JPH02225499A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物から得られる新規な抗菌活性物質、それ
らの製造方法、および医薬としてのそれらの使用に関す
る。

〔発明の構成〕

数多くの微生物が自然界から分離され、これらの微生物
のいくつかは有用な抗閘活性を有する分離可能な代謝産
物を生理することが見出された。

この種の代謝産物の１つがＭＭ４９７２Ｂと呼ばれる物
質である。これは新規なグリコペプチド化合物の複合体
であると考えられ、有用な抗菌活性をもつことが判明し
た。

従って、本発明は新規物’ｉｔＭＭ４９７２８を提供す
飛。この物質ＭＭ４９７２８は次の特性を有する：（１
）それはアミコラトプシス種（Ａｍ）’ｃｏｌａｔｏｐ
ｓｉｓ　）属の微生物の培養により得られる； （１１）この複合体はＭＭ５５２６６、　ＭＭ５５２６
７／１　。

ＭＭ５５２６７／２およびＭＭ５５２６８と呼ばれる４
種類の物質を含む；および ｒ　ｒｒ＋　＞それは黄色ブト９球菌（５ｔａｐｈ）’
１ｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ　）Ｖ　５７３　Ｋ対し
て抗菌活性を示す。

前Ａ己のＭＭ５５２６６　、　ＭＭ５５２６７／１　、
ＭＭ５５２６７／２　。

およびＭＭ５５２６８は新規物質であると考えられ、従
ってそれぞれの物質はその製法および用途と共に本発明
の別の面を構成する。それらは実験の部で以下（示す同
定データ・を有している。

ＭＭ５５２６６は式ＣＩ）： Ｃ式中、ＲＬ！　ＣａＨ＋？であ７．　）で表される化
合物から成ると考えられ、２以上の異性体として存在す
ることができる。従って、本発明の別の面は、−般に異
性体混合物としての、式ｔＸ＞の化合物を提供する。

ＭＭ５５２６７／１　、ＭＭ５５２６７／２およびＭＭ
５５２６８のそれぞれは異性体混合物として存在し得る
グリコペプチド化合物から成ると考えられる。

本発明はさらに、生産用微生物を培養し、その後本発明
物質または化合物もしくはその誘導体を培養物から単離
することから成る、本発明物質または化合物の生産方法
を提供する。

本発明はさらに１本発明物質または化合物もしくはその
誘導体と他の抗菌活性￥ｌ；３質および／または不活性
物質とが混じっている溶液から、アフィニティー樹脂へ
の吸着（よって本発明物質また（ま化合物もしくはその
誘導体を分離することから１茂る、本発明物質または化
合物の分離方法を提供する０ 本明細書中で用いる１培養１なる用語Ｃおよび：この用
語の派生飴）は、同化可能な炭素源、窒素源、硫黄源お
よび無機塩の存在下での微生物の計画的な好気的増殖を
意味１゛る。このような好気的増殖は固体または半固体
の栄養培地中で、あるいｋより実施できろ。栄養培地は
複合栄養から成るものであっても、化学的（規定された
ものであってもよい。

本発明の培重方法において用いるの１ζ適した微生物は
、ＭＭ４９７２ｇを生産できるアミコラトプシス種属に
含まれる菌株であることが見出された。官らに、このよ
うな菌株の例は自然界から分離された菌種ＮＣＩＢ　４
００８９およびその突然変異株であることが分かった。

本明細書中で用いる“突然変異株”なる用語は、自然に
あるいは外的原因物質（その外的原因物質は計画的に加
えられたものであっても、そうでなくてもよい）の作用
により生ずるあらゆる突然変異株を含む。突然変異株を
作るための適当な方法は１産業用微生物のための放射お
よび放射性同位元”Ｊｔ　（Ｒａｄ、１ａｔｔｏｎ　ａ
ｎｄ　ＲａｄｉｏｌｓｏｔｏＰａａｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓ
−ｔｒ４ａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　）　’
中の°微生物の発生技術１　シンポジ９ムの記録、ウィ
ーン、１９７３年、２４１頁、国際原子力機関において
Ｈ，１，Ａｄ、１ｅｒ　Ｋよりて概説された方法であり
、これらは次のものを含む： ＣＩ）ｉｆｆ、離線（例、Ｘ線およびλ線）、紫外線、
紫外線＋ｓ光削（例、８−メトキシブンラレン）、亜硝
酸、ヒドロキｈミン、ピリミジン塩基類縁体ｃ例、５−
プロモウラシ／’　）　、アクリジン類、アルキル化量
ｃ例マスタードガス、エチル−メタンスルホネート）、
過酸化水素、フェノール類、ホルムアルデヒド、熱；お
ヨヒ〔１１）遺伝子操作技術、例えば組換え、形質転換
、形質導入、溶原化、清涼変換、プロトプラスト融合、
並びに自然突然変異株の選択技術を含む。

菌ｆ！ＩＮＣＸＢ　４００８９はアミコラトプシス種属
に含まれる以前に報告されたことのない５４４欅である
と考えられ、従って、これは特に主す学的１純粋な形態
（おいて本発明の一部を構成する。これは１９８８　年
ｘ２月６日に番号４００８９としてスコツトランド、ア
ハティーンのナショナル修コレクショｒｖｅオン・イン
ダストリアル・アンド−マリーン昨バクテリア（Ｎａｔ
ｔｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｌｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｉａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ
　Ｌｔｄ、：　ＮＣＩＢ　）　ｈ−寄託された。

菌種ＮＣＩＢ　４００８９を培養するための発酵培地は
、適当には同化可能な炭素源および同化可能ｒ（窒素源
を無機璃類と共に含有する。適当な窒素源には酵母エキ
ス、大豆粉、肉エキス、綿実、小麦粉、麦芽、蒸留器乾
燥可溶分、アミノ酸、タンパク″ｘｔ加水分解物、並び
１アンモニウムおよび硝酸窒素が含まれる。適当な炭素
源（はグルコース、ラクトース、マルトース、テンブン
およびグリセロ−・塩化物イオン）、アルカリ土類金項
イオンＣ例、カル７ウムおよびマグネシウム）、および
鉄やコバルトのような微量元素を含有する。

培養は適切には約加〜３５　’Ｃ、有利には加〜３０℃
で行われ、そして培養物は生産物の最適収量を得るため
（発酵開始後最高７日間、有利には約３〜５日間収穫さ
れる。

目的生産物またはその誘導体はその後培地から分離され
、そしてグリコペプチド化合物のための慣用技術を用い
て精製される。この種の分離・精製法はすべて低温ない
し周囲温度、例えば４〜３０℃、有利には２０〜２５℃
で行われる。

目的生産物は一般１培養物ν液から主として得られ、従
って最初の分離工程は例えば濾過または遠心分離によっ
て発酵培地から固体物質を除き、澄明化された培養物炉
液を得ることを包含するのが有利である。

この澄明化された培養物炉液からの目的生産物の分離は
、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン−セファロースアフィニ
ティー樹脂のようなアフィニティー樹脂への吸着により
有利に行われる。

目的生産物は抗菌活性１ついて試験しかつ／まだりＩ（
ＰＬＯ保持時間を監視することにより、一般的な方法で
簡単（同定することができる。

適当（は、分離方法は、好ましくは最終工程として、高
性能液体クロマトグラフィー工程を含む。

溶出は水性ＮａＨｔＰＯ４／アセトニトリルを用いて行
うのが好ましい。

本発明茫よる生産物は適当には実質的に純粋な形態で、
例えば少なくとも５０％の純度、適当（は少なくともω
チの純度、有利（は少なくとも７５チの純度、好ましく
は少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも
９５チの純度、特（少なくとも９８チの純度で提供され
るＣ百分率はすべて重量／重量として計算した）。本発
明生産物の純粋でないすなわち純度の低い形態は、例え
ば医薬用途に適したより純粋な形態の同一生産物または
関連産物Ｃ例えば対応する誘導体）を製造するため（用
いることができる。

本発明の生産物は抗菌特性を有し、動物、＃にヒトを含
む哨乳動物、中でもヒトおよび家畜ｃＭｋ場動物を含む
）ｋおける細菌感染症の治療に有用であ°る。この生産
物は広範囲の生物Ｃ例えば、本明細書に列挙した生物を
含む）（よって引き起こされる感染症の治療（用いるこ
とができる。

本発明は、本発明生産物またはその薬学的Ｃ許容しうる
誘導体を製剤学的に許容しうる担体または賦形剤と共（
含有する薬剤組成物を提供する。

本発明はまた、本発明生産物またはその薬学的に許容し
うる誘導体もしくは本発明組成物を患者に投与すること
から成る、動’ａ（＠にヒトおよび家畜）における細菌
感染症の治療方法を提供する。

本発明による生産物は、ヒトまたは動物用医薬として有
利な方法で投与するために１他の抗生物質から類推して
製剤化される。

本発明の生産物は例えば経口、局所または非経口のよう
な経路で投与するため（製剤化することができる。本組
成物は例えば錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、ロゼン
ジ剤、クリーム剤、シロップ削、または液体実刑Ｃ例、
溶液剤または懸濁剤）の形であり得、これらは経口投与
のために１あるいは注射またはｌ！４ｉ液による非経口
投与のために無菌状態で製剤化されろ。

経口投与用の錠剤およびカプセル剤は単位投与形態をし
ており、そして慣用の賦形剤、例えば結合剤ｆ例、シロ
ップ、アラビアゴム、ゼラチン、ンルビトール、トラガ
カントまたはポリビニルピロリドン）；充填剤Ｃ例、乳
糖、ショ糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム
、ンルビトールまたはグリシン）；錠剤用滑沢Ｉｌｌ　
（例、ステアリン酸マグネジ９ム、メルク、ポリエチレ
ングリコールまたはシリカ）：崩壊剤Ｃ例、ジャガイモ
デンプン）：および製剤学的に許容しうる湿潤剤１例、
ラウリル硫酸ナトリウム）を含むことができる。錠剤は
一般的な展剤分野でよく知られた方法により被覆しても
よい。

経口液体展剤は例えば水性または油性懸濁剤、溶液剤、
乳剤またはエリキシル剤の形態をしており、あるいは使
用前に水または他の適当なビヒクルで再調製される乾燥
製剤として提供されてもよい。この種の液体製剤は慣用
の添加剤、例えば懸ｆｆｉ化削ｒ例、ンルビトール、メ
チルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒド
ロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは水素化食用脂）
；乳化剤Ｃ例レシチン、ソルビタンモノオレエートまた
はアラビアゴム）；非水性ビヒクルＣ食用油を含む）１
例、アーモンド油、グリセリンのエステルのような油性
エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコー
ル）：防腐剤Ｃ例、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまた
はプロピル、もしくはンルビン酸）；および所望により
、慣用の香味削および着色剤を含むことができる。

局所投与を意図した本発明組成物は、例えば軟膏、クリ
ーム、ローション、眼軟膏、点眼削、点耳削、含浸包帯
およびエーロゾル剤の形態をしており、そして適当な慣
用添加剤、例えば防腐剤、薬物の浸透を促進させる浴剤
、および軟膏やクリーム中の皮膚軟化剤を含むことがで
きる。このような局所製剤はさらに相溶性の慣用担体、
例えはクリームまたは軟膏用の基剤、およびローション
剤用のエタノールまたはオレイルアルコ−Ａ・を含んで
いてもよい。この種の担体は組成物の約１〜９８重量％
を占めることができ、より一般的にはそれらは組成物の
約（資）重量％までを占めるであろう。

本発明による組成物は、慣用の座剤用基剤ｃ例、カカオ
脂または他のグリセリド類）を含む座削として製剤化す
ることができる。

非経口投与を意図した本発明組成物は、有利には活性物
質と無菌ビヒクルＣ水が好適である）を用いて調製しう
る液状単位投与形態をしている。

活性物質は、用いるビヒクルおよび濃度１応じて、ビヒ
クル中に懸濁または溶解されろ。溶液剤を調製する場合
は、活性物質を注射用水１−Ｔ溶かし、濾過滅菌し、そ
の後適当なバイアルまたはアンプルに充填して密封する
。有利には、局所麻酔剤、防腐剤および緩衝剤のような
慣用添加剤をビヒクル中に溶解させる。溶液剤の安定性
を高めるために１バイアルに充填後組成物を凍結して、
水を真空下で除去してもよい。得られた凍結乾燥粉剤は
そσつ後バイアル中に密封され、そして使用前に液体を
再調製するための注射用水のノくイアルと−ｇｋ供給さ
れる。非経口懸濁剤は実質的１同じやり力で調製しうる
が、活性物質をビヒクル中に溶解する代わりに懸濁し、
そして濾過滅菌を行うことができないので、活性物質を
エチレンオキシドにさらすことにより滅菌し、その後で
無菌ビヒクル中（懸濁させる。有利（は、活性物質の均
一分布を容易にするために１懸濁剤中に表面活性剤や湿
潤剤が配合される。

本発明による生産物は適切（は抗菌的に有効な脩で患者
に投与される。

本発明組成物は、投与方法に応じて、Ｃ組成物の全重量
に基づいて）少なくとも０．１重量％、好ましくは１０
〜６０重曾チの本発明主産物を含むのが好適である。

本発明生産物は適切には１．０〜５０Ｍｌ９／ｋｇ（体
重）の１日分の投与量で患者（投与される。大人【体重
約７０　ｋｑ　）　ｈ：対しては、５０〜３０００■Ｃ
例え瘉ゴ約１５００　ｍｙ　）の本発明生産物を毎日投
与しうる。適当には、大人の投与量は５〜２０■／に９
／日である。

しかしながら、これより高い投与量もこれより低い投与
量も一般的な臨床上の慣習に従って使用することができ
る。

本発明組成物が単位投与形態で提示される場合、各単位
用量は２５〜１０００■、好ましくは５０〜５００■の
本発明生産物を含有するのが適当である。

以下の実施例は本発明による生産物の製造を例示するも
のである。

〔実施例〕

実施例１ ａ）発酵 培養ＩＲＮＣＩＢ　４００８９はマツカートニー　（Ｍ
ａｃａ−ｒｔｎｅＹ　）びん中の固形寒天斜面培地上で
２６℃（おいて７日間増殖させた。寒天培地は次の組成
を有していた： 酵母エキス 麦芽エキス デキストロース 寒天 脱イオン水 ４．０ １０．０ ４．０ ２０．０ 全量１リツトルとする 〔上記成分はすべてＤｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌ
ｅｓｅＰ、Ｏ。

Ｂｏｘ　１４ＢｕＣｅｎｔｒａｌ　ＡｖｅｎｕｅｓＥａ
ｓｔ　Ｍｏ１ｅａｅｙ＃５ｕｒｒｅｙがら供給される”
　Ｂａｃｔｏ　’製品（Ｂａｃｔｏは商標名である）で
あった。〕培地は滅菌前＆ｒ：ｐＨ７，３に調整した。

マツカートニーびん中のＮＣＩＢ　４００８９寒天培養
物ｉｆｆ　Ｏ，０２％トリトン関を含む滅菌水１０！Ｒ
Ｉを加え、表面をワイヤループでこすることによって胞
子懸濁液を調製した。この胞子懸濁液の一部（２１１１
）を用いて、５００Ｉｎ１円錐形フラスコ中の播種培地
１００　＃Ｌ／に接種し、綿ガーゼで栓をした。

その後、旋回振盪器上２４０　ｒｐｍ　ｓ　２８　’Ｃ
で７２時間発酵させた。

発酵培地１５１は、０．１％消泡剤ポリプロピレンクリ
コールＰ　２０００と共（、加リットルのバッフル付き
発酵槽中で１２１℃にて１時間滅菌した。発酵槽は３枚
の羽根車を備えた攪拌機を用いて２００ｒｐｍで攪拌し
、そして０．５容１１／容量／分で無曲の空気を吹き込
んだ。播種段階からの増殖期接種物２００−を用いて発
酵槽に接種し、その後２８℃で４日間インキュベートし
た。全体を通して０．５バールの空気圧を維持した。発
酵物は４日後に収穫し、遠心により澄明化した。

播種培地と発酵培地は同じ組成を有しており、次の成分
を含んでいた： 大豆粉　　　　　　　　１０．０ グリセロール　　　　　２０．０ マルトース　　　　　　　２．０ ＣａＣ１＊　ｅ唐ＨｔＯＯ，００５ 微量元素溶液　　　　　１（Ｈｌ 脱イオン水　　　　全量１リツトルとする微量元素溶液
は次の成分を含んでいた：成分　　　−唐（９／ｌ＞ ＣａＣ１暑、２Ｈ１０１０，０ ＭｇＣ１雪、６ＨｓＯ１０，０ ＮａＣＡ！　　　　　　　　　　　　　　１０，０Ｆｅ
Ｃ１ｓ　　　　　　　　　　　　　　３，０ＺｎＣＪ１
　　　　　　　　　　　　　０，５ＣｕＣ１ｚ、２Ｈｓ
０　　　　　　　　０，５Ｍｎ５Ｏａ、４Ｈｚ０　　　
　　　　　０，５培地はｐＨ７，３に調整した後、１１
７℃で１５分間滅菌した。ｆ大豆粉はＡｒｋａｄｙ−Ａ
ＤＭ＊Ｍａｎｃｈｅｇｔｅｒ＋ＵＫから供給されるＡｒ
ｋａｓｏｙ’５０’であった。）ｂ）　　ＭＭ４９７２
８の分離 ＆）に記載したように実施して収穫した溌明化培地のア
リニー）５１Ｇ’！１））１７．ＯＩ！：調整し、そし
て（０，５９リツトｋ　）　Ｄｉａｉｏｎ　ＨＰ　２０
カラムに入れた。

（ＨＰ２０は東京の三菱化学工業から供給された。）こ
のカラムを脱イオン水ｌｌで洗い、その後０．１Ｍアン
モニア中の５０ｑｂプロパン−１−オールで溶出した。

１６ＩＲｉ画分を集めた。抗菌活性を有する画分子２３
−４０）を合わせて真空濃縮した。この濃縮溶液に０．
０５　Ｍ　ＮａＨｇＰＯｉを加えて全量を１１とした。

その後、この溶液は０．０５　Ｍ　ＮａＨｘＰＯ４’　
ｌ！（６，４）であらかじめ平衡化したＣ１リットル）
ＣＭセファデックスＣ２５カチオン交挨カラム（Ｎａ　
　形）に加えたｏ　ｒＣＭセファデックスはＰｈａｒｍ
ａｃｌａ　Ｌｔｄ。

Ｕｐｐｓａｌａ＊Ｓｗｅｄｅｎから供給された。）この
カラムを０．０５　Ｍ　Ｎ！ＬＨＩＰ０４　（聞７．０
　）　１１で洗い、次いで０．０５　Ｍ　ＮａＨｇＰＯ
４’　［）Ｈ７，０）から０　、２　Ｍ　Ｎａ耶ＰＯ４
ｒｐＨ９，５）までの指数勾配を用いて溶出したＣ混合
容器中ｓｏｏｍ）。２０Ｒ１の両分を集めた。抗菌活性
は画分２−４ＯＣ検出され、これらの画分を一緒（合わ
せた（　０，７５１　）。

合わせた両分はｐ！−１７，０でＤ−丁うニルーＤ−ア
ラニンセファロースアフィニティー樹脂と共１１時間攪
拌することｋより無機不純物を除去した。

アフィニティー吸着剤は活性化されたαセファロ−、ｘ
４ＢｃＤ−アラニル−Ｄ−アラニンヲ固定化することｋ
より作製したＣ６−アミノヘキサン酸活性化セファロー
ス４ＢはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、ｅＰｏ
ｏｌｎ＊Ｄｏｒｓｅｔから得られた）。この混合物はガ
ラス漏斗を用いて濾過し、Ｐ液を捨てた。アフィニティ
ー樹脂は脱イオン水１１ＧｃＭ濁し、前のように濾過し
た。樹脂を脱イオン水（２Ｘ８００ｒＲＩ）で洗った後
、５１）％アセトニトリルを含む０．Ｉ　Ｍアンモニア
（４Ｘ　２００ｔｊアリコート）で溶出した。溶出画分
は減圧下で蒸発させ、抗菌活性を有するものを凍結乾燥
して１０３■のＭＭ４９７２ｇを得た。

ＭＭ４９７２８は３，９　ｒｒｔｓ　Ｘ　３００　ｍ　
Ｗａｔｓｒｓ　μｂｏｎｄａｐａｋＣ１ｌ逆相カラムを
用いる高性能液体クロマトグラフィーにかけ、２５チア
セトニトリルを含む０．ＩＭＮａＨｔＰＯｎ　’　ｐＨ
６，０）を用いて２１１Ｌｔ／分の流速で溶出した。溶
出物は２２０　ｎｍ　でのＷ吸光度について監視した。

これらの条件下において、ＭＭ４９７２８は１８．１分
の保持時間を有していた。

ＭＭ４９７２８の性質 ＦＡ、Ｂ　Ｘ量スペクトルは分子９１９６８±２および
１９８２±２１１：対応する２つのイオンの存在を示し
た。

本質的に実施例１のようｋして得られた物質の抗菌活性
はマイクロタイター法により調べた。全ての生物に対し
て０ｘｏｉｄ　ｍ　２培地（０ｘｏｌｄ　Ｌｔｄ。

Ｗａｄｅ　ＲｏａｃＬＢａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ＋Ｈａｍ
ｐｓｈｉｒｅ＋ＵＫ、から供給された：　０ｘｏｉｄは
商標名である）を用いたが、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ種はＴｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔ培地（０ｘｏｉｄＬｔｄ
、から供給）を用いて試験した。接種物は１０倍に希釈
した一晩培養物であった。マイクロタイタープレートは
３７℃で冴時間インキュベートした。

結果を表１（示す。

表 論多重耐性Ｃメチシリン、テトラサイクリン、エリスロ
マイシンおよびゲンタマイシン耐性）丁フイニテイー吸
着削の炸裂 ６−アミンへキサン酸セファロース４ＢＯ）Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル印ｇをガラス漏斗上に置き
、１ｍＭ塩酸溶液２１を用いて吸引しながら洗浄した。

湿ったケークをその後０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液
６０ＩＩＬｔ中のＤ−アラニル−Ｄ−アラニア１．５ｇ
の溶液（加え、その次の時刻の間中ときどき振とうした
。この懸濁液を吸引炉遇し、残留物は０．Ｉ　Ｍ　）リ
ス「ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲｌ５　）　
１００　ｄ中に１時間懸濁し、その後ガラス漏斗を通し
て再度濾過した。ケークは順次０．Ｉ　Ｍ炭酸水素ナト
リウム溶液、０．０５ＭＴＲｌ５　（０，５Ｍ塩化ナト
リウムを含む）、０．０５　Ｍホルメート緩衝液ｐＨ４
，０（０，５Ｍ塩化ナトリウムを含む）および最後ニ蒸
留水で洗った。アフィニティー樹脂はその後水性懸濁液
として４℃で保存した。

実施例２ ａ）発酵 すべての播種および生産段階は実施例１ａ［記載した通
りの液体培地を使用した。液体窒素下で２０４グリセロ
ールおよび１０チラクトース中（保存した培養物ＮＣＩ
Ｂ　４００８９の増殖期細胞懸濁液１Ｎを用いて、５０
０！ｎ１円錐形フラスコ中の発酵培地１．００　＃１７
Ｎ接種し、プラスチックフオームの栓をした。振盪器上
２４０　ｒｌ）ｍ　ｓ　２に３℃で７２時間インキユベ
ートシた後、新鮮培地１００耐を含む５００１１１１円
錐形フラスコに４ｍ！了りコートを移した。これらは２
４０　ｒｐｍ　ｓ　２８℃でさら（４８時間インキュベ
ートした。

発酵培地１５１は、０．１’％消泡削ポリプロピレング
リコールＰ　２０００と共ニ、加リットルのバッフル付
き発酵槽中で１２１℃において（イ）分間その場で滅菌
した。発酵槽は滅菌および培養の間中３枚の羽根車を備
えた底部駆動攪拌機（よって２０Ｏｒｐｍで攪拌した。

第二段階播種フラスコからの増殖期無Ｙｆ４濾過空気を
０．２３容量／容ｉ／分で発酵槽に吹き込み、そして全
体を通して０．５）（−ルの空気圧を維持した。

発酵槽は５０１部ずつ収穫し、５　Ｍ　ＮａＯＨを添加
してｐＨ１０，９に調整した後、遠心分離した。得られ
た上清は５　Ｍ　ｌ−ｌＣｌを添加してｐＨ６〜８に調
整した。

ｂ）グリコペプチド橡合体の分離 中和した澄明化培地２７０１はＤｉａｔｏｎ　ＨＰ　２
０の２２４カラムに１１／分の流速で加えた。このカラ
ムを脱イオン水３０１で洗い、浸出物と洗液を捨てた。

活性物質は５０チブロバンー２−オールを含む０．１Ｍ
アンモニアによりカラムから溶出した。ｌ１画分を集め
た。抗菌活性を示す画分（１６−３５）を合わせ、真空
蒸発させて８．８１とした。

水性濃縮物８．８ノはブタン−１−オール４．５１と混
合し、０，１Ｍ塩酸の添加により…３．０に調整した。

相を電力分離し、下部水相を除去した。上部溶媒相およ
び混合相は遠心分離し、溶媒相を吸引により回収した。

この溶媒相４．５１を等ｉｔσ）脱イオン水と混合し、
０．Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨの添加により−１０，０に調整し
た。相を重力分離し、水相４．７１を０、Ｉ　Ｍ　ＨＣ
ＪでＩ）！（７，ＱＮ調整した。水相はゼラチン状の析
出物が生ずるまで真空濃縮し、濾過により析出物を分離
した。この析出物は脱イオン水（再ｉ濁Ｌ、５４１フイ
ルターベーパーを用いて再濾過した〔フィルターはＷｈ
ａｔｒｎａｎ＊　Ｓｐｒ　ｉｎｇｆ　１ｅｌｄ　Ｍｌ　
ｌ　１　＋Ｍａｉｄ、ｓｔｏｎｅｐＫｅｎＬＥｎｇｌａ
ｎｄにより供給された〕０合わせた炉液６．３１はＤ−
アラニル−Ｄ−アラニン−セファロースアフィニティー
樹脂（ｆＷｆ１４容量３５０　ｍｌ　）と共ＧＣ１時間
攪拌した〔アフィニティー樹脂は実施例１に記載した通
りに作製された〕。

この混合物は先（述べたように処理して溶出物を得、き
わせだ溶出物を真空蒸発させて水性濃縮物２．３１を得
た。

アフィニティー浸出物７．４５１は上記のようにアフィ
ニティー吸着剤３５０−で再処理し、追加の水性濃縮物
２．５５１を得た。

合わせた濃縮物４，８５１は凍結乾燥してＭＭ５５２６
６゜ＭＭ５５２６７およびＭＭ５５２６８の混合物を含
むグリコペプチド複合体ＭＭ４９７２８を１５．２９得
た。

実施例３ 実施例２ｂのようにして得たＭＭ４９７２８２　ｇを…
８．０の５チメタノール／水４００１１中１溶解した。

この溶液を０．Ｉ　Ｍ　ＮａＨ雪ＰＯｎ　（ｐＨ６，０
）であらかじめ平衡化したＭｓｔｒｅｘ　Ｃｈ　ｓ逆相
シリカ（粒径間μｍ。

孔径６０Ａ）の２７０＃Ｉ７カラム（加えた（　Ｍａｔ
ｒｅｘはＡｒｎ１ｃｏｎｅＵり１）ｅｒ　Ｍｉ１１＋５
ｔｏｎｅｈｏｕｓｅｓＧ１ｏｕｃｅａｔｅｒｓｈｉｒｅ
＋Ｅｎｇｌａｎｄから供給された〕。

このカラムは平衡化緩衝液５ＯＮで洗い、次（１５チア
セトニトリルを含む上記緩衝液５００　ｍｔおよび２０
φアセトニトリルを含む上記緩衝液５００　ｒｎｔを用
いて１５ｍ１／分で浴出した。これらの浸出物、洗液お
よび溶出物は捨てた。２５％アセ）　ニドＩＪ　Ａ含有
緩衝液を用いて溶出を続け、２０１＋１７画分を集めた
。

これらの画分は３，９　Ｘ　１５０　ｒｍ　Ｗａｔｅｒ
ｓ　Ｎｏｖａｐａｋ（’ＩＩ逆相カラムを用いるｆ（Ｐ
ＬＣｃかけ、２５チアセトニトリルを含む０．Ｉ　Ｍ　
ＮａＨｓＰＯｎ　（ｐＩ″ｉ６ｓ＋０　）　ｈ：より２
　ａｔ　７分の流速で溶出した。浴出物は２２０　ｎｍ
でのＵＶ吸光度について監視した。これらの条件下で、
ＭＭ５５２６６は４．４分の保持時間を有していた。

ＭＭ５５２６６を主（含む画分（２９−４０＞を合わせ
、真空蒸発させて１６０ｍ１とし、Ｄｉａｌｏｎ　ＨＰ
　２０の６０　ｒｎｔカラムに４ＲＩ１分の流速で加え
た。このカラムは脱イオン水１４０縦で洗い、浸出物と
洗液を捨てた。

カラムは５０％メタノール２４０１／で溶出し、溶出物
を１０８ｍｊになるまで真空蒸発させた。

この水性濃縮物をＮａＨｚＰＯ４の添加ぐよりＩ）Ｈ６
，５（調整し、そして０．０５　Ｍ　ＮａＨｔＰＯ４’
　ｐＨａ、ｏ　）であらかじめ平衡化したＤｙｎａｍａ
ｘ　１５０−　Ａ分離相ＨＰＬＣカラム（ｔｏ　Ｘ　３
００　ｗ　＊　Ｃ＋ａ逆相シリカの１２μｍ粒子を使用
）に加えた〔カラムはＲａ１ｎｉｎ　Ｉｎｓ−ｔｒｕｍ
ｅｎｔ　Ｃｏ＋Ｗｏｂｕｒｎ＋ＭＡｐＵＳＡから供給さ
れた〕。

このカラムは平衡化緩＠ｇ１．２０　ｒｎｔで洗い、プ
ログラム化勾配のアセｌ−二）リルを含む緩衝ｉ’！！
［より５　ｍｌ　７分で溶出した。溶出物は５　ｒｎｔ
両分として集めた。２分から１２分まで、アセトニトリ
ル含有量ニトリル含有歇を２７％に増加させた。各画分
は上記のようなＮｏｖａｐａｋを用いるＨＰＬＣにより
監視した。ＭＭ５５２６６含有画分子８４−９６）を合
わせ、４５戯に真空蒸発させた。

この水性濃縮物はＤ−アラニル−Ｄ−アラニン−セファ
ロースアフィニティー樹脂ｒ湿潤容−１１ｔ８Ｎ）と共
に１時間攪拌した〔アフィニティー樹脂は実施例１に記
載の通りに炸裂された〕。この混合物を先１述べたよう
（処理し、合わせた溶出物を真空蒸発させ、凍結乾燥さ
せて１３０■のＭＭ５５２６６を得た。

ＦＡＢ質量スペクトルは１９６８士１の分子量に対応す
る分子イオンを示した。

実施例４ ＭＭ５５２６７複合体の分離 実施例３に記載した分離用ＨＰＬＣ操作はＭＭ５５２６
７含有画分子６含有画分子音８もたらし、これらの両分
を一緒に合わせて、２５ｍ１に真空蒸発させた。

ｍ５５２６７は上記のようなＮｏｖａｐａｋカラムを用
いるＨＰＬＣｃより監視した。これらの条件下でＭＭ５
５２６７は４０分の保持時間を有していた。

この水性濃縮物はＤ−アラニル−Ｄ−アラニンーセワア
ロースアフイニテイー樹脂（ａ＠容ｔ２ｍ、ｔ　）と共
に１時間攪拌した〔アフィニティー樹脂は実施例１（記
載の通りに炸裂された〕。この混合物を先に述べたよう
に処理し、合わせた溶出物を真空蒸発させ、凍結乾燥さ
せて２５１１＃９のＭＭ５５２６７を得た。

ＦＡＢ質猾スペクトルは２１９０±１および２２０４士
１の分子量に対応する２つの分子イオンＣそれぞれＰｖ
Ｍ５５２６７　／　１および＆ＩＭ５５２６７／２と呼
ばれる）の存在を示した。

実施例５ 実施例２ｂのようにして得たＭＭ４９７２８２　、Ｖを
…８．０の水２００ｍ１中に溶解し、５４２フイルター
ペーパーを通して濾過した〔フィルターはＷｈａｔｍａ
ｎｙＳｐｒｔｎｇｆｉｅｌｄ　ＭｉｌｌｓＭａｉｄｓｔ
ｏｎｅ＋ＫｅｎｔｐＥｎｇｌａｒ＋ｄから供給された〕
。得られた固体を水に再懸濁し、再濾過し、合わせたＦ
液５００ｍ１を得た。

この溶液はあらかじめ０．０５　Ｍ　Ｎａｔ４ｔＰＯ＋
　（ｉ４６．０　）で平衡化したＭａｔｒｅｘＣ１ｓ逆
相シリカＣ粒径逆相シリカ１孔径−人）の２７０ＩＩＬ
ｔカラムに加えた。

カラムは平衡化緩衝液２００　＃Ｉ７で洗い、次に２０
チアセトニトリル含有緩衝液３００耐を用いて１６Ｒ１
／分で溶出した。これらの浸出物、洗液および溶出物は
捨てた。その後、２５チアセトニトリル含有緩衝液を用
いてヤ出を続け、１ＧＩＬｔ画分を集めた。

各画分は上記のようなＮｏｖａｐａｋカラムによるＨＰ
ＬＣで監視した。これらの条件下で■５５２６８は９．
２分の保持時間を有していた。

ＭＭ５５２６８含有画分（８５−１２０）を合わせ、真
空蒸発させて１６０Ｍとし、これをＤｉａｉｏｎ　ＨＰ
　２０の１ｍｌカラムに４絨／分の流速で加えた。この
カラムは脱イオン水２００威で流込、浸出物と洗液を捨
てた。その後、カラムは５０％メタノール／水２００１
ｉｊで溶出し、この溶出物を捨て、液後にメタノール２
５０　ＩＩｔｉで溶出した。メタノール浴出物は脱イオ
ン水２００　＃！７と混合し、１５５１１ｔ７１．：真
空蒸発きせた。生じた白色沈殿物を戸数し、脱イオン水
に溶かした１、その後、合わせた溶液をＣＦ’／Ｆガラ
ス繊維フィルターを通して戸遇し〔フィルターはＷｈａ
ｔｍａｎから供給された〕、凍結乾燥して４８８■のＭ
Ｍ５５２６８を得た。

ＦＡＢ質量スペクトルは１９８２±１の分子量ｃ対応す
る分子イオンを示した。

検出方法 ａ）発酵試料およびカラム画分は、通常のホール・イン
・プレート（ｈｏｌｅ　ｉｎ　Ｐｌａｔｅ　）法を用い
て１黄色ブドウ球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｕｒｅｕｓ　）Ｖ　５／３に対するバイオアッセイに
より抗菌活性について調べた。

ｂ）　　ＭＭ５５２６６　、　ＭＭ５５２６７およびＭ
Ｍ５５２６８は２８０ｎｍｋＴおいて特徴的なＵＶ最犬
値を有する。精製した試料はこの吸光度の直接測定を用
いて検定することができる。

ＭＭ５５２６６　、　Ｍｌｖ１５５２６７およびＭＭ５
５２６８の抗菌活性は実施例１ｂ（記載したようなマイ
クロタイター法により測定した。

結果を表２．３および４に示す。

謝多重耐性Ｃメチシリン、テトラサイクリン、エリスロ
マイシンおよびゲンタマイシン耐性）表 （ＭＩＣμ、！ｉ＋／１４ｉ ＭＩＣμ９／廚 謄多重：耐性Ｃメチシリン、テトラサイクリン、エリス
ロマイシンおよびゲンタマイシン耐性）給多重耐性Ｃメ
チシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシンおよび
ゲンタマイシン耐性）同定データ Ｊ７．３Ｈｚ　）、５．３９ｆｆ　１１４．ｄ、Ｊ７．
５Ｈｚ　）、５．３３ｒ　ＩＨ。

ＦＡＢ−兇【グリセロール／チオグリセロ−／Ｉ−／酢
酸） ＭＩｒ′″１９６９±１ 分子量：　１９６８ 分子式：　Ｃ５ａＨｓｓＮｓＯｘｓＣ／　ｇＩＪＶ　（
ＨｚＯ）λｍａｘ　２８０１ｍ　（ａ　８６．８０　）
’ＨＮＭＲ（３５３＠にでＤＭＳＯｄｓ　：内部標準と
してテトラメチルシラン） δＨ８，６０（ｉｍｐ　ｄ　−Ｊ６Ｈｚ　）　ｅ　８．
１２　ｒ　ＩＨｌｄ、Ｊ６．４’Ｈｚ　）７．８０（１
１（−ｓ　Ｌ　７．７２ｆＩＨ，ｄ−Ｊ９．４Ｈｚ　）
ｔ　７．５０（］椙、巾広ａ、）　１７．４６ｒ　ＩＨ
−ｄ−ＪＩ　０．６Ｈｚ　）ｅ　７．３８ｒＩＨ−ｄ、
Ｊ２Ｈｚ）＃７．３５ｒｌＨ，ｄ、Ｊ７．５）ＴＺ）、
７．２８ｒｌＨ＃ｄ、Ｊ８．５Ｈｚ）−７，２５ｒｌＨ
１ｄ、Ｊ２Ｈｚ）＋７．２０ｒｌＨ−ｄ、Ｊ８．２Ｈｚ
Ｌ７．１３（ＩＴ−Ｉ、ｓ）、７．０１ＩＨ，ｄ、Ｊ９
．９Ｈｚ）、６．８２ｒｌＨ，ｄ、Ｊ２．１Ｈｚ）、６
．７８ｒｌＨ，ｄ、ＪＩＨｚ）、６．５９（２Ｈ，重複
ｍＬ　６．４１　（１）Ｉ＃　ｄ　、　Ｊ２．０）ｌｚ
　）　１６．３７ｒｍＨ，ｄ、Ｊ２Ｈ１）、６．１ｒｌ
ＨＩ巾広ｄ）、６．０７ＮＨ−ｄ−ＪｌＯ，６Ｔ（ｚ）
＋５．８１（ＩＨｌｓ）＋５．６９（’１１１．ｄ−Ｈ
ｚ）、５ｊｌｒｌＨ，ｓ）、５．０８ｒｌＨ，ｒｎ）、
４．５３ｒｌＨ。

ａ　、　Ｊ　６．２Ｈｚ　）　、　４．４．１　（２Ｈ
，重複ｄ）、４．３３（ＨＬ　ｓ）。

４．１２ｒ　ＩＨＩｄ、Ｊｌ　１．ＩＨｚ　Ｌ　３．９
２ｒ　ＩＨ９ｍ）　１３．７−３．０（重複シグナル）
、２．３８ｒ３Ｈ，ｓ）、２．］７ｒ２Ｈ，ｍ）１．５
Ｏｒ２Ｈ，ｍ）、１．２５ｒＣＨｚエンベロープ）　ｔ
　ｏ、ｇ　ｓ　ｒ　６Ｈ。

ｄ　、Ｊ６．６Ｈｚ　）ｐ　。

ＨＰＬＣ：上記の通り ＭＭ５５２６７の物理的および分光学的特性ＦＡＲ−Ｍ
ＳＩ’グリセロール／チオグリセロール／酢酸） Ｍ）（＋２１・９１士１および２２０５±１分子量：　
２１９０および２２０４ Ｉ（ＰＬＣ：上記の通り ＦＡＢ−ＭＳｒジチオトレイト−３／ジチオエリトリ　
　ト　−　ル　） ＭＮａ＋２００５±１　：　ＭＮａｔ＋２０２８±１分
子量：１９ｇ２ ＨＰＬＣ：上記の通り

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）明細書中で定義する通りの物質ＭＭ４９７２８、
   ＭＭ５５２６６、ＭＭ５５２６７／１、ＭＭ５５２６７
   ／２またはＭＭ５５２６８。
2. （２）式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、ＲはＣ＿８Ｈ＿１＿７である）で表される化合
   物。
3. （３）実質的に純粋な形態である、請求項１または２記
   載の物質または化合物。
4. （４）生産用微生物を培養し、その後培養物から請求項
   １〜３のいずれか１項記載の物質または化合物もしくは
   その誘導体を単離することから成る、上記の物質または
   化合物の生産方法。
5. （５）微生物は￥アミコラトプシス種￥（Ａｍｙｃｏｌ
   ａｔｏｐ−ｓｉｓｓｐ．）ＮＣＩＢ４００８９またはそ
   の突然変異株である、請求項４記載の方法。
6. （６）生物学的に純粋な形態の￥アミコラトプシス種￥
   ＮＣＩＢ４００８９またはその突然変異株。
7. （７）抗菌的に有効な量の、請求項１〜３のいずれか１
   項記載の物質または化合物、もしくはその薬学的に許容
   しうる誘導体を、製剤学的に許容しうる担体または賦形
   剤と共に含有する薬剤組成物。
8. （８）治療に用いるための請求項１〜３のいずれか１項
   記載の物質または化合物、もしくはその薬学的に許容し
   うる誘導体。
9. （９）細菌感染症の治療に用いるための請求項１〜３の
   いずれか１項記載の物質または化合物、もしくはその薬
   学的に許容しうる誘導体。
10. （１０）細菌感染症の治療用医薬を製造するための請求
    項１〜３のいずれか１項記載の物質または化合物、もし
    くはその薬学的に許容しうる誘導体の使用。