BG99736A

BG99736A - Сескитерпени,тяхното получаване и използването им като инхибитори на гамк-бензодиазепиновите рецептори

Info

Publication number: BG99736A
Application number: BG99736A
Authority: BG
Inventors: Didier Renno; Gerard O'beirne; Brent Copp
Original assignee: Xenova Limited
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 1996-04-30
Also published as: GB9503413D0; CZ164695A3; IL108140A; NZ258986A; GB2284603B; MX9400174A; AU5709694A; HUT71859A; TW242141B; IL108140A0; CZ284121B6; BR9307712A; EP0675888A1; CA2151251A1; HU9501840D0; NO952483D0; JPH08504804A; KR950704324A; FI953081A; US5565486A

Abstract

Изобретението се отнася до сескитерпени и до техни фармацевтично и ветеринарно приемливи соли, инхибитори на свързването на бензодиазепин с -аминомаслена киселина (ГАМК)-бензодиазепин-Сl- йонофорен рецепторен комплекс. Съединенията се получават чрез ферментация в присъствие на източник на въглерод, азот и неорганични соли на щам от гъба Acremonium strictum, означен с ХО6/15/458 (IMI 3544451), или негов мутант, продуциращ посочените сескитерпени, изолиране на сескитерпените от ферментационната среда и по желание превръщане на получените сескитерпени в тяхна фармацевтично или ветеринарно приемлива сол.

Description

Нстоящото изобретение се отнася до нови съединения, свързващи бензодиазепиновите рецептори. Изобретението се отнася и до метод за получаване на тези съединения, до фармацевтични и ветеринарни състави, които ги съдържат и до микроорганизма, от който се получават.

Бензодиазепинът (Bz) е обичайно понятие, което се използва за описване на структурносвързни съединения с основната бензо-1,4 диазепинова структура (Haelely et al, Advances in Drug Res. 14, 165- 322 (1985)). Фармакологичният скрининг на някои от по рано синтезираните аналози от тази нова пръстенна система е показал, че бензодиазепините притежават транквилизираща и антиконвулсна активност.Понататъшни изследвания са довели до пускането на хлордиазепоксида (Librium) за терапевтична употреба през I960 г.

След обширни електрофизиологични и изследвания за свързването е установено, че механизмът на действието на бензодиазепина включва алостерична модулация на главния инхибиторен невротрансмитер, гамааминомаслената киселина (ГАМК). По-специално, този ефект се дължи на хиперполяризацията на невроните от увеличения приток на < I йон през ΓΑΜΚ-Βζ-СГ йонофорния рецепторен комплекс. Този рецепторен комплекс е означен като подтип А , или ГАМКд.

Болшинството от предписваните понастоящем бензодиазепини са агонисти и действуват чрез потенциране на ГАМК инхибиращото действие. Вследствие на това, те упражняват седативно, хипнотично, антиконвулсно и анксиолитично действие. Отделни (с ниска ефективност) агонисти също представляват интерес, тъй като използуването им може да намали нежеланите действия при бенздиазепиновата терапия като седативният ефект, толерантност и лекарствената зависимост все още съпровождат техния клиничен ефект. Обратни агонисти, притежаващи биологична активност противоположна на класическите бензодиазепинови ефекти, т.е. конвулсивни средства, също имат определена роля за засилване на паметта. Антагонистите им са лишени от биологична активност, но са намерили приложение при противодействуване на излишък от горните действия, т.е. при свръх до тира не.

Взаимовръзката структура - действие (SAR) за бензодиазепините е напълно охарактеризирана и са идентифицирани фармакофорите.Вследствие на това, допълнителен акцент се поставя на ендогенната рецепторна лиганда, или на новите структури, като потенциално нови възможности за лекарства. За различни химични класове (напр. бензазепини, β-карболини, циклопиролони, фенилхинолини, триазолпиридазини и имидазопиридини) е установено, че са активни на това място. Цопиклонът ( едно циклопиролоново производно) и цолпидемът (имидазопириди ново производно) са пуснати в употреба като хипнотици.

Сега е намарено, че при ферментация на хранителна среда съдържаща щам от гъбата Acremonium strictum ( Xenova organism XO6/15/458, IMI 354451) се продуцират нови съединения, които инхибират свързването на бензодиазепините с бензодиазепиновия рецептор, намиращ се в ГАМК-Bz СГ йонофорния рецепторен комплекс. Тези съединения са сескитерпени, които заедно с техните синтетични производни образуват нов клас.

В съответствие с горното, настоящото изобретение се отнася до сескитерпени с формула I:

в която всяка една от връзките и -_г : : - означава проста връзка или едната е проста, а другата е двойна връзка,

А заедно c ---/--, и въглеродните атоми, <

които са свързани образуват пръстен като:

(а) където R е II или Oi l (Ь)

(с)

(d) и У означава двойна връзка или, когато А означава пръстен (а) както е дефиниран по горе, У означава или двойна връзка или образува заедно < въглеродните атоми, към които е свързан епоксидна връзка ⁴ р ^и техни фарма цевтичноприемливи или ветеринарноприемливи соли.

Съгласно едно изпълнение, сескитерпените с формула I имат следната структура II:

в която -У- означава двойна връзка или образува заедно с въглеродните атоми, към които са свързани епоксидна връзка ^()/ .

В друго изпълнение, сескитерпените с формула 1 имат следната структура III:

н н

в която R означава II или ОН.

В следващо изпълнение, сескигерпените с формула I означават съединение със следната формула IV:

(IV) в която X означава

Сескитерпенът с

Аз формула II, в която У означава двойна връзка по-нататък е означен къто съединение А.

Сескитерпенът с формула II, в която У образува с въглеродните атоми, към които е свързан, епоксидна връзка, е означен каго съединение А'. Сескитерпенът с формула III, в която R означава ОН е означен по-нататък като съединения В.

Сескитерпенът с формула III, в която R означава Н, е означен като съединение С. Натриевата сол (15-ONa) на съединение А е съединението

D.

Сескитерпенът с формула

IV, в която X о знача в а е съединението

Е.

Сескитерпенът с формула

IV, в която X означава е съединението

F.

Съединение F е 15,16 орто производно на съединение Е. Изразът настоящите съединения, когато е използван тук се отнася общо до всички сескигерпени с формула I и техните фармацевтичноприемливи и ветеринарноприемливи соли.

Сески герпенит е с формула I са изолирани от микроорганизъм означен като ХО6/15/458 и който е идентифициран като щам от гъбата Acremonium strictum въз основа на следните морфологични данни:

При растеж върху 2% агар с малцов екстракт в продължение на 10 дни, колониите на щама ХО6/15/458 са 15-20 mm в диаметър, в сравнение с 37-40 mm, с изобилно спорообразуване, по-скоро чисто бели, отколкото вариращи в нюанси на белезникаво, включващи по-скоро плътен, компактен, отколкото рехав мицел, спираловиден и флокулозен само в центъра, вместо влакнест в центъра, ръбът е неправилен, въздушен, не рязко от граничен и снишаващ се, конидиофорите са плектонсматозни до синематозни и са повече над повърхността, отколкото под повърхността, повече ортофиални, рядко по-сложни, прави, постепенно изострени, повече хиалинни, отколкото хрома гофилни, дълги до 40 54 μιη и широки 1,5 μιη, в сравнение с 20 40 х 1,5 2,0 μπτ. Конидиите са в слизести бели маси, цилиндрични, 3,0 7,0 х 1,5 μ ш.

Организми показва следните различия от типичните щамове на Acremonium slriclum: по бавен растеж, чисто бели компактни колонии, краищата въздушни, неправилни и дифузни, конидиофорите са въздушни и клонящи към синематозни, дължината на главната конидиофора е погол ям а.

От гореописаните микроскопски и общи морфологични характеристики , изолатът от гъбата ХОб/15/458 се класифицира по добре като Acremonium c.f. strictum W.Gams както е описано в Gams, W. (1977) Cephalospori um artige Sc himmelpilze, Gustav Fischer publ.

Щамът ХОб/15/458 е депозиран съгласно Будапещенския договор в International Mycologlcal Institute, Egham, Surrey, U.K. на 7.10.1992, c входящ номер IMI 354451.

Горното описание илюстрира щама Acremonium strictum, който може да се използва за продуциране на сескитерпените съгласно настоящото изобретение. Настоящото изобретение се отнася и до мутанти на гореописания микроорганизъм. Например получения чрез естествен подбор или получения посредством мутиращи агенти, включително йонизираща радиация като ултравиолетово облъчване или посредством химически мутагени като нитрозогуанидин или посредством подобни третирания, които също са включени в обхвата на настоящото изобретение.

Настоящото изобретение се отнася освен това и до метод за получаване на настоящите съединения, който се състои от (1) ферментация на щам от гъба ХО6/15/458 (1М1 354451) или негов мутант, в среда от въглерод, азот и неорганични соли, продуциращ сескитерпени с формула I, (2) изолиране на получените сескитерпени от ферментационната среда, (3) и при желание окисляване на сескитерпени!е с формула I, в която А означава пръстен (с) до сескитерпени с формула I, в коя го А означава пръс тен D, и/или (4) при желание превръщане на получените сескитерпени във фармацевтичноприемливи или ветери нарноириемливи 1 ехни сол и

Сескитерпените с формула I обикновено се продуцираг през време на аеробна ферментация на водна хранителна среда, при условията описани по-долу, с продуциращ щам от Acremonium stricluni XO6/I5/45H. Подходяща е водна среда като използваната за продуциране на редица антибиогични субстанции. Такава хранителна среда съдържа източници на въглерод и азот, които могат да се усвоят от микроорганизма. При желание могат да се прибавят неорганични соли, обикновено в ниски концентрации. Освен това фермен! ационната с реда може да съдържа микроелементи, необходими за растежа на микроорганизма и «редуцирането на желаното съединение. Обикновено те се намират в достатъчни концентрации в комплексни източници на въглерод и азот, които могат да се използват като хранителни източници, но могат да се прибавят и поотделно към с редата, ако това с е желае. Друг аспект на изобретението е биологичночистата култура на щама от гъбата Х<)б/15/458 или негов мутант, които продуцират <е<китерпени с формула I. Такива култури по същество не съдържат други м и к ρ ο ο р та н и з м и.

Усвояеми източници на въглерод, азот и минерали могат да се осигурят или от отделни, или от комплексни хранителни вещества. Източниците на въглерод обикновено включват глюкоза, малтоза, нишесте, глицерол, меласи, декстрин, лактоза, захароза, фруктоза, карбоксилни киселини, аминокиселини, глицериди, алкохоли, алкани и растителни масла. И τι очниците на въглерод обикновено съставляват от 0,5 до 10 тегловни % от ферментационната среда.

Източниците на азот обикновено включват соево брашно, царевичен екстракт, разтворими продукти от <пиртоварни, дрождеви екстракти, брашно от памучни семена, пептони, фъстъчено брашно, малцов екстракт, меласи, казеин, смеси на аминокиселини, амоняк (газ или разтвор), амониеви соли или нитрати. Могат да се използват също и карбамид и други а миди. Източниците на азот обикновено представляват <>г 0J до 10 тегловни % от ферментационната среда.

Хранителните минерални соли, които могат да се включват в културалната среда са обичайно използвани соли, способни да доставят натрий, калий, амоний, желязо, магнезий, цинк, никел, кобалт, манган, ванадий, хром, калций, мед, молибден, бор, фосфатни, сулфатни, хлорни и карбонатни йони.

За да се контролира излишното пенене, на интервали може да се прибави противопенител, ако това е необходимо.

Ферментацията при използване на Acremonium slrictum ХО6/15/458 може да се провежда при температури от 20'С до 30С, за предпочитане 24 30°С. За оптимални резултати най-удобно е ферментацията да се провежда при температура от порядъка на 24-26°С. Подходящото pH на хранителната среда за продуциране на съединенията може да варира от 5,0 до Н,5, < предпочитан обхват от 6,0 до 7,5.

Ферментация в малък мащаб удобно се провежда чрез поставяне на подходящи количества хранителна среда в стъклена колба по известните стерилни техники, инокулиране или със спори или с вегетативен клетъчен растеж от Acremonium strlctum, леко затваряне на колбата с памук и провеждане на ферментацията при постоянна стайна температура при около 25°С, на ротационна клатачна машина, при 95-300 rpm, в продължение на 2 до 10 дни.

При работа в по голям мащаб, за предпочитане е ферментацията да се провежда в подходящи резервоари, снабдени с бъркалка и средство за аериране на ферментационната среда. Хранителната среда се приготвя в резервоара и след стерилизация се инокулира с източник на вегетативен клетъчен растеж от Acremonium stictum. Ферментацията продължава от 1 до 8 дни, при разбъркване и/или аериране на хранителната «реда, при температура от порядъка на 24 30'С. Степента на аерация зависи от няколко фактора като размера на ферментатора и скоростта на разбъркване. Обикновено при по-големи мащаби на ферментация, ферментационната течност се разбърква при около 95 до 500 rpm и се аерира при около 0,1 до 1,0 vvm.

Соски терпените с формула I първо са намерени в мицела от края на ферментацията и могат да се съберат и пречистят. Разделянето и пречистването на съединенията от ферментационния бульон и извличането им може да се постигне като се използва екстракция с разтворител и след това общоприети хроматографски фракционирания с различни хроматографски техники и системи разтворители. Сескитерпените могат да се получат в по същество чиста форма.

Сескитерпените с формула I са разтворими в органични разтворители, включително етилацетат, метанол и ацетон. Това свойство може да се използва за извличането им от ферментационния мицел. Подходящо е ферментационният мицел да се смеси с приблизително равен обем от органичния разтворител, например ацетон. Полученият в резултат суров екстракт след това може да се концентрира под намалено налягане, като се получава водна суспензия, която отново се екстрахира с органичен разтворител като се получава суров органичен екстракт. Общият екстракт се филтрира (или центрофугира) и разтворителят се концентрира под намалено налягане. Органичният остатък след това се пречиства първоначално посредствном хроматография, например колонна хроматография на колона със Sephadex LH-20 с елуент метанол.

Желаният продукт и някои онечиствания се задържат в колоната, докато много от онечистванията (особено неполярните онечиствания) не се задържат. Колоната се промива с неполярен органичен разтворител като хексан или толуен, за да се отстранят други онечиствания и след това с последователни смеси от дихлорметан или хлороформ и друг органичен разтворител като метанол или етилацетат. Разтворителят се изпарява и остатъкът се хроматографира след това например чрез колонна хроматография, тънкослойна хроматография, хроматография на препарагивен слой или високоефективна течна хроматография. Съгласно предпочитано изпълнение на изобретението етапът на хроматографското пречистване се състои в повтаряща се HPLC на С18 с обърната фаза (25 х 10 cm, СНзСМ:Н₂О градиентно елуиране).

Подходящи адсорбенти са силикагел и свързан с октадецил силициев диоксид, а като елуент могат да се използват различни разтворители или комбинации от разтворители. Фракциите от елуата след гова се изследват чрез тънкослойна хроматография, високоефективна течна хроматография или други обичайни техники за откриване присъствието на желаното съединение или за изолиране. Използването на техниките описани по-горе води до получаване на пречистени състави, съдържащи желания сескитерпен, наличието на когото се определя чрез анализиране на различни хроматографски фракции за физикохимични характеристики и/или активност на свързване на бензодиазепинрецепторния комплекс.

Сескитерпенът с формула I, в която А означава пръстен (с) (съединение Е) може да се окисли до неговото 15,1 б-ортохиноново производно, което е сескитерпен с формула 1, в която А означава пръстен (d) (съединение Е). Съединение F има следната структура:

Окислението може да се осъществи като се остави разтвор на съединение Е да стои на въздуха. Окислението може да се извърши и по друг начин или окислението на въздуха както е описано но-горе се ускори чрез прибавяне на окисляващо средство към разтвора на съединение Е. Подходящ пример за окисляващо средство е натриевият перйодат (NalO^.

Сескитерпените с формула I могат да се превърнат във фармацевтичноприемлива или ветеринариоприемлива сол.

Примери за подходящи голи са тези с алкални метали като натриеви и калиеви и амониеви соли. Съединение I), натриева сол на съединение А, може да се получи например взаимодействие на съединение А с натриев хидроксид в метанол.

Настоящите съединения са активни при лечение на заболявания повлиявани от лигандите за бензодиазепиновия рецептор, съдържащ се в ΓΑΜΚ-Βζ-СГ йонофорния рецепторен комплекс. Съгласно настоящото изобретение пациентът се лекува по метод, който се състои в даване на пациента терапевтичноефективно количество от едно от настоящите съединения. По такъв начин настоящите съединения притежаващи активност на агонисти, могат да се използват за контрол на състояния, причинени от свързване на бензодиазепина с бензодиазепиновия рецептор, съдържащ се в ΓΑΜΚ-Βζ-СГ йонофорния рецепторен комплекс. Следователно, те могат да се използват например като антиконвулеивни средства, анксиолитици, мускулни релаксанти и хипнотици. По такъв начин състоянието на човека или животното може да бъде подобрено.

Настоящите съединения покозват активност при опити за свързване на бензодиазепиновия рецептор, при които се използва белязана с тритий лиганда специфична за рецептора, намиращ се в пречистения ΓΑΜΚ-Βζ-СГ йонофорния рецепторен комплекс. Подробносите от тези опити са дадени в пример 5, който следва.

Настоящите съединения могат да се приемат под различни дозирани форми, например орално под формата на таблети, капсули, филмтаблети или покрити със захар таблети, течни разтвори или суспензии или парентерално, например мускулно, венозно или подкожно. Следователно, настоящите съединения могат да се прилагат чрез инжекции или инфузия.

Дозата зависи от различни фактори, включително възрастта, теглото и състоянието на пациента и начина на приемане. Обикновено, все пак, дозата възприета при всеки

Hi начин на приложение за възрастни хора е 0,001 до 10 mg/kg, най-често от порядъка на 0,01 до 5 mg/kg телесно тегло. Такава доза може да бъде дадена например от 1 до 5 пъти дневно орално или чрез инфузия на болуси, инфузия в течение на няколко часа и/или повтарящо се приемане.

Настоящите съединения се приготвят във форми за приемане каго фармацевтични или ветеринарни състави, съдържащи също фармацевтичноприемлив или ветеринарноприемлив носител или разредител. Съставите обикновено се приготвят като се съблюдават общоприети методи и се приемат във фармацевтичноподходяща или ветеринарноподходяща форма.

Например, твърдите орални форми могат да съдържат заедно < активното съединение разредители като лактоза, декстроза, захароза, целулоза, царевично нишесте или картофено нишесте, смазващи вещества като силициев диоксид, талк, стеаринова киселина, магнезиев или калциев стеарат и/или полиетиленгликоли, свързващи средства каго нишестета, арабска гума, желатина, метилцелулоза, карбоксиметилцелулоза или поливинилпиролидон, разпадащи с редства каго нишесте, алгинова киселина, алгинати или на триевони тестен гликолат, ефервесцентни смеси, оцветители, подсладители, омокрящи средства като лецитин, полисорбати, лаурилсулфати. Такива препарати могат да се произвеждат по известен начин, например чрез смесване, гранулиране, таблетираие, покриване със захар или филмиране.

Течните дисперсии за орално приложение могат да бъдат сиропи, емулсии и суспензии. Сиропите могат да съдържат като носител например захароза или захароза с глицерин и/или манитол и/или сорбитол. В частност, сироп за диабетични поциенти, може да съдържа като носители само продукти например сорбитол, които не метаболи зират до глюкоза или метаболизират много малко количество до глюкоза. Суспензиите и емулсиите могат да съдържат като носител например природна гума, arap, натриев алгинат, пектин, метилцелулоза, карбоксимегилцелулоза или поливинилалкохол.

Суспензиите или разтворите за мускулни инжекции могат да съдържат заедно с активното съединение и фармацевтичноприемлив носител като стерилна вода, маслинено масло, етилолеат, гликоли като пропиленгликол и при желание подходящо количество лидокаинхидрохлорид. Разтворите за венозно инжектиране или инфузии могат да съдържат носител например стерилна вода, която най-общо е вода за инжекции. За предпочитане е все пак те да приемат формата на стерилен воден изотоничен солев разтвор. Алтернативно, настоящите съединения могат да се микрокапсулират в липозоми.

Следващите примери илюстрират изобретението:

ПРИМЕР 1

ХО6/15/458 култура в течна среда

Изходният материал за щама ХО6/15/458 се произвежда посредством суспендиране на зряла коса култура, растяща на МЕА (2% малцов екстракт, 1,5% агар), в 5 mL 10%ен воден глицерол. От тази суспензия 1 mL, в 1,5 mL cryovial, съдържащ изходния материал, се съхранява при -135°С. Предкултурата се приготвя чрез асептично преместване на 0,5 mL изходен материал в 10 ml. хранителен разтвор S (1,5% глицерол, 1,5% соев пептон, 1% D-глюкоза, 0,5% малцов екстракт, 0,3% NaCl, 0,1% СаСОу, 0,1% Tween 80, 0,1% Junlon PW110 (доставени от Honeywell and Stein Ltd., Times House, Throwley Way, Sutton, Surrey, SMI 4AF), при pH 6 в епруветка (25 mm x 200 mm) рзклащана при 240 ipm в продължение на 4 дни при 25‘ С.

Междинна култура се приготвя след това, чрез асептично преместване на предкултурата в 300 mL хранителен разтвор S в 21 Ерленмайерови колби и инкубиране на ротационна клатачна машина при 240 rpm в продължение на 3 дни при 25°С.

Производствена култура се получва посредством асептично премествне на междинна култура в 14 литров разбъркван ферментатор съдържащ 10 L хранителен разтвор Р (2,38% трехалоза, 0,69% дрождев екстракт, 0,1% карбокс имегилцелулоза, 0,1% t ween 80, 0,98% MES, при pH 6). Резервоарите се рзбъркват при 340 prm и аерират при 0,7 vvm. Стойността на pH не се контролира, но остава в границите 6,0 до 7,0. По време на ферментацията във ферментатора се поддържа постоянна темпертура от 25°С. След седем дни ферментцията се спира и биомаата се събира за екстракция на продукта.

Ферментация в по-голяма степен се извършва в 75 литрови ферментатори както следва. Приготвя се предкултура 40 mL както е описано по горе (четири х '200 mm епруветки) и се прехвърля в 2 литра хранителна среда S в 3 литров ферментатор. Резервоарът се разбърква при 500 rpm и аерира при 0,25 vvm. Стойността на pH не се контролира, а температурата с поддържа при 25С. След 4 дни тази междинна култура се прехвърля асептично в 75 литров ферментатор съдържащ 50 литра хранителна среда Р. Този 75 литров резервоар се аерира при 0,5 vvm и се разбърква при 350 rpm, за да се поддържа налягането на разтворения кислород >70% през време на ферментацията. Стойността на pH не се контролира, но остава между 6,0 и 7,0, а температурата се поддържа постоянна при 25°€. След 7 дни ферментацията се спира и биомасата се събира.

ПРИМЕР 2

Екстрахиране и пречистване на съединение А Ферментационен бульон 14 L се центрофугира и мицелът (-344 д) се екстрахира с ацетон (3x5 L). Екстрактът <е концентрира до сухо (В,0 q) и се разтваря в чист метанол. Пречистването се осъществява с помощта на препаративна HPLC е обърната фала кг? то <е използва Walers Della Рак С 18 (100А, 15 pm) колона (1D 10,0 mm, дължина 25,0 cm) и градиентна подвижна фаза от 4 минути (80% воден ацетон и трил, 12 mL/min скорост на изтичане) бързо нарастваща линейно до 20 минути (100% ацетонитрил, 12 mL/min скорост на изтичане). Измерването става при дължина /0 на вълната 280 ппт

Събират <е фракции те при 17-18 минути и се подлагат на по-нататъшно пречистване като се използва същата колона, но с градиент на подвижна фаза от 15 минута (40% воден ацетонитрил, 12 inL/niin скорост иа изтичане) бързо нарастваща линейно до 20 минути (100% ацегони трил, 12 mL/min скорост на изтичане).

Събират се фракциите между 9 и 10 минути, които са сескитерпен с формула II, в която У означава двойна връзка. Съединението има следните физични характеристики:

Молекулна формула: С 22^Η30θ4

Μ о л е к у л н о т е г л о: 3 5 8

Разтворимост в метанол, ацетон, етилацетат

У В: R_max( nm)(f.)
2 7 6,6 (4900)	МеОН
20 7,6 (30000)	МеОН КОН
3 11,2 (4100)

Масспектър: (m/z (интензитет (%)):

DEI 358 (М⁺, 100), 233 (55), 203 ( 1 5), 155 (20)

DCI 359 (МН⁺, 100) 233 ( 1 0), 203 (20), 155 (20)

Виеокоразрешителен Е1: 359,2 270, ¢-22^3()()4, изчислено 359,2214

ИЧ (КВг): (υ в с m ¹ }: 3395,2, 2930,2, 1 730,4 ^НЯМР: (400 MHz, CD3OD, δ (m, J, позиция)):

1,13 (ЗН, S, ЗН 21), 1,14 (ЗН, s, ЗН 20), 1,37 (1 Н, m,

Н 10а), 1,51 (ЗН, s, ЗН 19, 1,58 (1Н, bddd, 13,2, 10,1, 6,8,(Н 10а),

1,72 (ЗН, s, ЗН 22), 1,85 (1Н, bdd, 13,0, 4,5, Н 6а), 2,08 1Н, bdd,

12,5, 7,1, Н 9а), 2,22 (1Н, bdd, 9,8, 5,2, Н 11), 2,23 (1 Н, bdd, 11,6

Н 9Ь), 2,33 (1Н, bdd, 12,7, 12,7, Н 6Ь), 2,38 (111, dd, 14,5, 9,9, Н

2а), 2,70 (111, bddd, 14,5, 2,2, 1,6, H 2b), 3,02 (1H, ddd, 7,8, 5,6, 1,5, H-17), 3,67 ( 1H, dd, 5,8, 5,8, H 13), 3,80 (1H, dd, 9,3, 7,9, H18a), 3,83 (111, bdd, 6,0, 6,0, H 12), 4,03 (111, bdd, 9,3, 1,5, H 18b), 5,1 7 (111, m, H 7), 5,24 (111, dd, 15,9, 1,5, H 4), 5,32 (1H, ddd, 15,9, 10,0, 2,2, 11-3).

¹³СЯМР : (100 MHz, CD₃OD, δ (m, позиция)]:

17,66 (q, C 22), 23,7 1 (q, €19), 24,92 (q, € 20), 30,85 (q, C-21), 32,24 (t, C IO), 37,37 (I, € 9), 39,37 (s, C 5), 42,22 (d, (13), 43,11 (t, C 6), 45,01 (d, € 11), 45,17 (t, C 2, 48,97 (d, C1 7), 70,86 (t, C 18), 83,70 (d, €12), 88,94 (s, C l), 121,90 (d, C 3), 1 24,68 (d, C 7), 135,25 (s, C 1 5), 137,39 (s, C-8), 144,73 (d, C 4), 166,96 (s, C 14), 200,99 (s, €16).

ПРИМЕР 3

Екстрахиране и пречистване на съединение В Ферментационна течност 75 L се центрофугира и мицелъг се екстрахира с етилацетат (5 х 10 L). Този екстракт ^ге концентрира до сухо и се разтваря в метанол. Пречистването се осъществява чрез препаративна HPLC с обърната фаза като се използва Waters Delta Рак С1Н (ЮОА, 15 μΐη) колона (ID 10,0 in ni, дължина 25,0 cm) и подвижна фаза от 5 минути при 80% воден ацетонитрил (10 mL/min скорост на изтичане). Измерването става при дължина на вълната '280 пш. Съединението, което се елуира между 23 и 25 минути е съединение В, сескитерпен с формула III, в която R е ОН. Съединението има следните физични характеристики:

Молекулна формула: Ο^Η^θΟθ

Μ о л е к у л н о т е г л о: 4 1 1

Разтворимост в метанол, етилацетат, хлороформ, а цетои

2

УВ: [X_max(nm)(E)J:
2 00		HPLC разтворител (H2O-CH3CN)
2 68
277,0	(29500)	МеОН
3 53,5	(3900)
289,8	(32100)	МеОН КОН
344,4	(3800)
2 71,6	(47000)	МеОН CF3CO2H
324,8	(3400)

Масс пектър: Jm/z (интензитет (%)]:

DEI 414 (M ⁺ , 100), 331 (45), 277 (20), 2 11 (50)

DC1 (NII3) 415 |MH ⁺ , 100)

Ви(окоразрешителен El: 4 14,2050, изчислено 4 14,2034 и 2 11,0240, СдНуОц, изчислено 21 1,0240

ИЧ (КВг): ]о в cm 1}:

3265, 2960, 2930, 2855, 1 735, 1625

1НЯМР: [400 MHz, CDCI3, δ (m, J, позиция)]:

1,4 (I), 1,7 (dd), 1,75 (dd), 2,05 (dd), 2,16 (d + dd), 2,3 (t), 2,4 (dd), 2,7 (dt), 4,9 (d + td), 5,05 (d + d), 5,2 (dd), 5,25 (dd).

¹³СЯМР: [100 MHz, CDC1_;1, δ (m, позиция)]:

160,4, 150, 146,1, 1 44,2, 144, 1 42,1, 136, 1 26,9, 1 23,7,

23, 118,7, 86,9, 84,3. 72,3, 43,5, 4 1,4, 40,7, 38,2, 37,7, 29,4, 28,2, 24,2, 2 2,7, 7,17.

ПРИМЕР 4

Екстрахираме и пречистване на съединение С

Ферментационна течност 75 L се центрофугира и мицелъг се екстрахира с етилацетат (5 х 10 L). Този екстракт се концентрира до с ухо и се разтваря в метанол.

Пречистването се осъществява с помощта на препаративна

HPLC < обърната фаза като се използва Waters Delta Рак РгерРак 300(1 патрона (С 18, ЮОА, 15μητ, ID 47 mm, дължина 30,0 cm) и градиентна подвижна фаза от 0,5 минути при 80% воден ацетонитрил (50 mL/min скорост на изтичане) бързо нарастваща линейно до 30 минути при 100% ацетонитрил (50 mL/min скорост па изтичане). Съединението, което се елуира между 18 и 19 минути е съединение С, ссскитернен с формула II, в която R е водород. Готи пик след това се пречиства като се използва същата колона, но с градиентна подвижна фаза от 5 минути при 30% воден ацетонитрил (50 ml/min скорост на изтичане) бързо нарастваща линейно до 10 минути при 15% воден ацетонитрил (50 mL/min скорост на изтичане). Гози разтворител след това се държи в продължение на 15 минути при 15% воден ацетонитрил (50 ml/min скорост на изтичане) и след това нараства бързо линейно за период от 5 минути до 100% ацетонитрил (50 mL/min скорост на изтичане). Търсеният пик, съединение С, се елуира между 22^и 24 минути при този градиент. Съединението има следните физични ха рактерис гики:

Молекулна формула: С24Н30О5

Молекулно тегло: 398

Разтворимост в метанол, ацетон, етилацетат

У В ^: (*max<^nn|HeH^:

2 70,6	(41700)	МеОН
338,4	(3800)
209,3	(13300)	МеОН-КОН
282,3	(41400)
326,4	(3200)
34 2,8	(3900)

390,0 (3000) t ,2 (52 200) MeOH-CF₃CO₂H

316,6 (4300)

Масспектьр: (m/z (интензитет (%)]:

DEI 398 (M ⁺ , 100), 315 (90), 256 (100),233 (95), 195 (40) DC I (NHj) 399 (MH⁺, 100), 222 ( 10), 205 (90), 195 (20), 172 (70)

Високоразрешителен El 390,2093, C24H30O5, и 3 ч и c лен ο 3 9 0,20 8 5

ИЧ (КВг): [υ в cm Ц:

3400 (sh), 3200, 2928, 1750, 1600, 1380.

^НЯМР: [400 MHz, €βΗθ], сравнени с 7,16 ppm, δ (m,

J, позиция)]:

0,75* (ЗН, s, ЗН 23), 0,93* (ЗН, s, ЗН-22), 1,01 (ЗН, s, ЗН-21), 1,11 (1Н, 1, 11,7, Н-10а), 1,40 (1Н, bdd, 14,9, 7,6, Н 10b),

I, 45 (ЗН, bs, ЗН 24),1,63 ( 1 Н, dd, 13,0, 5,0, Н-6а), 2,05 (1Н, bt,

II, 5, Н-6Ь), 2,10 (1Н. m, Н 2а), 2,11 (1Н, т, Н 9а), 2,17 (III, dd, 11,0, 3,8, Н 11), 2,60 (1Н, I, 12,1, Н 9Ь), 2,74 (1Н, bd, 14,5, Н 2Ь), 4,37 (11-1, dd, 12,9, 1,6, Н 20а), 4,44 (1Н, dd, 13,0, 3,2, Н 20Ь), 4,59 (1Н, bdt, 11,2, 3,0, Н 12), 5,01 (1Н, dd, 15,8, 1,5, Н 4), 5,11 (III, dd, 15,8, 2,8, Н 3), 5,15 (111, bdd, 10,0, 3,2, Н 7), 6,57 (1Н, s, Н-18).

^,JC-HMP: [100 MHz, CjjD^, сравнени с 128,00 ррт, δ (т, позиция)]:

17,20 (q, С 2 4), 22,82 (q, С-21), 24,21' (q, С-23), 28,61 (1, С 10), 29,55* (q, С-22), 38,28 (I, С 9), 38,33 (s, С 5), 41,44 (d,

С 11), 41,93 (1, С 6), 43,98 (I, С-2), 75,35 (I, С-20), 85,28 (d, С

2), 86,75 (s, С- 1), 108,49 (d, С- 18), 1 20,05 (d, С-3), 1 24,20 (d, С

7), 1 27,94 (s, С-13), 136,22 (s, С-«), 137,45 (s, С 19), 143,74 (d, С

4), 147,96 (s, (14), 149,71 (s, C 15), 160,00 (s, ( 17, 165,58 (s, C 16).

ПРИМЕР 5

Екс трхиране и пречиствне на съединение А' Биомасата от ХО6/15/458 се събира чрез филтриране, екстрахира се последователно с ацетон (25 L) и екстрактът се отделя от биомасата чрез филтриране. Ацетонът се отстранява посредством ротационен изпрител, а получената водна суспензия се суши чрез замразяване като се получава смолист продукт. Смолистият продукт се разтваря в метанол (250 mL), филтрира се и след това се изпарява (150 mL). Хроматографира се проба на HPLC с обърната фаза като се изполлзва 47 х 100 mm (j 3 (октадецилсилициев диоксид) Della Рак патрони <;. 15 микрона пълнеж. Използва се скорост на изтичане ог 100 mL/min с градиент от 80% вода 20% ацетонитрил до 20% вода 80% ацетонитрил за период от 30 минути. Съединение А се отчита при 278 пш. Активната фракция се хроматографира повторно като се използва същата колона и скорост на изтичане с градиент от 60% вода 40% ацетонитрил до 35% вода 65% ацетонитрил за период от 40 минути. Активната фракция се концентрира на ротационен изпарител като се отстранява а цетонитрил ъ г и след това се суши чрез замразяване като се получава твърд продукт (съединение А, количество 1).

Следващото пречистване се провежда чрез хроматография при нормална фаза като се използва флаш колона (30 cm х 1,4 cm), напълнена до дълбочина 16 cm със силикагел (MERCK, 230 400 меша,частици 0,040 - 0,063 mm) и изократно елуирана < 10% хексан 60% етилацетат 1% оцетна киселина. Летливият разтворител се отстранява под намалено налягане като се получава безцветно масло,а останалият разтворител се отстранява посредством сушене чрез замразяване като се получава бяло кристално твърдо вещество (съединение А, количество 3).

Продуктът се съхранява във фризер в продължение на шест седмици. След това съхраняване се провежда HPI.C ( обърната фаза на твърдия продукт на Prep 3000 като се използва 25 х 100 mm патрони напълнени с C^g Nova Рак HR (6 микрона). Използва се скорост на изтичане от 2 0 mL/min < градиент от 70% вода 30% ацетонитрил до 100% ацетонитрил за период от 20 минути. Освен съединение А, се изолира втори

LN по полярен компонент, идентифициран като 7,8-епоксид на съединение А, съединение А’. Алтернативен метод за отделяне на съединение А от неговия 7,8-епоксид е използването на Della-Prep с градиент от 60% вода 40% ацетонитрил до 40% вода 60% ацетонитрил за период ог 20 минути.

Идентифицирането на съединение А' е направено при сравнение на данните от У В, мас спектъра и ЯМР със съответните данни получени за съединение А (виж пример 2).

Съединение А' има следните физични х а р актери сти к и:

Молекулна формула: C22l^J30^5

Молекулно тегло: 37 4

Разтворимост: МеОН (добра)

УВ: R_max (nm)]

278 (метанол)

Масспектър: Техника m/z интензитет (%)

CI МН ⁺

5

100

7

М Ml ,+ 4	39 2	2
м⁺	37 4
	2 19	2 0
	153	40
	43	100

ИЧ (КВг): υ в cm 3383 широк, 2 959 широк, 1624,

1387.

		¹ Н ЯМР	: δ/ppm в	CD3OD:	1,13	(ЗН, s), 1,29 (ЗН,	s),
1,39	(3 Н,	s), 1,45	(111, т), 1	,49 (ЗН,	dd),	1,53 (2Н, т), 1,82	(11-1,
dd),	2,00	(1Н, т),	2,10 (211,	т), 2,55	( 1 Η,	т), 2,75 (1Н, т),	2,80
(1 Н,	ш),	3,00 (1 н,	т), 3,7 0	(1Н, dd),	3,75	(11-1, dd), 3,80 (1Н	1, dd)
5,5 5	(211,	d).

¹³С-ЯМР: δ/ppm в CD₃OD: 200,7 (C_ltt), 165,9 (С₁₄),

143,4 (С₄), 135,0 (С₁₅), 122,6 (С₃), 87,6 (С₄), 82,6 (С₁₂), 70,7 (С_1в), 63,7 (С₈), 62,3 (С₇), 47,6 (С_н), 44,9 (С₂), 42,1 (С₁₃), 41,4 (С₆), 36,6 (С₅), 36,5 (Сд), 31,2 (С ₂), 27,4 (С_|0), 24,7 (С₂₀), 23,1 К_{д), 17,6 (С₂₂), 48,6 (Сj 7) - зас енчен от разтворителя.

ПРИМЕР 6

Екстрахиране и пречистване на съединение Е

Ферментационен бульон 75 L от ХОб/15/458 се центрофугира и мицелът се екстрахира с етилацетат (5 х 10 L). Този екстракт се концентрира до сухо и се разтваря в чист метанол. Пречистването се осъществява посредством п репа ра ти вна HPLC с обърната фаза като се използва Waters Deila Рак РгерРак 1000 патрона (С18, ЮОЛ, 15pm, ID 47 mm, дължина 30,0 cm) и изократна подвижна фаза от 40% воден ацетонитрил (50 mL/min скорост на изтичане) в продължение на 50 минути, и след това струя ацетонитрил в продължение на 10 минути. Съединението, което се елуира между 44 и 48 минути е обектът на вниманието, съединение Е. Измерването става при дължина на вълната 200 nm. Готи пик след това се пречиства чрез семипрепаративна HPLC с обърната фаза като се използва Waters Delta Рак колона (С18, ЮОЛ, 15 pm, ID 10,0 mm, дължина 25,0 cm) и изократна подвижна фаза от 55% ацетонитрил (15 mL/min скорост на изтичане) в продължение на 28 минути, последвана от струя ацетонитрил в продължение на 10 минути. Съединението, което се елуира между 23 и 28 минути е желаното съединение Е. Измерването става при дължина на вълната 200 nm.

Съединение Е има следните физични характеристики:

Молекулна формула: С23Н30О4

Молекулно тегло: 370

Разтворимост: метанол, етилацетат

R_max(nm)[	(ε)	разтворител):
213,4	2 4 400	МеОН
230,Osh	7500
2 7 7, з	9 2 00
215,6	6900	МеОН КОН
228,2_SH	5 400
286,1	5 2 00

Масспектър: [m/z (интензитет %)[:

EI 370 (М ⁺ , 2%), 167 (80), 166 (100)

DCI |NH₃|: 371 (ΜΙΓ, 30%), 205 (100), 167 ( 100) 149 (40), 135 (25), 1 23 (40), 12 1 (30), 109 (40)

ИЧ (КВг): [и в с m ¹J:

3333,4, 2932,2, 2862,7, 1 720,7, 1622,3, 1496,9, 1381,2,

1329,1, 1 286,7, 1 167,1 hl-ЯМР: [400 MHz C_fiD_f)/CD₃OD (сравнени < CD₃OD при 3,40 ppm), δ (m, J, позиция)]:

0,86* (ЗН,	s, ЗН 22),	1,0 7* (3H	, s, 3H-21),	1.26 (3H, s,
311 20), 1,36 (1Н, dd	, 13,6, п,:	L H-	10a),	1,62 (3H, bs, 3H-23),	1,68
(1Н, т, Н 10Ь),	, 1,75	(1 Н, т, Н	-6a)	, 2,09	(1H, dd, 9,	8, 8,6, H	11),
2,2 1 (1Н, 1, 12,	3, н-	f»b), 2,2 7 (ΓΗ, ι	dd, 1 2,	7, 7,1, H-9a	), 2,34 Mil.
dd, 14,5, 10,3, ]	Н 2а)	, 2,70 (1Η,	bt,	1 1,7,	H 9b), 2,84	(1 Η, d t,	14,5,
2,1, II 2Ь), 4,81	(1Н,	dd, 1 1,4,	1,2,	H 19a), 4,88 (1H,	bddd, 10	,2,
2,3, 1,5, П 12),	5,0 2	(1H, ddd,	1 1,3	, 2,5,	0,9, H 19b),	5,19 (1H	, dd,
15,9, 1,7, Н-4),	5,24	(111, bddd,	11,	9, 4,5	, 1,2, H 7),	5,3 3 (1H,	ddd,
15,9, 10,3, 2,4,	П 3),	6,64 (1H,	bs,	H 17).

^{1 3}C ЯМР : ] 100 Mil/, C₆D₆/CD₃<>D ( сравнени c

C'D-iOl) при 49,00 ppm), δ (m, позиция)]:

17,8 (q, C 23), 22,20 (q, C 20), 2 4,1 1* (q, C-22), 29,56 (t,

C- 10), 30,32* (q, C 21), 38,33 (s, C 5), 38,55 (t, C-9), 42,12 (I, C 6), 43,72 (d, C 11), 43,89 (1, C 2), 73,50 (t, C 19), 83,12 (d, C 12), 80,05 (s, C l), 101,43 (d, C 17), 119,23 (s, C 13), 121,10 (d, C 3), 1 23,414 (d, 07), 131,08** (s, CIS), 131,08“ (s, C 18), 136,89 (s, C 8), 140,31 (s, C 14), 1 43,02 (d, ¢ -4), 1 47,54 (s, C 16).

*,“: означенияга могат да бъдат разместени.

ПРИМЕР 7

Получаване и идентифициране на съединение F

Разтвор на съединение Е, описано в пример 6, в метанол се подлага на въздушно окисление ускорявано от η ри ба вяне на и зл и шък N а 10q.

Пречиtιвнего на съединението се осъществява с помощта на препаративна HPLC с обърна ι а фаза като <е използва Waters Delta Рак колона (С18, ЮоЛ, 15 pm, ID 10,0 mm, дължина 25,0 cm) с разтворител със стъпаловидна градиентна концентрация от 25% воден ацетонитрил (12 mL/min) в продължение на 5 минути, бързо нарастваща до 80% воден ацетонитрил (12 mL/min) при време 35 минути.

Съединението елуирано между 30 и 32 минути е желаното съединение F. Измерването става при дължина на вълната 200 ηιη.

Съединението F има следните физични характеристики:

Молекулна формула: С23Н7ПО4

Молекулно тегло: 368

Разтворимост: метанол ^УВ: l^Amax<^nm) (е)

4

Разтворител):

СН₃С\:Н₂О

HPLC разтворител

300

482 ¹Н ЯМР: [400 MHz, CD3OD (в сравнение с CD3OD при

3,4 0 ρ р m ), δ (m , J) [:

6,03 (1Н, bs), 5,24 (1H, dd, J- 1,8, 15,9), 5,07 (1H, bdd,

J= 3,4, 10,9), 5,00 (1H, ddd, J= 2,5, 10,6, 15,9), 4,79 (1H, dd, .1

1,2, 15,6), 4,65 (1H, dd, J= 2,2, 15,5), 4,55 (1H, d, 9,7), 2,63 (1H, dt, J- 2,1, 14,8), 2,44 (1H, dd, .1= 10,5, 14,7), 2,27 (2H, m), 2,11 (1H, dd, J= 7,2, 12,9), 1,88 (1H, d, J= 9,0), 1,77 (1H, m), 1,65 (3H, s), 1,50 (1H, bl, J == 11,0), 1,27 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,04 (3H, s).

^С-ЯМР: [100 MHz, CD3OD (в сравнение c CD3OD при

9,00 ppm), δ (m) ]:

180,16 (s), 175,03 (s), 159,46 (s), 144,57 (d), 137,71 (s),

124,25 (d), 120,6 (d), 114,37 (d), 88,75 (s), 81,63 (d), 71,91 (1), 43,40 (I), 42,68 (t), 42,58 (I), 39,19 (s), 38,96 (t), 30,52 (q), 30,22 (t), 24,50 (q), 21,90 (q), 17,21 (q).

ПРИМЕР 8

Изпитване на съединенията съгласно изобретението чрез анализ на свързването на бензодиазепинов рецептор

Рецепторният екстракт представлява суров синаптосомен препарат изолиран от мозъчната кора на вол по метода на LANG и сътр. ( Febs Lett.,104, 14 9-153,1 979). Свързването на рецептора се определя като се използува модификация описана от O'Beirne и Williams (Eur.J.

Biio< hem., 1 75,4 1 3-42 1,1 988) на метода на Braestrup и Squires (PNAS 7 4,3805-3809, 1977). Рецепторният препарат се инкубира в 50 птМ Tris/Cl, pH 7,4, със съединението Л и pHJ флунитразеиам (агонист) при крайна концентрация от сх пМ. Свързаната радиолиганда се събира върху филтри от стъклени влакна и се измерва посредством течностен (цинтиломегър. Неспецифичното свързване се определя чрез заместване на лигандата с диазепам.

Данните за свързването се налагат към един или два участъкови модели чрез утежнен нелиеен регресионен анализ като се използува компютърна програма Liga nd( М unson and Rod ba rd: Analytic Biochem 107, 220 239,1980) и EBDA (Me Pherson Computer Prog, in Biomed. 1 7 107 1 1 4, 1983).

Методът описан по горе се повтаря като се използува всяко от съединенията В и С описано в примерите 3 и 4 респективно и също като се използува съединението D , което е натриевата сол на съединението А.

JC50 стойностите се определят също и за съединенията А', Е и F описани в примерите 5 до 7 респективно.

Получените резултати са какго следва:

- з2 ТАБЛИЦА 1 Инхибиране свързването на бензодиазепина до бензодиазепиновия рецептор посредством настоящите съединения

Съединение	Концентрация	%Инхибиране	I
А	93дМ	107	40пМ
	28	106
	9	99
	3	93
	930ПМ	92
	280	80
	93	65
	28	44
	9	35
	3	11
В	177дМ	78	5дМ
	53	92
	18	82
	5	69
	2	53
	530ПЙ	42
	177	36
	53	21
	18	21
,с	2 42М15	ъ 88	20μΜ
	80	77
	24	54
	8	35
	2	12
	800пН	9
	240	-3
	80	9
D	ΙΟΟμΗ	92	ЮпМ
	50	103
	10	100
	5	98
	1	86
	500пИ	81
	100	65
	50	70
	10	45
	5	45

- зЗ -

к·	2.8Х10*⁵ М	104	85ПМ
	9.3x10*®	103
	2.8x10*®	85
	9.3Х10*⁷	83
	2.8Х10*⁷	79
	9.3X10*®	51
	2.8X10*®	32
	9.3x10*’	19
	2.8X10*’	8	—
Е	9.5Х10*⁵ М	104	500ПМ
	4.8X10*5	101
	9.5x10*®	93
	4.8Х10*⁶	88
	9.5Х10*⁷	65
	4.8Х10*⁷	52
	9.5x10’®	42
	4.8x10*®	37
	9.5X10*’	27
	4.8x10*’	22

F	2.7х10^ч М	94	З.ОдМ
	9.0x10*5	89
	2.7Х10*⁵	77
	9.0X10*®	65
	2.7x10*®	48
	9.0Х10*⁷	41
	2.7Х10’⁷	33
	9.0x10’®	27
	2.7x10’®	24
	9.0x10*’	15

ПРИМЕР 9

Фармацевтичен състав

Таблети, всяка с тегло 0,15 g и концентраация 25 mg на едно от настоящите съединения, могат да се получаат както следна:

Състав за 10 000 таблети

Едно от настоящите съединения (250 д)

Лактоза (800 д)

Царевично нишесте (415 д)

Талк на прах (30 д)

Магнезиев сгеараат (5 д)

Съединението съгласно изобретението, лактозаата и половината от царевичното нишесте се смесват. Сместа след товаа се прекарва през сито с 0,5 mm големина на отворите. Царевично нишесте (10 д) се суспендира в гореща вода (90 mL). Получената паст се гранулир до прах. Гранулагът се суши и стрина през сито с 1,4 mm големина на отворите. Прибавя се останалото количество нишесте, талк и магнезиев стеарат, стрива се грижливо и се пресова на таблети.

Claims

ПА I EH I НИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Сескитерпени с формула I проста връзка или едната е проста, а другата е двойна в р ъ з к а,

А заедно < и въглеродните атоми, с които са свързани образуват пръстен като:

R (а) където R е Н или Oi l (Ь) и У означава двойна връзка или, когато А е пръстен (а) както е дефиниран по горе, У означава или двойна връзка или образува заедно с въглеродните атоми, към коиго е свързан епоксидна връзка ^ν· θ/ и техни фармацевтично приемливи или ветеринарноприемливи соли.
2. Сескигерпен съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има формула II:

в която У означава двойна връзка или образува заедно с въглеродните атоми към които са свързани епоксидна връзка ⁴ Ο , или техни фармацевтичноприемливи и ветеринарно приемливи соли.
3. Сескитерпен съгласно претенция 1,характеризиращ се с това, че има формула III:

в която R означава Н или ОН или техни фар м а цевти чн«при е м ли в и и в ете р и нар нои р и е мл и в и сол и.
4. Сескитерпен с формула IV:

в която означава

\/^υΗ \ о или / \)Н

или техни фармацевтичноприемливи или ветеринарноприемливи соли.
5. Метод за получаване на съединения както са дефинирани в преденция 1, характеризиращ се с това, че (1) се подлага на ферментация щам от гъба Acremonium strictum означен ХО6/15/458 (IM1 354451) или негов мутант, в среда от въглерод, азот и неорганични соли, продуциращ сескитерпени с формула I, (2) изолиране на получените сескитерпени от ферментационната среда, (3) и при желание окисляване на с ескитерпените < формула 1, rt която А означава пръстен (с) до сескитерпени с формула I, в която А означава пръстен (d), и/или (4) при желание превръщане на получените сескитерпени във фармацевтичноприемливи или ветеринарноприемливи техни соли.
6. Съединение съгласно някоя от претенции 1 до 4 за използване при метод за лечение на хора или животни.
7. Съединение съгласно претенция 6 за използване при лечение на състояния повлиявани от лигандите за бензодиазепиновия рецептор, съдържащ се в гамаамино маслена киселина бензодиазепин-CI йонофорния рецепторен комплекс.
8. Съединение съгласно претенция 7, за използване като антиконвулсно, анксиолитично, мускулнорелаксирагцо или хипнотично средство или за използване за засилване на паметта или за терапия при свръхдозиране.
9. Фармацевтичен или ветеринарен състав, характеризиращ се с това, че съдържа фармацевтичноприемлив или ветеринарноприемлив носител или разредител и като активен компонент съединение, както е дефинирано в която и да е от претенции 1 до 4.
10. Биологично чиста култура от щам от гъба Acremonium strictum означен ХО6/15/458 (1Μ1 354451) или негов мутант, продуциращ сескитерпени с формула 1 както са дефинирани в претенция 1.
11. Метод за ферментация на щам от гъба

Acremonium strictum означен ХО6/15/458 (IMI 354451) или негов мутант, продуциращ сескитерпени с формула I както са дефинирани в претенция 1, характеризиращ се с това, че на ферментация се подлага щам ХО6/15/458 или негов мутант в среда от въглерод, азот и неорганични соли.