PT92667B

PT92667B - Processo para a producao de novos complexos de antibioticos glicopeptidicos

Info

Publication number: PT92667B
Application number: PT92667A
Authority: PT
Inventors: Nigel John Coates; Chel Sykes; Christopher John Davis; Lawrence Mary Curtis
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1995-09-12
Also published as: JPH02225499A; PT92667A; GB8830225D0; EP0375448A2; DK657289D0; CA2006437A1; DK657289A; EP0375448A3

Description

U p r — : ι te χ Γι V ei 110 Γ e 1 e.'._ X^;_J. i a ”::-e ΟίΓί Ρ! υ V Οξ antibacteriamamente activos que se podem obter a. partir de um diicroorganisfflo, com processos para a sua produção, e com a sua utilização farmacêutica.

Um grande número de microorganismos Toram isolados apartir da natureza e alguns destes microorganismos revelaram produzir vários metabo1itos, os quais podem ser isolados e alguns dos quais apresentam actividade antibacteriana útil. Um desses metabolitos é uma substancia que foi designada como MM 49728. Pensa-se que é um novo complexo de compostos q1icopeptídicos e verificou-se ter uma actividade antibactariana útil.

presente invento consequentemente proporciona, a substância MM 49728.

nova

A s u b s t â n c i a Μ M 4 9C l‘S a.presen rarac terí stica.s que íe i>tíuuemi

Ci) pode set ubtida por cultura de- um microorqanismo do qénero A m y c o 1 a t ο ρ s i s ;

Cii) e- c om μ· 1 e χ ο mel u qu. a. 11 o s-u bs-1 an c i as que f or a m des í qnad as

ÍMM X ζ-_τή'vl cr e. !_ -I ί·.Ί.·.'Ί ΕΓΕΓ·- /~T — .,-.1-. — — __ t II ι — ‘-i, ι ll ie-_#x.o / / ί , ι iij -x-_jx.ò / / χ , e ι κι , e

Ciii) apresenta actividade antibacteriana contra o 51 a ρ h11oc oc c u s •a lí r e lí -3 5 7 3 „

PpnC.

•eferidos MM 55266, ΜΜςοΣ’67/1 , MM dos 3.Q’ji 3. sequir na seccão exoeriroente 1

LíiTíLí d 3? 1-3.3- LLTi OLltr<

-3.' *j C ^!Õ? C Έ O Q O 1 Π ν Ρ⁷' Π L i j li.n t3.men te c oσι

3. SLÍ3.

F'ens;

que

c o m o cí s c o :am fflU i <

H

MO M em que R ê ^e pede existir em mais de uma forma isomérica.

Um outro aspecto do invento proporciona assim um composto com a. fórmula (I), tipicamente coma uma. mistura de isómeros„

Uada um de entre MM 5526//Ί, MM considerado como consistindo num composto pode existir sob a forma de uma mistura de

552Ó7/2 e MM 55 q 1 i cc?pep t id i c o o qua 1

a. u ff: processo ρ a. r a e s u. b s e q u. e π t e me n t e

u. ί η q r o c .ξ- s s c ϊ p a. r $.

□ presente invento também proporcion a produção de uma substância ou composto do in de a. cultura, de um microorça.nismo orodutor presente invento oroporciona ainda ccmjoreende a separação da substância ou do com posto ou. d 5? Ufí!

derivado de uma sua solução em mistura com ou.iras substancias adsorção numa resina com afinidade.

rt exp: eSaso xunura ·.e ubrivàaus> uessd exp? como é aqui utilizada significa o crescimento aeróbico deliberado de um organismo na presença ds fontes assimiláveis ds carbono, azoto, enxofre e sais minerais. Esse crescimento aeróbico pode ter lugar num meio nutritivo sólido ou semi-sólido, ou num meio líquido em que os nutrientes são dissolvidos ou suspensos. A cultura, pode tsr lugar numa superfície aeróbica ou por meio de cultura submersa. □ meio nutritivo pode ser composto por nutrientes complexos ou pode ser definido quimicamente.

Verificou-se qu.e microorçanismas apropriados para utilização no processo de cultura de acordo com o invento incluem estirpes bacterianas pertencendo ao género Amycolatopsis que sao capazes de eiabcrar dí'! 49/Ç'ó. VsriTictíou-ss smda que u.m exemplo de uma tal estiroe é so. NCIB 40089 e também seus mutantes, os q u ci .1 s ρ u li e m oa r tr ureza.

A expressão “mutante tal como é aqui usada inclui qualquer estirpe mutante que aparece expontãneamente ou através do efeito de um aqente externo quer o aoente seja aplicado d e 1 i b e r a d a m e n te ou de estirões mutantes incluindo iuaiquer outro modo. Métodos apropriad:

par a a o r o d u ç ã. o i n d i cad a s por em Radidtion and Radioisotopes for Industrial Microorganisms, Proceedings of a Simposium, Vianna, 1973, page 241, International Atomic tnerqy Authority, e estes incluem;

lu;

Lí Z Lí..

mais agentes ^: o t o se n s i ti i I i z a d o r e s ( por

K £?ÍH p 1 P

8-metoxipsoralen), ácido nitroso, hidroxilamina, bases pirimidina análogas (por exemplo 5-bromouracilo), acridinas, agentes de alquilação (por exemplo, qás da mostarda, sulfonato de eti1 —meta— c; ; ±u u l; -l i :idr lj ér! i lí , i en o i . f o r ma 1 o a i b ο » a. 1 u r , ε

Lo (ii > Técnicas oenéticas, incluindo , por exemplo, recombinaçSo, fusão protop 1 ástica. ε técnicas se 1 ectivas para mutantes expontâneos :

Pensa-se que Sp. NCIB 4O0S9 seja. uma. espécie não referida, anteriormente no género Amycolatopsis fazendo assim também ⁿ5rte de presente invento, particularmente na. sua. forma bio1óqicamente pura d e pu e 1.1 a. d a.

Natií ,o 11 ec t ίαn s o f

Industrial and Marins Bactéria Ltd. (N;C:I:B:), Aberdeen, Scotland sob o número 40Ô39 em 6 de Dezembro, 1983.

0 meio de fei	rmen ta.çã.o	nara a cnl	t u r a. d a s ρ .	NCIB	400
c o n tem a ρ ro ρ r i a d a, m e n t e	fontes de	c arbono	assimilável	e de	5ZO
a ss i mi 1 á ve I j un t amen te	COiT: 53-Íe	i η o r q S n i c	os. Fontes	a.propi	-iad

iiia. us 'x-i_í .nclusm extracto de levedura, far , 1 .-..-1.^rde carne, sementes de algodão, farinha. malte, aqentes soiúveis secos poiamónio e y1ucose, meio d nitrato de azoto. Fontes de carbono apropriadas incluem lactose, mal tose, amido e glicerol. Apropriadamente o i lóes de naioqén:

po:

íejTji ε ;< eiír i O {·“2 ta ) , (Ξ 1 2(·?S d t t? ΠΊβ.^Γ',θΞ Í O ) , d.SSÍr

A C LÍ 1 t Lí Γ :

ira de cerc r· O d €? 2 t? Γ E f 5l il· Lí 3 d 3.

apropriadamente ο ρ ri ad a.mente lente 20 y 30 até 7

u.m;

vantajosamente cerca de ·.? a O dias, após o início da fermentação a fim de dar origem a um rendimento óptimo do produto.

produto desejado ou um seu derivado podem então ser isolados a partir do meio ds cultura e manipulados s purificados usando técnicas convencionais para os compostos glicopeptídicos;. Todos esses processos de isolamento e de purificação podem ser convenientemente realizados a temparturas que vão do frio até & temperatura ambiente, por exemplo a uma temperatura variando entre 4 e 3õ^,;,c, convenientemente entre 20 e 25’^:'C.

□ produto desejado é geralmente obtido predominantemente a partir do filtrado da cultura, e é assim conveniente para o primeiro passo de isolamento envolver remoção do material sólido a partir do caldo de fermentação por, por exemplo, filtração ou centrifugação, para dar oriqem a um filtrado clarificado da cu 1 tura..

Posterior isolamento do produto desejado a parttir do filtrado da cultura clarificado pode convenientemente ser realizado por adsorção numa resina de afinidade tal como resina de afinidade D-a 1 ani 1 -D-a 1 anina-sefarose. 0 produto desejado pode ser rapidamente identificado de um modo rotineiro fazendo um teste quanto è. actividade antibacteriana e/ou por monitorização do tempo de retenção de c.l.s.p.

Apropriadamente, o processo de separação pode incluir um passo de cromatografia liquida de elevada performance, de preferincia constituindo o último passo, fi eluição pode ser efectuada usando NaH^F’0^ aquoso/acetonitri1 o„ ijsí produtos, de acordo com o invento são proporcionados apropriadamente numa forma substancialmente pura, por exemplo com pelo menos 50% de pureza, apropriadaraente com pelo menos 60% de pureza, vantajosamente ccm pelo menos 75% de pureza, de preferência com pelo menos 857. de pureza, com maior preferência com pelo menos 95% de pureza, especialmente com pelo menos 98% de pureza, sendo todas as percentagens calculadas como peso/peso. Uma forma impura ou menos pura de um produto de acordo com o invento pode, por exemplo, ser usada na preparação de uma forma mais pura do mesmo produto ou de um produto afim (por exemplo um derivado correspondente) a. ρ r ο ρ r i a. d ο ρ a r a u. t i 1 i z a ç ã o f a. r m a c ê u t i c a .

Os produtos do invento possuem propriedades antibacterianas e são úteis para o tratamento de infecçSes bacterianas em animais, especialmente mamíferos, incluindo seres humanos e animais domesticados (incluindo animais de lavoura). Os produtos podem ssr usados para o tratamento de infecções causadas por uma ampla série de organismos incluindo, por exemplo, os aqui mencionados.

íj presente invento proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um produto do invento ou um seu derivado farmacêuticamente aceitável juntamente com um veiculo ou. excipiente f a r m a c ê u. t i c a m e n t e a c e i t. á v e 1 .

presente invento proporciona também um método para o tratamento de infecções bacterianas em animais, especialmente eni seres humanos e em mamíferos domesticados, o qual consiste em administrar um produto do invento ou um seu derivado farmacêuticamente aceitável, ou uma composição de acordo com o invento, a Uni oue tinecessitando -desse tratamento.

ÍJs p roeu tos de -acordo com o invento podem ser formulados para administração em qualquer modo conveniente para utilização sai medicina humana ou outros antibióticos.

por analogia com

Os produtos de acordo com o invento podsm ser formulados para administração por qualquer via, por exemplo via oral, tópica ou parentêrica. As composições podem, por exemplo, ssr constituídas sob a forma de comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pastilhas, cremes, xaropes, ou preparações líquidas, por exemplo soluções ou. suspensões, as quais podem ser formuladas para utilização oral ou sob uma forma estéril para administração parentéri c a ρor injec ção ou infusão.

Comprimidos e cápsulas para administração oral podem apresentar-se sob a forma de unidade de dosagem, e podem conter excipientes convencionais incluindo, por exemple, agentes de ligação, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, ou polivini1pirrolidena; agentes de enchimento, por exemplo lactose, açúcar, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificantes para a formação de comprimidos, por exemplo estearato de magnésio, talco, polietilene glicol ou sílica; desin tegra·-tes, por exemplo amido de batata; e agentes de humidificação farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sulfato laurilo de sódio. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na prática farmacêutica normal.

As preparações líquidas orais podem apresentar-se sob a forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem apresemtar-se sob a forma de um produto seco para reconstituição com água ou com um outro veículo apropriado antes da utilização. Essas preparações líquidas podem conter aditivos convencionais, incluindo, por exemplo, agentes de suspensão, por exemplo sorbitol, celulose metílica, xarope cie glucose, gelatina, celulose hitíroxietí1ica, celulose carboximeti1ica, gel estearato de alumínio ou gorduras comestíveis hidroganadas; agentes de amulsificação, por exemplo lecitina, íiionooleato de sorbitan ou acacia; veículos não aquosos (os quais podem incluir óleos csoastíveis), por exemplo óleo de araertdoa, ésteres oleosos (por exemplo glicerina!, propilene glicol, ou álcool etί1ico5 preservativos, por exemplo p-hidroxibenzoato de metilo ou propilo ou ácido sórbico; e, se desejado, agentes de aromatização e ds coloração convencionais.

Composições de acordo com o invento que se pretende administrar tópicamente, podem, por exemplo, apresentar-se sob a forma de unguentos, cremes, loções, unguentos para os olhos.

gotas para os olhos, gotas para os nados, e aerosois, e podem conter priados, incluindo, por exemolo, auxiliem a penetração da droga, cremes,, Essas formulações tópicas: c c η v e nc,L onais com patί veis, ρo r ç unguento, e álcool etanólico ou veículos podem constituir de cerca da formulação; mais usualemnts ele: em peso da formulação.

ouvidos, revestimentos impregaditivos convencionais apropresarvativos, solventes que e emolientes em unguentos e podem também conter veículos xemplo bases para creme ou oleilico para loçSes. Esses de 1/i. a. coroa de ?SX em peso constituirão até cerca de 80%

Composições de acordo com o invento podem ser formuladas como supositórios, os quais podem conter bases convencionais para supositórios, por exemplo manteiga de cacau ou outros

Composições ds acordo com o invento cue se pretende administrar parentéricamente podem apresentar—se convenientemente sob formas de unidades de dosagem fluidas, as quais podem ser preparadas utilizando o agente activo e o veiculo estéril, sendo preferida a água,. 0 aqente activo, dependendo do veículo s da

MU

I o . A f i m	de aument	-5 Γ êi	estabi1	i d. í J cá
pode ser	conge1ada	dep	o is de	ser
-1 _ _ i . - uu -a apUa			ácuo; o	PÓ

concentração usaoa> pode ser ou suspenso ou dissolvido no veículo. Ao preparar soluções, o agente activo pode ser dissolvido em agua para injecção e esterilizado por filtração antes de ser introduzido num recipiente ou ampola apropriado, o qual é então selado. Vantajosaraente, aditivas con·-· eno iona is incluindo, por exemplo, anestésicos locais, preservativos, e agentes tampão podem ser dissolvidos no vel de da solução, a cooiposic? introduzida no recipiente, s liofilizado seco- resultante pode então ser selado no recipiente e um recipiente acompanhante de Aguai para injecção pode ser fornecido a fim de reconstituir o líquido antes da. utilização. Suspensões parentéricas podem sei- pre paradas substancialmente do mesmo lo o facto do agente activo ser suspenso no veículo ser dissolvido náo podendo zi esterilização ser realizada. poi- filtração. 0 agente activo pode de outro modo ser esteriexposição ai óxido cie etileno antes de ser suspenso no veículo estéril» Vantajosamente, um surfactante ou agente de humiditícação é incluído nessas suspensões a fim de facilitar uma distribuição uniforme do agente activo.

modo e;·	ι c e p
em vez	de
da por	f il
1 i Z 3 d O	por

Um pruuLíto de dLurdo lOiD u invsntu pude a.propriadaííiHi ι ta ser administrado ao doente numa quantidade antibacteríanamente (J m a c o m ρ o s i ç ã o d aproprj.adamente de tí, 1/1 em peso, de preferência ae peso, de um produto de acordo com o ρe so to t a 1 d a c om ρo siç áo), d epend end ο ιnventο ρode conter Ití a 6tí7. em invento (tendo como base o d o ro é t o d o d e a d m i n i s t r a ç a o .

Os produtos de mente sei- administrados 1,0 e utí mg/kg do peso uorn o invento podem aprooriada —u uuenue numa i co tr ·_ί χ /cí

ICÍ VÃi' 1. CtfjCjC

5Γ|·ΓΓ ?ui put al. tara um ser humano adulto (com

aproximadamente 7ϋ kq de oeso corporal 5 , entre PO e 3.0ΘΟ mq exempio cerca de 1 .t-W mg, ds um produto ae acoroo com o invento podem ser administrados· diáriamente. Aprapriadamente, a dosagem para seres humanos adultos varia entre 5 e 2-i mg/kg por dia. Dosagens mais elevadas ou mais baixas podem, contudo, ser usadas

Quando as composições de acordo com o invento são apresentadas sob a forma de unidade ds dosagem, cada unidade de dosagem pode compreender apropriadamente de 25 a 1 . õõQ mq, de preterancia de ou a oyí) mg, eis um produto de acordo com o invento .

•Js Exemplos que e seguem ilustram a preparação produtos de acordo com o oresente invento.

Produção e Isolamento f _ !vtM .1 :

Exemplo 1

A cultura NCIB 40Φ89 foi feita crescer durante 7 dias ilano inclinado de agar i 0 meio de aqar tinha a composição nu.e se seque;

o num plano inclinado de agar sólido numa garrafa de McCart

Qua ide

Extracto de levedura Extracto de malte Dext rose

Agar

Até 1 litro tUs uuustituintes eram todos produtos “Sact Registada.) tal como sao fornecidos pelos* Eu u to é Uma M,;s.! Ce boratories, P.O.

Β ο 14 Β , Central Α ν e η u e, Ε a s t Μ ο 1 s s ε y , S u r r e v ( ajustado para pH 7,3 antes da esterilização.

meio foi

Foi preparad·;

< esterilizada contendo @,@27. de WCIB em aqar em qarrafa de McCsrtnsy e raspando a. superfície u íí: a s u. s p e n s ã o d e e s ρ o r o s a d i c i o n a n d o t 1 ·!-,»», corri uhi yanuho de arame·. Foram usadas pc de esporos a fim de inocular o meie contido era frascos cónicos de 500 ml fe de alqodão.

:oeS Iz mi i ue sUspt*ns«tO ι saríiiéH lai ã então realizada ?tí°C e 24@ rpm num aqitador giratório.

de agente anti formação de espuma, foram esterilizados num ferment agitador equipado

Foram usados 200 ml de inóculo veqstat:

> sementeir	.3.
'os com rol	Π3.Ξ-
'Cí. uUf ciT; Ltcd	—7-—ι
juntamentê
opí. lene SI	ico
v i d i u o c	omp
citado por	me
•Ξ d i Ξ C O ct	20<
r volume	por
partir do	es
incubação	foi

um •_l „ __ ·”. H :?r· j , .u uma superpressão de ar ds @,5 bar. A fermentação foi recolhida após 4 dias e clarificada por centrifugação.

dia». Manteve-»e tudo o tempo da fermentação

Os meios de sementeira e de fermentação tinham composição. U meio continha:

mesma

. tu. in tí

I- a r i n h a d s s o j a

G1icsro1

Maltose

CaCl,-,.6H_o0

So1ução e 1sos rs to s v áqua desionisada

13.1!

λ Ί-1

10,0 Ξ0,0

2,0 O , 00:

ιτι 1 1 litrc soluçãc eleíT ffl©'ϊ I LU = VtíitigidiS LUil Llilllâ:

Constituinte

030¼ ,2H_r.O MgCl^.óH^.0 NaCl FeC 1 _

ZnCl₇

CliC1₇.2H₇0 MnSD , -4H.-0

Q tí a η t i d a de (q /1 )

10,0 C\ Cl

Í0,0

3,0 0,5 0,5 0.5 meio foi ajustado para pH 7,3 antes da esterilização a Í17'^:'C durante 15 minutos.

(A t a! i nha d © ;dy - ADN , Manchester, UK) oja era Av

Torrieciaa por

b) Isolamento de MM

Uma porção aliquota ds caldo clarificado (5 litros) preparada tal como foi descrito em a) foi ajustada para pH 7,0 e aplicada a uma coluna Diaion HP20 (0,59 litro), (HF'20 foi fornecido por Mitsubishi Chemical Industries, Tokvo, Jaoan!. A coluna

507. de Propan-1 — o 1 em amónia O,1M. Foram recolhidas ló fracçSes.

Essas fracçSes com actividade anti reunidas numa massa s concentradas in 2,25M à solução concentrada para dar litro. Esta, solução foi então aplicad catiónica. CM Sephadex C25 (1 litro) previamente com NaH_F'O , y , 2oM pH ó „ 5 . por Pharmacia Ltd., Uppsala, Sweden). NaH.^PQ^ O,05M pH 7,2 (1 litro) e em gradiente exponencial de WaH^PD^, 2,25M 9,5 (527 ml em recipiente de mistura). 20 ml. A actividade antibacteriana 3· 2-42 que foram reunidas numa massa (2, ba.c teri an a. ( 23—42) f ora.m vacuo. Ad i c i cηou-se NaH- FO , tí íx origem a um total de 1 a a uma coluna de permuta

4( !' o r m a N a ) e q u i 1 i h r a íí a (CM Sephadex foi fornecido

At coluna foi lavada com seguida eluida usando um □H 7,2 a 2,2M pH

Foram colhidas fracções de o i detec tad a nas f rac ç8ss 75 1itro).

ρ o r a g i t a c S o nil-D-alanin preparado a Sefarose 4B xanoico foi impure z durante a sefaro parti r activada obtida

Dorset). A mistura foi filtr vidro e o filtrado foi eli suspensa de novo em água des anteriormente. A resina. foi desionizada (2 x 3t*2 ml) s contendo 527. de acetonitrilo As fracções eluidas foram ev as inorgânicas foram removidas desta massa 1 hora com resina com afinidade para D-alase com pH 7,2. 0 adsorvente de afinidade foi. de D-alanil-D-alanina imobilizada em CM (seíarose 4B activada com ácido à-arainohea partir de Sigma Chemical Co., Poole, que apresentavam actividade antibacteriana congelação para proporcionarem 123 mg de MM 4 ada por um funil de aglomerado de minado. A resina de afinidade foi ionizada (1 litro) e filtrada como lavada mais duas vezes com água endo então eluida com amónia 2,ÍM (porçSes aliquotas de 4 x 222 ml), aporadas sob pressão reduzida e as f oram sec a.

por

M>4 Λ r~.

IΊ1Ί 57/2.2 líquida de elevada

C|Waters ubondapat com foi monitorizado p Ε' Γ T Ο Γ ;Tí cf. Γι C Θ ij. S -õí Π d u i S, 9 ítíítj x 300 com NsH.-.PO,, 2,1M pH ó, 2 contendo 257. d' :<r meio de cromatografia ia coluna de fase reversa mm, fazendo-se a. eluição acetonitrilo numa taxa de

fluxo venc i ·: rstent ds '2 ml/min. 0 produto eluido U V a 2 2 © n m. N e s t a s c o n d i c S e s ão de ítí, 1 minutos.

risadu por absartinha um tempo de

Propriedades de NM 49728

A espectrometria d£ dois iSes correspondendo a. pc fnae-iíci de FAB iiidii_uu a presença de sós moleculares de 1963+2 e 1982+2.,

A actividade essencialmente tal como de iTiicrotitulãçáo. Laldo Wade Road, Basingstoke, registada) foi usado pa Streptococcus spp. que fornecido por Oxoid Ltd culturas eni caldo rea.liz.

antibacteriana do material produzido no exemplo 1 foi determinada, pelo método

No. 2 Oxoid (fornecido por Oxoid Ltd., Hampshire, UK.,, (Oxoid é uma. marca ra todos os organismos com excepção dos foi testado usando caldo Todd Hewitt Os ináculos eram constituídos por adas durante a noite diluídas dez vezes.

As placas de microtitu 37'^:'0. Os resultados são ção foram incubadas ndiçados no Quadro 1

..I, , _w___4- t- .1

UUf ctl I t fc? *“!· horas

ftct i v i d a d g antibacteriana de MM 49/28 contra uma série de or q a r· i- s ro o s d g tarm π. π a d a psi □ método de T-icrofituÍac ao (UlM pq/m 1 )

Organism o	MM 49728
Bacillus subtilis ATCC 6633	2.0
Corynebacterium xerosis NCTC 9755	<0.5
Sarcina lutea NCTC 8340	4.0
Staphylococcus aureus Smith	8.0
Oxford	2.0
Russel	4.0
V573 MR*	1.0
S.saprophyticus FL1	16.0
FL2	8.0
S.epidermidis 60137	2.0
54815	4.0
Streptococcus pyrogenes CN10	<0.5
1950	<0.5
S.agalactiae 'Hester'	<0.5
S.sanguis ATCC 10556	1.0
S.viridans 'Harding'	1.0
S.pneumoniae Pu7	1.0
S.faecalis I	1.0

•4« K-l. .

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B i e agitada ocasionalmente durante a hora seguinte. A suspensão foi filtrada sob sucção e o resíduo foi suspenso em trisíhidroximetil lamino metano (TRIS) < 1©© ml) durante 1 hora sendo então refiltrado através de um cintilador de vidro. A massa foi lavada sucessivamente oom solução de bicarbonato de sódio ©,1N, TRIS ©,©5M (contendo cloreto de sódio ©,5M), tampão formato ©,©5M com pH 4,0 (contendo cloreto de sódio ©,5M> e finalmente com água destilada. A resina de afinidade foi então armazenada a 4*C- numa s u s ρ e ηι s ã o a g u o s a ·

Exemplo 2

a) Fermentação

Todos os estádios de sementeira e de produção utilizaram α meio líquido tal como foi descrito no Exemplo la. Uma suspensão de 1 ml de células vegetativas da cultura NCIB 4©©G9 armazenada em 2©% de glicerol s 10% de lactose sob azoto líquido, foi usada para inoculai^- 1©© ml de meio de fermentação contido num frasco cónico de 5©€s ml, rolhado com uma rolha de espuma de plástico. Após incubação durante 72 horas a uma temperatura de 23 °C e 24© rpm num agitador rotativo, porçSes a.líquotas de 4 ml foram transferidas para frascos cónicos de 5©© ml contendo 1©© ml de meio fresco. Estes foram incubados a 23*C e 24© rpm durante mais 48 h o r a s.

litros de meio de fermentação juntamente com 0,1% de agente an ti formação ds espuma, pol ipropilene alicol F'2©©0, foram esterilizados ι n satu durante ó© minutos a 12Í'-'C num fermentador completamente dividido, de 2© litros, 0 fermentador foi aqitado por meio de um agitador conduzido pelo fundo equipado oom três pf opulsores de discos cata-ventos a 20© rpm durante tanto a esterilização como a cultura. 4©y ml ds inóculo vegetativo a

D ·? Γ t ί ϊ~ 'frSSCQ· SE'fTiE?o.d C) :-j dui £-9CLinQC S?S'C<5.d .LC? fOfàffl U.S^.dOS Ρ6.Γ’·3.

Π O C U 1ΐ Γ Ο 7 Ξ Γ ϊΤ^Γί t õid Ο Γ & -7. 1Π 7Ltb-5.Ç A O 701 Γόΐ. J. 1 Z + Cií- <7. Zo '*O d Ο7·κΓ; lE‘ 45 horas antes de transferência para. o estádio de produção. Durante a fermentação o fermentador foi fornecida com ar filtrado estéril a O,23 volumes oor volume oor minuto mantendo-se ao lonqo

ClO pruCcisSO Ul!!·:

produto fermentado foi recolhido em Dorções de ujo pH foi gjustadi _ ... ! - _ _l 1 _ d». h « _ .·“«!_! CM ptc* 1 ct ct ul ct U Jíd l4dL'i ι '—' Li á ctPi L C:

centrifugação. 0 produto flutuante resultante foi ajustado para pri o — o pur auiçaU Ue hH o n.

b? Isolamento de complexo qlicopeptidico

D caldo clarificada neutralizado (27ÃL) foi aplicado a uma coluna de Diaion ΗΡ2Θ com uma taxa de fluxo de IL min t, A coluna foi lavada com 30L de água desionizada e o percolato e a égua foram eliminados. 0 material activo foi eluido a partir da coluna com amónia y,lM contendo 507 de propan-2-ol. Foram recolhidas fracções de 1 litro. Fracções com actividade antibiótica, (16—85), foram reunidas numa massa e evaporadas in vacuo para dar oriqem a 3,3 L..

3,8 L de concentrado aquoso foram misturados com 4,5 L de butan-l-ol e o pH foi ajustado para 3,0 pela adição de ácido clorídrico 0,1M. As fases foram separadaso e 1 a.

:ã.o da. qra.vida.de e a fase aquosa inf '«ι· iur foi removida ase solvente suDerior e as fases misturadas foram separadas por centrifuqacão & a. fase solvente foi recuperada por aspiração. 4,5 L da fase solvente foram misturados com u.m volume iqua 1 de água desionizada e o oH foi ajustado para i€t,0 pela -adição de fases foram separadas pela accão da aquosa foram ajustadas para pH 7,0 co gravidade e 4,7 L da fase

ΛΗΙ ctuxuu Liunurico y.in, — 1

fase aquosa foi concentrada in va.cuo até se formar um precicitado gel atii iuso , o quai

ipi' suspenso de novo em á.qua desionizada e filtrado de novo por

LJ c' LJ X de filtre

Springfield rl.il 1, Maidstone, Kent, t.ngland.3 f···. ·

Os- filtrados- combinados (6,3 L) foram agitados durante hura uoíTí resina loíh afinidade para a 1ani1-D-a21an ina-sefai se, (350 ml de volume húmido), [Preparado tal como foi descrito no exemplo 13. A mistura foi tratada tal como foi prévismente descrito para, dar origem aos produtos de eluição combinados os quais foram evaporados in vacuo para dar origem a 2, concentrado aquoso.

L de

Us 7.,45 L de percolato de afinidade foram tratados de novo com 35Θ ml de adsorvente de afinidade tal como foi anteriormente referido para dar origem a outros 2.,55 L de concentrado aquosa.

4,35 L de concentrados combinados foram secos congelação para proporcionarem 15,2 q de complexo g1icopeptid:

MM 4972S o MM55263.

qual ---a·;}Γ| 11II hã eiap χ o

Iso1amento de MM 55266

	2 g de	\|mí j-j\| *10 “7 O	ρ Ts? pcit	zp H —		X - 1 —__— -ú -J____ ί-cu LUIHU i UX UÍZ* =··:_	rito n
exemp1 o	2b foram	dissolvido	s em 40	Θ ÍTí	1	de metanol a 5%	em áqu
c o rn u m ρ	ri de 6 u „	Esta solu	ção foi	ap	Τ	içada a uma coluna	de 27
m 1 de si	1 i c a d e	fase rever	sa Matre	;·ί Π	4	o, (partículas de	30 pun
diâmetro	do poro	60A), pré	viamen te	eq	H	ilibrada em NaH^PO	ο ι m ,-T ·-· R A > ^! *+ --

snenouse,

G1ou ceste rsh i re, Εnq1 and) :oiuns ιοί iâvsos com oú mi oo ml . min

OiTi LJ i-ãiupU.LJ an t erio rmente referido, contendo 15% de acetonitrilo (500 ml ) e 20% de acetonii. . _ j 1 ._ .-· cr . \ Γ7 - -L — - — -- — 1 - -L — — τ .. .... -j

L r XI U UV V lll i / » C.S LOO- po i C i_- ί -ι LU , i «v cSQOS s nados. A eluição continuou, contendo 25% produto eluido foi recolhido em fracções ds eluidos foram de acetonitrilo

2õ ml .

As fracções foram monitorizadas por cLEF' usand η I I !'T;

ase reversa C. Matres Novap:

tí com MaH.-,F'O . ύ,ΙΜ pH 6,0, contendo

O U j. ui i 1 a u — fazendo-se jV Xf · · - · acetonitrilo com uma taxa de fluxo de 2 ml.min . 0 produto eluido foi monitorizado quanto à absorvencia ds UV a 220 nm. Nestas condiçSes, MM 55266 tinha um tempo de retenção de 4,4 minutos.

tracções contendo principalmente MM 55266, (29-40),

ITI ι u r-Sui f‘ f l.l H i ·Σζ c*. ’=> nLiíBct iB-3. — o ct q - '-•'ct ρ tj Γ·ί.υ 3. o J_; ;

e aplicadas a uma coluna de 60 ml de Diaion HF’2y com ur ó ç? τ 1 li y. o d *3 4 íb 1 rn 2. π desionizada e o percolato e o produto de lavagem oom agua eliminados, A coluna foi eluida com 24y ml de 50% de metanol produto eluido foi evaporado in vacuo até se obter 108 ml.

140 ml de r a. ;·: a áqua ^:oram

O v(_ni_eíiLr adu aquusu foi ajustado para. pH 6,5 oela e aplicado a uma coluna CL.EP preparativa

Uyiianax íoú-k, 10 x ouç mm, contendo partículas de 12 um de silica de fase reversa C_1Q préviamente equilibrada, em NaH^F'0., U.hbM. CColuna fornecida por Eainin ínstrument Co, Woburn, MA, t i,^-· ^r·. *7

UOMJ

A uuluna Toi lavada luíb 2t·· ml de tampão para squilibrar e eluida com o tamDão contendo um gradiente programado de aceto— _ 4 nitrilo a Sml.min Q produto eluido foi recolhido em fracçSes de o íti 1 . A partir dos z—J. 2 minutos.

foi aumentado linearmente até 23% altura. em que íTi 1 n Li tut r ΟΠ t £?U.□ O G?ffl 5C S t GH i t Γ ϊ 1 C f O í 3.LIiT!Sf*51.3. d C? pβ. Γ

As fracçSes Novapak tal como foi í V & fll H t- ,· torar ín 1 .

foram monitorizadas por préviamente descrito. FracçSes contei reunidas numa massa e evaporadas m

ΜΓ ;uc produ t_ o rf e ír¹1 υ i e a ο ι_ η í : 11* i ι í a d os tu r am — v a por congelação para oroporcionarem 13Θ mcj de Mt • Λ ρ , r·. -ι

tdo duran	te 1 hora
'· a ro=,r-·. „ í	A ml dvn
. t o n o	£? X Ξ¹ íTi piG i J
/ormente	descrit o s
irados x n	V 3 C Lí D G? =. ·
jjp Nif.]	'7* A A

icou um	ião vis;

Lilar co: t espondendo a um peso molecular de 19óyíl „

Exemplo 4

Iso1 amgnto d e c omρ1 r*t f'

13. ífí b é' íi} r.j r d d o r c i o n c« li ΐ r a c

C Ο Π t G? Γί tí O N;

f Ο Γ 3. ’Ti

ΊΐΐιΤί*

MM 50267 foi monitorizado por CLLr numa coluna Movapak tal como foi anteriormente descrito. Nestas condicSee, MM 55267 tinha um tempo de retenção de 4,0 minutos.

Q concentrado aquoso foi agitado durante 1 hora com a. resina de afinidade D-alanil-D-alanina-sefarose, (2 ml de volume húmido). [Preparado tal como foi descrito no exemplo 13. A mistura foi tratada tal como foi anteriorsiente descrito e os produtos eluidos combinados foram evaporados in vacuo e secos por congelação para proporcionar 25 mg de MM 55267.

A espectroscopia de massa d o i s i Se s m o 1 ec u lares c o r r e s ρ·on u en d o a ρ ± 1 e 22Ú4 ± 1 , designados- MM 55267men te.

Ah' indicou a presença de cs moleculares de 2190 t? KM 33 Σ £ Ύ / 2 , ηξ s ρ θ c t i v -a. ~

Lxsmolo g de MM 47728, preparado tal como foi descrito no exemplo 2b, foram dissolvidos em 200 ml ds água com um pH 3,O e filtrados por meio de papeis de filtro 542, CFiltros fornecidos por Whatman, Springfield Mill sólidos obtidos foram suspensos

England.3 Os áqua e filtrados de nuvu para dar origem a um filtrado combinado de 500 ml fc.s t a s o 1 uc ão

aplicada a uma coluna de sílica de 270 ml, (partículas de 30|.im, diâmetro ;m ixari.-ihU >

Μ, pH 6,0.

A coluna foi lavada com 203 ml de ti brio antes de ser eluida a 16 ml.min^-1 co m o tampão, contendo 20%

de ace ton i tri1o f o r a m e 1 i m i n a d o s.

. _ X. .

.<=· LL sT’ 1

1avados

A eluicão continuou com o tampão contendo 2f o proí produto eluido foi recolhido em

Π» ι r sU-çoeS

Toram moro irisadas por ίΓ IIUHia

C υ 1 Ui i a

Novapak tal como foi anteriormente descrito. Nestas condiçSes, MM tinha um tempo ds retenção de 9,2 minutos.

As fracçSes contendo MM 552ά( numa massa, evaporadas in vacuo até sa ohter lc© ml e apii (3O-120), foram reunidas uma coluna de 60 ml de Diaion HP20 a. uma taxa de fluxo de 4

A coluna foi lavada com 200 ml de áqua desionizada e o percolato e a água foram eliminad e j. li .1 ω;

com 200 ml de 507. de metanol em água que foi eliminado e finalmente com 250 ml de metanol. 0 produto de eluição com o metanol foi misturado com 200 ml de égua desionizada e evaporado in vacuo até se obter 155 ml. 0 precipitado branco resultante foi tração [ i sso1vido em égua desion i cada..

As aepar aou solucSes ' O.Tib i. 1 1 3iJ =i.í ip.-PU I J vidro GF/F , iFiittos fornecidos por Whatntanl e seco; ção para proporcionar *»ca mg oe por

A eapactruscupia de massa FAB indicou um ião c o r r e s ρ o n d e π d o a u m ρ e s o m o 1 e c u 1 a r d c mo 1ecu1 ar e a z*. í*i-iHhJa > zíz; Ut i S C il I f ii L i, zi O S m o n i t o r 1 z a d a 5 g lí ant o a a eti v i □ a d e a. n t i b i G t i c a

3or bioensaio em h MM

ΙΓΙ -ί·:.·':::

MM 55267 e MM 55263 tãm iJm máximo

u.sando medição d i rec ta desta absorv'éπcia.

As actividades antibacterianas de MM 55266, MM 55267 e MM 55263 foram determinadas pelo método de mioroti-tu. 1 amgri tal como

Os resultados sSo indicados nos quadre

Quadro 2

.Λ ... 2- .. .. η -	ie antibsctsrians de MM 55266	contra uma série da
π i smos,	determinada oelo método de mi	c r o t i t u 1 a ç a o
	(CIM ng/ml)	-
	Organism o	MM 55266
	Bacillus subtilis ATCC 6633 Corynebacterium	4.0
	xerosis NCTC 9755	8.0
	Sarcina lutea NCTC 8340 Staphylococcus aureus	4.0
	¹ Oxford'	4.0
	'Russell'	8.0
	'V573' MR*	2.0
	S.saprophyticus 'FLI'	16.0
	S.epidermidis 60137	8.0
	Streptococcus pyrogenes CN10	2.0
	S.agalactiae 'Hester'	4.0
	S.sanguis ATCC 10556	4.0
	S.pneumoniae Pu7	2.0
	S.faecalis 1	8.0
^Multi—resistente (resistente á.	detici1ina, tetracicl

Ac t i v ide.de erstibacterie.r Π 1S ÍP C G- r. d E t >5 Γ íp X f~! ct d «â D

H«» MM

L ui ; t. Γ X. Ll G, G- G Γ i Q d G (CIM uq/ml)

Organism o	MM 55267
Bacillus subtilis ATCC 6633	16.0
Corynebacterium
xerosis NCTC 9755	16.0
Sarcina lutea NCTC 8340	16.0
Staphylococcus aureus
¹ Oxford'	32.0
¹Russell'	64.0
'V573' MR*	16.0
S.saprophyticus 'FLI'	64.0
S.epidermidis 60137	16.0
Streptococcus pyrogenes CN10	4.0
S.agalactiae 'Hester'	8.0
S.sangius ATCC 10556	16.0
S.pneumoniae Pu7	8.0
S.faecalis 1	32.0

eri tromicina q e n t a m i c i n a )

Q > · .^ rl Γι *3.

(CIM	ptg/íiil )	-
Organismo		MM 55268
Bacillus subtilis ATCC 6633	4.0
Corynebacterium
xerosis NCTC 9755		4.0
Sarcina lutea NCTC 8340		2.0
Staphylococcus aureus
'Oxford'		4.0
'Russell'		4.0
'V573' MR*		1.0
S.saprophyticus 'FLI'		8.0
S.epidermidis 60137		4.0
Streptococcus pyrogenes	CN10	0.25
S.agalactiae 'Hester'		2.0
S.sanguis ATCC 10556		2.0
S.pneumoniae Pu7		1.0
S.faecalis 1		4.0

Mu 1 ti-resisten te ( resistente á Matic.il ina eritremicina e aentamicin^)

Ρrο ο r i e d ades fí = i ca?

de MM

MH'*' 19ú?±3

Pese? Molecular : 196S

Fórmula Molecular : ©_, l*V-Ν^Ο-,—ΕΙ — tí o tí 9 tí j· O 5 !JV (14.-,0) Umax 28« nm (88680) *H RMN em DMSO d, a 353'-Ή. Tetram

ÍH 3,60 (ÍH.

7,72 (ÍH, d, J .9,4 Hz), 7,50 (ÍH, br.d), 7,46 (ÍH, d, J 10,6 Hz),

7,33 (1H,

7,35 (ÍH, d, J 7,3 Hz) ( 1H,

Hz), 7,25 (1H, d, J 2 Hz), 7,20 (ÍH, d, J 3,2 Hz), 7,13 (ÍH, H, d, J 9,9 Hz), 6,32 (1Η, d, J 2,1 Hz), 6,78 (1H, <

1Hz), 6,59 (2H., sobrepondo-se a m> , 6,41 ( 1H, d, J 2,0 Hz), > 1 'ri, d ,, j_ 2 H © ) , 6,1 ί ÍH, b r. d) , (1H, —), 5,69 (1H, d, J 7,3 Hz) e) , 0,2© (1Η, d, J 1,4 Hz)

J 10,6 Hz )? ( ÍH, d, J 7,5 Hz) i,81 \ 1 íí , ( 1H.

□onJ 5,1 Hz), 5,11

4,33 (ÍH, s), 4,12 Í1H, d, J 11,1 Hz>

1H.

m), 3,/-3,0 (sinais sobrepondo-se), 2,38 (3H, s), 2,17 (2H, m),

0,35 (6H,

A Hz)nr

rAb-Mo ·- x u υ. r /í l 'fa a d 3. d S' s í 1 s i c 3. s θ E? s C'^! tol/uitioeritritol) + .·- - ,- , ,

Pese molecular : lvtí'2

Claims

REIVINDICAÇÕES lã. - í-Tocessc para a produção de compostos gicopeptídicos MM 49723, MM 55266, MK552Ó7/1, MM 55257/2, ou MM 55263, caracterisado por se efectuar a cultura de um microorqanismo produtor e no isolamento subsequente da substância ou ds um seu derivado a partir da cultura.
2 a terisado por

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracproduzir o composto com a fórmula (I):

H

HO H
3=. - Processo de ac caracterizado por a substância forra substân,: is 1 nen te ;

ua!!! a ou composto reivindicação ser produzida ou 2 „ h Ui!) a
4ã, - (-'rocesso de acordo com a reivindica.ção 1, 2 ou 3, caracterizado por o mi c roorqan ismo ser Amicol atopsis s ρ NCIB 40089 ou um seu mutante.
5 2 . — Μ ί c r Ο Ο Γ C' ·3 Π Í SIB O , C 3 r 3 C t S í'~ i Z 3 Q O □ Ο Γ S S Γ Ο A (Γ; V C O 1 3 * :e pur

63. - Processo psra a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a mistura de uma. quantidade antibacterianamante eficaz de uma substância ou composto íal como foi aqui anteriormente definida., ou um seu te farmaceuticamente aceitável.

/ ã)» — iiétodo para o tratamenco de intecçoes paczenanas em animais, caracterizado por se administrar uma. quantidade antibacterianamente eficaz ds uma substância ou composto tal como foi aqui anteriormente definida;, ou um seu derivado fa. rma.cêutica.— mente aceitável, a um animal necessitado desse tratamento, sendo a. gama, de dosagem de produto a.ctivo de 1,0 a 50 mg por kq de peso c u r ρ o r ·--. ι ρ o t d χ a ,