FI110871B - Menetelmä polysyklisten antiparasiittisten aineiden valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä mikro-organismi - Google Patents

Description

110871

Menetelmä polysyklisten antiparasiittisten aineiden valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä mikro-organismi Tämä keksintö koskee menetelmää polysyklisten 5 antiparasiittisten aineiden valmistamiseki ja menetelmässä käytettävää mikro-organismia.

Tunnetaan uusia antiparasiittisia aineita, kuten US-patenttijulkaisuissa 4 310 519 ja 4 199 569 esitetyt avermektiinit. Mainitunlaiset avermektiiniyhdisteet, vaik-10 ka ovatkin tehokkaita sisä- ja ulkoloisten vastaisia aineita, eroavat kuitenkin rakenteellisesti hyvin merkittävästi tässä käsiteltävistä yhdisteistä. Avermektiinit, jotka ovat eräästä aktinomyseetasta eristettyjä makrosyk-lisiä aineita, eivät ole sukua tässä käsiteltäville poly-15 syklisille sienimetaboliiteille. Julkaisussa de Jesus et ai., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1984) 697 - 701 kuva taan sienimetaboliitteja, jotka on identifioitu janti-treemeiksi (janthitrems), joilla on polysyklinen rakenne, josta kuitenkin puuttuu muutamia tässä käsiteltävien yh-20 disteiden rakenne-elementtejä.

.’ · Tämä keksintö koskee uusien antiparasiittisten ai- • V neiden ja ektoparasitisidisten aineiden valmistusta. Niin- : pä tämän keksinnön yhtenä tavoitteena on esittää mainitun- ·:··· laisia uusia yhdisteitä. Yhtenä lisätavoitteena on tarjota : 25 käyttöön uudenlainen menetelmä mainitunlaisten yhdisteiden valmistamiseksi. Yhtenä lisätavoitteena on kuvata mainitunlaisten yhdisteiden valmistukseen käytettävää mikro-organismia ja mainitunlaiseen tuotantoon sovellettavissa olevia fermentointiolosuhteita. Yhtenä lisätavoitteena on 30 vielä kuvata koostumuksia ja menetelmiä, joissa käytetään ♦ ♦ # '.·. tässä käsiteltäviä yhdisteitä antiparasiittisina aineina.

Muut tavoitteet käyvät ilmi luettaessa seuraava kuvaus.

... : Oheiset kuviot 1, 2 ja 3 ovat yhdisteiden 1, 2 ja >t>>; vastaavasti 3 protoni-NMR-spektrejä. Kuvioissa on muutamia . . 35 resonanssipiikeistä merkitty kirjaimella "X". Nämä piikit 110871 2 ovat seurausta liuotteen läsnäolosta eivätkä merkitseviä yhdisteiden rakenteen kannalta.

Kuvio 1 on yhdisteen 1 NMR-spektri, joka on rekisteröity taajuudella 500 MHz CD2Cl2:ssa Varian Unity 500 5 -NMR-spektrometrillä lämpötilassa 25 °C. Kemialliset siirtymät esitetään ppm:inä suhteessa TMS:iin, jonka ppm-arvo on nolla, käyttämällä kohdassa δ 5,32 esiintyvää liuote-piikkiä sisäisenä standardina. Vain diagnostiset piikit mainitaan.

10 Kuvio 2 on yhdisteen 2 NMR-spektri, joka on rekis teröity taajuudella 400 MHz CD2Cl2:ssa Varian Unity 400 -NMR-spektrometrillä lämpötilassa 25 °C. Kemialliset siirtymät esitetään ppm:inä suhteessa TMS:iin, jonka ppm-arvo on nolla, käyttämällä kohdassa δ 5,32 esiintyvää liuote- 15 piikkiä sisäisenä standardina. Vain diagnostiset piikit mainitaan.

Kuvio 3 on yhdisteen 3 NMR-spektri, joka on rekisteröity taajuudella 300 MHz CD2Cl2:ssa Varian XL300 -NMR-spektrometrillä huoneenlämpötilassa. Kemialliset siirtymät 20 esitetään ppm:inä suhteessa TMS:iin, jonka ppm-arvo on nolla, käyttämällä kohdassa δ 7,24 esiintyvää liuotepiik-: '.· kiä sisäisenä standardina. Vain diagnostiset piikit maini- taan.

;··· Tämä keksintö koskee uutta menetelmää yhdisteiden : 25 valmistamiseksi, joiden kaavat ovat

30 A o ^OH

Yhdiste 1 35 110871 3

5 °V Y OH

Yhdiste 2 10

JiVvYYnTY^i «e r £ °AVi

Me Me OH Λ-k^Me -0 Me

15 O Y OH

Yhdiste 3

Menetelmälle on tunnusomaista, että fermentoidaan 20 hiili-, typpi- ja hivenainelähteitä käsittävässä väli-’ aineessa Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245- | tuotantokantaa ja eristetään yhdisteet.

: :’· Keksintö koskee myös biologisesti puhdasta *:··’ Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245-viljelmää, jolle on . .· 25 tunnusomaista, että sillä on kyky tuottaa edellä kuvattuja .·.· yhdisteitä.

Edellä esitetyt rakennekaavat esitetään stereoke-miallisesti määrittelemättömänä tiettyjen asemien ja ste-reokemiallisesti määriteltynä muiden asemien osalta ja 30 tämä keksintö tulisi ymmärtää kaikki mainitunlaiset ste-·. · reoisomeerit kattavaksi. Stereoisomeerit voivat olla eri- tyisesti erilaisten asymmetriakeskusten kohdalla joko a-... tai β-oritentoituneita, jolloin mainitunlaiset ryhmät ovat joko molekyylin yleisen tason ala- tai vastaavasti yläpuo-’. ! 35 lella.

110871 4 Tämän keksinnön mukaistesti valmistettujen yhdisteiden pääkäyttö on antiparasiittisina aineina sellaisten tautien hoidossa ja/tai ehkäisyssä ja hoidossa, joita aiheuttavat kotiläimissä ja siipikarjassa loiset, 5 esimerkiksi niveljalkaisloiset, kuten punkit, täit, kirput ja muut purevat hyönteiset, kuten Tenophalides, Ixodes, Psoroptes, Lucilia ja Hemotobia. Ne ovat tehokkaita myös muissa eläimissä, ihmiset mukaan luettuina, esiintyvien loissairauksien hoidossa. Optimaalinen käyttömäärä 10 parhaiden tulosten saavuttamiseksi riippuu tietenkin hoidettavasta eläinlajista ja loisinfektion tai -tartunnan tyypistä ja vakavuudesta. Uudenlaisella yhdisteellämme saavutetaan yleisesti ottaen hyviä tuloksia antamalla sitä suun kautta noin 0,001 - 100 mg/painokilo, ja tällainen 15 kokonaisannos annetaan kerralla tai osa-annoksina suhteellisen lyhyessä ajassa, kuten 1-5 vuorokauden aikana. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla uusilla yhdisteillä saadaan aikaan mainitunlaisten loisten erinomainen torjunta eläimissä antamalla sitä noin 0,025 -20 50 mg/painokilo kerta-annoksena. Toistohoitoja annetaan tarvittaessa uusintainfektioiden torjumiseksi, ja ne •« · : riippuvvat loislajista ja käytettävistä karjanhoitome- ί.ί,' netelmistä. Menetelmät näiden aineiden antamiseksi eläi- *:·· mille ovat eläinlääketieteen alan ammattimiesten tuntemia.

; 25 Näitä yhdisteitä voidaan antaa suun kautta yksikköannosmuodossa, kuten kapselina, isona pillerinä tai tablettina, tai lääkejuomana, joka on normaalisti aktiivisen aineosan liuos, suspensio tai dispersio tavallisesti vedessä yhdessä suspendointiaineen, kuten 30 bentoniitin, ja kostutusaineen tai vastaavan jatkeaineen » · '· ' kanssa. Lääkejuomat sisältävät yleensä myös vaahtoa- misenestoainetta. Lääkejuomaformulat sisältävät yleensä ... noin 0,001 - 1,0 paino-% aktiivisia yhdisteitä.

Edullisissa lääkejuomaformuloissa pitoisuus voi olla noin •· 35 0,01-0,1 paino-%. Kapselit ja isot pillerit käsittävät * » i • > » 110871 5 aktiivista aineosaa sekoitettuna kantaja-aineen, kuten tärkkelyksen, talkin, magnesiumstearaatin tai dikalsium-fosfaatin kanssa.

Kun keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä 5 halutaan antaa kuivassa, kiintässä yksikköannosmuodossa, käytetään tavallisesti kapseleita, isoja pillereitä tai tabletteja, jotka sisältävät halutun määrän näitä yhdisteitä. Nämä annostelumuodot valmistetaan sekoittamalla aktiivinen aineosa perusteellisesti ja 10 yhtenäisesti sopivien hienojakoisten laimennusaineiden, täyteaineiden, hajotusaineiden ja/tai sideaineiden, kuten tärkkelyksen, laktoosin, talkin, magnesiumstearaatin, kasvikumien yms., kanssa. Mainitunlaiset yksikkö-annosformulat voivat vaihdella laajasti kokonaismassansa 15 ja antiparasiittisen aineen sisältönsä suhteen sellaisten tekijöiden, kuten hoidettavan eläimen tyypin, infektion vakavuuden ja tyypin ja hoidettavan eläimen painon mukaan.

Kun yhdisteitä on määrä antaa eläinten rehun kautta, ne dispergoidaan perusteellisesti rehuun tai 20 käytetään sen päälle kaadettavana valmisteena tai pellettien muodossa, joita voidaan sitten lisätä • · · • valmiiseen rehuun tai syöttää mahdollisesti erikseen. Nyt • » ’•S' kuvattuja antiparasiittisia aineita voidaan vaih- ·:·· toehtoisesti antaa eläimille parenteraalisesti, esimerkik- : 25 si pötsin-, lihaksen- tai henkitorvensisäisenä tai ihon alaisena injektiona, missä tapauksessa aktiivinen aineosa liuotetaan tai dispergoidaan nestemäiseen kantajaan. Pa-renteraalisen annon ollessa kyseessä aktiivinen materiaali sekoitetaan sopivalla tavalla hyväksyttävän vehikkelin, 30 edullisesti kasviöljyn, kuten maapähkinäöljyn, puuvillan- I 1 ' siemenöljyn yms., kanssa. Muitakin parenteraalisia vehik- • » » kelejä, kuten orgaanista valmistetta, jossa käytetään sol- ... ketaalia, glyserolia, formaalia ja vesipitoisia parente- raalisia formuloita, käytetään. Yhdisteet liuotetaan tai . . 35 suspendoidaan parenteraaliseen formulaan antoa varten; * > 4 » » 110871 6 mainitunlaiset formulat sisältävät yleensä noin 0,55 -5 paino-% tätä yhdistettä.

Kun tässä kuvattavia yhdisteitä annetaan eläinten rehun komponentteina tai liuotettuina tai suspendoituina 5 juomaveteen, tarjotaan käyttää koostumuksia, joissa aktiiviset yhdisteet ovat perusteellisesti dispergoituina inerttiin kantaja- tai laimennusaineeseen. Inertillä kantaja-aineella tarkoitetaan ainetta, joka ei reagoi antipa-rasiittisen aineen kanssa ja jota voidaan turvallisesti 10 antaa eläimille. Rehun kautta tapahtuvaan antoon tarkoitettu kantaja on edullisesti aine, joka on tai voi olla eläimen ruokavalion aineosa.

Soveltuviin koostumuksiin kuuluvat rehuesiseokset tai täydennysrehut, joissa on läsnä keksinnön mukaisia 15 aineita suhteellisia suuria määriä ja jotka soveltuvat annettaviksi suoraan eläimelle tai lisättäviksi rehuun joko suoraan tai välilaimennus- tai sekoitusvaiheen jälkeen. Mainitunlaisiin koostumuksiin soveltuviin tyypillisiin kantaja- tai laimennusaineisiin kuuluvat esimerkiksi 20 kuivattu rankki, maissijauho, sitrusjauho, käymisjäännök- I » t V set, jauhetut osterinkuoret, vehnäjätteet, liukoinen me- • \ lassi, maissintähkäjauho, syömäkelpoinen papumyllyn syöte, : : ' soijasuurimot, murskattu kalkkikivi yms. Tämän keksinnön ·;··' mukaiset yhisteet dispergoidaan perusteellisesti kaikkial- . .· 25 le kantajaan sellaisin menetelmin kuin jauhamalla, hämmen- * » » ,·,· tämällä tai rumpusekoittamalla. Koostumukset, jotka sisäl- » · tävät noin 0,005 - 2,0 paino-% keksinnön mukaista yhdistettä, ovat erityisen sopivia rehuesiseoksiksi. Täydennys-rehut, joita annetaan suoraan eläimelle, sisältävät noin 30 0,0002 - 0,3 paino-% keksinnön mukaista yhdistettä.

i · ‘ Mainitunlaisia täydennysrehuja lisätään eläimen • · » ·., rehuun sellainen määrä, että valmiiseen rehuun saadaan » · ... aktiivisen yhdisteen pitoisuus, joka on toivottu loissai- rauksien hoitamisen ja torjunnan kannalta. Vaikka tämän .. 35 keksinnön mukaisten yhdisteiden toivottu pitoisuus vaihte- • » » 7 110871 lee edellä mainittujen tekijöiden samoin kuin kulloinkin käytettävän yhdisteen mukaan, tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä annetaan tavallisesti rehussa, jossa niitä on pitoisuutena noin 0,001 - 0,2 %, halutun antiparasiittisen 5 tuloksen saavuttamiseksi. Kun yhdiste on määrä lisätä eläinten rehuun, on lisäksi mahdollista käyttää fermen-tointiliemestä saatua kuivattua myseelikakkua. Myseelit sisältävät runsaasti aktiivisuutta, ja koska myseelien aktiivisuustaso voidaan määrittää, voidaan niitä lisätä 10 suoraan eläimen rehuun.

Nyt kuvattujen yhdisteiden antiparasiittinen aktiivisuus voidaan määrittää antamalla rehun mukana näyte yksittäistä yhdistettä, mainitunlaisten yhdisteiden seosta, konsentroitua uutetta yms. hiirelle, joka on infektoi-15 tu 3 vuorokautta aikaisemmin asianomaisella loisella. Hiiren ulosteista tutkittaan 11, 12 ja 13 vuorokauden kuluttua lääkityksen aloittamisesta munat ja hiiri lopetetaan seuraavana päivänä ja määritetään ohutsuolen proksimaali-sessa osassa olevien matojen lukumäärä. Yhdisteen todetaan 20 olevan aktiivinen, kun muna- ja matomäärät laskevat mer- i » · V kitsevästi verrattuna infektoituihin, lääkitsemättömiin > i « « \ vertailueläimiin.

: Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdis- ·;·1 teitä valmistetaan fermentoimalla sienisuvun Nodulisporium < 25 erästä kantaa. Yhdellä tällaisella viljelmällä on tunnus > > 1 MF-5954 Merck & Co., Inc:n, Rahway, New Jersey, t t viljelmäkokoelmassa. MF-5954-tuotantokanta on talletettu the American Type Culture Collectionin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Md. 20852, pysyvään kokoelmaan 30 ja sille on annettu tulonumero 74245. Talletus on tehty 21. syyskuuta 1993 sopimuksen The Budapest Treaty on the < I i ί># International Recognition of the Deposit of Microorganisms » · ,., for the Purposes of Patent Procedure mukaisesti.

Nodulisporium sp. MF-5954:n morfologiset ja vilje- * , , 35 lyominaisuudet ovat seuraavat: i »

I I

• I * t · 110871 8 MF5954 (tuottaa L-954,967:ää) on eristetty JP337:nä, endofyyttisenä sienenä puumaisesta kasvikudoksesta Billsin ja Polishookin (1991) pintasterilointimene-temällä. Seuraavassa kuvauksessa isolla kirjaimella alka-5 vat värien nimet ovat Ridgwayn (1912) mukaisia.

Maissijauhoagarilla (Difco) pesäke saavuttaa läpimitan 42 mm 6 vuorokaudessa lämpötilassa 25 °C suhteellisen kosteuden ollessa 50 % ja käytettäessä 12 tunnin va-laistusjaksoa fluoresoivalla valolla. Pesäkematto kasvaa 10 pinnanalaisesti, pinta tiiviiksi painautunut - huopamai-nen, kokonaan väritön; erite ja liukoinen pigmentti puuttuvat; kääntöpuoli väritön; makea aromaattinen tuoksu.

Kaurajauhoagarilla (Difco) pesäke saavuttaa läpimitan 42 mm 6 vuorokaudessa samoissa olosuhteissa. 15 Pesäkematto tiiviiksi painautunut - niukasti vanumainen, pesäkkeen keskusta kellanruskea (Mars Yellow, Raw Sienna) vaalean kellanruskea (Light Orange Yellow, Antimony Yellow) puolivälissä reunaa kohti siirryttäessä; reuna yhtenäinen, valkoinen; erite, haju ja liukoinen pigmentti 20 puuttuvat; kääntöpuoli vaaleanruskea.

·, : Peruna-sakkaroosiagarilla (Singleton et ai. 1992) : ‘pesäke saavuttaa läpimitan 43 mm 6 vuorokaudessa samoissa olosuhteissa. Pesäkematto tiiviiksi painautunut - niukasti vanumainen, punertavanruskea (Light Russet-Vinaceous) pe-. .·. 25 säkkeen keskellä ja vaalenee läpinäkyväksi reunalla, reuna ,· erottumaton; erite, haju ja liukoinen pigmentti puuttuvat; kääntöpuoli punaruskea (Dark Vinaceous).

Lämpötilassa 37 °C, maissijauhoagarilla ja pimeässä pesäke saavuttaa läpimitan 82 mm 6 vuorokaudessa; pesäke-30 matto vanumainen kaikkialla muualla paitsi inokulaatiokoh-V\ dassa, jossa matto on tiiviiksi painautunut, valkoinen; reuna yhtenäinen, valkoinen, erite ja liukoinen pigmentti puuttuvat; kääntöpuoli väritön; makea aromaattinen tuoksu.

. Hyyfit läpinäkyviä - vaaleanruskeita, väliseinäl- . . 35 lisiä, seinämät sileitä - hieman karheita, paksuseinäisiä, 110871 9 leveys 2,5 - 3,5 μπι. Konidioforit yksirihmaisia, pystyjä, 150 - 400 x 3,0 - 4,0 pm, sienirihmamaisesti haaroittuneita, läpinäkyviä - vaaleanruskeita, väliseinällisiä, paksuseinäisiä, sileitä - hieman karheita - känsäisiä, sisältä-5 vät joskus oliivinvihreitä, pyöristyneitä ulkonemia (läpimitta 2,5 pm). Konidiogeeniset solut holoblastisia, terminaalisia, 16 - 24 x 1,5 - 2,0 pm, hieman karheita - känsäisiä, sylinterimäisiä, kärkestä epäsäännöllisiä. Koni-diot munamaisia - pitkänomaisen soikeita, typistynyt liit-10 tymiskohta, 4,1 - 5,7 x 1,6 - 2,5 pm, läpinäkyviä, väli-seinättömiä, ohutseinäisiä, haarajatkoisesti konidiogeeni-sen solun kärjestä syntyneitä, kerääntyvät kärkirykelmäksi dentikaaleille.

MF-5954 sijoitetaan sienisukuun Nodulisporium 15 (Hyphomycetes, Deuteromycotina). Tämän suvun tärkeimpiin taksonomisiin ominaispiirteisiin kuuluvat yksirihmaiset konidioforit, jotka ovat tyypillisesti haaroittuneita, ja konidioiden haarajatkoinen tuotanto. Lisäksi konidioita sisältävät alueet ovat pääte- tai välialueita ja solmuk-20 keisia runsaan konidiotuotannon vuoksi (Jong ja Rogers ’.· ‘ 1972) . Nämä ominaispiirteet erottavat suvun Nodulisporium • \ muista samankaltaisista sienistä, kuten sivuista Geniculo- sporiumr Xylocladium ja Ustilina. Nämä suvut ovat monien ·;··; ksylariamaisten sienten (Ascomycotina) , kuten sukujen Hy- . .·. 25 poxylon, Xylaria, Rosellinia jne., suvuton (anamorfinen) tila.

Toisin kuin useimmat eristetyt Nodulisporium-kannat MF-5954 kasvaa hyvin lämpötilassa 37 °C, mutta sillä ei ole viljelyssä mitään muita erottuvia piirteitä, 30 jotka liittäisivät sen johonkin tunnettuun lajiin. Siksi ·’/’! siitä käytetään nimeä Nodulisporium sp.

·.. Kirjallisuus ,,, · 1. Bills, G. F. ja Polishook, J. D., Microfungi #i>i. from Carpinus caroliniana, Can. J. Bot. 69(7) (1991) ! 35 1477 - 1482 110871 10 2. Jong, S. C. ja Rogers, J. D., Illustrations and descriptions of conidial states of some Hypoxylon species, Wash. State Agric. Exp. Sta. Tech. Bull, nro 71 (1972) 51 s .

5 3. Ridgway, R., Color Standards and color nomenclature, omakustanne, Washington, D.C. 1912, 43 s. + 53 kuvasivua 4. Methods for research on soilborne phytopatho-genic fungi, toim. Singleton, L. L. , Mihail, J. D. ja 10 Rush, C. M., APS Press, St. Paul, Minnesota 1992, liite A, s. 247.

Nyt kuvattuja yhdisteitä tuotetaan fermentoimalla aerobisesti sopivaa kiinteää tai vesipitoista ra vintoalustaa jäljemänä kuvattavissa olosuhteissa käyttä-15 mällä Nodulisporium sp. -tuotantokantaa. Vesipitoiset ja kiinteät alustat, kuten monien antibioottien tuotannossa käytettävät, soveltuvat käytettäviksi näiden polysyklisten yhdisteiden tuotantoprosessissa.

Mainitunlaiset ravintoalustat sisältävät mikro-or-20 ganismin assimiloitavissa olevia hiili- ja typpilähteitä V ' ja yleensä pieninä pitoisuuksina epäorgaanisia suoloja, j '> Fermentointialustat voivat lisäksi sisältää hivenainemää- riä mikro-organismien kasvulle ja haluttujen yhdisteiden ·;··, tuotannolle välttämättömiä metalleja. Niitä on yleensä . ,·. 25 läsnä riittävinä pitoisuuksina monimutkaisissa hiili- ja (· typpilähteissä, joita voidaan käyttää ravintolähteinä, mutta haluttaessa niitä voidaan tietenkin lisätä erikseen alustaan.

Hiilihydraatit, kuten sokerit, esimerkiksi glukoo-30 si, sakkaroosi, maltoosi, laktoosi, dekstriini, sereloosi, maissijauho, kaurajauho yms., ja tärkkelykset, ovat ylei-sesti ottaen ravintoalustaan soveltuvia assimiloitavissa ,,, olevan hiilen lähteitä. Alustassa käytettävä tarkka hiili- ( . lähdemäärä riippuu osaksi alustan muista aineosista, mutta . , 35 yleensä havaitaan, että hiilihydraattimäärä 1 - 150 g/1

t I

110871 11 alustaa on tyydyttävä. Näitä hiilihydraattilähteitä voidaan käyttää yksittäin tai voidaan yhdistää muutamia mainitunlaisia hiililähteitä samaan alustaan.

Erilaiset typpilähteet, kuten hiivahydrolysaatit, 5 hiiva-autolysaatit, hiivasolut, tomaattisose, maissijauho, kaurajauho, soijajauho, kaseiinihydrolysaatit, hiivauut-teet, maissinliotusliemet, liukoiset tislaamomateriaalit, puuvillansiemenjauho, lihauute yms., ovat Nodulisporium sp:n helposti assimiloitavissa keksinnön mukaisten yhdis-10 teiden tuotannossa. Erilaisia typpilähteitä voidaan käyttää yksinään tai yhdistelminä määrinä 1-5 g/1 alustaa.

Epäorgaanisiin ravintosuoloihin, joita voidaan sisällyttää kasvualustaan, kuuluvat tavanomaiset suolat, jotka pystyvät antamaan natrium-, kalsium-, magnesium-, 15 ammonium-, kalsium-, fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi-, karbonaatti-, yms. ioneja. Joukkoon kuuluvat myös hivenai-nemetallit, kuten rauta, sinkki, mangaani, kupari, boori, molybdeeni yms.

Tulisi huomata, että jäljempänä ja esimerkeissä 20 kuvattavat alustat ovat vain valaisevia esimerkkejä monis-V ta erilaisista alustoista, joita voidaan käyttää, eikä : ' niitä ole tarkoitettu rajoittaviksi.

Seuraavat ovat esimerkkejä Nodulisporium sp. -kan-.;· tojen MF-5954, ATCC 74245, kasvatukseen soveltuvista alus- , ,· 25 toista.

t · I I I <

Vinopinta-alustan koostumus

Hiivauute 4 g

Mallasuute 10 g 30 Glukoosi 4 g ',*· Bacto-agar 10 g

Tislattu vesi 1 000 ml ’ pH 7,0 » » » i » > » * 110871 12

Inokulaatti- ja tuotantoalustojen koostumus Inokulaattialusta

Komponentti g/1

Hiivauute 4,0 5 Mallasuute 8,0

Glukoosi 4,0

Junlon 1,5

Alusta valmistettiin käyttämällä tislattua vettä, 10 pH säädettiiin arvoon 7,0 ennen sterilointia, ja sitä käytettiin 50 ml väliseinätöntä 250 ml:n erlenmeyerpulloa kohden. Käytettiin vanutulppia. Steriloitiin 20 minuuttia 121 °C:n lämpötilassa.

Tuotantoalusta A 15 1. Kiinteä osa

Lisätään 1 250 cm3 vermikuliittia 4 l:n pyöri- tyspulloon. Suljetaan lateksitulpalla; autoklavoidaan 60 minuuttia ynnä 30 minuuttia kuivassa.

2. Nestemäinen osa 20 Komponentti g/1 ‘ Glukoosi 150,0 : . ‘ Urea 4,0 N Z -amiini, tyyppi A 4,0 "·: K2HP04 0,5 25 MgS04-7H20 0,25 KC1 0,25

ZnS04 · 7H20 0,9

CaC03 16,5 30 Alusta valmistettiin käyttämällä tislattua vettä “· ‘ (ei pH:n säätöä). Sitä käytettiin 425 ml/1 l:n erlenmeyer- pullo. Käytettiin vanutulppia ja alustaa steriloitiin ... ' 15 minuuttia 121 °C:n lämpötilassa.

110871 13

Tuotantoalusta B

Komponentti g/1

Glyseroli 75,0

Glukoosi 10,0 5 Ardamine PH 5,0 (NH4)2S04 2,0

Soijajauho 5,0

Tomaattisose 5,0

Natriumsitraatti 2,0 10

Alusta valmistettiin käyttämällä tislattua vettä, pH säädettiiin arvoon 7,0 ennen sterilointia. Alustaa käytettiin 50 ml väliseinätöntä 250 ml:n erlenmeyerpulloa kohden. Pullot suljettiin vanulla ja niitä autoklavoitiin 15 20 minuuttia 121 °C:n lämpötilassa.

Fermentointi, jossa käytetään Nodulisporium sp:a, voidaan tehdä suunnilleen lämpötila-alueella 20 - 40 °C.

Optimaalisten tulosten saavuttamiseksi on kätevintä tehdä nämä fermentoinnit suunnilleen alueella 22 - 36 °C olevas-20 sa lämpötilassa. Lämpötilat noin 22 - 27 °C ovat edullisimpia. Yhdisteiden tuotantoon soveltuvan ravintoalustan : . pH voi vaihdella suunnilleen alueella 6,5 - 8,0; edullinen alue on noin 6,8 - 7,3. Pienimittaiset fermentoinnit ·;··; tehdään kätevästi sijoittamalla sopivia määriä : 25 ravintoalustaa pulloon käyttämällä tunnettuja steriilejä menetelmiä, inokuloimalla pullo joko Nodulisporium sp:n itiöillä tai vegetatiivisella solukasvustolla, sulkemalla pullo löysästi vanulla ja antamalla fermentaation edetä noin 7 - 35 vuorokautta vakiona pidettävässä huo- 30 neenlämpötilassa noin 25 °C pyöröravistimella, jonka kier-*· ' rostaajuus on 95 - 300 min”1. Suuremmassa mitassa työsken neltäessä on edullista tehdä fermentointi sopivissa säili-... ‘ öissä, jotka on varustettu sekoittimella ja välineillä fermentointialustan ilmastamiseksi. Ravintoalusta valmis-• 35 tetaan säiliössä ja inokuloidaan steriloinnin jälkeen No- 110871 14 dulisporium sp:n vegetatiivisen solukasvuston lähteellä. Fermentoinnin annetaan edetä 7 - 25 vuorokautta sekoittaen ja/tai ilmastaen ravintoalustaa suunnilleen alueella 22 -27 °C olevassa lämpötilassa. Ilmastusaste riippuu muuta-5 mistä tekijöistä, kuten fermentorin koosta, sekoitusnopeu-desta yms. Suurempimittaisten fermentointien yhteydessä sekoitusnopeus on yleensä noin 95 - 300 min-1 ja ilmastus-nopeus noin 50 - 500 1/min.

Yhdisteiden erottaminen koko fermentointiliemestä 10 ja yhdisteen talteenotto tehdään liuoteuutolla ja käyttämällä erilaisilla kromatografiamenetelmillä ja liuotejärjestelmillä toteutettavia kromatografisia fraktiointeja.

Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat 15 veteen niukkaliukoisia, mutta liukenevat orgaanisiin liuotteisiin. Tätä ominaisuutta voidaan käyttää kätevästi yhdisteen ottamiseen talteen fermentointiliemestä. Niinpä yhdessä talteenottomenetelmässä koko fermentointiliemi yhdistetään suunnilleen yhtä suuren tilavuuden kanssa 20 orgaanista liuotetta. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa ’·’ orgaanista liuotetta, on edullista käyttää veteen . sekoittumatonta liuotetta, kuten etyyliasetaattia, dikloorimetaania, trikloorimetaania yms. Yleensä on *"* toivottavaa tehdä muutamia uuttoja maksimisaannon : 25 saavuttamiseksi. Liuote poistaa keksinnön mukaisia yhdisteitä, samoin kuin muita aineita, joilta puuttuu keksinnön mukaisen yhdisteen antiparasiittinen aktiivisuus. Jos liuote on veteen sekoittumaton, kerrokset erotetaan ja orgaaninen liuote konsentroidaan 30 alipaineessa. Jäännös laitetaan kromatografiakolonnille, '·’ joka sisältää edullisesti silikageeliä. Kolonni pidättää halutun tuotteen ja joitakin epäpuhtauksia, mutta päästää lävitseen monet epäpuhtaudet, erityisesti poolittomat epä-....· puhtaudet. Kolonni huuhdotaan kohtalaisen polaarisella •· 35 orgaanisella liuotteella, kuten dikloorimetaanilla tai 110871 15 trikloorimetaanilla, epäpuhtauksien poistamiseksi edelleen ja sitten dikloorimetaanin tai trikloorimetaanin ja orgaanisten liuotteen seoksella, joista liuotteista ovat edullisia asetoni, metanoli, etanoli yms. Liuote haihdutetaan 5 ja jäännös käsitellään edelleen kromatografisesti käyttämällä pylväskromatografiaa, ohutkerroskromatografiaa, pre-paratiivista ohutkerroskromatografiaa, suurpainenestekro-matografiaa yms., joissa käytetään silikageeliä, alumiini-oksidia, ioninvaihtohartseja, dekstraanigeelejä yms., kro-10 matografiaväliaineena ja erilaisia liuotteita ja liuoteyh-distelmiä eluenttina. Ohutkerros-, suurpaine-, neste- ja preparatiivista kerroskromatografiaa voidaan käyttää keksinnön mukaisen yhdisteen läsnäolon detektointiin ja eristämiseen.

15 Edellä mainittujen samoin kuin ammattimiesten tun temien muiden menetelmien käytöllä saadaan aikaan puhdistettuja koostumuksia, jotka sisältävät nyt kuvattua yhdistettä. Halutun yhdisteen läsnäolo määritetään analysoimalla eri kromatografiafraktioista biologinen aktiivi-20 suus tai fysikokemialliset ominaisuudet. Molemmat yhdis- '.· teet on määritetty analysoimalla yksityiskohtaisesti yh- • disteiden erilaiset spektriominaisuudet, erityisesti nii- * den NMR-, massa-, ultravioletti- ja infrapunaspektrit.

•; · · Esimerkki 1 . 25 1. Viljely: MF-5954 saatiin agarvinopinnalla ja .V käytettiin pakastettujen vegetatiivisten myseelien (FVMs; frozen vegetative mycelia) valmistukseen. Osa agarvinopin-nasta siirrettiin aseptisesti inokulaattialustaan A (50 ml, väliseinätön 250 ml:n pullo). Sitä inkuboitiin 30 pyöröravistimella, jonka liikerata oli 5 cm (2 tuumaa), ’ kierrostaajuudella 220 min’1 3 vuorokautta lämpötilassa 25 °C suhteellisen kosteuden (rh) ollessa 85 %, jolloin ... saatiin biomassaa. Biomassa-annoksia siirrettiin sterii- leihin pulloihin, jotka sisälsivät glyserolia, ja pakas-.. 35 tettiin (FVM:nä). Niitä pidettiin yllä lopullisen glysero- 110871 16 lipitoisuuden ollessa 10 - 15 % lämpötilassa -75 °C. Se-kundaari-FVM:iä valmistettiin primaari-FVM:stä siirtämällä 1,0 ml sulatettua primaari-FVM:ää inokulaattialustaan ja inkuboimalla 2-3 vuorokautta lämpötilassa 25 °C käyttä-5 mällä kierrostaajuutta 220 min-1 ja pakastamalla edellä kuvatulla tavalla.

2. Inokulaatti: Pakastettu pullo (FVM) sulatettiin huoneenlämpötilaan ja käytettiin NF-5954-inokulaattivil-jelmien inokulointiin suhteessa 0,5 - 1,0 ml 50 ml:aa koh- 10 den inokulaattialustaa A. Kasvatettiin pyöröravistimella (220 min-1) 2-3 vuorokautta lämpötilassa 25 °C rh:n ollessa 85 %. Joskus käytettiin toisen vaiheen inokulaattia. Sen kehittämiseksi laimennettiin 1 ml edellä kuvattua ensimmäisen vaiheen inokulaattia 50 ml:ksi tuoreella inoku-15 laattialustalla A ja inkuboitiin 24 - 30 tuntia lämpötilassa 25 °C sekoitustaajuudella 220 min-1 rh:n ollessa 85 %.

3. Tuotanto: Tuotantoalustan A koostumus on kiin-teäsubstraattifermentointialusta. Annos (18 - 24 ml) ino- 20 kulaattia laitettiin 425 ml:aan tuotantoalustaa A. Pulloa pyöritettiin voimakkaasti biomassan dispergoimiseksi. Si-* \ sältö kaadettiin 4 l:n pyöritysviljelyastiaan, joka sisäl- si 1 250 cm3 suurihiukkasista vermikuliittia. Pyörityspul-lon sisältö ravisteltiin/sekoitettiin homogeenisen inoku-, ,* 25 laation ja peiton takaamiseksi. Pyörityspulloja in- ,·,· kuboitiin vaakasuorassa pyörittäen niitä kierrostaajuudel- > i la noin 4 min-1 Wheaton-pyorityslaitteella lämpötilassa 22 - 25 °C rh:n ollessa 50 - 75 % 19 - 28 vuorokautta, jolloin saatiin sekundaarista metaboliittia fermentointi-30 alustaan.

’Λ Joukosta nestemäisiä alustoja tutkittiin keksinnön mukaisten yhdisteiden tuotanto, niin että fermentointi ... ’ voitiin helposti laajentaa suuriin astioihin. Tuotantoa havaittiin vain pienessä määrässä tutkituista nestemäisis-. , 35 tä alustoista. Käytettiin nestemäistä tuotantoalustaa B.

110871 17

Inokulaattiviljelmät inokuloitiin edellä kuvatulla tavalla ja niitä kasvatettiin kierrostaajudella 220 min"1 pyörivällä pyöröravistimella 3 vuorokautta lämpötilassa 25 °C rh:n ollessa 85 %. Inokuloitiin annoksella 5 inokulaattia (1 ml) kukin tuotantopullo, jonka sisältö oli 50 ml (2 % inokulaattia). Pulloja inkuboitiin pyöröravistimella (220 min"1) 21 - 28 vuorokautta lämpötilassa 25 °C rh:n ollessa 50 %.

Käytetyt kaksi tuotantomenetelmää olivat olennai-10 sesti samanlaiset valmistetun tuotteen määrän suhteen. Toisen menetelmän (nestemäinen tuotantoalusta B) etuna on kuitenin, että se voidaan laajentaa sekoituksella varustettuihin astioihin, niin että voidaan valmistaa suuria määriä. Kiinteään alustaan perustuva tuotantomenetelmä 15 (pyörityspullot, alusta A) tekee laajentamisen vaikeaksi.

Myös suurempia astioita (22 l:n säiliöitä) on käytetty keksinnön mukaisten yhdisteiden tuottamiseen tästä viljelmästä.

Esimerkki 2 20 Puhdistus ja alustava karakterisointi '·' Uutettiin kutakin 12:sta 2 l:n pyörityspullosta, * jotka sisälsivät alustalla 21 vuorokautta kasvatettua vil-jelmää, 650 ml :11a metyylietyyliketonia (MEK) 4 tuntia ·;·· pyörityslaitteella käyttämällä kierrostaajuutta 100 min-1.

; ’ 25 Uutteet suodatettiin, yhdistettiin ja haihdutettiin ali- . ,· paineessa kuiviin, 8 g:ksi. Tämä materiaali liuotettiin 20 ml:aan dikloorimetaania ja syötettiin silikageelia (E. Merck) sisältävään 800 ml:n kolonniin liuoteseoksessa di-kloorimetaani:metanoli 95:5. Eluointiin käytettin yksi 30 kolonnin tilavuus kutakin seuraavista liuotteista: dikloo- t f i ’· ’ rimetaani :metanoli 95:5, 9:1, 3:1 ja 1:1 ja metanoli.

* i >

Otettiin talteen 40 ml:n fraktioita; suurin osa aktiivi- I » ... suudesta oli fraktioissa 51 - 55 biologisesti määritettynä .... (Lucilia) . Fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin . . 35 alipaineessa, ja niiden massa oli 200 mg. Tämä näyte liuo- * * * * » » 110871 18 tettiin 8,5 ml:aan metanolia, syötettiin Sephadex LH20 -kolonniin (Pharmacia) metanolissa ja kerättiin 13 ml:n fraktioita virtausnopeudella 6,5 ml/min. Aktiivisuuden määritettiin olevan fraktioissa 41 - 50, ja nämä fraktiot 5 yhdistettiin ja kuivattiin; massa oli 90 mg. Tämä materiaali liuotettiin 0,5 ml:aan metanolia ja injektoitiin kahtena eränä Eka Nobel C-18 -HPLC-kolonniin (9,6 mm x 250 mm) huoneenlämpötilassa; seuranta tapahtui aallonpituudella 270 nm, ja virtausnopeus oli 4 ml/min. Käytetty 10 liuotejärjestelmä oli suhteessa 70:30 asetonitriiliä ja vettä, joka sisälsi 0,1 % TFA:a, ja aktiivinen materiaali tuli eristetyksi fraktioissa 26 - 27 ensimmäisessä eristyksessä ja fraktioissa 27 - 28 toisessa. Yhdisteen puhtaus varmistettiin analyyttisellä HPLC:llä Eka-Nobel-ko-15 lonnissa (9,6 mm x 250 mm, C-18) virtausnopeudella 1 ml/min lämpötilassa 40 °C samoin kuin TLC:llä käyttämällä muutamia liuotejärjestelmiä. Yhdistetyt fraktiot konsentroitiin alipaineessa, uutettiin dikloorimetaaniin ja kuivattiin, jolloin saatiin 4,8 mg puhdasta yhdistettä 20 (yhdiste 1).

'7 Silikageelipylväästä tulleet myöhemmät fraktiot * > « ; olivat myös bioaktiivisia; ne yhdistettiin ja haihdutet- · tiin kuiviin alipaineessa, ja niiden massa oli 1,4 g.

·;·· Kiinteä aines pestiin metanolilla muutamaan kertaan, ja se . .* 25 sisälsi yhdisteitä, joilla oli samanlainen UV-spektri kuin ,·,· yhdisteellä 1. Tätä spektroskooppista ominaisuutta käytet- » · tiin jatkopuhdistusvaiheiden seuraamiseen ja varmistettiin bioaktiivisuus lopullisesti puhtaista yhdisteistä. Niinpä 500 mg ainesta sisältävä metanoliliuos fraktioitiin 30 250 ml: n Sephadex LH20 -kolonnissa metanolissa. Pääosa > » ’ massasta oli näissä yhdisteyissä fraktioissa. Materiaali Λ * » kuivattiin, liuotettiin 3 ml:aan metanolia ja injektoitiin ( » 1 ml:n annoksina preparatiiviselle Zorbax C-18 -kolonnille (22,5 mm x 250 mm) huoneenlämpötilassa käyttämällä liuote-. . 35 järjestelmänä asetonitriiliä ja vettä (0,1 % TFA:a) suh- 110871 19 teessä 80:20 virtausnopeudella 8 ml/min, tehden UV-detek-tointi aallonpituudella 270 nm ja keräten 8 ml:n fraktioita. Kussakin kolmesta fraktioinnista saadut fraktiot 29 yhdistettiin, jolloin saatiin yhdistettä 2, ja fraktiot 5 21-22 sisälsivät yhdistettä 3. Molemmat liuokset kon sentroitiin, uutettiin etyyliasetaatilla, pestiin vedellä ja kuivattiin. Yhdisteen 2 massa oli 1,8 mg ja yhdistettä 3 oli 1,0 mg. Molemmat yhdisteet karakterisoitiin NMR- ja MS-tutkimuksilla yhdisteen 1 analogeiksi.

10 Nopeilla atomeilla tehtävään pommitukseen perustu vat (FAB) massaspektrit rekisteröitiin JEOL HX110 -massaspektrometrillä. FAB-spektri mitattiin käyttämällä ditio-treitoli-ditioerytritolimatriksia (20:80). Tarkat massa-mittaukset tehtiin suurella resoluutiolla käyttämällä re-15 ferenssiyhdisteenä Ultramark 1960:tä (Fomblin). Ratkaisevat suurella resoluutiolla mitatut tulokset esitetään seu-raavassa.

Yhdiste 1 20 Mitattu Teoreettinen Kaava Kohdennus

680,3891 680,3951 C43H53NO6+H M+H

: V: 662,3790 662,3845 C43H51NO5+H 68O-H2O

25 Yhdiste 2

Mitattu Teoreettinen Kaava Kohdennus 695,3806 695,3822 C43H53NO7 M+ 30 13C-NMR- tulokset 13C-NMR-spektrit rekisteröitiin CD2Cl2:ssa taajuuk-silla 100 ja 125 MHz Varian Unity 400 ja vastaavasti 500 ... : -NMR-spektrometreillä lämpötilassa 25 °C. Kemialliset I I I t 110871 20 siirtymät esitetään ppm:inä suhteessa tetrametyylisilaa-niin (TMS), jonka ppm-arvo on nolla, käyttämällä kohdassa 53,8 ppm esiintyvää liuotepiikkiä sisäisenä standardina.

Yhdiste 1 (125 MHz); 198,0, 172,6, 162,0, 154,7, 5 154,6, 140,8, 140,0, 138,4, 135,9, 134,0, 125,9, 125,1, 122.7, 122,0, 121,8, 117,5*, 116,7, 113,1, 76,8, 76,4*, 75.3, 73, 9, 72, 6, 58,2, 56, 1, 48,0, 47,8, 45,2, 39, 1, 32.3, 32,0, 30,1, 29,9, 27,8, 26,0, 25,7, 24,7, 23,5, 19,6, 18,1*, 15,1, 12,6, 11,2 ppm.

10 Hiilien lukumäärä 43 sopii yhteen HR-FAB-MS:llä saadun molekyyli kaavan C43H53NO6 kanssa.

Yhdiste 2 (100 MHz); 198,1, 172,0, 162,0, 154,8, 147,1, 140,1, 138,1, 135,9, 134,0, 126,8, 122,6, 122,0, 121.8, 117,8*, 116,7, 113,2, 106,9, 76,6*, 75,3, 73,9, 15 73,3, 72,7, 58,2, 55,5, 49,6, 48,1, 44,5, 41,3, 39,5, 32,0, 30,4, 30,1, 30,0, 29,9, 27,8, 26,0, 24,8, 23,4, 18,0*, 17,7, 16,7, 15,3, 12,5 ppm.

Hiilien lukumäärä 43 sopii yhteen HR-FAB-MS:llä saadun molekyylikaavan C43H53NO7 kanssa.

20 *Asteriskilla merkityt hiilet havaittiin leveinä *.· · resonansseina.

1H-NMR-tulokset 1H-NMR-tulokset rekisteröitiin 300, 400 tai • ;··; 500 MHz:n spektrometreillä. Kemialliset siirtymät ilmoite- . 25 taan ppmrinä suhteessa TMS:ään, jonka ppm-arvo on nolla, käyttämällä liuotepiikkejä sisäisinä standardeina.

Yhdiste 1 (katso kuvio 1) (500 MHz); δ 0,96 (3 H, s), 1,07 (3 H, s), 1,12 (3 H, s), 1,14 (3 H, s), 1,31 (3 H, s), 1,33 (3 H, s), 1,42 (3 H, s), _ 1,46 (3 H, br.

30 s), 1,96 (3 H, d, J = 1 Hz), 2,32 (1 H, dd, J = 11, 14 Hz), 2,75 (1 H, dd, J = 6,5, 14 Hz), 2,81 (1 H, dd, J = 3, 6,0 Hz), 2,85 (1 H, m), 3,43 (1 H, m), 4,96 (1 H, br.

‘ s), 5,09 (1 H, s), 5,20 (1 H, br. s), 5,22 (1 H, d, _ . J = 6,0 Hz), 5,95 (1 H, d, J = 15 Hz), 6,06 (1 H, d, J = \ 1 35 110871 21 3 Hz), 6,40 (1 H, dd, J = 11, 15 Hz), 7,33 (1 H, br.d, J _ 11 Hz), 7,71 (1 H, s).

Yhdiste 2 (katso kuvio 2) (400 MHz): δ 0,95 (3 H, s), 1,07 (3 H, s), 1,122 (3 H, s), 1,126 (3 H, s), 1,31 5 (3 H, s), 1,34 (3 H, s), 1,42 (6 H, s), 1,73 (1 H, dd, J = 9,5, 12,5 Hz), 1,86 (3 H, d, J = 1,5 Hz), 2,34 (1 H, br. dd, J = 7,5, 12,5 Hz), 2,36 (1 H, dd, J = 11, 14 Hz), 2,78 (1 H, dd, J = 6,5, 14 Hz), 2,81 (1 H, dd, J = 3, 6,5 Hz), 2,93 (1 H, m), 4,88 (H, br.q, J ^ 8 Hz), 5,00 10 (1 H, br.s), 5,10 (1 H, s), 5,20 (1 H, dq, J _ 1 Hz), 5,21 (1 H, d, J = 6,5 Hz), 6,06 (1 H, d, J = 3 Hz), 6,93 (1 H, dq, J = 8, 1,5 Hz), 7,72 (1 H, s).

Yhdiste 3 (katso kuvio 3) (300 MHz): δ 0,91 (3 H, s), 1,05 (3 H, s), 1,09 (3 H, s), 1,11 (3 H, d, J ~ 15 7,5 Hz), 1,13 (3 H, s), 1,33 (3 H, s), 1,34 (3 H, s), 1,47 (3 H, s), 2,30 (1 H, dd, J = 10,5, 13,5 Hz), 2,72 (1 H, dd, J = 6,5, 13,5 Hz), 2,87 (1 H, dd, J = 3, 6,0 Hz), 4,00 (1 H, dd, J = 2,5, 10,5 Hz), 4,58 (1 H, m), 5,02 (1 H, br.s), 5,07 (1 H, s), 5,17 (1 H, br.s), 5,23 (1 H, d, 20 J = 6,0 Hz), 6,02 (1 H, d, J = 3 Hz), 7,67 (1 H, s).

Lyhenteet: s = singletti, d = dubletti, q = kvar-: ' . tetti, br = leveä, m = multipletti, J = 1H-1H-kytkentäva- kio hertseinä (± 0,5 Hz, ~ = suunnilleen).

Claims (3)

22 110871

1 Or-iTYti m. r s i: ” Me Me OH λ-L^Me k.--O Me </ OH tunnettu siitä, että fermentoidaan hiili-, typpi-30 ja hivenainelähteitä käsittävässä väliaineessa Noduli- .’· sporium sp. MF-5954 -tuotantokantaa, ATCC 74245, ja : eristetään yhdisteet.

1. Menetelmä yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava \XJy « °V-Y OH 20 : ;* ja • I

2. Biologisesti puhdas Nodulisporium sp. MF-5954 -viljelmä, ATCC 74245, tunnettu siitä, että sillä , , 35 on kyky tuottaa patenttivaatimuksen 1 mukaisia yhdisteitä. * > 1 I · 110871 23