JPH02195892A - 新規化合物リューアラシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規化合物り豆−アラジン （Ｌｅｕａｌａｃｉｎ）、その製造法およびそれを有効
成分とするカルシウム拮抗剤に関する。

（従来の技術） 心筋または血管平滑筋細胞が電気的に興奮する際、膜電
位依存性のＣａ　２　＋　４オンの流入が起こるが、ジ
ヒドロピリジン感受性カルシウムチャンネルは、骨格筋
や心筋の細胞表層に位置し、細胞内へのカルシウムイオ
ンの流入を調節する役割を果たしている。

ベラパミル「商品名「ワラソン」：エーザイ（株）製］
等の既存のカルシウムブロッカ−は、３Ｈ−ニトレンジ
ピンの細胞膜カルシウムチャンネルへの結合を阻害する
ことが明らかにされている。

従ってニトレンジピンの細胞膜カルシウムチャンネルへ
の結合を阻害する物質はカルシウムブロッカ−として有
用である。

カルシウムブロッカ−は、カルシウムチャンネルをブロ
ックすることで細胞内カルシウム濃度の上昇をおさえ、
冠動脈スパスムの防止、血管拡張作用がある。そしてカ
ルシウムブロッカ−１即ち、カルシウム拮抗剤は、例え
ば狭心症、高血圧症などの治療薬として有用であること
が知られている。

カルシウム拮抗作用を有する薬物として従来、ニフェジ
ピン［商品名「アダラード」：バイエル薬品（株）製］
、ジルチアゼム［商品名「ヘルベツサー」：田辺製薬（
株）製］、ベラパミルし商品名「ワラソン」：エーザイ
（株）製］などが知られており実用に供されている。し
かしながらこれらはいずれも化学合成品であり天然物で
カルシウム拮抗作用を有するものとしては藻から単離さ
れた環状ペプチドのシトネミンＡ　［”Ｓｃｙｔｏｎｅ
ｍｉｎ　Ａ”Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　
ＣｌｌｅｍｉＣ１１ｅ、　　５３Ｊ１２９８−１３０７
゜（１９８８）　］が知られているにすぎず、更にこれ
は未だ実用に供されていない。

（発明が解決しようとする課題〉 本発明者らは、土壌より分離したハプシドスポラ属に属
する５ＡＮＫ　１７１８２株の培養物から、カルシウム
拮抗作用を有する新規化合物リューアラシンが生産され
ることを見出して本発明を完成した。

（課題を解決しようとする手段） 本発明のリューアラシン［化学名：１１−ベンジル−２
，５，８−トリイソブチル−１０−メチル−１，７−シ
オキサー４．１０．１３−１〜リアザシクロヘキサデカ
ン−３，６，９，１２，１６−ベントン（１１−ｂｅｎ
ｚｙｌ−２、５，８−ｔｒｉｉｓｏｂｕｔｙｌ−１０−
ｍｅｔｈｙｌ−１，７−ｄｉｏｘａ−４，１０゜１３−
ｔｒｉａｚａｃｙｃｌｏｈｅｘａｄｅｃａｎｅ−３，６
，９，１２，１６−ｐｅｎｔｏｎ）　］は下記の構造式
および性状を有する。

１）構造式 ２）物質の性状：中性、脂溶性 ３）融点：　１４０℃ ４）比旋光度：［α］ｏ　　１０２°（ｃｌ、１４、Ｍ
ｅＯＨ）５）元素分析： 実測値　Ｃ６４，６５％　８８．３３％　Ｎ７．２１％
計算値　Ｃ６４，９０％　８８．２６％　Ｎ７．３２％
６）分子量：　　５７３　　（質量分析法により測定）
７）分子式：　　Ｃ３１Ｈ４７Ｎ３０７（高分解能質量
分析スペクトル法により測定）８）紫外線吸収スペクト
ル： メタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは、第１
図に示す通りである。

９）赤外線吸収スペクトル： 臭化カリウム（ＫＢｒ　）錠剤法で測定した赤外線吸収
スペクトルは、第２図に示す通りである。

１０）　”Ｃ−ＮＭＲスペクトル： 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）
は、第３図に示す通りである。実験条件で重クロロホル
ムの中央のシグナルは７７、　ｌｐｐｍに発現した。ま
たマススペクトルデータと一致して３１個の炭素が観察
された。

１１）　’Ｈ−ＮＭＲスペクトル： 重クロロホルム中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共嶋スペクトル（２７０λ（Ｈｚ
）は、第４図に示す通りである。

１２）溶解性： メタノール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチルに可
溶、水に不溶。

１３）高速液体クロマトグラフィー： 分離カラム；ラジアルパック・ツバパックカートリッジ
Ｃ１８、粒子径４μｍ。

カラムサイズ８　ｍｍ　Ｘ　１０　ｃｍ（ウォーターズ
社製） 移動相；アセトニトリル：水＝７：３ 流速；　２　ｍ１７分 検出波長；ＵＶ２１０ｎｍ カラム温度２５℃のとき５，７分にピークを観測するこ
とが出来た。

１４）酸加水分解： 酸加水分解によりアミノ酸としてロイシン、Ｎ−メチル
フェニルアラニン、β−アラニン及びロイシン酸を与え
る。

本発明のリューアラシンは種々の異性体を有する。前記
式においては、これらの異性体およびこれらの異性体の
混合物がすべて単一の式で示されている。従って、本発
明においてはこれらの異性体およびこれらの異性体の混
合物をもすべて含むものである。

リューアラシンの生産菌である５ＡＮＫ　１７１８２　
株の菌学的性状は次の通りである。

１）形態学的特徴 本発明の、リューアラシンを生産する上記５ＡＮＫ　１
７１８２株はネパール王国、マニガオンの土壌より分離
された子のう菌の一種でその菌学的性質は次の通りであ
る。

ワイツマン寒天培地上における生育は遅く２５℃、７日
間でコロニーの直径は１５　ｍｍ、１４日間で３５　ｍ
ｍに達する。コロニーは平坦で泊色（Ｗｈｉｔｅ、　１
−１−Ａ）乃至淡黄白色（Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈｗｈｉｔ
ｅ、　１−２−Ａ）である。コロニーの裏面も無色乃至
淡黄白色である。

子のう果は、暗褐色でコロニーの中央部にわずかに形成
される。

子のう果は、表在性で球形ないし亜球形で口孔はなく、
暗褐色でその径は２５０−４００μｍである。

子のうは、８胞子性で球形ないし亜球形、半透明、消失
性でその径は８−１５μｍである。

子のう胞子は球形で、表面は網目状であり、暗褐色で発
芽孔は認められずその径は４−６μｍである。

アナモルフは、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
）で分生子はフィアライドの先端に球状にかたまって形
成される。

分生子は無色、半透明で楕円形ないし長円形で３．５−
１０．Ｏｘ　２．０−３゜５μｍである。

以上の諸形状から既知菌株のそれらと比較検討したとこ
ろ、Ｄ、　Ｍａｌ　１ｏｃｈ及びＲ，Ｆ、　Ｃａ１ｒｌ
著［ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａ
ｎｙ、　４８．１８１５−１８２５　（１９７０）］に
記載されているハブシドスポーイ上」ξＬプ刀ノ、とよ
く一致した。従って本菌を公知菌ハブシドス本プ不にぎ
ｊう刃区マロツクエツトケイン（Ｈａ　５ｉｄｏｓ　ｏ
ｒａ　ｋコ幻山ｔｒｉｓ　Ｍａｌｌｏｃｈ　ｅｔ　Ｃ，
ｔｉｎ）と同定し、保存番号として５ＡＮＫ　１７１８
２　（ｗ、工研条寄第２５１１号、　　ＦＥＲｌ、（Ｂ
Ｐ−２５１１）を付与した。なお色の表示は、Ａ、　Ｋ
ｏｒｎｅｒｕｐ及びＪ、　Ｈ，Ｗａｎｓｃｈｅｒ著「λ
イｅｔｈｕｅｎ　ｆ（ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏ
ｕｒ、第３版、１９７８年、Ｅｙｒｅ　Ｍｅｔｈｕｅｎ
、　Ｌｏｎｄｏｎ発行コに従って行なった。

以上、リューアラシンの生産菌について説明したが、カ
ビの諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的に
容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使用
しうる菌株はハプシドスボラ属に属するリューアラシン
を生産する全ての菌株を包含するものである。

本発明の新規化合物リューアラシンを得るため、これら
の微生物の培養は他の発酵生成物を生産するために用い
られるような培地中で行う。このような培地中には、微
生物が資化出来る炭素源、窒素源および無機塩を含有す
る。

一般に７４炭素源としてグルコース、フラクトース、マ
ルトース、シュークロース、マンニトール、グリセロー
ル、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデ
ンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉−ζ大豆粉、綿実
油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併
用して用いる事が出来る。一般には、培地量の１−１０
重量％で変量する。

窒素源としては、一般に蛋白質を含有する物質を発酵工
程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、
落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファ
ーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉
エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝
酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等
である。

窒素源は、単一または併用して培地量の０．２−６重量
％の範囲で用いる。

培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、
クロライド、カーボネート等のイオンを得ることの出来
る通常の塩類である。また、カリウム、カルシウム、コ
バルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も
含む。液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面
活性剤等が消泡剤として使用される。

へＡ乞基囚ボラＳ口とぞ互プ丈みマロツクエツトケイン
（ヒ胆Ｕ坦匹ユヒＥ良山ｍ国ＭａＨ。

ｃｈ　ｅｔ　Ｃａ１ｎ）ＳＡＮＫ　１７１８２株を培養
しリューアラシンを生産する培地のＰＥ（は、５．０−
８．０に変化出来る。

菌の生育温度は１５℃から３５℃までであるが２２℃か
ら３５℃の範囲が生育良好であり更にリューアラシンの
生産には、２２℃から２８℃が好適である。

リューアラシンは、好気的に培養して得られるが通常用
いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養
法、通気攪拌培養法等が用いられる。小規模な培養にお
いては、２６℃で数日聞損どう培養を行うのが良好であ
る。培養は、バッフル（水流調節壁）のついた三角フラ
スコ中で、１−２段階の種の発育工程により開始する。

種発育段階の培地は、炭素源および窒素源を併用出来る
。

種フラスコは定温インキュベーター中で２６℃、７日間
振とうするか、または充分に成長するまで振どうする。

成長した種は第二の種培地、または生産培地に接種する
のに用いる。中間の発育工程を用いる場合には、本質的
に同様の方法で成長させ、生産培地に接種するためにそ
れを部分的に用いる。

接種したフラスコを一定温度で数日聞損とうし、インキ
ュベーションが終わったらフラスコの含有物を遠心分離
またはろ過する。大量培養の場合には、攪拌機、通気装
置を付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この
方法によれば、栄養培地をタンクの中で作成出来る。栄
養培地を１２５℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培
地にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は
２６℃で通気攪拌して行う。この方法は、多量の化合物
を得るのに適している。

培養の経過に伴って生産されるリューアラシンの量の経
時変化は、ラジオリガンドパインディング（Ｒａｄｉｏ
ｌｉｇａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ）検定法すなわち、Ｇ、
　Ａ。

ＷｅｉｌａｎｄとＲ，Ｅ、　Ｏｓｗａｌｄの方法［Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　２６０　８４５６−８４６４（１９８５）］
を用いて、３トニトレンジピンのミクロゾームへの結合
を阻害する活性で測定出来る。また、高速液体クロマト
グラフィーを用い測定することができる。通常は、７２
時間から１５０時間の培養でリューアラシンの生産量は
最高値に達する。

培養終了後、培養液中の液体部分及び菌体内に存在する
リューアラシンは、菌体、その他の固形部分を珪藻土を
ろ過動剤とする、ろ過操作または遠心分離によって分別
し、そのろ液または上清中および菌体中に存在するリュ
ーアラシンを、その物理化学的性状を利用し抽出精製す
ることにより得られる。例えば、ろ液または、上清中に
存在するリューアラシンは、中性ｐＨ条件下で水と混和
しない有機溶剤、例えば酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、ク
ロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独ま
たは、それらの組み合わせにより抽出精製することがで
きる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭または吸着
用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４（
ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ
−１０，ＨＰ−２０，ＣＨＰ−２０Ｐ、ＨＰ−５０（三
菱化成（株）製）等が使用される。リューアラシンを含
む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸
着させて取り除くか、またはりューアラシンを吸着させ
た後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水な
どを用いて溶出させることにより得られる。また、菌体
内に存在するリューアラシンは、５０−９０’／；の含
水アセトンまたは含水メタノールにより抽出し有機溶媒
を除去した後、ろ液と同様な抽出精製操作を行なうこと
により得られる。

このようにして得られたリューアラシンは、更にシリカ
ゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロ
マトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマ
シア社製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィー
、および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー等で精製することが出来る。

本発明のリューアラシンは、文献未載の新規化合物であ
り、動物（例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等）に対して
カルシウム拮抗作用を示し、例えば高血圧、不整脈、心
不全、狭心症等の予防、治療剤として有用である。

本発明のリューアラシンを医薬として用いる場合、常法
に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容される担体
、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセ
ル剤、注射剤などの形態で経口的または非経口的に安全
に投与することが出来る。投与量は対象疾患、投与経路
および投与回数などにより異なるが、例えば成人に対し
ては１日０．０１ｇから２ｇを、症状に応じて１回また
は数回に分けて投与するのが好ましい。

次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。

エツトケイン５ＡＮＫ　１７１８２株を、無菌的に、滅
菌した後述の組成の培地１００　ｍｌを含むバッフルの
付いた５００　ｍｌの三角フラスコ（種フラスコ）に−
白金耳接種した。次いでこれを２６°Ｃで７日間、２０
Ｏｒｐｍ（７ａｍの回転半径）のロータリー振とう機で
培養した。

培地組成 シュークロース　　　　　　　　　２０　　ｇジャガイ
モ　　　　　　　　　　１００ｇカサ゛ミノ酸　（ヒリ
ミンフリー）１０ｇリン酸−カリウム　　　　　　　　
　５ｇ硫酸マグネシウム（７水相物）　　　　２．５ｇ
イオン交換水　　　　　　　　１０００　　ｍ１種培養
と同じ組成の培地を、各々１００　ｍｌずつバックルの
ついた５００　ｍｌの三角フラスコ２０本に入れ、滅菌
後、種フラスコから２　ｍｌずつ成長菌を取って接種し
た。この２０本の三角フラスコを種培養と同じ条件で７
日聞損とう培養した。

１１阜阻 培養液全体物を、３０００　ｒｐｍ、２０分間遠心分離
した。沈でん物を抽出のためにとっておいた。１゜７Ｌ
の上清をｐＥ（７，０に調整し分液ロートに入れ、２Ｌ
の酢酸エチルで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を
３Ｌの飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウム
で乾燥した後、ロータリーエバポレーターで、減圧上濃
縮、乾固して２７３　ｍｇの油状物を得た。菌体を含む
前述の沈でん物は、アセトン３００　ｍｌを加え、１時
間攪拌しながら抽出した。得られた抽出液をろ過し、ろ
液よりロータリーエバポレーターで、減圧下アセトンを
留去した。残留物に水を加え１０００　ｍｌとした後、
カセイソーダでｐＨ７，０に調整し酢酸エチル１０００
　ｔｎｌで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を２Ｌ
の飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾
燥した後、ロータリーエバポレーターで減圧下、濃縮乾
固して３９１　ｍｇの油状物を得た。培養ろ液から得ら
れた油状物２７３　ｍｇと、菌体部分から得られた３９
１　ｍｇの油状物の合わせて６６４ｍｇを、ｎ−ヘキサ
ン／酢酸エチル＝４：６に溶解しておき、あらかじめｎ
−ヘキサジ／酢酸エチル＝４：６で平衡化しておいなシ
リカゲルカラム（ローパーカラム、Ａｒｔ、　１０４０
１　Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ　５ｉ６０、サイズＢ、メル
ク社製）に付し精製した。流速１０　ｍ１７分で検出器
として示差屈折計を用い、検出されたすべてのピークを
それぞれ分取した。それぞれを、ロータリーエバポレー
ターで減圧下濃縮乾固した。得られた各分画を、後述の
試験例１．のラジオリガンドパインディング検定法で活
性を検定したところ、３０分から３７分の分画１００　
ｍｇに活性があり、ＩＣ５Ｏ値が１．３８μｇ／ｍ　１
の非常に有効なカルシウムブロッカ−の存在を示した。

活性のあるこの分画の一部を、高速液体クロマトグラフ
ィー（分離カラム；ラジアルパック・ツバパックカート
リッジＣ１８、粒子径４μｍ、カラムサイズ８　ｍｍ　
Ｘ　１０　ａｍ（ウォーターズ社製）、移動相ニアセト
ニトリル：水＝７：３、流速；　　２ｍｌ／分、検出波
長；　ＵＶ　　２１０　ｎｍ、カラム温度；２５℃）に
付すと、５．７分に末端に紫外部吸収を持つピークが単
一に見られた。次いで、得られた活性分画を逆相液体ク
ロマトグラフィーに付して精製した。即ち、逆相カラム
の、センシューパックＯＤＳ　Ｆ［−５２５１（２０ｍ
ｍ　ｉ、ｄ、　Ｘ　２５０　ｍｍ、センシュー科学（株
）製〉にアセｌ−ニトリル２００μｌに溶かした全量を
注入した。６０％アセトニトリル／水を流速７．０ｍｌ
／分で展開溶出し、示差屈折計を用いて検出し２８分に
現れるピーク画分を集め、ロータリーエバポレーターで
減圧下、濃縮、乾固して純粋なリューアラシンの白色粉
末を７０　ｒｎｇ得た。

この粉末を更に結晶化のためアセトンとｎ−ヘキサンの
混合溶媒を用いて結晶とし４０　ｍｇの無色２．１１３
−ベンジル−２Ｒ５Ｓ　　８Ｓリユーアラジンを得るた
めのハＺ乞凡み水プ不に壬工之丈久マロツクエツトケイ
ン５ＡＮＫ１７１８２株を用いる大量培養を行なった。

培養工程に用いる種培養培地は以下の組成を有する。

培地組成 シュークロース ジャガイモ カザミノ酸（ビタミンフリー） リン酸−カリウム 硫酸マグネシウム（７水和物） 消泡剤（ＣＢ−４４２＞ イオン交換水 ｐＦ［無調整 ０　　　ｇ ００ｇ ０　　　ｇ ５ｇ ２．５ｇ ０．２ｇ １０００　　　ｍｌ ５００　ｍｌのバッフルのついた三角フラスコに、１０
０　ｍｌの培地を入れ、微生物を接種する前に１２０℃
で２０分間加熱滅菌し、無菌的にへ１ン且ム託プｎゼλ
孟丈入マロツクエツトケイン ５ＡＮＫ　１７１８２株を接種した後、２６℃で７日間
２００ｒｐｍのロータリーシェーカーで振とう培養した
。２基の３０　Ｌステンレス製ジャーファーメンタ−中
に、各々１５　Ｌずつの種培養と同一の組成の培地を入
れ、これを１２０℃で３０分間加熱殺菌した。

次いでこれに上述の種培養液を２００　ｍｌ入れ、２６
℃で６日間、７．５Ｌ／分の空気流量で溶存酸素濃度を
０．３−０．５　ｐｐｍに保つため攪拌速度を１１００
−３００ｒｐの範囲で自動的にコントロールし通気攪拌
培養した。

旦月」弘 前述の５ＡＮＫ　１７１８２株の培養全体物１５Ｌ中に
、約３　Ｋｇのろ適用のセライトを加え、混合物をフィ
ルタープレスを通じてろ過し、菌体区分とる液に分けた
。菌体区分８　Ｋｇに、３５　Ｌのアセトンを加え室温
下で１時間攪拌し抽出した。得られた抽出液をろ過し菌
体と抽出ろ液に分けた。菌体区分にもう一度８０％アセ
トンを１５　Ｌ加え１時間攪拌し抽出した後、ろ過し、
抽出ろ液を得、さきのろ液及び抽出ろ液と合せた。これ
をロータリーエバポレーターで減圧下、アセトンを留去
し水溶液１０　Ｌを得た。得られた水溶液をｐＥ［６，
５に調節した後１０　Ｌの酢酸エチルで２回抽出し、１
８　Ｌの酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を１５　Ｌ
の飽和食塩水で洗浄し、８００ｇの無水硫酸ナトリウム
で乾燥後、ロータリーエバポレーターで減圧下、濃縮乾
固して油状物２１．２ｇを得た。あらかじめ、ｎ−ヘキ
サン／酢酸エチル＝４：６で平衡化しであるシリカゲル
カラム（ローバーカラム、Ａｒｔ、　１０４０２Ｌｉｃ
ｈｒｏｐｒｅｐ　５ｉ６０、サイズＣ、メルク社製）に
、この油状物を、同じ組成の溶媒８０　ｍｌに溶かし、
４回に分けてカラムに付した。各回とも同一溶媒で展開
しカラムに接続した示差屈折計が示す３５分から５０分
のピークを分取した。この画分について実施例１．と同
様にして高速液体クロマトグラフィーにより成分の純度
をモニタリングしさらにラジオリガンドパインディング
検定法によっても活性を確認した。次いで両分をロータ
リーエバポレーターで減圧下、濃縮乾固して合計１．８
ｇの油状物を得た。次いで、得られた油状物を逆相液体
クロマトグラフィーに付して精製した。即ち、逆相カラ
ム（７）、センシューパックＯＤＳ　Ｆ［−５２５１（
２０ｍｍ　ｉ、ｄ。

Ｘ　２５０　ｍｍ、センシュー科学（株）製）に、アセ
トニトリル８　ｍｌに溶かした油状物を、１０回に分け
て注入した。６０％アセトニトリル／水を流速７．０ｍ
ｌ／分で展開、溶出し、示差屈折計を用いて検出し、２
８分に現れるピークの両分を集め、ロータリーエバポレ
ーターで減圧下、濃縮、乾固して純粋なリューアラシン
を無色油状物として、１．６６ｇ得た。

この油状物を更に結晶化のため、アセトンとｎ−ヘキサ
ンの混合溶媒を用いて結晶とし、８００　ｍｇの無色針
状結晶を得た。

（実施例の効果） ＝１．−ジ　１　ン′バ　ンーイン ラジオリガンドパインディング（Ｒａｄｉｏｌ　ｉｇａ
ｒ＋ｄｂｉｎｄｉｎｇ）検定法、即ち、Ｇ、　Ａ、　Ｗ
ｅｉｌａｎｄとＲ，Ｅ。

Ｏｓｗａｌｄの方法［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ハ几８４５６−８４６４　（１９８５）］の変法を用い
て、３■−ニトレンジピン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ
）のミクロゾームへの結合を阻害する活性で測定した。

即ち、豚の心臓（Ｐｏｒｃｉｎ　ｈｅａｒｔ）より調製
したミクロゾーム画分１５−２０　μｇ、３Ｈ−ニトレ
ンジピン（ＭＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ社製、比活性８８．　
Ｉ　Ｃｉ／ｍλ（）２００　ｐＭ、５０ｍＭ　Ｎａ０Ｈ
−ｆ（ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＦ（７，４）、０．５５；エ
タノールからなる１ｍｌの反応溶液中で２５°Ｃ１３０
分の反応を行なわせた。リューアラシンはエタノール溶
液を調製し、それを順次希釈して反応液中のエタノール
濃度が０．５％となるように添加した。なおこのとき非
放射性の二１〜レンジピンを１ｇＭ添加したものの結果
をバックグラウンド値とした。反応終了後、セルハーベ
スタ（Ｍ−２４型、ブランデル社製）を用いてグラスフ
ァイバーろ紙（ＧＦ／Ｃ）上でろ過および洗浄を行ない
、グラスファイバーをバイアルに入れ、０ＰＴＩ−ＦＬ
ＵＯＲ（パラカード社製）をシンチレータ−として加え
放射能（ｄｐｍ　）を求めた。その結果、リューアラシ
ンの５０％阻害濃度は、０．９９μｇ／ｍ　ｌと強い阻
害作用を示した。

：　　２．　　　に　　　ルシ　ム 盲腸紐によるカルシウム拮抗作用を、 Ｍ、Ｓｐｅｄｄｉｎｇ［Ｎａｕｎｙｎ−３ｃｈｍｉｅｄ
ｅｂｅｒｇ’ｓ　ＡｒｃｈＰｈａｒｍａｃｏｌ、　ＩＬ
８．．２３４−２４０　（１９８２）］の方法に従って
測定した。即ち、体重２５０−３００　ｇの雄性モルモ
ットを、ベンドパルビタール麻酔下に腹部を切開し直ち
に盲腸より紐をはぎとった。これを混合ガス（９５％酸
素、５％炭酸ガス）で通気飽和したタイロード液に移し
た。盲腸紐を６−７　ｍｍの長さに切り、次いでカルシ
ウムを除去したタイロード液２０　ｍｌの入ったマグヌ
ス槽内に懸垂した。この状態で１時間放置して標本を安
定させてから、３０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭの塩
化カルシウム溶液をそれぞれ０．２ｍｌずつ３分間隔で
累積注入し、標本の収縮高を測定した。測定後、標本を
カルシウムを除去したタイロード液で２回洗浄し３０分
間放置した。次いで標本にリューアラシン溶液を添加し
て３０分間インキュベートした後同様に、３０ｍＭ、１
００ｍλ（，３００ｍＭの塩化カルシウム溶液をそれぞ
れ０．２ｍｌずつ３分間隔で累積注入して標本の収縮高
を測定した。塩化カルシウム溶液単独の収縮高からリュ
ーアラシン溶液処理の収縮高を引き、この値を塩化カル
シウム溶液単独の収縮高で割り拮抗率を算出した。

試験結果を次に示す リューアラシン濃度 ｇ／ｍｌ 拮抗率 （％） １０〜６ 以上から明らかな如く、リューアラシンは優れたカルシ
ウム拮抗作用を示した。

；！３．古 自然発症高血圧ラット（以下５ＨＲ）にリューアラシン
を静脈内投与して抗高血圧作用を試験した。

即ち、生後１５週令の雄性ＳＨＲをソジウムベントバル
ビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔的投与）で麻酔し、股
動脈にポリエチレンカニユーレを挿入した。動物のカニ
ユーレの他端を血圧測定装置に接続し麻酔状態で血圧及
び心拍数を直接法により測定した。

血圧測定装置は、Ｌａｆｆａｎらの装置［Ｌａｆｆａｎ
　Ｐ、　Ｊ、　。

Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ａ、、　Ｈｉｔｃｈ　Ｓ、Ｗ、、　
ａｎｄ　Ｊｅｕｎｅｌｏｔ　Ｃ，、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃｕｌａｒ　Ｒｅｓ、、　６．３１９−３２４　（１９
７２）］を、改良したものを使用した。リューアラシン
は、エタノールに溶解したものを生理食塩水で希釈して
股静脈より投与した。リューアラシン投与は、リューア
ラシン投与前１時間コントロールの血圧および心拍数を
観察しそれらが安定した時に行なった。

投与量 血圧降下（ｍｍＨｇ　） １００　μｇ／ｋｇ ３００　μｇ／ｋｇ 以上のように、リューアラシンは優れた抗高血圧作用を
示した。

Ｘ竪医生−二住朗住 マウスに、リューアラシンを２００　ｍｇ／ｋｇ経口投
与したが毒性は認められなかった。

次に製剤例を示す。

！’１．ｊ：　　　　プセル１ 処方 リューアラシン　　　　　　　　３０　　ｍｇ乳糖　　
　　　　　　　　　　　１７０　　ｍｇトウモロコシ澱
粉　　　　　　　１４８．８　ｍｇステアリン酸マグネ
シウム　　　　１．２ｍｇ上記処方の粉末を混合し、３
０メツシユのふるいを通した後、この粉末３５０　ｍｇ
をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とした。

（発明の効果） 以上から、本発明のリューアラシンは顕著なカルシウム
拮抗作用を示し例えば血圧降下剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、リューアラシンの紫外線吸収スペクトルを示
す。第２図は、同物質の赤外線吸収スペクトルを示す。 第３図および第４図は、同物質のそれぞれ、１３Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルおよび’Ｉ（−ＮＭＲスペクトルを示す
。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるリューアラシン。
2. （２）ハプシドスポラ属に属するリューアラシン生産菌
   を培養し、その培養物より請求項（１）記載のリューア
   ラシンを採取することを特徴とする請求項（１）記載の
   リューアラシンの製造法。
3. （３）請求項（２）において、ハプシドスポラ属に属す
   るリューアラシン生産菌が￥ハプシドスポラ￥￥イレギ
   ユリス￥マロックエットケイン ＳＡＮＫ１７１８２株（微工研条寄第２５１１号、ＦＥ
   ＲＭＢＰ−２５１１）である製造法。
4. （４）請求項（１）記載のリューアラシンを有効成分と
   するカルシウム拮抗剤。