bz-Cl^_.

Preto sa môžu použiť ako protikččové liečivá, anxiolytiká, uvlhovače svalového napätia a hypnotiká. Stav ľudí a zvierat, sa tak z lepší.

Zlúčeniny podľa vynálezu vykázali účinnosť v skúške benzodiazepí n-receptor, ktorá využíva tritiovaný ligand, ktorý je špecifický pre receptor prítomný vo vyčistenom iónoformnom receptorovom komplexe GABA-Bz-Cl~. Podrobnosti skúšky sú uvedené v príklade 5, ktorý nasleduje.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa podávajú v rôznych formách na dávkovanie, napríklad orálne ako sú tabletky, kapsule, cukrom alebo tenkou vrstvou potiahnuté tabletky, kvapalné roztoky alebo suspenzie alebo parenterá1 ne, napríklad intramuskulárne, intravenózne a subkutánne. Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť podané tiež injekčné alebo vo forme infúzií.

Dávka závisí na mnohých faktoroch, ako je vek, hmotnosť a stav pacienta a na ceste podania. Typická dávka pre všetky cesty podania je u dospelých pacientov 0,001 až 10 mg/kg, najčastejšie 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti. Dávka sa podáva napríklad 1 až 5 x denne orálne alebo bolusovou infúziou, niekoľkohodinovou infúziou a/alebo opakovaným podaním.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú formulované na použitie ako farmaceutické alebo veterinárne prípravky a obsahujú tiež far14 maceuticky alebo veterinárne použiteľný nosič alebo riedidlo. Prípravky sú typicky pripravované nasledujúcimi známymi spôsobmi a sú podávané vo farmaceuticky alebo veterinárne vhodnej forme.

Napríklad pevné formy na orálne použitie môžu obsahovať spoločne s aktívnou zlúčeninou, riedidlá, ako sú laktóza, dextróza, sacharóza, celulóza, kukuričný škrob alebo zemiakový škrob, mastivá, ako je oxid kremičitý, talok, kyselina stearová, stearát horečnatý alebo vápenatý alebo polyetylénglykoly, pojivá, ako sú škrob, arabská guma, želatína, metylcelulóza, karboxymetylcelulóza alebo polyviny1pyrrolidon, dezintegračné činidlá ako sú škrob, kyselina alginová, algináty, sodné glykoláty škrobu, šumivé zmesi, farbivá, sladidlá, zmačadlá, ako je lecitín, polysorbáty, laurylsírany. Tieto prípravky sa pripravia známymi spôsobmi, napríklad zmiešaním,granulovaním, tabletkovaním, povliekaním cukrom alebo tenkou vrstvou.

Kvapalné disperzie na orálne podanie môžu byť vo forme sirupov, emulzií alebo suspenzií. Sirupy môžu obsahovať ako nosiče napríklad sacharózu alebo sacharózu s glycerolom a/alebo manitolom a/alebo sorbitolom. Zvlášť sirup pre diabetikov obsahuje ako nosič len také látky, napríklad sorbitol, ktoré nemetabolizujú na glukózu alebo ktoré metabolizujú len v malom množstve na glukózu. Suspenzie a emulzie môžu obsahovať ako nosiče, napríklad prírodnú živicu, agar, alginát sodný pektín, metyIcelulózu, karboxymetylcelulózu alebo polyviny lal kohol.

Suspenzie alebo roztoky pre intramuskulárne injekcie môžu obsahovať spoločne s aktívnou zlúčeninou, farmaceutický použiteľný nosič, ako je sterilná voda, olivový olej, etyloleát, glykoly, ako je propylénglykol a keď je to potrebné, vhodné množstvo hydrochloridu lidokaínu. Roztoky na intravenózne injekcie môžu obsahovať nosič, napríklad sterilnú vodu. Výhodné sú vo forme sterilného, vodného izotonického soľného roztoku. Alternatívne môíu byť zlúčeniny podľa vynálezu zapúzdrované v lypozómoch.

Vynález bude bližšie objasnený pomocou nasledujúcich príkladov:

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Kultúra X06/15/459 v kvapalnom médiu

Východzia látka kmeňa X06/15/458 sa vytvorila suspendovaním zrelej bakteriálnej kul túry pestovanej na MEA (2 Z sladový extrakt, 1,5 Z agar) v 5 ml

7. vodného glycerolu. 1 ml tejto banke obsahuje východziu látku, ktorá bola uskladnená pri

135 o C. Predkul túra sa získala asep— tickým uložením 0,5 ml východzej látky do 10 ml živného roztoku

S (1,5 7. sojového peptónu, 1 7.

D-glukózy, 0,5

7. sladového ex — traktu, 0,3 7. NaCl,

0, 1

0,1 7. Tween 80, 0,1 7. Junlon

PW110 (výrobca Honeywell a Stein

Ltd., Time House, Throwley Way

Sutton, Surrey, Sľll 4AF) , upraveného na pH 6 v skúmavke (25 mm x 200 mm) a pretrepávaní m pri 240 otáčkach za minútu počas 4 dní pri 25 ^Ľl C.

Medzikultúra sa získala aseptickým prenesením predkultúry

do 300	ml
báciou	na
pri 25	'-'C.

živného roztoku S v 2 1 Erlenmeyerovej banke a inku— rotačnom šejkri pri 240 otáčkach za minútu počas 3 dní

Produkčná kultúra sa získala aseptickým prenesením medzi— kultúry do 14 1 fermentoru za miešania, ktorý obsahová1

1 živ— ného roztoku P

2,38 7. trehalózy,

0,69 7. k.vasničného extraktu,

0,1 Z karboxymetylcelulózy, 0,1

7. Tween SO, 0,98 Z MES, upraveného na pH 6). Nádoba sa miešala pri 340 otáčkach/min a prevzdu— šňova1 a pri 0,7 obj./obj./min, rozsahu pH sa neupravilo, zostávalo v

6,0 až 7,0. Počas fermentacie sa fermentor udržiaval na konštantnej teplote ^C'C. Po 7 dňoch sa fermentácia zakončila a produkt sa extrahoval

Fermetácia väčšieho množstva sa vykonala v 75 1 fermentoroch nasledovne. 40 ml predkultúry sa pripravilo vyššie popísaným spôsobom (štyri 25 x 200 mm skúmavky) a prenieslo sa do 2 1 živného roztoku S v 31 fermentore. Nádoba sa miešala pri 500 otáčkach/min a prevzdušňova1 a sa pri 0,25 obj./obj./min, pH sa neupravovalo a teplota sa udržovala na 25 ^C'C. Po 4 dňoch sa táto medzikultúra aseptický preniesla do 75 1 fermentoru obsahujúceho 50 1 živného roztoku P. 75 1 nádoba sa prevzdušňovala pri 0,5 obj./obj./min a pri 350 otáčkach/min za účelom udržania tenzie rozpusteného kyslíka v priebehu fermentácie na hodnote vyššej ako 70 Z, pH sa neupravovalo ale zostávalo stále na hodnote 6,0 až 7,0 a teplota sa udržiavala konštantná, 25 °C. Po 7 dňoch sa fermentácia zastavila a biomasa sa vybrala.

Príklad 2

Extrakcia a čistenie zlúčeniny A

Z

1 fermentačnej živnej pôdy sa odstredilo a mycelium (— 344 g) sa extrahovalo acetónom (3 x 5 1). Extrakt sa koncentroval do sucha (8,0 g) a opäť sa rozpustil v čistom metanole. Čistenie sa vykonalo preparátívnou HPLC s reverznou fázou pou— t

žitím Waters Delta-Pak C18 (100 A, 15 pm) kolóna (ID 10,0 mm, dĺžka 25,0 cm) s gradientom mobilej fázy 4 minúty (80 7. vodný acetonitril, prietok 12 ml/min), lineárne stúpanie na 20 minút (100 7. acetonitril, prietok 12 ml/min). Monitorovanie vlnovej dĺžky pri 280 nm.

Pik odobratý po 17 až 18 minútach sa ďalej čistil použitím rovnakej kolóny ale s gradientom mobilnej fázy 15 minút (40 Z vodný acetonitril, prietok 12ml/min), stúpanie lineárne na 20 minút (100 7. acetonitril, prietok 12 ml/min).

Pik odobraný medzi 9 a 10 minútami bol seskviterpén všeobecného vzorca II, v ktorom Y znamená dvojitú väzbu.

Zlúčenina mala nasledujúce fyzikálne charakteristiky: Molekulový vzorec : C22H30O4

Molekulová hmotnosť: 358 Ffozpustnosť v metanole, acetóne, etylacetáte

UV C max	(nm) (e )1:
276,6	(4900)	MeuH
207,6	(30000)	MeDH-KDH
311,2	(4100)

Hmôt, spektr.: Lm/z intenzita (Z)]:

DEI	358 (M+, 100), 233 (55), 203 (15), 155 (20)
DCI (NH₃ )	359 (MH+, 100), 233 (10), 203 (20), 155 (20)

Vysoké rozlíšenie CI: 359,2270, CíjHsiO# predpokladá 359,2214

IC (KBr)

C < v c m™ ¹ ] - 3395,2, 2930,2, 1730,4

1 HNMR	: C400 MHz, CD3OD, δ (m,	J, poloha)]:
1, 13	(3H,	s,	3H-21),	1,14 (3H,	s, 3H-20),	1,37	(1H, m, H-lOa)
1,51	(3H,	S,	3H-19),	1,58 (1H,	šdd, 13,2,	10, 1,	6,8, H-10a),
1,72	( 3H,	S ,	3H-22),	1,85 (1H,	šdd, 13,0,	4,5,	H-6a), 2,8 (1H
šdd,	12,5,	7,	1, H-9a)	, 2,22 (1H	l, šdd, 9,8,	5,2,	H—11), 2,23 (

šdd, 11,6, 11,6, H^-9b), 2,33 (1H, šdd, 12,7, 12,7, H—6b), 2,38

( 1H,	dd, 14,5, 9	,9,	H-2a),	2,70 (1H, šddd, 14,5,	n o	1,6, H-2b),
3,02	(1H, ddd,	7,8,	5,6,	1,5, H-17), 3,67 (1H,	dd,	5,8, 5,8,
H-13)	, 3,80 (1H,	dd,	9,3,	7,9. H—18a), 3,83 (1H,	Šdd,	6,0, 6,0,
H—12)	, 4,03 (1H,	šdd	, 9,3,	1,5, H—18b), 5,17 (1H,	m,	H-7), 5,24
( 1H,	dd, 15,9, 1	,5,	H-4) ,	5,32 (1H, ddd, 15,9, 10	,0,	2,2, H-3).

i-^;C-NMR: Ľ100 MHz, CĽh>OD, 8 (m, poloha)]:

17,66	(q, C-22),	23,71	(q, C-19),	24,92 (q, C-20),	30,85 (q,
C—21),	32,24 (t.	C-10)	, 37,37 (t,	C-9), 39,37 (s,	C-5), 42,22
(d, C—	13), 43,11	(t, C	-6), 45,01	(d, C-ll), 45,17	(t, C-2),
48,97	(d, C—17),	70,86	(t, C-18),	83,70 (d, C-12),	88,94 (s,
C-l ),	121,90 (d,	C-3) ,	124,68 (d,	C-7), 135,25 (s.	C-15),
137,39	(s, C-8),	144,7	3 (d, C—4),	166,96 (s, C-14)	, 200,99

(s, C—16).

Príklad 3

Extrakcia a čistenie zlúčeniny B

Z

Obsah 75 1 fermentoru sa centrifugoval a mycelium sa extrahovalo etylacetátom (5 x 10 1). Tento extrakt sa koncentroval do sucha a opäť sa rozpustil v metanole a Čistil sa preparatívnou HPLC v reverznej Ťázi použitím Waters Delta—Pak C18 /

(100 A, 15 pm), kolóna ID 10,0 mm, dĺžka 25,0 cm a mobilnA fáza 5 minút v 80 Z acetonitrile (prietok 10 ml/min). Vlnová dĺžka bola zisťovaná pri 280 nm. Zlúčenina, ktorá bola eluovaná medzi 23 a 25 minútami bola zlúčeninou B, seskviterpén všeobecného vzorca III, kde R znamená OH.

Zlúčenina mala tieto nasledujúce fyzikálne charakteristiky:

ľlol.ekulový vzorec : C24H30O6

Molekulová hmotnosť: 414

Rozpustnosť v metanole, etylacetáte, chloroforme a acetóne

UV C A. max (nm) ( ^£ ) 3

200

HPLC, rozpúšťadlo (H2O-CH3CN)

268

368

277,0 (29500)

MeOH (3900)

289,8 (32100)

MeOH-KOH

344,4 (3800)

271,6 (47000)

MeOH-TFA

324,8 (3400)

Hmôt, spektr.: Cm/z intenzita (Z)]

DEI

414 (M+, 100), 331 (45), 277 (20), 211 (50)

DCI (NH3)

415 (MH+, 100)

Vysoké rozlíšenie EI: 414,2059, CsaHsoOô predpokladá 414,2034 211,0240, C9H7O6 predpokladá 211,0240

IČ (KBr) C< v cm-J:

3265, 2960, 2930, 2855, 1735, 1625

¹H-NMR :	C400 MHz,	CDCla	, 8 (m,	J, poloha)1
1,4 (t),	1,7 (dd),	1,75	(dd), 2	,05 (dd), 2,	16 (d+dd), 2,3 (t),
2,4 (dd),	2,7 (dt)	, 4,9	(d+td),	5,05 (d+d),	5,2 (dd), 5,25 (dd)
130-NMRs	C 100 MHz,	CDCla	, 8 (m,	poloha)]:
160,4, 150, 146,1,	144,2	, 144,	142,1, 136,	126,9, 123,7, 123,

118,7, 96,9, 84,3, 72,3, 43,5, 41,4, 40,7, 38,2, 37,7, 29,4, 28,2, 24,2, 22,7, 17

Pr í k 1 ad 4

Extrakcia a čistenie zlúčeniny C

Obsah 75 1 fermentoru sa centrifugova1 a mycélium sa extrahovalo etylacetátom (5 x 10 1). Tento extrakt sa koncentroval do sucha a opäť sa rozpustil v metanole a čistil sa preparatívnou HPLC v reverznej fázi použitím Waters Delta-Pak F'repo

Pak 3000 patróna (C18, 100 A, 15 pm, ID 47 mm, dĺžka 30,0 cm) a gradient mobilnej fázy 0,5 minút v 80 Z vodnom acetonitrile (prietok 50 ml/min), stúpanie lineárne do 30 minút v 100 Z acetonitrile (prietok 50 ml/min). Zlúčenina, ktorá bola eluovaná medzi 18 a 19 minútami bola zlúčeninou C, seskviterpén všeobecného vzorca II, kde R znamená H. Tento pik sa ďalej čistil použitím rovnakej kolóny ale s gradientom mobilnej fázy 5 minút v 30 Z acetonitrile (prietok 50ml/min), stúpanie lineárne do 10 minút v 15 Z vodnom acetonitrile (prietok 50 ml/min). Tento roztok sa udržiaval 15 minút v 15 Z vodnom acetonitrile (prietok 50ml/min) a potom stúpal lineárne 5 minút do 100 Z acetonitrilu (prietok 50 ml/min). Pik žiadanej zlúčeniny (zlúčenina C) eluoval medzi 22 a 24 minútami pod týmto gradientom.

Zlúčenina mala nasledujúce fyzikálne charakteristiky: Molekulový vzorec : C24H3QO5

Molekulová hmotnosť: 398

Rozpustnosť v metanole, acetóne, etylacetáte

UV: C (nm) (<£)]: 270,6 (41700)	MeOH
338, 4	(3800)
209,3	(13300)	MeOH-KOH
282, 3	(41400)
326,4	(3200)
342, 8	(3900)
390,0	(3000)

- 20 271.2 (52200)

MeOH-TFA

316,6 (4300)

Hmôt, spektr.: Lm/z intenzita (Z) 3 s

DEI 398 (M+, 100), 315 (90), 256 (100), 233 (95),

195 (40)

DCI (Nhb) 399 (MH+, 100), 222 (10), 205 (90), 195 (20),

172 (70)

Vysoké rozlíšenie EI : 398,2093 CaAHsr.Oi predpokladá 398,2095

IČ (KBr) v cm^-]:

3400 (sh), 3200, 2928, 1750, 1600, 1380 i H-NMR

C400 MHz, Cé Da , vo vzťahu k 7,16 ppm, 8 (m, J, pozícia) J (3H,

3H-22), 1,01 (3H, s, 3H-21),

5H-23), 0,93*

0,75* (3H, s,

1,11	(1H, t,	11,7, H—10a),	1,40	(1H, šdd,	14,9,	7,6, H-10b),
1,45	(3H, šs	, 3H-24), 1,63	( 1H,	dd, 13,0,	5,0,	H—6a), 2,05	(1H,
št,	11,5, H-	6b), 2,10 (1H,	m, H	-2a), 2,11	( 1H,	m, H—9a), 2,	17
( 1H,	dd, 11,	0, 3,8, H—11),	2,60 (1H, t,	12,1,	H-9b), 2,74	( 1H,
šd,	14,5, H—	2b), 4,37 (1H,	dd,	12,9, 1,6,	H—20a), 4,44 (1H,	dd,
13,0	, 3,2,	H—20b), 4,59 (1H,	šdt, 11,2,	3,0,	H—12), 5,01	(1H
dd,	15,8, 1	,5, H—4), 5,11	( 1H,	dd, 15,8	, 2,8,	H—3), 5,15	(1H
šdd,	10,0, 3	,2, H-7), 6,57	( 1H,	s, H-18).

T ^1::,C—NMR: £400 MHz, C* D* , vo vzťahu k 7,16 ppm, 8 (m, J pozícia)!:

17,20 (q, C—24), 22,82 (q, C-21), 24,21* (q, C-23), 28,61 (t, C-10), 29,55* (q, C—22), 38,28 (t, C-9), 38,33 (s, C-5), 41,44 (d, C-ll), 41,93 (t, C-6), 43,98 (t, C-2), 75,35 (t, C-20),

85,28 (d, C—12), 86,75 (s, C-l), 108,49 (d, C-18), 120,05 (d,

C—3), 124,20 (d, C—7), 127,94 (s, C-13), 136,22 (s, C-8), 137,45 (s, C—19), 143,74 (d, C-4), 147,96 (s, C-14), 149,71 (s, C-15), 160,00 (s, C—17), 165,58 (s, C-16).

2ί

Príklad 5

Extrakcia a Čistenie zlúčeniny A

Biomasa X06/15/458 sa zozbierala filtráciou a postupne sa extrahovala acetónom (25 1) a extrakt sa oddelil od biomasy filtráciou. Acetón sa odstránil rotačným odparovaním a zvyšok vodnej kaše sa suchým vymrazovaním previedol na gumu.

Táto guma sa rozpustila v metanole (250 ml), filtrovala sa a potom odparila. Vzorka sa chromatografoval a HPLC v reverznej fázi použitím 47 x 100 mm Cia (oktadecylsi1ica) Delta-Pak patróny s 15 mikrónovou náplňou. Použitý prietok bol 100 ml/min s gradientom 80 Z voda - 20 Z acetonitril až 20 Z voda - 80 Z aceto— nitril počas periódy 30 minút. Zlúčenina A bola stanovená pri 278 nm. Aktívna frakcia bola opäť chromatografovaná použitím tej istej kolóny, pri prietoku s gradientom 60 Z voda — 40 Z acetonitril až 35 Z voda - 65 Z acetonitril počas 40 minút. Aktívna frakcia sa koncentrovala na rotačnej odparovačke na odstránenie acetonitrilu a suchým vymrazovaním sa získala pevná látka (zlúčenina A, dávka 1).

Ďalšie čistenie sa vykonalo chromatografiou s normálnou fázou použitím momentovej (mžikovej) kolóny naplnenej do hĺbky 16 cm silikagélom (MERCK, 230-400 mesh, častice 0,040 - 0,063 mm) a izokratickou eluciou zmesi 40 Z hexánu — 60 Z etylacetátu - 1 Z kyseliny octovej. Prchavé rozpúšťadlo sa odstránilo znížením tlaku a získal sa bezfarebný olej. Odstránením zvyšku rozpúšťadla suchým vymrazovaním sa získali biele kryštály (zlúčenina A, dávka 3).

Produkt sa uložil do mraziaceho boxu na 6 týždňov. Potom sa vykonala HPLC v reverznej fázi na Prep 3000 použitím 25 x 100 mm patróny naplnenej Cia-Nova—F'ak HR (6 mikrónov). Použitý prietok bol 20 ml/min a gradient 70 Z voda - 30 Z acetonitril až 1O0 Z acetonitril počas 20 minút. Okrem zlúčeniny A bola izolovaná druhá polárnejšia zložka, ktorá bola identifikovaná ako 7,8—epoxid zlúčeniny A, zlúčenina A- . Na oddelení zlúčeniny A od jejho 7,8 epoxidu sa použil Delta Prep s gradientom 60 Z vody — 40 Z acetonitrilu až 40 Z vody - 60 Z acetonitrilu počas 20 minút.

Identifikácia zlúčeniny A' sa vykonala porovnaním UV, HS a NMR údajov s odpovedajúcimi údajmi získanými pre zlúčeninu A (viď pri k 1 ad 2).

Zlúčenina A^z má nasledujúce fyzikálne

Molekulový vzorec : C22H30O5

Molekulová hmotnosť: 374

Rozpustnosť : MeOH (dobrá)

U V : Ľ A-max (nm) J:

278 (metanol)

Hmôt, spektr.: Technika	m/ z	intenzita ( 7.)
	Cl	MH+	375	100
		M N Ha	392	·-> x.
	EI	M+-	374
			219	20
			153	40
			43	100
IČ (KBr)	•f v c m ~¹	: 3383 š,	2959 š,	1624, 1387.

1H-NMR

S/ppm v CĽHOD:

1,13 (3H

s), 1,29 (3H, s),

1,39 (3H, s)

1,45 (1H, m), 1,49 (3H, dd)

1,53 (2H, m),

1,82 ( 1H, dd), 2,00 (

1H, m),

2,10 (2H,

m) , 2, <1H, m), 2,75 (1H, m) ? -‘‘-t (1H, m),

3,0 (1H,

m), 3,70 (1H, dd),

3,75 (1H, dd), 3,80 (1H, dd),

5,55 (2H, d) ¹⁵ C—NMR

8/ppm v

CDsOD: 200,7 (C_í6), 165,9 (C14), 143,4 (Ca ) ,

135,0 (Čie), 122,6 (C-< ) , 87,6 (Ci ), 82,6 (C₁₂), 70,7 (C_i9), 63,7 (C₃), 62,3 (C₇), 47,6 (Cn), 44,9 (C₂), 42,1 (C13), 41,4 (C₆), 36,6 (Ce), 36,5 (C?), 31,2 (C₂), 27,4 (Ci_C>), 24,7 (C_2O), 23,1 <Ci9), 17,6 (C22), 48,6 (C17) — zatienené rozpúšťadlom.

Príklad 6

Extrakcia a čistenie zlúčeniny E

1 fermentačnej živnej pôdy X06/15/458 sa odstredilo a mycélium sa extrahovalo etylacetátom (5 x 1O 1). Extrakt sa koncentroval do sucha a opäť sa rozpustil v čistom metanole. Čisté23 nie sa vykonalo preparatívnou HPLC v reverznej fázi použitím Waters Delta—Pak PrepPak 3000 patróny (C18, 100 A, 15 mu, ID 47 mm, dĺžka 30,0 cm) a izokratickou mobilnou fázou 40 Z vodného acetonitrilu (prietok 50 ml/min) počas 50 minút a potom prepláchnutím acetinitrilom počas 10 minút. Zlúčenina ktorá eluovala medzi 44 a 48 minútami bola stanovovaná pri 200 nm. Tento pik bol ďalej čistený semipreparatívnou HPLC v reverznej fázi použitím Waters Delta—Pak kolóny (C18, 100 A, 15 JJm, ID 10,0 mm, dĺžka 25,0 cm) a izokratickou mobilnou fázou 55 Z vodným acetonitrilom (prietok 15 ml/min) počas 10 minút. Zlúčenina eluujúca medzi 23 a 28 minútami bola zlúčeninou E. Vlnová dĺžka bola stanovená pri 20 nm.

Zlúčenina E má nasledujúce fyzikálne charakteristiky:

Molekulový vzorec : C23H3CO4

Molekulová hmotnosť: 370

Rozpustnosť : metanol, etylacetát

UV: C λ max (nm)	(e)	rozpúšťadlo 3:
213,4	24400	MeOH
230,Osh	7500
277,3	9200
215,6	6900	MeOH-KOH
228,2sh	5400
286, 1	5200
Hmôt, spektr.: Em/z (intenzita	( Z ) 3 :
EI 370 (lt+, 2 Z),	167 (80)	, 166 (100)
DCI (NHs): 371 (MH+, 30 Z)	, 205 (100), 167 (100), 149 (40),
135 (25), 123 (40), 121	(30), 109 (40)
IČ (KBr): Ľ < v cm~i3:
3333,4, 2932,2,	2862,7,	1720,7, 1622,3, 1496,9,
1381,2, 1239,1,	1286,7,	1167,1

íH-NMR : L4O0 MHz, C*D_ó/CD3OD (vo vzťahu na CDsOD pri 3,40 ppm,

S (m, J, poloha)3:

0,86* (3Η, s, 3H-22), 1,07* (3H, s, 3H-21), 1,26 (3H, s, 3H-20) , 1,36 (1H, dd, 13,6, 11,3, H-lOa), 1,62 (3H, šs, 3H-23), 1,68 (1H, m, H-lOb), 1,75 (1H, m, H-6a), 2,09 (1H, dd, 9,8, 8,6,

H—11 )	. 2,	21 (1H, t, 12,3,	H—6b),	2,27 (1H, dd,	12,7, 7,1, H-	-9a),
2,34	( 1H,	dd, 14,5, 10,3,	H—2a),	2,70 (1H, št,	11,7, H-9b),	2,84
( 1H,	dt,	14,5, 2,1, H-2b),	4,81	(1H, dd, 11,4,	1,2, H-19a),	4,88
( 1H,	šddd	, 10,2, 2,3, 1,5,	H—12)	, 5,02 <1H, ddd	, 11,3, 2,5,	0,9,

H—19b),	5,19 (1H, dd, 15,9, 1,7,	H-4) ,	5,24	(1H, šddd,	11,9
4,5, 1,2,	H-7),	5,33 (1H, ddd, 15,9,	10,3,	2 4	H-3), 6,64	(1H,
šs, H—17)	•
¹³C-NMR :	C 100	MHz, CôDé/CĽbOD (vo	vzťahu	na CD3 OD pri 49	,00
	ppm,	S (m, poloha)3:
17,8 (q,	C—23),	22,20 (q, C—20),	24,11*	(q,	C—22), 29,	56 (t

C-10), 30,32* (q, C—21), 38,33 (s, C-5), 38,35 (t, C-9), 42,12 (t, C-6), 43,72 (d, C-ll), 43,89 (t, C-2), 73,50 (t, C-19),

83,12 (d, C—12), 86,05 (s, C-l), 101,43 (d, C-17), 119,23 (s, C-13), 121,10 (d, C—3), 123,84 (d, C-7), 131,08** (s, C-15), 131,08** (s, C—18), 136,89 (s, C-8), 140,31 (s, C-14), 143,02 (d, C—4), 147,54 (s, C-16).

*, ** : priradenie môže byť vymenené.

Príklad 7

Príprava a identifikácia zlúčeniny F

Roztok zlúčeniny E popísaný v príklade 6 v metanole sa o— xidoval. na vzduchu pridaním NaI04 na urýchlenie oxidácie.

Čistenie zlúčeniny sa vykonalo preparatívnou HPLC v reverznej fázi použitím Waters Delta-Pak kolóny (C18, 100 A, 15 jim, ID 10,0 mm, dĺžka 25,0 cm) so stupňovým gradientom 25 7. vodného acetonitrilu (12 ml/min) počas 5 minút, stúpajúcej do 80 7. vodného acetonitrilu (12 ml/min) počas 35 minút. Zlúčenina eluujúca medzi 30 a 32 minútami bola zlúčeninou F. Vlnová dĺžka bola stanovená pri 200nm.

Zlúčenina F má nasledujúce fyzikálne charakteristiky: Molekulový vzorec : CsaHseO*

Molekulová hmotnosť: 368

Rozpustnosť : metanol

UV: C Λ ^max <nm)

204

300

482 rozpúšťadlo 3:

CHsCNsHaO hplc iH-NľlR : C400 MHz, CD? OD (odkaz na CD3 OD pri 3,40 ppm, 8 (m, J>3:

6,03 (1H, šs), 5,24 (1H, dd, J=l,8, 15,9), 5,07 (1H, šdd, J=3,4,

10,9), 5,0 (1H, ddd, J=2,5, 10,6, 15,9), 4,79 (1H, dd, J=l,2,

15,6), 4,65 (1H, dd, J=2,2,	15,5), 4,	55 ( 1H	d, 9,7), 2,63	( 1H,	dt,
J=2,l, 14,8), 2,44 (1H, dd,	J=10,5,	14,7),	2,27 (2H, m),	2,11	(1H
dd, J=7,2, 12,9), 1,88 (1H,	d, J=9,0)	, 1,77	í1H, m), 1,65	(3H,	s),

1,50 (1H, št, J=ll,0), 1,27 (3H, s), 1,07 <3H, s), 1,04 (3H, s).

13C-NMR : E100 MHz, CD? OD (odkaz na CD3OD pri 49,00 ppm, S (m)J: 180,16 (s), 175,03 (s), 159,46 (s), 144,57 (d), 137,71 (s), 124,25 (d), 120,6 (d), 114,37 (d), 88,75 (s), 81,63 (d), 71,91 (t), 43,40 (t), 42,68 (t), 42,58 (t), 39,19 (s), 38,96 (t), 30,52 (q), 30,22 (t), 24,50 (q), 21,90 (q), 17,21 (q).

Príklad 8

Testovanie zlúčeniny podľa vynálezu v skúške väzby benzodiazepín - receptor

Receptorový extrakt bol vo forme synaptosomálneho preparátu izolovaný z hovädzej mozgovej kôry spôsobom popísaným Langom a kol. (FEBS Lett, 104 149-153, 1979). Viažuci receptor bol stanovený použitím modifikácie popísanej □ Beirnom a Williamsom (Eur. J. Biochem., 175 413-421, 1988) metódou Braestrup and Squi— res (PNAS Z4L 3805-3809, 1977). Receptorový preparát bol inkubo— vaný v 50 mM Tris/Cl, pH 7,4 so zlúčeninou A a C⁵HJ—flunitraze— parnom (agonist) pri finálnej koncentrácii 1 nM. Viažuci rádioaktívny ligand bol umiestnený na filtri so sklenenou vatou a meraný kvapalným scintilačným čítačom. Nešpecifická väzbovosť bola stanovená vytesnením ligandu diazepamom (1 pH).

Väzbové údaje boli vložené do jedného alebo dvoch polohových modelov hmotnostnou nelineárnou regresnou analýzou použitím počítačových programov LIGAND (Munson a Rodbard: Analytic Biochem 107 220-239, 1980) a EBDA (McPherson-Computer Prog. in Biomed. _1Z 107-114, 1983).

Vyššie popísaná metóda bola opakovaná použitím zlúčenín

B a C popísaných v príkladoch 3 a 4 a tiež použitím zlúčeniny D, ktorá je sodnou soľou zlúčeniny A.

Hodnoty ICeo boli stanovené tiež pre zlúčeninu A^z, E a F popísané v príkladoch 5 až 7.

Získané výsledky boli nasledovné:

Tabuľka 1: Inhibícia väzby benzodiazepínu k benzodiazepínovému receptoru zlúčeninami podľa vynálezu

Zlúčenina	Koncentrácia	Z inhibície	ICb<>
A	93 uM	107	40 nM
	28	106
	9	99
	3	93
	930 nM	92
	280	80
	93	65
	28	44
	9	35
	3	11
B	177 jjM	78	5 μΜ
	53	92
	18	82
	5	69
	2	53
	530 nM	42
	177	36
	53	21
	18	21
C	242 uM	88	20 uM
	80	77
	24	54
	8	35
	2	12
	800 nM	9
	240	-3
	80	9

D	100 50 10 5 1 500 100 50 10 5	yM nM	92 103 100 98 86 81 65 70 45 45	10	nM
W	2,8 .	1Q-E	M	104	85	nM
	9,3 .	10”⁶		103
	2,8 .	io-⁶		85
	9,3 .	10-7		83
	2,8 .	10-7		79
	9,3 .	10” ⁸		51
	2,8 .	10-8		32
	9,3 .	10 9		19
	2,8 .	10”9		8
E	9,5 .	ÍO-S	M	104	500	nM
	4,8 .	10 S		101
	9,5 .	10-8		93
	4,8 .	10-8		88
	9,5 .	10-7		65
	4,8 .	10-7		52
	9,5 .	10-8		42
	4,8 .	10-s		37
	9,5 .	10-9		27
	4,8 .	10-9		22
F	2,7 .	ío—*	M	94	3,0	jjM
	9,0 .	10-s		89
	2,7 .	10- E		77
	9,0 .	10-8		65

2,7 .	10~í>	48
9,0 .	10-7	41
2,7 .	10-7	33
9,0 .	10-θ	27
2,7 .	10~ ⁸	24
9,0 .	ΙΟ“⁹	15

Príklad 9

Farmaceutický prípravok

Tabletky, každá hmotnosti 0,15 g obsahujúca 25 mg jednej zo zlúčenín podľa vynálezu sa pripravia nasledovne:

Prípravok na 10 000 tabletiek zlúčenina podľa vynálezu (250 mg) laktóza (800 g) kukuričný škrob (415 g) práškový talok (30 g) stearát horečnatý (5 g)

Zlúčenina podľa vynálezu, laktóza a polovica škrobu sa zmiešajú. Zmes sa potom pretlačí cez sito (veľkosť oka 0,5 mm).

Kukuričný škrob (10 g) sa suspenduje v teplej vode (90 ml).

Vznikne pasta, ktorá sa granuluje na prášok. Granulát sa suší a rozotiera na site (veľkosť oka 1,4 mm). Pridá sa zvyšok škrobu, talok a stearát horečnatý, opatrne sa premieša a spracuje na tabletky.

Claims

1. Seskviterpén všeobecného vzorca I v ktorom —a— a —b— znamená jednoduchú väzbu alebo jeden znamená jednoduchú väzbu a druhý znamená dvojitú väzbu, A, spoloč ne s —a— , —b— a atómami uhlíka ku ktorým sú viazané tvoria kruh vybraný zo skupiny (b) v ktorom R znamená H alebo OH a Y znamená dvojitú väzbu alebo, keď A znamená kruh (a) ako je vyššie definované, Y znamená buď dvojitú väzbu alebo tvorí spoločne s atómami uhlíka, ku ktorým je viazaný epoxidovú väzbu , alebo ich farmaceutický a veterinárne prípustné soli.

v ktorom -Yznamená dvojitú väzbu alebo tvorí spoločne s atómami dusíka, ku ktorým je viazaný, epoxidovú väzbu alebo jeho farmaceutický alebo veterinárne prípustnú soľ.

Seskviterpén podľa nároku 1 všeobecného vzorca III

III v ktorom R znamená H alebo OH alebo jeho farmaceutický alebo veterinárne prípustnú soľ.

4.

Seskviterpén všeobecného vzorca IV

IV

- 34 v ktorom X znamená

Nové nároky

CH alebo alebo jeho farmaceutický alebo veterinárne prípustnú soľ.

Spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca

I podľa naroku 1, vyzná čujúci sa tým , že sa (i) v zdroj i uhlíka, dusíka a anorganických solí kmeň pliesn í

Acremonium strictum označený

X06/15/458 (IMI 354451) a 1 ebo jeho mutant (ii) izoluktorý produkuje seskviterpén všeobecného vzorca II, je sa uvedený seskviterpén z fermentačného média (iii), keď je to potrebné, oxiduje sa seskviterpén všeobecného vzorca I, v ktorom A v ktorom prevedie znamená kruh (c) na seskviterpén všeobecného vzorca I

A znamená kruh (d) a/alebo (iv) keď je to potrebné, sa uvedený seskviterpén na farmaceutický alebo veteri nárne prípustnú soľ.

6. Zlúčenina ako je definovaná v ktoromkoľvek z nárokov 1 až

4, na použitie k liečeniu ľudského alebo živočíšneho tela.

*

Ί. Zlúčenina podľa nároku 6, ktorá sa použije na liečenie choroby zmiernenej ligandami na benzodiazepínový receptor v iónoformnom receptorovom komplexe gama-aminobutanová kyselina— —benzodiazepín-Cl.

8. Zlúčenina podľa nároku 7, na použitie ako antikonvulzatum, anxiolitikum, uvolňovač svalového napätia alebo ako hypnotikum alebo na zlepšenie pamäti alebo pri predávkovaní liečivami.

9. Farmaceutický alebo veterinárny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako aktívnu zložku zlúčeninu definovanú v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 4 a farmaceuticky prípustný nosič alebo riedidlo.

10.. Biologicky čistá kultúra kmeňa pliesní ňcremonium strictum označená X06/15/458 (IMI 354451) alebo jeho mutantu, ktorý produkuje seskviterpén všeobecného vzorca I, ako je definované v nároku 1.

11. Spôsob fermentácie kmeňa pliesní Acremonium strictum označený X06/15/458 (IMI 354451) alebo jeho mutantu, ktorý produkuje seskviterpén všeobecného vzorca I, ako je definované v nároku 1, vyznačujúci sa tým, že spôsob obsahuje fermentáciu uvedeného kmeňa X06/15/458 alebo jeho mutantu v zdroji uhlíka, dusíka a anorganických solí.