PT88523B - Processo para a producao de um antibiotico glicopeptidico - Google Patents

Description

presente invento relaciona-se com novos materiais anti-bacterianamente activos, obtidos a partir de um microorganismo, com o processo para a sua produção, e com o seu uso farmacêutico.

Um largo número de microorganismos têm vindo a ser isolados da natureza e, descobriu-se que alguns desses microorganismos produzem vários metabôlitos, que podem ser isolados e alguns deles possuem actividade anti-bacteriana útil.

Em EP-A-0 231 111 e EP-A-0 265 071 (USSN 909791) descrevem-se antibióticos fcj 1icopeptidicos,que têm vindo a ser obtidos por fermentação de microorganismos.

«

Um primeiro aspecto do presente invento fornece um composto de fórmula (I):

(i)

em que R é hidrogénio ou cloro, ou um se.u derivado farmaceuticamente aceitável, mais particularmente na forma substancialmente pura.

Um segundo aspecto do invento fornece uma mistura de compostos do invento, particularmente na forma substancialmente pura.

presente invento também fornece um processo para a produção de um composto de fórmula (I), que compreende a cultura de um microorganismo produtor e sub sequentemente o isolamento do composto de fórmula (I) ou de um seu derivado, da cultura.

presente invento fornece ainda um processo para a preparação de um composto de fórmula (I) que compreende, a separação do composto de formula (I) ou um seu derivado a partir de uma sua solução, em mistura com outras substancias anti-bacterianamente activas e/ou substâncias inactivas, por adsorção numa resina de afinidade.

Os compostos de fórmula (I) têm as características descritas a seguir, nos Exemplos.

Cada composto de fórmula (I)pode ser obtido pela cultura de um microorganismo produtor e a recuperação do composto de fórmula (I) ou um seu derivado, de cultura.

termo cultura (e derivados des te termo) tal como usado nesta Memória Descritiva, significa o crescimento aeróbico deliberado de um microorganismo na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto, enxofre e sais minerais. Este crescimento aeróbico pode ser reali-5zado num meio nutriente semi-sólido ou sólido, ou num meio liquido, no qual os nutrientes estão dissolvidos ou suspensos.

A cultura pode ser realizada sobre uma superfície aerôbica ou por cultura submersa. 0 meio nutritivo pode ser composto de nutrientes complexos ou pode ser quimicamente definido.

Descobriu-se que os microorganismos adequados para serem usados no processo de cultura de acordo com o invento, incluem estirpes bacterianas pertencentes à classe actinomicetais que são capazes de elaborar compostos de fórmula (I). Descobriu-se ainda que, um exemplo dessa estirpe ê o actinomiceto sp. NCIB 12531 e também seus mutantes, que têm vindo a ser isolados da natureza.

termo mutante aqui usado,inclui qualquer estirpe mutante que surge espontaneamente ou através do efeito de um agente externo, quando o agente é aplicado deliberadamente ou por outro processo. Métodos adequados de produção de estirpes mutantes incluem aqueles delineados por H.I. Adler em Techniques for the Development of Microorganisms em Rádiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms; Proceedings of a Symposium,

Vienna, 1973, página 241, International Atomic Energy Authority e estes incluem:

(i) Radiação ionizante (e.g. raios X e raiosÀ), luz u.v. luz u.v. mais agentes foto-sensiveis (e.g. 8-metoxipsoraleno), ácido nitroso, hidroxilamina, análogos básicos da pirimidina (e.g. 5-bromo-uracilo), acridinas, agentes de alquilação (e.g. gás de mostarda, eti1-metano-sulfonato), perôxido de hidrogénio, fenois, formaldeído, calor, e (ii)

Técnicas genéticas, incluindo, por exemplo, recombinação, transformação, transdixção, 1 isogen ização, conversão lisogénica, fusão protoplástica e técnicas de selecção para mutantes espontâneos.

Acredita-se que o actinomiceto sp. NCIB 12531 ê uma estirpe não conhecida na classe dos actinomicetais e por conseguinte, também forma uma parte do presente invento, particularmente quando na forma biologicamente pura. Tem vindo a ser depositada na National Collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd. (N.C.I.B), Torry Research Station, PO Box 31,135 Abbey Road, Aberdeen,

United Kingdom AB9 8DG sob o número 12531 em 7 Setembro, 1987.

Classificação do NCIB 12531

Métodos Usados

Os métodos seguintes foram aqueles recomendados por INternational Streptomyces Project (ISP) para a caracterização das espécies do Streptomyces /Shirling, E.B. and Gottlieb, D.'Methods for characterisation of Streptomyces species' Int. J. Syst.Bacteriol., J_6:313-340 ( 1966)_7 e aqueles recomendados para a caracterização das espécies Amycolata e Amycolatopsis /lechevalier, M.P., Prausen, H. Labeda.D.A. and Ruan, J.-S.Two new genera of nocardioform actinomycetes: Amycolata gen.nov. and Amicolatopsis gen.nov. Int.J. Syst.Bacterio1., 36: 29-37 ( 1986 )J.

Os isómeros dos ãcidos diamino-pimêlico (DAP) e os hidratos de carbono na forma de hidrolisados, das células completas foram estabelecidos por Cromatografia em Camada Fina (CCF) usando os métodos descritos por

Komagata e Suzuki /Komagata, K and Suzuki, K-I. Lipid and

Cell-Wall analysis in bacterial systematics em Current Methods for the Classification and Identification of Microorganisms.

R.R. Colwell and R. Grigorva, Eds. Methods in Microbiology Vol. 19 (1987) p. 161-207, Academic Press Inc. London, New York/. Os ácidos micôlicos foram determinados pelo método descrito por Minnikin et al. /“Minnikin, D.E., Hutchinson,

I.G. and Caldicott, A.B. Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid Containing Bactéria. J. Chromatography 188:221-233 (1980)7.

Caracteristicas da Cultura

A cultura NCIB 12531 teve um bom crescimento em todos os meios de crescimento recomendados pelo ISP, formando micêlio de substrato creme/amarelo pálido/ castanho pálido bem desenvolvido e micêlio gasoso branco abun dante. Nenhuns pigmentos solúveis foram detectados em qualquer dos meios. As caracteristicas da cultura do NCIB 12531 em vários meios estão resumidos no Quadro 1.

Caracteristicas Químicas

As células totalmente hidrolisadas da cultura NCIB 12531 continham o isómero meso do ácido diaminopimélico e arabinose e galactose como açúcares principais. E quantidades menores de açúcares como a ribose em glucose foram também detectados nos hidrolisados. Os ácidos micôlicos não estavam presentes. Estes resultados indicam que esta cultura de NCIB 12531 tem uma divisão celular do tipo IV e um açúcar do tipo A do modelo sensu Lechevalier

et al . Contudo, a falta dos ácidos micólicos coloca a cultura NCIB 12531 firmemente fora da classe Nocardia sensu stricto.

Caracteristicas Fisiológicas

As caracteristicas fisiológicas chave das culturas NCIB 12531 e Amycolatopsis orientalis ATCC 19795, apresentadas no Quadro 2, mostram que estas duas culturas compartilham muitos aspectos comuns.

Identificação de Cultura NCIB 12531

Baseado nos aspectos química, fisiológicos e morfológicos chave, a cultura NCIB 12531 ê identificada como sendo uma estirpe do Amycolatopsis orientalis. Visto que a cultura NCIB 12531 difere em alguns aspectos da estirpe do tipo Amycolatopsis orientalis (e.g. decomposição de adenina, produção de anilase e utilização de arabinose e xilose como únicas fontes de carbono), a cultura pode ser vista como uma nova técnica de isolamento das espécies Amycolatopsis orientalis.

τ

-9Quadro 1

NCIB 12531:

Características de crescimento depois de 14 dias a 28¾

-,.—.-...—...,.·-.,......- MEIO	CRESCI- MENTO	MICELIO GASOSO	SUBSTRATO	SOLUBILIDADE
FORMAÇÃO	COR
ISP No.2	Bom	Boa	Branco	Creme amarelo pálido	Nenhuma
ISP No. 3	Bom	Boa	Branco	creme/branco	Nenhuma
ISP No.4	Bom	Boa	Branco	creme amarelo pálido	Nenhuma
ISP No.5	Bom	Boa	Branco	creme castanho pálido	Nenhuma
ISP No.6	Bom	Nenhuma		creme castanho pálido	Nenhuma
ISP No.7	Bom	Boa	Branco	creme/branco	Nenhuma
Agar Nutriente	Bom	Boa	Branco	amarelo pálido	Nenhuma
Agar de Bennett	Bom	Boa	Branco	creme amarelo pálido	Nenhuma
CzapekDox Agar	Bom	Boa	Branco	creme/branco	Nenhuma

-10NCIB12531: Características Fisiológicas depois de 14 dias a 28°C

- 'i • λ

Quadro 2

CARACTERÍSTICAS	NCIB 12531	Amycolatopsis orientalis ATCC 19795
Decomposição de: Adenina	+
Caseína	+	+
Hipoxantina	+	+
Tirosina	+	+
Xantina	+	+
Produção de: Amilase	+
Urease	+	+
Gelatinase	+	+
Melanina	-	-
Crescimento na presença de:
Lisozima (500u./ml)	+	+
Rifampicina(50/jg/ml)	+	+
NaCl (5%,p/v) Crescimento a:	+	+
10°C	+	+
28°C	+	+
37°C	-	-
45°C	-	-
Utilização de hidratos de car- bono como única fonte de carbono
Arabinose		+
Frutose	+	+
Glucose	+	+
Inositol	-	V
Manitol	+	+
Rafinase	-	-
Ramnose	V	V
Sacarose	+	V
xilase	V	+
Controle (sem açúcar)	-	-

Chave: V=variável

..x’ meio de fermentação para a cultura de sp. NCIB 12531 adequadamente contêm fontes de carbono assimiláveis e de azoto assimilável, em conjunto com sais inorgânicos. Fontes adequadas de azoto incluem extrato de levedura, farinha de feijão de soja, extrato de carne,sonante de algodão, farinha, malte, amino-ácidos solúveis secos por destilação, hidrolisados de proteina e azoto do amónio e do hidrato. Fontes de carbono adequadas incluem a glucose, lactose, maltose, amido e glicerol. Adequadamente o meio de cultura também inclui ipes de metais alcalinos (por exemplo, sódio), iões halogénio (por exemplo cloreto), e iões de metais alcalino-terroso (por exemplo, cálcio e magnésio), assim como vestígios de elementos como de ferro e de cobalto. A fermentação pode ser realizada em continuo ou em descontinuo.

A cultura pode adequadamente ser eficaz a uma temperatura de cerca de 20 a 35°C, vantajosamente 25 a 32°C, e a cultura pode ser adeqiBdamante colhida até os 7 dias, vantajosamente a cerca de 3 a 5 dias, depois da iniciação da fermentação de modo a dar um rendimento óptimo dos compostos de fórmula (I).

composto desejado de fórmula (I) ou um seu derivado, pode depois ser isolado do meio de cultura e trabalhado e purificado usando técnicas convencionais para compostos gl icopêptideos. Todos estes processos de purificação e isolamento podem ser convencionalmente eficazes a frio até a temperatura ambiente, por exemplo a uma temperatura na gama desde 4 a 30°C, convencionalmente desde 20 a 25°C. 0 produto desejado pode ser obtido a partir do filtrado de cultura, e/ou a partir da massa de célula. Contudo, conveniente mente, o primeiro passo do isolamento pode envolver a remoção do material sólido do caldo de fermentação, por exemplo, por filtração ou centrifugação, para dar um filtrado de cultura clarificado.

Outro isolamentò'do composto deseja_ do de fórmula (I), a partir do filtrado de cultura clarificado pode convenientemente ser eficaz por adsorção na resina de afinidade como resina de afinidade de D-alanil-D-alaninaSepharose (Sepharose ê uma Marca Registada).

composto desejado pode rapidamente ser identificado de um modo rotineiro, testando a actividade anti-bacteriana e/ou por registo do tempo de retenção por c.1.a.r.

Adequadamente, o processo de separa ção pode incluir um passo de cromatografia liquida de alto rendimento preferencialmente com o último passo. A eluição pode ser eficaz, usando Nal-^PO^ aquoso/acetonitrilo.

Os compostos de fórmula (I) e seus derivados, podem estar na forma cristalina ou não-cristalina e, se cristalinos, podem opcionalmente estar hidratados ,ou solvatados.

Os compostos de acordo com o invento são adequadamente fornecidos na forma substancialmente pura, por exemplo pelo menos com 50% de pureza, adequadamente pelo menos com 60% de pureza, vantajosamente pelo menos com 75% de pureza, preferencialmente pelo menos com 85% de pureza, mais preferencialmente pelo menos com 95% de pureza, especialmente pelo menos com 98% de pureza, sendo todas as percentagens calculadas de peso/peso. Uma forma impura ou menos pura de um composto de acordo com o invento pode,por exemplo, ser usado na preparação de uma forma mais pura do mesmo composto ou de um composto relacionado (por exemplo um derivado correspondente) adequado para uso farmacêutico.

Os compostos de fórmula (I) e seus

derivados farmaceuticamente aceitáveis têm propriedades anti -bacterianas e são úteis para o tratamento de infecções bacteriológicas em animais, especialmente em mamíferos,incluindo humanos, em particular em humanos e animais domesticados (incluindo animais domésticos de propriedade agrícola). Os compostos podem ser usados para o tratamento de infecções causadas por um largo número de organismos incluindo, por exemplo, aqueles aqui mencionados.

presente invento ainda fornece uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, em conjunto com um suporte ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

presente invento também fornece um método de tratamento de infecções bacterianas em mamíferos, especialmente em humanos e em mamíferos domesticados, que compreende a administração de um composto de fórmula(I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, ou uma composição de acordo com o invento, a um paciente em sua necessidade.

Os compostos do invento também têm potencial como promotores de crsecímento, em animais.Em concordância, um outro aspecto do invento fornece um método de promoção do aumento de peso e/ou aumento na eficiência de utilização de alimentação em animais de fazendas agrícolas, cujo método compreende a administração de uma quantidade eficaz, não tóxica de um composto do invento.

Os compostos e composições de acordo com o invento ,podem ser formulados para administração por qualquer via conveniente, para serem usados em humanos ou em medecina veterinária, por analogia com outros antibióticos.

V

-14Os compostos e composições de acordo com o invento, podem ser formulados para administração por qualquer via, por exemplo oral, tópica ou parenteral.

As composições podem, por exemplo, ser feitas na forma de comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pastilhas, cremes, xaropes ou preparações liquidas, por exemplo soluções ou suspensões, que podem ser formuladas para uso oral ou na forma estéril, para administração parentérica por injecção ou infusão.

Comprimidos e cápsulas para administração oral podem estar na forma de dosagem unitária, e podem conter excipientes convencionais incluindo, por exemplo, agentes de ligação, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, ou polivinilpirrolidona; agentes de enchimento, por exemplo, lactose, açúcar, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificantes de comprimidos, por exemplo estearato de magnésio, talco, polietilenoglicol ou silica; agentes de desintegração, por exemplo fécula de batata; e agentes de humidificação farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, lauri1-sulfato de sódio.

Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na prática farmacêutica corrente.

As preparações líquidas orais podem ser na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veiculo adequado, antes de serem usados. Estas preparações liquidas podem conter aditivos convencionais, incluindo, por exemplo, agentes de suspensão, por exemplo sorbitol, meti1-celulose, xarope de glucose, gelatina, hidroxi-etil-celulose, carboxi-meti1-celulose,estearato de alumínio, gel ou gorduras comestíveis hidrogenadas; agentes de emulsão, por exemplo lecitina, mono-oleato de sor1»

bitano ou acácia; veiculos não aquosos (que podem incluir óleos comestiveis), por exemplo óleo de amêndoa, esteres oleosos (por exemplo glicerina), propileno glicol, ou álcool etilico; conservantes, por exemplo p-hidroxi-benzoato de metilo ou propilo ou ácido sórbico; e, se desejado, agentes aromatizantes e corantes.

As composições de acordo com o invento, destinadas a administração tópica podem, por exemplo, estar na forma de pomadas, cremes, loções, pomada para os olhos, gotas para olhos, gotas para o ouvido, pensos impregnados, e aerossois, e podem conter aditivos convencionais apropriados, incluindo, por exemplo, conservantes, solventes para ajudarem na penetração da droga, e emolientes nos unguentos e cremes. Estas formulações tópicas podem também conter suportes convencionais compatíveis, por exemplo bases de creme ou pomada e etanol ou álcool oleilico, para as loções. Estes suportes podem constituir desde cerca de 1% a cerca de 98%, em peso, da formulação; mais usualmente, eles constituem atê cerca de 80% em peso, de formulação.

As composições de acordo com o invento podem ser formuladas como supositórios, que podem conter bases do supositório convencionais, por exemplo mante^ ga de cacau ou outros glicerídeos.

As composições de acordo com o invento, destinadas a administração parentérica podem convenientemente ser em formas de dosagem unitária, fluidas, que podem ser preparadas utilizando o composto e um veiculo estéril, sendo preferivel utilizar água. 0 composto, dependendo do veiculo e das concentrações usadas, pode estar ou suspenso ou dissolvido no veiculo. Na preparação de soluções, o composto pode ser dissolvido em água por injecçao e

esterilizado por filtração antes de encher um frasco ou ampola adequadas, que depois são seladas. Vantajosamente, aditivos convencionais incluindo, por exemplo, anestésicos locais, conservantes, e agentes tampão podem ser dissolvidos no veiculo. De modo a aumentar a estabilidade da solução, a composição pode ser congelada depois de estar no frasco, e a água removida sob vácuo; o pô liofilizado seco resultante, pode depois ser selado no frasco e pode vir acompanhado com um frasco com água para injecção quando da reconstituição do liquido antes de ser usada. As suspensões parentéricas podem ser preparadas, substancialmente na mesma maneira â excepção de que o composto é suspenso no veiculo em vez de ser dissolvido e a esterilização pode não ser conseguida por filtração. Em vez disso o composto pode ser esterilizado por exposição a óxido de etileno, antes de ser suspenso no veiculo estéril.

Vantajosamente, um agente surfactante ou de humidificação está incluído nessas suspensões de modo a facilitar uma distribuição uniforme do composto.

Um composto ou composição de acordo com o invento, pode adequadamente ser administrado ao paciente numa quantidade anti-bacterianamente eficaz.

Uma composição de acordo com o invento, pode adequadamente conter desde 0,1% em peso, preferencialmente desde 10 a 60% em peso, de um composto de acordo com o invento (baseado no peso total da composição), dependendo do método de administração.

Os compostos de acordo com o invento podem adeqiaiamante ser administrados ao paciente numa dosagem diária de desde 1,0 a 50 mg/kg do peso corporal. Para um humano adulto (de aproximadamente 70 kg de peso

corporal), desde 50 a 3000 mg, por exemplo cerca de 1500 mg, de um composto de acordo com o invento, pode ser administrado diariamente. Adequadamente, a dosagem para humanos adultos é desde 5 a 20 mg/kg, por dia. Dosagens superiores ou inferiores podem, contudo, ser usadas de acordo com a prática clínica corrente.

Quando as composições de acordo com o invento são apresentadas numa forma de dosagem unitária, cada dose unitária pode adequadamente compreender desde 25 á 1000 mg, preferencialmente desde 50 a 500 mg, de um composto de acordo com o invento.

Os Exemplos, seguintes ilustram o presente invento. Nos Exemplos, MM 45289 designa o composto de fórmula (I) em que R ê cloro, e MM 47756 designa o composto de fórmula (I), em que R ê hidrogénio.

Exemplo 1

a) Fermentação

A cultura NCIB 12531 cresceu durante 7 dias, a 26°C num plano inclinado de agar sólido numa garrafa de McCartney. 0 meio de agar teve a composição seguinte:

Constituinte

Quantidade (g/1)

Extracto de levedura Extracto de malte Dextrose Agar água desionizada atê 1 litro.

4,0

10,0

4,0

20,0

/Os constituintes foram todos produtos 'Bacto' (Bacto ê uma Marca Registada) fornecidos por Difco Laboratories, P.O. Box 14B, Central Avenue, East Molesey, SurreyJ. 0 meio foi ajustado a pH 7,3 antes de esterilização.

Ura suspensão de esporos foi preparada por adição de 10 ml de água esterilizada contendo 0,005% triton X 100 a uma cultura de NCIB 12531 em agar numa garrafa de McCartney, seguido de sujeição a um aparelho de ultra-sons, durante 1 minuto. Um ml desta suspensão foi adicionada a um frasco de meio do estado de semente /Triton X 100 foi obtido de B.D.H. Chemicals, Ltd., Poole; DorsetJ.

A fermentação em estágio de semente foi realizada num frasco cónico de 500 ml contendo 100 ml de meio de estágio de semente. 0 meio de estágio de semente continha:

Constituinte

Quantidade (g/1)

Farinha de feijão de soja 10

Glicerol 20

Maltose 2

Elementos vestigiários lotados 10 ml

Agua desionizada atê 1 litro

A solução dos elementos vestigiários lotados continha:

-19Constituinte Quantidade (g/1)

C aC12·2 H 2 0	10
MgCl2.6H20	10
NaCl	10
FeClg	3
ZnCl2	0,5
CuC12.2H20	0,5
MnS04.4H20	0,5
CoC12.6H20	0,5

meio foi ajustado a pH 7,3 antes de esterilização a 117°C durante 15 minutos.

/Ά farinha de feijão de soja foi Arkasoy 50 fornecida pela British Arkady Co. Ltd, Old Trafford, ManchesterJ.

A incubação foi realizada durante 72 horas a 26°C e 240 r.p.m. num agitador giratório.

Cinco ml de cultura de semente foi usada para inocular cada um dos vinte frascos cónicos de 500 ml, contendo 100 ml de meio de fermentação. 0 meio de fermentação foi idêntico ao meio do estado de semente.A fermentação foi fcealizada durante 96 horas a 26°C e 240 r.p.m num agitador giratório. 0 caldo colhido foi clarificado por centrifugação.

b) Isolamento do MM 45289 glicopeptideo, MM 45289 foi isolado a partir do caldo clarificado por adsorção numa resina de afinidade D-alani1-D-alanina Sepharose.

adsorvente de afinidade foi preparado a partir de D-alani1-D-alanina imobilisada em Activated CH-Sepharose 4B como descrito no Exemplo de Referência.

/Ό ácido 6-amino-hexanoico activadoSepharose-4B foi obtido de Sigma Chemical Co., Poole, DorsetJ· caldo clarificado (1000 ml), preparado como descrito em a) foi agitado durante 1 hora com resina de afinidade D-alani1-D-alanina-Sepharose (30 ml de volume húmido). A mistura foi filtrada num filtro de aglomerado de vidro e o filtrado foi descarregado. A resi na de afinidade foi lavada com ãgua destilada (100 ml) e filtrada como anteriormente. 0 glicopeptideo foi eluido a partir de resina de afinidade por agitação com amónia 0, IM, contendo 50% de acetonitrilo (50 ml), durante 15 min. A mistura foi filtrada e o filtrado evaporado sob pressão reduzida atê à secura, originando um sólido branco (50 mg).

sólido foi re-suspenso em água (50 ml) e o glicopeptideo adsorvido uma vez mais numa resina de afinidade D-alani1-D-alanina-Sepharose (30 ml de volu me húmido). A resina foi lavada com água e o glicopeptideo eluido com amónia 0,IM, contendo 50% de acetonitrilo,como prêviamente descrito. 0 eluente foi evaporado atê à secura originando 30 mg de MM 45289 substancialmente puro.

A espectroscopia de Massa de Bombardeei mento Atómico Rápido (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscqy) indicou um peso molecular de 1556+2 para o MM 45289.

A actividade anti-bacteriana do MM 45289 contra uma gama de organismos Gram positivos está indicada no Quadro seguinte.

Actividade Anti-bacteriana do MM 45289 contra uma

gama de organismos, determinada pelo método micro-
-título
Organismo	MM 45289
Bacillus subtilis
ATCC 6633	0,10
Coynebacterium
xerosis NCTC 9755	0,05
Sarcina lutea
NCTC 8340	0,05
Staphyloceccus aureus
'Oxford'	0,25
'Russell'	0,25
'V573' MR*	1,00
S.saprophyticus 1FL1'	2,00
S.epidermidis 60137	0,50
54815	0,50
Streptococcus .pirogenes
CN10	<0,03
S.agalactiae 'Hester'	0,10
S.sanguis ATCC 10556	0,50
S.faecalis 1	1,00

* Multi-resistente(Resistente a metici1ina,tetraciclina,eritromicina e gentamicina)

Exemplo 2

a) Fermentação

De modo a providenciar um largo volume de inóculo, para fermentação em larga escala,400 ml de meio de estágio de semente, preparado como dsecrito no Exemplo 1, foi usado para inocular 15L de meio de semente de segundo estágio num fermentador de aço inoxidável de 20L. 0 meio tem a mesma composição do meio do primeiro estágio, excepto à adição de agente anti-formador de espuma P2000 de poli-propileno glicol a 0,1% v/v. A cultura do segundo estágio foi incubada a 28°C agitada a 200 r.p.m. com um agitado de disco com três pás e pulverizado com ar estéril a uma razão de 0,5 volumes por volume por minuto, durante 72 horas.

Oito litros desta cultura foram usados para inocular um fermentador de aço inoxidável de 450L, contendo 300L de meio de fermentação com a mesma composição do meio de semente do segundo estágio. A cultura foi incubada a 20°C, e pulverizada com ar estéril a uma razão de 0,5 volumes por volume por minuto. A cultura foi agitada com um agitador de disco com três pás a 50 r.p.m., que foi aumentada para 75 r.p.m. às 24 horas e para 100 r.p.m. às 48 horas. A agitação foi mantida nas 100 r.p.m. durante o tempo restante da fermentação. A fermentação foi colhida às 75 horas e o caldo clarificado por centrifugação.

b) Isolamento do MM 45289 caldo clarificado do exemplo 2a) foi aplicado'a uma coluna de permuta aniónica Amberlite IRA 458 de 12L (na forma de Cl“) com um caudal de 1,5L/min.

/A resina foi fornecida por Rohm and Haas Ltd., Lenning House 2 Mason‘s Avenue, Croydon, SurreyJ. 0 filtrado, contendo MM 45289 foi recolhido, ajustado a pH 6,4 e foi carregar numa coluna de permuta catiónica Amberlite IRC 50 de 15L (na forma de Na⁺) com uma velocidade de fluxo de lL/min.

(A resina foi fornecida por Rohm and Haas Ltd). A coluna foi lavada com 10 litros de água e a água de lavagem descarregada. 0 material activo foi eluido a partir da coluna com uma solução de amónia 0,2M, a lL/min. Fracções de 10L foram recolhidas. As fracções com actividade antibiótica (6-11) foram combinadas e evaporadas in vacuo até atingirem um volume de 3,9L. Adicionou-se NaH₂P0^ para dar uma molaridade de 0,005M e o pH foi ajustado a 6,5 com NaOH, 5M.

eluato IRC 50 concentrado foi aplicado a uma coluna de permuta catiónica CM Sephadex C25 de 0,77L (na forma de Na⁺), previamente equilibrada com NaHgPO^ 0,005 M, pH 6,5. Z~CM Sephadex foi fornecida por Pharmacia Ltd., Uppsala, SwedenJ. 0 percolato foi descarregado, e a coluna foi lavada com NaH₂P0₄ 0,005M (IL), pH 7,0 e depois NaH₂P0₄ 0,05M (IL) pH 7,0. Os solventes de lavagem foram descarregados. 0 MM 45289 foi eluido, usando um gradiente exponencial de NaH₂PO^ 0,05M, pH 7,0 a Na₂HPO^ 0,2M, pH 10,0 (1 litro num vaso misturador) a um caudal de 20 ml/min. Fracções de 16 ml foram recolhidas. As fracções contendo o glicopeptideo (85-175) foram juntas, diluídas a 3L, com água desionizada, e o pH ajustado a 6,7 com HC1 5M. As fracções combinadas foram dessalinizadas usando resina de afinidade D-alani1-D-alanina-Sepharose (100 ml) de volu-24me húmido de resina). A resina foi agitada com as fracçoes combinadas durante/1 hora e a resina recuperada por filtração. A resina foi lavada com âgua (três alíquotas de 250 ml) e eluida com quatro alíquotas de 400 ml de amónia O,1M, contendo 50% de acetonitrilo. 0 percolato, que ainda contem alguma actividade antibiótica foi tratado uma vez mais, com resina de afinidade D-alani1-D-alanina Sepharose de 100 ml de volume húmido e a resina foi recuperada, lavada e eluida como anteriormente descrito. Os eluatos e as fracçoes de água de lavagem que contêm o MM 45289 foram combinados e a amónia e o acetonitrilo evaporados in vacuo. Adicionou-se NaH₂P0₄ à solução concentrada (1900 ml) para dar uma molaridade de 0,005M, e o pH foi ajustado a 6,6 com NaOH 5M.

A solução tamponada foi aplicada a uma coluna CM Sephadex C25 de 320 ml, previamente equilibrada com NaH₂P0₄ 0,005M, pH 6,6 a uma velocidade de fluxo de 10 ml/min. A coluna foi eluida usando um gradiente exponencial de NaH₂P0₄ 0,05M, pH 7,0 a Na₂HP0₄ 0,2M, pH 10,0 (500 ml num vaso misturador). Fracçoes de 16 ml foram recolhidas. Aquelas fracçoes contendo MM 45289,(65-140) foram combinadas e ajustadas a pH 6,5 com HC1 5M.

A solução foi agitada durante hora com resina de afinidade D-alanil-D-alanina-Sepharose (90 ml de volume húmido). A resina foi recuperada por filtração, lavada com quatro partes alíquotas de 400 ml de água desionizada e o MM 45289 eluido com amónia 0,lM contendo 50% de acetonitrilo (três alíquotas de 200 ml).O filtrado e a água de lavagem, que ainda contêm alguma actividade antibiótica foram combinados e re-tratados com resina de afinidade D-alani1-D-alanina-Sepharose, como anteriormente descrito. Este procedimento foi repetido duas vezes mais. As fracçoes de eluato foram todas combinadas

e evaporadas in vacuo para remover a amónia e o acetonitrilo. A solução foi finalmente seca por congelamento para originar 3,33 g de MM 45289 substancialmente puro. 0 sólido foi seco sobre P^Og antes de ser analisado.

Exemplo 3

a) Fermentação

Uma suspensão de esporos (1 ml) de NCIB 12531 em glicerol a 10%, lactose a 5%, Tween 80 a 0,01% em âgua desionizada, que foi armazenada em azoto liquido, foi usada para inocular um frasco de 500 ml contendo o meio seguinte:

Constituinte

Quantidade (g/1)

Glucose

15,0

Dextrina

20,0

Farinha de feijão de soja(Arkasoy 50) 15,0

Licor de infusão de milho (pulverizador seco)

10,0

Extracto de levedura

1,0

CaCO

2,0

Agua desionizada atê 1 litro pH ajustado a 6,7 antes de esterilização a 121°C, durante 15 minutos.

-26'λ

/Licor de infusão de milho foi fornecido por Roquette (UK) Ltd., Tunbridge Wells,Kent, UK.

Os outros constituintes tiveram como fornecedores os nomeados no Exemplo lj.

frasco foi incubado a 26°C, durante 72 horas, a 240 r.p.m. num agitador giratório.

Porções de 5 ml do estágio de semente foram usadas para inocular outros oito frascos de 500 ml contendo 100 ml do mesmo meio. Estes frascos foram incubados sob as mesmas condições, mas durante 48 horas.

Quatrocentos ml do segundo estágio de semente foi usado para inocular 15 L do mesmo meio, mas contendo agente anti-formador de espuma, P2000 de polipropileno-glicol (0,1% v/v), e preparado em água de torneira, num fermentador de 23L. 0 meio foi esterilizado, antes da inoculação, a 121°C, durante 60 minutos.A fermentação foi agitada com um agitador de disco com três pás apropriado a 200 r.p.m. com ar estéril a ser fornecido numa razão de 0,5 volumes por volume por minuto, e a incubação foi aos 28°C, durante 48 horas.

Oito litros do terceiro meio estágio de semente foram usados, para inocular 300L de meio de produção num fermentador de 450 L. 0 meio foi idêntico ao meio descrito no Exemplo 1, mas contendo agente anti-formador de espuma P2000 de propileno-glicol (0,1% v/v). 0 fermentador foi agitado com um agitador de disco com três pás apropriado a 50 r.p.m. com fornecimento de ar estéril a 0,5 volumes por volume por minuto. A cultura foi incubada aos 28°C, durante 76 horas.

caldo de cultura (300L) foi colhido durante 76 horas.

b) Isolamento de MM 45289 caldo clarificado foi aplicado a uma coluna de permuta iónica Amberlite IRA 458 de 12,5L (na forma de Cl) a uma velocicfede de fluxo de lL/min. A coluna foi lavada com 15L de água. 0 percolato e a água de lavagem foram combinados e o pH ajustado a 6,8.

Uma coluna de permuta iónica IRC 50 de 16,5L (na forma de Na⁺) foi equilibrada pela lavagem com 50L de NaH₂P0₄ 0,05M, pH 6,5, seguido por 50L de água desionizada. A .combinação do percolato IRA 458 e da água de lavagem foi carregar a coluna a uma velocidade de fluxo de 1L/ /min. A coluna foi lavada com 20L de água desionizada, e o percolato e água de lavagem descarregados.

material activo foi eluido a partir da coluna com solução de amónia 0,2M a lL/min. Fracções de 10 litros foram recolhidos. As fracções com actividade antibiótica (9-16) foram combinadas, ajustadas a pH 7,0 com ácido acético e evaporadas até um volume 4,2L.

eluato IRC concentrado foi carregar a coluna de permuta catiónica CM Sephadex C25 de 0,79L (na forma de Na⁺), previamente equilibrada com NaF^PO^ 0,005M, pH 6,5. A coluna foi lavada com NaH₂P0₄ 0,05M, pH 7,0 (1L) e o percolato e o solvente de lavagem foram descarregados. A actividade antibiótica foi eluida usando um gradiente exponencial.de Na^PO^ 0,05M, pH 7,0 a Nc^dPO^ 0,2M, pH 10,2 (1 litro num vaso misturador).Fracções de

ml foram recolhidas. As fracções ocntendo MM 45289 (55-145) foram combinadas (1,540 ml) e ajustadas a pH 7,0.

As fracções de CM Sephadex combinadas, foram diluídas a 5 litros e dessani 1 izadas numa coluna Diaion HP 2 0, de 1,5L /fornecido por Mitsubishi Chemical Industries, Tokyo, JapanJ. A velocidade de fluxo foi de 80 ml/mín. A coluna foi eluída com água desionizada, recolhendo-se três fracções de 500 ml e depois fraccçes de 250 ml. Asfracções contendo MM 45289 (5-11) foram combinadas e secas por congelamento, originando 10,3 g de MM 45289 substancialmente puro. 0 sólido foi seco sobre Ρ*2θ2 antes de ser analisado.

Exemplo 4

Preparação do MM 45289 por C.L.A.R. preparativa

MM 45289, preparado como descrito nos Exemplos 1 a 3, embora substancialmente livre de impurezas, pode conter 3-4% de MM 47756. 0 MM 47756 pode ser removido por cromatografia em coluna usando resina de permuta catiónica CM Sephadex, como descrito no Exemplo 6, para a preparação do MM 47756. Vestígios residuais do MM 47756 podem ser removidos a partir de amostras de MM 45289 por C.L.A.R. preparativa como descrito a seguir.

Cem mg de MM 45289 substancialmente puro, mas contendo 3% de MM 47756 foram dissolvidos em 1 ml de tampão de fosfato de sódio O,1M, pH 6,0 aplicando-se aliquotas de 2 x 250 yul a uma colunac.l.a.r.preparativa Dynamax 150-A, com 10 mmx300 mm /Ramin Instruments Co., Woburn, MA,USA/, que contem material de fase invertida C18.

A coluna foi eluida isocratieamente com tampão de fosfato

-29 , - i de sódio 0,IM, pH 6,0, contendo 5% de acetonitrilo, a um caudal de 6,0 ml/min. 0 eluente foi monotorizado a 210nm num espectrofotometro Waters Lambde Max model 481, usando uma célula de fluxo semi-preparativa.

As fracções foram recolhidas quando o MM 45289 começou a eluir da coluna (6 minutos) e em fracções de 2x1 minuto, seguido de fracções de 0,5 minutos. As fracções foram ensaiadas numa coluna c.l.a.r. analítica Waters, como descrito na secção dos Métodos de Detecção.

As fracções 2-4 de ambos os tempos de recolha contendo MM 45289 livre de MM 47756 foram combinados. 0 produto foi dessalinizado por tratamento com resina de afinidade D-alanil-D-alanina Sepharose como já foi descrito, e o eluato de afinidade evaporado in vacuo e seco por congelação, para originar 23 mg de MM 45289 contendo menos de 1% de MM 47756.

Exemplo 5

Preparação do MM 45289 por Focagem isoelêctrica preparativa

Os extractos semi-purifiçados de MM 45289 podem ser ainda purificados por focagem isoelêctrica preparativa como seguidamente se descreve.

Duzentos ml de MM 45289 parcialmente purificados foram dissolvidos em 50 ml de água, destilada e 1% de anfólito Bio-Lyte 3/10 foi adicionado/fornecido por Bio-Rad Laboratories, 1414, Harbour Way South, Richmond CA, USA?. A solução foi vasada numa câmara de focagem de uma

-30cêlula de focagem isoelêctrica preparativa Bio-Rad Rotofor. /Rotofor é uma Marca Comercial/. 0 fraccionamento foi tealizado a uma potência constante de 12W, durante 4 horas aos 5°C. Vinte fracções foram colhidas a partir da câmara de focagem. As fracções foram ensaiadas por c.l.a.r. As fracções 15-19 (pH 8,6-9,4), contendo MM 45289, foram combinadas, perfez-se o volume atê aos 50 ml com água destilada e foram novamente vazadas na câmara de focagem Rotofor, sem adição de mais anfólito. A focagem foi realizada a 12w, a potência constante durante 4 horas aos 5°C, e as fracções recolhidas foram ensaiadas por c.l.a.r. As fracções contendo MM 45289 (fracções 13-18, pH 8,9-9,1) foram combinadas, ajustadas a pH 6,5 e tratadas com resina de afinidade D-alanil-D-alanina Sepharose, como descrito nos exemplos anteriores, para remover os anfólitos. 0 eluato de afinidade foi evaporado in vacuo e seco por congelação, dando origem a 68,0 mg de MM 45289 substancialmente puro.

Exemplo 6 (a) Fermentação

Duzentos ml de cultura de semente obtida como descrita no Exemplo 1, foi usada para inocular 15 litros do meio de fermentação num fermentador de aço inoxidável de 20 litros. 0 meio de fermentação foi idêntico ao meio de estágio de semente excepto que para o controlo da formação de espuma, 0,1% v/v de poli-prcpileno-glicol,

P 2000 foi adicionado no meio de fermentação, antes da esterilização./? 200 foi fornecido por KWR Chemicals Ltd.,

133-35 Eleanor Cross Road, Waltham Cross, HentsJ. 0 meio foi esterilizado com vapor do fermentador durante 60 minutos a 120°C. A fermentação foi realizada durante 93 horas, aos 28°C e a 200 r.p.m. por um agitador de disco com três t 9 *

pás de diâmetro de 100 mm e fornecido com 7,5L/ min de ar estéril. 0 caldo colhido foi clarificado por centrifugação. 0 caldo clarificado contem MM 47756 e MM 45289.

b) Isolamento do MM 47756

Uma parte aliquota de 4 litros dos 12 litros do caldo clarificado, obtido da fermentação, foi carregar a 10 ml/min uma coluna de permuta iónica IRC-50 com resina, Amberlite (na forma de Na⁺), (55xl80cm/ ΖΆ resina foi fornecida por Rohm and Haas UK Ltd., Lenning House, 2 Masons'Ave., Croydon UK/.

A resina foi lavada com água (IL) e os antibióticos MM 47756 e MM 45289 eluidos com NaCl 1M a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min. Fracções de 400 ml foram recolhidas. As fracções foram bioensaiadas pelo método do orificio no prato usando S. aureus V573. As fracções antibacteriologicante activa (1-5), contendo a mistura de MM 47756 e MM 45289, foram combinadas e agitadas com resina de afinidade, D-alani1-D-alanina Sepharose (30 ml de volume húmido)durante 1 hora.

A resina foi filtrada e lavada com água (4x 400 ml) e depois eluida com amónia 0,lM contendo 50% de acetonitrilo (2x 200 ml), 0 eluato foi evaporado sob pressão reduzida, dando origem a umasólido em creme (94 mg).

Adicionou-se tampão de fosfato de sódio 0,05M, pH 7,0 (50 ml) ao sólido e a mistura foi carregar uma coluna de permuta catiônica CM Sephadex C25 (28x2,5m) compactada com tampão de fosfato de sódio 0,05M, pH 7,0.

-32(Sephadex ê a Marca Comercial). (A resina foi fornecida por Pharmacia Ltd, Uppsala, Sweden). A coluna foi lavada com tampão de fosfato de sódio 0,05M, pH 7,0 (400ml) e os gl icopeptideos são depois eluídos usando um gradiente exponencial de tampão de fosfato de sódio 0,05M, pH 7,0 a pH 10,0, (250 ml na câmara misturadora) a uma velocidade de ) gluxo de 3 ml/min. Fracções de 10 ml foram recolhidas.

Aquelas fracções que mostraram actividade antibacteriolôgica foram ainda monitorizadas por c.l.a.r. As fracções 75-84 contêm predominantemente MM 47755. As fracções 85-108 contêm predominantemente MM 45289. As fracções que contêm * predominantemente MM 47756 foram combinadas. 0 ph das fracções combinadas foi ajustado a 6,5 e a solução foi agitada durante 1 hora, com resina de afinidade D-alani 1-D-alanin.a Sepharose, (30 ml de volume húmido). A resina foi lavada com água, e eluida com amónia 0,lM contendo 50% de acetonitrilo como previamente descrito. As fracções de eluato goram combinadas e evaporadas originando 23 mg de MM 47756.

Adicionou-se fosfato de sódio

0,05M, pH 7,0 ao sólido e a mistura foi carregar uma segunda coluna CM Sephadex (25xl05cm). A coluna foi lavada e eluida com um gradiente de fosfato de sódio como descrito para a primeira coluna CM Sephadex, à excepção da velocidade de fluxo ser 2 ml/min e fracções de 5 ml terem sido recolhidas. As fracções antibacteriologicamente activas foram ainda monitorizadas por c.l.a.r. As fracções contendo MM 47756 (fracções 58-61) foram combinadas ajustadas a pH 6,5 e dessalinizadas com uma resina de afinidade D-alanil-Dalanina Sepharose como anteriormente descrito. 0 eluato da resina de afinidade foi evaporada até â secura e ainda purificado através de dissolução em água (10 ml) e sua submissão a um cartucho C18 Sep-pak //fornecido por Waters Associates,

Maple Street, Milford, Mass, USA/. 0 cartucho foi lavado com água (2 xlO ml) e o glicopeptideo foi eluído com metanol a 50%, contendo amónia 0,1M (10 ml). 0 eluato foi evaporado,

-33originando 4,5 mg de MM 47756 substancialmente livre de MM 45289. A Espectroscopia de Massa por Bombardeamento Atómico Rápido indicou um peso molecular de 1522+1.

A actividade antibacteriana do MM 47756 contra uma gama de organismos Gram positiva está indicado no Quadro seguinte:

Actividade Antibacteriana do MM 47756 contra uma gama de organismos, determinada pelo método_ micro-título (MIC xig/ml)

Organismo	MM 47756
Bacillus subtilis
ATCC 6633	0.25
Coynebacterium
xerosis NCTC 9755	1.0
Sarcina lutea
NCTC 8340	1.0
Staphylococcus aureus
Oxford'	0.25
'Russell'	2.0
'V57 3' MR*	0.5
S.saprophyticus 'FL1'	1.0
S.epidermidis 60137	1.0
54815	1.0
Streptococcus piroçenes
CN10	0.12
S.agalactiae 1Hester1	0.5
S.sanguis ATCC 10556	1.0
S.pneumoniae Pu7	0.5
S.faecalis 1	2.0

*Multi-resistente(resistente a metici1ina,tetraciclina,gritromicina e gentamicina)

ί -» '*·

Dados Caracteristicos

Propriedades físicas e espectrais do MM 45289 depois de seco sobre Ρ₂θ5^:

SM-BAV (FAB-MS) (glicerol/tio-glicerol/ãcido tri-fluoroacêtito)

MH⁺ 1557+1

Peso Molecular: 1556

Fórmula molecular: ^C73^H89^N10°26^C1

UV ^(H2^{0) A}max ^280nm (β 6215) ²⁰

Z«yD -118° (C = 0,97% em H₂0)

IV (KBr) 1660, 1590, 1500, 1070 cm¹

-35RMN em DMSO d^ a 358°K. Tetrameti1-silano ê usado como padrão interno.

8.45 (IH largo s)', 8.23 (IH, dl, J ca.5HZ)*,

7.95 (IH, dl, J ca.SHz)’, 7.63 (IH, d, J 8 QHz); 7.52 (IH, d, J 8.3Hz)·, 7.39 (IH, S)i 7.33 (IH, dl )\ 7,23 (IH, d, J 8.3Hz), 7.12 (IH, S)í 7.1 (IH, 1 d)) 6.97 (IH, d, J 8.0HZ); 6.76 (IH, dd, J 8.4 .e 2.0Hz), 6.68 (IH, d, J 8.4Hz); 6.45 (IH, d, J 2.0Hz); 6.33 (IH, d, J

2.0HZ); 5.68 (IH, l)) 5.63 (IH, s)', 5,50. (IH, d, J 7.4Hz)’, 5.43 (IH, s)5.27 (2H, sobreposição) ; 5.13 (IH, d, J ca.2Hz); 4j70 (2H, sobreposição); 4_?50 (IH, d, J 6HZ); 4.47 (IH, d, J 6.1); 4.33 (IH, 1);,’ 4.21 (IH,

1)', 4.13 (IH, dq, J 6.0 e 9.6Hz),‘ 3.75 - 3.30 (7H, sobreposição ) 3.00 (IH, dd, J 7.8 e 5.8Hz)* 2.88 (IH, d, J 9.6Hz); 2.86 (IH, d, J 9.6Hz); 2.58 (IH, dd, J 15.8 _e 4.0Hz)’, 2,3(2 (3H, s), 2.17 (IH, dd, 15.8 e 6.8Hz),’ 1.90 (IH, dl, J ca.l3Hz)‘, 1,82 (IH, d, J 13j7Hz),‘ 1.77 (IH, m),' 1.60 (2H, sobreposição J 13.5 e’ 4.4Hz), 1.52 (IH, m), 1.42 (IH, m)‘ 1.18 (3H, d, J 5.9Hz); 1.13 (6H, s); 1.09 (3H, d, J 6.0Hz); 0.92 (3H, d, J 6.6Hz); 0.89 (3H, d, J 6.6Hz) ppm.

Hidrólise ácida (6MHC1/110°/18hrs/N₂/trigo selado) deu ácido aspártico e N-metil-leucina.

Dados fisicos e espectrais do FAB-Ms (thioglicerol/glicerol)MH⁺ 1523+1 Peso molecular: 1522

Fórmula Molecular: ^C73^H90^M10°26

RMN em DMSO dg a 353°K, Tetrameti1-si1 ano usado como padrão interno.

Inter alia 7_;61 (2H, d, J ca.8.0Hz)', 7.4 - 7.2 (3H, sobreposição ~ m) ,* 7.13 (IH, dd, J 8.0 e 2.0Hz)) 7.10 (IH, d, J 2.0 Hz),⁴ 7.07 (IH, dd, J 8,0 e. 2.0Hz)) 6.97 (IH, dd, J 8.0 _e 2.0Hz);

6.76 (IH, dd, J 8.5 e.· 2.0Hz),’ 6.68 (IH, d, J 8.5Hz)' 6.40 (IH, d, J 2.2Hz)) 6.35 (IH, d, J 2.2Hz) ppm.

Métodos de Detecção

a) As amostras de fermentação e as fracções da coluna foram monitorizadas para a actividade antibiótica através do bio-ensaio sobre Staphylococcus aureus V573, usando o método do orifício no prato convencional.

b) 0 MM 45289 e o MM 47756 têm um máximo caracteristico no UV a 281 nm. As amostras putificadas podem ser ensaiadas

usando a medição directa desta absorção.

c) As preparações do MM 45289 e do MM 47756 foram ensaiadas numa coluna de cromatografia liquida de alto rendimento Waters (3,9 x 300 mm) contendo material de fase invertida /ibondapak.C18. /Waters Associates, 34 Maple Street, Milford, Mass. USA.J. Os glicopeptideos foram eluidos da coluna com NaH₂P0₄ 0,1 Μ , pH 6,0 contendo 9% de acetonitrilo com uma velocidade de refluxo de 2 ml/min. 0 eluente foi monitorizado a 210 e a 200nm por um monitor c.l.a.r. de ensaio díodo Hewlet-Packcard 1040A (Hewlet-Packard , Corvallis

Division, 100 N.E. Circle Boulevard,Corval1is,Oregon, USA7 ou um monitor UV Cecil modelo CE 2112/Cecil Instruments Ltd., Milton Industrial Estate, Milton, Cambridge, UKJ. Sob estas condições o MM 45289 e o MM 47756 têm tempos de retenção de

4.2 e 5,8 minutos respectivamente (cf. Vancomicina com

11.2 minutos).

Usando o mesmo sistema de c.l.a.r. mas eluindo com tampão de fosfato de sódio 0,lM, pH 7,5 contendo 15% de acetonitrilo e reagente contra-iónico de heptano-sulfonato de sódio, 0,005M, o MM 45289 e o MM 47756 têm um tempo de retenção de 7,6 e 3,6 minutos, respectivamente. Com tampão de fosfato de sódio 0,lM, pH 6,0 contendo 12% de acetonitrilo e reagente contra-iónico de heptano-sulfonato de sódio 0,005M, o MM 45289 e o MM 47756 têm tempos de retenção de 11,8 minutos e 9,0 minutos (cf. Vancomicina com 7,0 minutos).

Preparação de adsorvente de afinidade éster N-hidroxi-succinimida do ácido 6-amino-hexanoico Sepharose 4B (60g) foi colocado num filtro de aglomerado de vidro e lavado com solução de ácido cloridrico lmM (2L) sob sucção. 0 bolo húmido foi depois adicionado a uma solução de D-alani1-D-alanina (1,5g) numa solução de bicarbonato de sódio O,1M (60 ml) e ocasionalmente agitado, durante a hora seguinte. A suspensão foi filtrada sob sucção e o residuo suspenso em tris-(hidroximetil) amino-metano O,1M (TRIS) (100 ml) durante 1 hora e depois re-filtrado através de um filtro de aglomerado de vidro. 0 bolo foi lavado sucessivamente com solução de bicarbonato de sódio O,1M, TRIS 0,05M (contendo cloreto de sódio 0,5M), tampão formiato 0,05M a pH 4,0 (contendo cloreto de sódio) e finalmente água destilada. A resina de afinidade foi depois armazenada a 4°C, numa suspensão aquosa.

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   I^ã. - Processo para a produção de um composto de fórmula (I) em que R ê hidrogénio ou cloro, caracterizado por compreender (a) a cultura de Amycolatopsis orientalis NCIB 12531 ou de um seu mutante e subsequentemente o isolamento do composto de formula (I) ou de um seu derivado a partir da cultura, e/ou (b) separação do composto de fórmula (I) ou de um seu derivado, a partir de uma sua solução em mistura com outras substâncias com actividade anti-bacteriana e/ou substâncias inactivas, por adsorção sobre uma resina de afinidade.
2. 2^â. - Microorganismo caracteri-40- zado por ser Amycolatopsis orientalis NCIB^:12531 ou um seu mutante, na forma biologicamente pura.
3. 3^â. - Processo para a preparação de um medicamento para ser utilizado no tratamento de infecções bacteriológicas em animais, incluindo humanos, caracterizado por se incluir no referido medicamento um composto de formula (I), como definido na reivindicação 1, em que R ê cloro, juntamente com um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

   reivindicação 3, lado na forma de tórios.
4. 4^â. - Processo de acordo com a caracterizado por o medicamento ser formupÓ, grânulos, pastilhas, cremes ou suposi
5. 5^â. - Processo de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado por o referido medicamento ser adequado para a administração tópica.
6. 6^â. - Processo de acordo com as reivindicaçães 3, 4 ou 5, caracterizado por o referido composto ser substancialmente puro.

   < 11¾

   41Cs.

   V
7. 7^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido composto ter pelo menos uma pureza de 85% em peso.