PT92525A - Processo para a preparacao de um complexo de compostos glicopeptidicos - Google Patents

Description

*

0 presente inventes diz bacterianamente activos que podem microQrqanismQ5 a processos para a ç!d farmacêutica. respeito a no vos materiais CT0 r obtidos a partir de um sua i sroduçao3 e à sua utiliza--· T sm sido i so1ados da natureza alguns ir vários metabolitos partir produz um grande número de microorganismos a destes microorganismos têm mostrada 5 os quais podem ser isolados e alguns antibacteriana útil. Um de tais metabo·- crê* ser tm novo complexo de compos— trou ac t x v idaae antxhacterxana útil. dos quais têm actividade litos é uma substância qu tos glicopeptidicos e mos 0 presente invento fornece, de acordo com o exposto, o novo complexo de compostos glicopeptidicos que pode sr obtido como descrito unais adiante no Exemolo 1 ou 2. 0 complexo tem as seguintes características s pode ser obtido através da cultura de um microorganismo da ordem nm x c o 1 a to os i s g (ii) o complexo compreende g1icopeptidicos, incluindo nove ou maiscompostos três compostos que foram e designados por MM ΟΟΞ7Θ, Mn 5o271 e MM 05: contra Staohvlococcus mostra actividade antihactsrian au reus V573. r kí r=-a

3-ss que os referidos MM cr cr·”! *7 7®, MM 55271 sejam novos compostos glicopeptí. forma um outro apecto do invento a sua utilizaçlo. Eles têm os estabelecidos mais adiante na se d .icos, e, portan to» , juntaments com a daaos qu.e os os cç"Md experimental. d sua e MM 55272 a um deles produçSo e carac teri zam 0 presente inventa fornece também um processa para para a produção de um complexo ou composto de acordo com o invento5 o qual compreende a cultura de um micraorganismo produtor e o isolamento subsequente do produto ou de um seu derivado a partir da cultura* D presente invento fornece para além disso um processo para a preparação de um complexo ou composto de acordo com o invento, o qual compreende a separação do produto ou de um seu derivado a partir de uma sua solução em mistura com outras substancias antibacterianamente activas e/ou substâncias ínacti-vas por absorção sobre uma resina de afinidade» 0 termo "cultura" <e derivados desse termo;* tal como aqui utilizados, significa o crescimento aeróbico deliberado de um organismo na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto, enxofre e sais minerais» Este crescimento aeróbico pode tomar lugar num meio nutritivo sólido ou semi—sóiido, ou num meio liquida na qual os nutrientes slo dissolvidos ou suspensos» A cultura pode tomar lugar sobre uma superfície aeróbica ou por cultura submersa» 0 meio nutritivo pode ser composto tís nutrientes complexos ou pode ser quimicamente definida»

Foi descoberto que esses microorganismos adequados para utilização no processo de cultura de acordo com o invento incluem estirpes bacterianas que pertencem á ordem Amycolaçitosis» Foi ainda descoberto que um exemplo de tal estirpe é sp= NCIB 46€?86 e também os seus mutantes, os quais foram isolados a partir da natureza. 0 termo "mutante”, tal como aqui utilizado, incluí Qualquer estirpe mutante que surja espontaneamente ou através do afeito de um agente externo, se esse agente for aplicado

•Cd* \

d s 1 ibsradamer,ts ou ds outro modo» Métodos adequadas de produção tís mutantss incluam aqueles dsscritos por H,l = Adlsr em “Techní-quss for the Dsvslapment of Hicraorganisms" em "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorqanisms"5 Procssdings of a SyopasiuiH, visnna= 1973página 241=, International Atomic Enargy Auihority, e inclusot íi> Radiação ds ionização le.eu raios X e raios luz u»v»5 luz u,v. ma is um agente ds fotossens-ifci I ização (sn, S-mstoxipsoraleno) s ácido ni iroso,, hidren-íi lamina* análogos ds bass pirimidina (s.g. 5-bromouracil> ? acridinasj agentes ds alquilaçlo (s.g« gás ds mostarda, nustano-sulfonato ds atilo) ,= peróKido ds hidrogénio., f anéis., forma los ido, calor, s íii) Técnicas genéticas* incluindo* por exemplo* rscombina- çlo., transformação* transdução* lisoganisacSo* conversão lisogénicâp fusão ds protoplastos s técnicas seleciivas para mutantes ssEsntânsos,

Pensa-se que o sp» NCIB 4ΘΦ86 seja uma espécie não revelada anteriormente e, deste modo, forma também uma parte do presente invento* particu1ar.mente na forma biologicamente pura Foi depositado nas National Collections of Industrial and Marins Bactéria Ltd» (N.C.I.B), Aberdsen* Scotland* sob o número 4®®3ó 0;:: O W ds Novembro ds 1988« 0 meio de fermentação para a cultura de sp* ΝΟΣΒ 4ΘΘ86 conte® fontes de carbono assimilável e de azoto assimilável, juntamente com sais inorgânicos* Fontes adequadas de azoto incluem sxtracto de levedura, farinha de soja, extracto de carne, caroço de algodão* farinha, malte* solúveis secos de destilador, afiõ no-ácidos* hidrolisados de proteína e azoto de amónio e de V.-Λ ", - 5 i · ' nitrato» Fontes adequadas de carbono incluem glicose, lactose, ma1 tose, amido s glicerol» Adequadament s, o meio de cultura inclui também iões de metal alcalino (por exemplo, sódio), iões tíe halogénio ipor exemplo-, cloreto) , e iões de metal alcalino™ -terroso (por exemplo» cálcio e magnésio), bem como elementos vestigiais tais como ferro e cobalto» A cultura pode ser efectuada, adequadamente, a uma temperatura de cerca ds 20 até 35 ®C, vantajosamente 20 até 30 s a cultura pode adequadamente ser recolhida até 7 dias, vaniajo-samante cerca de 3 até 5 dias, depois do início da fermentação a fim de se obter um rendimento óptimo» 0 produto desejado ou um seu derivado pode ser então isolado a partir tio meio de cultura e processado e purificado utilizando técnicas convencionais para compostos glicopeptídicos. Todos estes procedimentos de isolamento e purificação podem ser ronvsniontsmsnte sfsctuados a frio até à temperatura ambiente5 por exemplo a uma temperatura dentro da gama de desde 4 até 30°C; convsnientemente dssds 2Θ atá 250C» 0 produto desejado é geralmente obtido predominantemente & partir do filtrado da cultura, e ê portanto conveniente, re1ativamente ao primeiro passo de isolamento, incluir a remoção do material sólido a partir do caldo de fermentação por, por exemplo, filtração ou centrifugação, de modo a obter-se um filtrado clarificado da cultura» 0 posterior isolamento do produto desejado a partir do filtrado da cultura clarificado pode conven i en temen te ser reali-cado pc?r sdsorção numa resina ds afinidade tal como resina de aí inidade D---alanil-D-alanina-ssfarose» >

0 produto desejado pode ser rápidamsnts identificada ds um modo rotineiro fazendo um teste quanto è actividsds antibacts..... tona ®/ou por monitorizaçlo do tempo de retenção por c»l»a«r«

Apropr i adamen te , o procedimento de separaçlo pode incluir um passo ds cromatografia liquida ds alta resolução, de prefer@nc.ia constituindo o último passo» h eluiçSo pode ssr sfsctuada usando N-sH~Pu~ aquoso/acetonitri 1 o»

Cada produto de acordo com o invento é proporcionado apropriadamente numa forma sufestancia1mente pura, por exemplo com pelo menos 5ΘΧ ds pureza, apropriadament® com pelo menos 60% de pureza, vantajosamente com pelo menos 75% de pureza, ds preferência com pelo menos 85% de pureza, com maior preferência com pelo menos 93% de pureza, especialmente com pelo menos 98% de pureza, sendo todas as percs-n tagens calculadas como peso/peso» Uma forma impura ou menos pura ds um produto de acorda com o invento pods = por exemplo, ser usada na preparaçlo de uma forma mais pura do mesmo produto ou de um produto afim (por exemplo um derivado correspondente) apropriado para utilizaçSo fannacêutiea»

Os produtos do invento possuem propriedades antibacts-rianas s sSa úteis para o tratamento de infecçSes hacterianas em animais, especialmente mamíferos, incluindo seres humanos, em particular seres humanos e animais domesticados (incluindo animais tíe lavoura). Os produtos podem ser usados para o trata-mento ds infseções causadas por uma ampla série ds organismos incluindo, por exemplo, os aqui mencionados» 0 presente invento proporciona uma composiçSo farmacêutica compreendendo um produto de acordo com o invento ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável juntamente com um veículo ou excipiente íarmaceuticamente aceitável» ir

0 presente invento proporciona também um método para o tratamento de infecções bacterianas sm animais, sspsciaimsnts em seres humanos s em mamíferos domesticados, o qual consiste em administrar um produto ds acordo com o invento ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável , ou uma composição de acordo com o invento5 a um paciente necessitando desse tratamento»

Os produtos e composições de acordo com o invento podem sor formulados para adniinistraçSo em qualquer modo conveniente para utilização em medicina humana ou veterinária, por analogia com outros antibióticos»

Os produtos s composições de acordo com o invento podem ser formulados para administração por qualquer via, por exemplo via oral. tópica ou parsntérics» As composições podem. por exemplo, ser preparadas na forma de comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pastilhas, cremes, xaropes, ou preparações líquidas, par Sfiemplo soluções ou suspensões, as quais podem ser formuladas para utilicação oral ou sob uma forma estéril para administração parentérica por injecção ou isifusão»

Os comprimidos e cápsulas para administração oral podem apresentar-se sob a forma de unidade de dosagem, e podem conter sKcipisntes convencionais incluindo, por exemplo, agente® de ligação, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, traga-canto, ou polivini1 pirrolidonaq agentes de enchimento, por exemplo lactose, açúcar, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina? lubrificantes para a formação de comprimidos , por exemplo estearato de magnésio, talco, polietileno-glicol ou sílicas desintegrantes, por exemplo amido de batataρ e agentes molhsntes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo lauril-sulfβίο de sódio» Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na prática farmacfuiica normal» -X -.-X '

As preparações liquida» orais podem sprssentar-se sob & forma de* por exemplo* suspensões aquosas ou oleosas* soluções* emulsões* xaropes ou elixires* ou podem sprssentar—se sob a forma de um produto seco para rsconsíituição com água ou com um outro veiculo apropriado antes da utilização» Essas preparações liquidas podem conter aditivos convencionais* incluindo* por exemplo* -agentes da suspensão* por exempla sorbitol* metll-cslulase* xarope de glucose* gelatina* hidroxietil-celulose* carboximetil- .....celulose* gel de estearato de alumínio ou gorduras comestíveis hid rogenadas f agentes emulsionantes* por exemplo lecitina* mono-o1eato de sorbitano ou acácias veículos não aquosos (as quais podem incluir óleos comestíveis)* por exemplo óleo de amfndoa* ésteres oleosos (por exemplo glicerina)* propileno-gli-col* ou álcool etílico^ conservantes* por exemplo p—hidroxiben-soato de metilo ou propilo ou ácido sórbicof e* se desejado* agentes de aromatizantes e corantes convencionais»

As composições de acordo com α inventa destinadas â administração tópica, podem* por exemplo, apresentar-se sob a forma de pomadas * cremes, loções* pomadas para os olhos* gotas para os olhos* gotas para os ouvidos* pensos impregnados, e a-srossois * a podem conter aditivos convencionais apropriados * incluindo* per exemplo* conservantes* solventes que auxiliem a penetração da droga* e emolientes em pomadas e cremes» Essas íormu1açSes tópicas podem também conter veículos convencionais compatíveis * por exemplo bases para creme ou pomada* a stanol ou. -álcool ’ oleilico para loções» Esses veículos podem constituir de cerca de 1% a cerca de 98% em peso da formulação! ma is usualmente eles constituirão até cerca de 8®% em peso da formulação»

As composições de acordo com α invento podem ser formuladas como supositórios* os quais podem conter bases

convencionais para supositórios* por exemplo manteiga de cacau ou outros glicsrítíecs»

As composições de acordo com o invento destinadas á administração parentérica podam apresentar-ss canvenienteaente sob formas de unidades de dosagem fluidas* as quais podem ser preparadas utilizando o composto e um veiculo estéril * senda preferida a água * Oís) ingredienteís) activoís)* dependendo do veiculo s da concentração usada, pode-Cm) estar ou suspenso<s) ou dissolvido<s) no veículo» Na preparação das soluções* o produto poda ssr dissolvida em água para injecçãa e esterilizada por filtração antes de ser introduzido num frasquinho ou ampola apropriada * a qual é então selado» Van taj osamen te * os aditivas convencionais incluindo* por exemplo, anestésicos locais* conse?— vantes, e agentes tamplo podem ser dissolvidas no veículo» A fim de aumentar a estabilidade da solução* a composição pode ser congelada depois de ser introduzida no frasquinho e a água removida sob vácuo§ o pó liofilizado seco resultante pode então ser selado no frasquinho e pode ser fornecido um frasquinho acompanhante de água para injecção a fim de reconstituir o liquida antes da utilização» Suspensões parentéricas podem ser preparadas substancialmente do mesmo modo exceptuando o facto do produto sctivo ser suspenso no veículo em vez de ser dissolvido & a esteri1izaçlo não pode ser realizada por filtração» 0 produto pode de outro modo ser esterilizado por exposição a óxido de stilsno antes de ser suspensa no veiculo estéril. Vantajosamente* é incluído nessas suspensões um surfactanie ou um agente molhar» is a fim de facilitar uma distribuição uniforme do produto»

Um produto ou composição de acordo com o invento pode apropriadamente ser administrado ao paciente numa quantidade antibacteriamamente eficaz» ' V.

Uma composição da acordo coo o invento pode conter aprcpr iatíasnenis de ®sí% em peso» de preferência de 10 a &®% em pascr da um produto da acorda com o invento < tendo como base o osso total da composição) = dependendo do método de administração»

Os produtos de acordo com o invento podem apropriada-monte ser administrados ao paciente numa dose diária variando entra i 3® e 5$ mg/kg do peso corporal» Para um ser humano adulta {com apro;;imadamente 7® kg de peso corporal) 3 entre 5® e 3 = ®®© nc» por exempla cerca de 1*5®® mg3 de um produto de acorda com a invento podem ser administrados diáriamente» Apropriadamentes a dosagem para seres humanos adultos varia entre 5 e 2Θ mg/kg por dia= Dosagens mais elevadas ou mais baixas podems contudo» ser usadas de acordo com a prática clinica normal»

Quando as composições do acordo com o invento slo apresentadas sob a forma de unidade de dosagem3 cada unidade de dosagem pode compreender apropriadamente de 25 a 1»ΘΘΘ mg3 de preferência de 59 a 599 mg, de um produto de acordo com o inven- ....

%..W

Os Exemplos que se seguem ilustram a preparação de produtos da acordo com o presente invento»

Produção ,e Isolamento do........c o?n- : suo......g 1 j ç c cg;r:: idtr o a5 Fermentação A cultura NCIB 4Θ®86 foi feita crescer durante 7 dias a 2ú°C num plano inclinado de agar sólido numa garrafa de McCar-iney. 0 meio de agar tinha a composição que se segues

Ci20Ji.yj^Ínte

Quantidade (q/l)

Extracto de levedura fcxtracto ds malte

Dertroas

Ag ar Agua desionizada

Ats 1 litro ECs constituintes eram todos produtos "Bacto” (Bacto à uma Marca Registada) tal como são fornecidos pelos Difco Laboratories9 P»0» 3o x 1435 Central Avenue, East MolsseyP Surreyl» 0 meio foi ajustado para PH /s,i antes da esterilizaçlo»

Foi preparada uma suspensão de esporos adicionando ÍO ml de água esterilizada contendo 03005% de Tricon X 100 a uma cultura de NCíB 4ΘΘ86 em &gar5 numa garrafa de McGsrtney» seguido por sonicaçSo da suspensão durante um minuto» ETriton X iu@ foi obtido a partir cia 8.D.H. Chemical Ltd» , Pools,, E*orset3. Foram usadas porçSes 11 ml) de suspensão de esporos a fim de inocular o meio ds fermentação (1ΦΦ ml) contido em frascos cónicos de 5©θ ml fechados com rolhas plásticas de espuma« 0 meio de ferment aç l'o continha

Constituinte

Quantidade (α/I)

Farinha de soja 31icsrol rlal tc?ss CaCl^.áH^O m 20

Solução elementos vsstiçiais Agua desionizada 10 ml atá 1 litro A solução do lote de elementos vestigiais continhas

Constituinte Quantidade CaCl„.2H^0 10 rigCl^,»6H^0 1Φ Na Cl 10 FeC I _ Λ ZnCl, 0,5 CuCl^.SH^Q Θ P 5 MnS0..4H„0 H' 0,5 0 meio foi ajustado para pH /$ó antes da esterilização a 117°C durante 15 minutos» EA farinha de soja era Arkasoy 5@ fornecida por Arkady - ADM? Manchester5 U«K.3 « A incubação foi levada a cabo durante 12© horas a 2è*C s 240 r.p.ffi. num agitador giratório. 0 caldo colhido foi clarificado por centrifugação» Foram monitorizadas amostras relativamen··· te à actividade antibiótica por bioensaio sobre Staohylococcus L- =. utilizando o método convencional de placa de um orifício» b) Isolamento do complexo

0 caldo clarificado C1500 ml) preparado como descrito em a) foi agitado durante 1 hora com con resina de afinidade d@ D--s 1 ani 1 -D~a 1 anina-sefarose (15 ml de volume Húmido)» 0 absorvente de afinidade foi preparado a partir da D-alanil-D—alanina imobilizada sobre CH-Sepharose 4B activada Ca se f af ross-4B activada com ácido ó-amino-bexanoico foi obtida a partir de Sigma Chemical Co» ? Poole, Dorsetl. A mistura foi filtrada sobre ura funil de aglomerado de vidro o o filtrado foi desprezado» A resina de afinidade foi rsssuspensa em água desionizada (75® ml) s filtrada como anis-riorrasnte» A resina foi lavada uma vez mais com água desionizada» 0 complexo q1icQpspfcidico foi eluído a partir da resina da afinioatís cora ΘΦ& ml de amónia ®? 1 M contendo 5®% de acetonitrilo.» 0 ©luata foi evaporado sob pressão reduzida © seco por congelação ds modo a obter-se 47 mg do complexo. 0 complexo <81 mg) preparada essencia1mente coma atrás referido foi dissolvido em 5®® ml NaR-,POa ®,®5 M pH é»5» Esta si fi* solução foi então aplicada a uma coluna de permuta catiónica Cri __ .f

Sephadex C2b (forma Na ) equilibrada prevlamente com NaH^HU* ©»®õ M pH é»5= <CM Ssphadex foi fornecido por Pharmacia Ltd»5 Uppsala, Swsden)» A coluna foi lavada com MaH^PO* ô?0S π pH 7»® (75© ml) a sm seguida eluida usando ura gradiente exponencial ds Naí-UPO;; ®»®5 n pH 7»® a Na^HPO* ®52 M pH 9S5 <50® ml em recipiente de mistura)» Foram colhidas fracçoes de íó ml» A actividade antibacteriana foi detestada nas lavagens ds fosfato s nas fracções i-i®.

As impurezas inorgânicas foram removidas a partir dos lotes separados por absorçáo uma vez mais sobre resina de afinidade de D-a1ani1-D-a1anina-sefar ose» A resina foi lavada com água desionizada (3 x 2®© ml de partes al(.quotas) e os g 1 icopeptídeos aluídos com amónia M contendo 50% de acetonitrilo (2©® m!>» 0 percolado s as águas das lavagens foram desprezados» A amónia s o acetonitrilo a partir de cada lote foram removidos por evapora-çac in vacus e ss amostras foram secas por congelaçSo. 9»3 mg do complexa foram obtidos a partir do lote ds lavagem ds fosfato5 ao casso que 2?® mg foram obtidos a partir do lote de fracçSes 1-1©= As amostras foram monitorizadas por cro-matografia líquida de alta resolução utilizando uma coluna de fase reversa CiS watsrs phandapak com 3,9 mm n 300 mm, fazendo-se a aluiçlo com WaH^PO^ ®,i Μ ρκ ό,β contendo 25% de acetonitrila com um caudal 2 ml/min » 0 produto sluido foi monitorizado por absorvSncia UV a Ξ2@nm= Ambas as amostras eram compostas do mesmo completo de nove glicope-ptideos» □ primeiro continha o componente principal com um tempo de retenção de 8,8 minutas, o última a 28,8 minutos (a vancomicina teve um tempo de retenção de 5,8 minutos neste sistema)» P espectroscopia de massa BAR indicou um ião molecular : ' ;Ks) de 14Q9±1 relativansen ts ao componente com um tempo de retenção de 8,8 minutos designado como MH 5527$ e 15i7±x reiativamente ao ds 28,8 minutos designado como MM 5527i»

Exemplo de Refsrgncia Preparação do absorvente ds afinidade 0 éster M-hãdroKi-su.ccinimida de Ssoharose 4B de ácido à-aminoheKanaico (6® g) foi colocado num aglomerado ds vidro s foi lavado com solução de ácido clorídrico í ®M (2 1) sob sucção» 0 bolo húmido foi então adicionado a uma solução ds D-alanil--D--alanina (1,5 g) em solução de bicarbonato de sódio ®,ÍM (6® ml) ® agitada ocaslona1mente durante a hora seguinte. A suspensão foi filtrada sob sucção s o resíduo foi suspenso em trisChidrovims— til lamino-mstano (TRIS) (®,1 M> 11&& ml) durante i hora sendo então refiltrado através de um aglomerado de vidro» A massa foi lavada sucessivamente com solução de bicarbonato de sódio Θ,Ι H, TRIS 0,05 M (contendo cloreto de sódio 0,5 M>, tampão formato ©,05 M cora pH 4,0 (contendo cloreto de sódio β,5 M) e finalmente com água destilada» A resina de afinidade foi então armazenada a 4°C numa suspensão aquosa»

a f Farsíantaçao

Todos os estádios de sementeira s de produção utilizaram o meio liquido tal como foi descrito no Exemplo la» Uma suspensão de 1 ml de células vegetativas da cultura WC1B 4Φ®3ό armazenada em glicerol a 20% e lactose a 10% sob azoto liquido, foi usada para inocular ml de meio de fermentação contido num frasco cénico ds 50® ml, rolhado com uma ralha de espuma ds plástico». Após incubação durante 72 horas a uma temperatura ds 28 °C s 24® rpm num agitador giratório, 15 ml da cultura celular foram transferidas 500 ml de meio fresco num frasco cónico ds 2 litros» A incubação foi mantida novamente durante 72 horas a 28-'C s 240 rpm num agitador giratório» 15 litros ds meio ds fermentação juntamente com θ,:1% ds agente anti-fcrmação de espuma, po1ipropi1eno-g1ico1 Ρ200Φ , foram esterilizados durante όθ minutos a 121°C num fermentador comple-taments tapado» ds 20 litros» 0 fsrmentador foi agitado por maio de um agitador conduzido pelo fundo equipado com tr'ês propulsores de discos ds pás a 200 rpm durante a esterilização e a 30® rpm durante a cultura» 5®® ml de inóculo vegetativo a partir de frascos semeados do segundo estádio foram utilizados para inocular o fsrmentador s a incubação foi realizada a 28°C durante 95 horas antes de transferencia para o estádio de produção»

Durante a fermentação o fsrmentador foi fornecido com ar filtrado estéril a ©,23 volumes por volume por minuto e foi mantida uma sobrepresslo de ar de ®,5 bar ao longo do processo« 300 ml do meio ds fermentação juntamsnts com 0,1% ds agente anti-formação de espuma, palipropileno-glicol Ρ2©©θ, foram esteri1i zados .urante ó© minutos a

121 °C nuiii fermentadoi· CQCTiD X t~j temente tapado, de 4 tador foi agitado a pelo fundo equipado .O litros» iíurante a esterilização o fertnen— 1ΘΘ rpm por meia de um agitador conduzido com três- propulsores de discos de pés» 15 litros os cuiturs vegetatxva a foram utilizados para inocular partir do fermentador de 2Θ o fermen tador de 45*3 litros foi apitado a Ό volumes por ar de 0,5 bar A incubação foi realizada a 28°C durante da colheita» Durante a fermentação o fermentador 50 rpm e fornecido com ar filtrada estéril a *3 volume por minuto» Foi mantida tuna sobrepressão de ao longo do processo» h) Isolamento do complexo ’UÍir*âÍ X zado < 350 1) iénxc a IRA 458 de C H resina foi f i gs H 2 Mason ' s Av em

Cl ) com um caudal de 1 l=fflin

Rohm and Haas 1td . , Lenning Hous

Surrey, Engla.nd3 = 0 percolado parcialmente descorado contendo a actívidade antibiótica, foi aplicado a uma coluna de 22,6 1 de — 1

Dxaion HP20 a um caudal de 1 l»min *» EA resina foi fornecida por Mitsubishi Chemical Industries, Tokyo, Japan»3= A coluna foi lavada com 10 1 de água desionizada e o percolado e a água foram eliminados» 0 material activo foi eluido a partir da coluna com amónia *3,1 M contendo 50% de propan-2-al» Foram recolhidas fracções de 1 litro» Fracções com actividade antibiótica, <65-96), foram reunidas numa massa e evaporadas in vacuo para dar origem a 1 © 1, ;través de filtros de Whatman, Springf ie1d 0 i_us.-i_s=fnLrado aquoso iui ixltrado fibra de vidro GF/D» CFiltros fornecidos por Mi 11» Maidstone, Ken t, Eng1and» j ϋ£ filtrados combinados'?oram agitados durante i hora cor resina is afinidads ds D-alaniI-D-alanina-ssfarose5 (350 ml de volume húmido), EPrsparado tal como foi descrito no exemplo ib3. A mistura foi tratada tal como foi previaments descrito s os produtos de eluigao combinados foram evaporados in vacuo s secos por congelacSo para dar origem a 4?9 g do complexo.

Exemplo 5 &> SeparacSp dos oicopeptldscs MM 55271 a MH 552/5.a partir_do 194 mq ds complsxo glicopsptidico preparados essencial-mente como descrito no Exemplo 2f foram dissolvidos em 1Φ& ml ds tampao NaB^PO* Θ?®5 Μ pH 5,0, s carregados sobre uma coluna ds permuta iónica 025 SP Sephadx de 3Θ® ml (forma Na' > ? prsviaments aquilibrada com o mesmo tampao, ESP Sephadex foi fornecida pela Pharmacia, Upsala* Sweden»3 . A coluna foi lavada com WaHoP0„ 0,05 Η pH 5,0 (300 ml) s em seguida eluida usando um gradiente exponencial de NaHJPO» Θ«Θ5 ri ρΗ 5«,$ a Ma„HP0„ Θ,;2 jl ρΗ 1Φ,5 (250 ml em recipiente de mistura). Foram colhidas fracçãss ds 10 ml. As fracções foram monitorizadas por bioensaio sobre i '."-hvlocsccus aureus V573, 0 percolado de SP Sephadex? lavagem ds tampão s frac™ çSas de eluato 18-23 eram taacterianaments activas» 0 percolado e & lavagem do tampSo foram combinados, fts fracçSes do eluato 13-23 foram reunidas separadamente» As fracçSes reunidas foram dsssaii-nizadas com resina de afinidade E-alani1-E—alanina-sefarose (10 ni ds volume húmido) como descrito no Exemplo 1. 0 percolado de SP Sephadex e lavagens produziram 69 mg de sálido branco? s foram obtidos 43 mg a partir das fracçoes ds eluato 18-23 ds SP Sephadex. Os produtos foram ensaiados por CLAE sobre uma coluna 18

Spherisorb <250 x 4,4 mm) contendo material de fase reversa Cí8

Phase separation H t* SSS

Spherisorb 0DH2 de 10 micron, L fornecido po Ltd.,Deeside Industrial móvel da CLAR foi monitorizada a 210 nm, com NaH^PO„ 0,1 M pH 6,0 cotendo 12% de acetonitrilo, caudal 2 ml/min.

h CLAR musLrou que ambos os prodt itos continham um g1i c opept í d eo p r i ncipal a um tempo de retenção de 9,0 minutos 0 çj 1 icopeptideo xso 1__í _ _ .____Λ. - — λ Cí Li U cl pclf LJ.f do percolado de SP Sephade: x e lavagem de tampão foi d SS1 Cf π sd €3 como MM 55271 e o çi 1 icopeptideo isolado a partir das fracçSes de eluato de HF Sephadex foi designado como MM b) Purificação adicional do HM 502/1

Os 69 mg de sólido contendo MM 55271 foram retomados em tampão NaH.-,ΡΟ^ 0,1 M pH 6,0 <25 ml) e carregados sobre uma coluna de 22;,5 ml contendo meio de cromatografia Matrex sílica 018 equilibrada com o mesmo tampão, CMatrex sílica CI8 foi fornecida pela Amieon Corp, Danvers? MA @1923 L5SA3. A colunas foi eluida com um qradiente exponencial de Nai-LPO„ 0,1 M oH 6,0 a Na„HP0, 0,1 H pH 63* contendo 2€s% de acetonitrilo <2ΘΘ ml em recipiente de fflx stura)» Forsí . hidas fra 10 ml B5 traccoss

Toram

u. LIS monitorizadas reiativamente à actlvitíade biológica e por CLAK» As fracçSes 2Θ-24 eram DDl. /" X 'oxLld s t an c í a 1 snen t e puro. As fracç :8es foram reunidas e o acetonitrilo foi removido por svaporaçSo in vácuo„ Oh sais de tampão foram removidos- po r tratamento c om resina de afinidade de D-alanil-D-alanina como previamente descrito de modo a obter-se 17,4 mg de MM 55271, A espectroscopia de massa por bombardeamento atómico rápido indicou um peso molecular de 151611=

fi actividads antihactsriana do HM 55271 contra uma série de organismos Srasn positivos é mostrada na tabela que ss segue»

Actividads antibactsriana de HH 5527:1 contra.....uma.......série da Qrcanismos.^dsterminada.....galo método., de micrctitulacSo (CTM pq/ml)

Organismos MM 55271 Bacilus subtil lis ATCC 6633 8 Coynebaotsrium xerosis MCTC 9755 4 Sarcina luiea NCTC 834® Stspnylococcus aureus 1 ò "Oxford” 8 ISRussel!S 16 ”9573 nR* 4 S = sprophyticus ;!FLI ” 16 S-epidermidis 6Θ137 S 54815 32 Stsptococcus pyogsnss CHI® 16 S=agalactias HHester” 16 3„sanguis ATCC 10556 16 8pneumon ias Fu7 16 S.faseai is 1 4 "'riulti-resistente (resistente à meticilina3 tstraciclinas eritromicina e geniamicina) c> Purificação adicional do MN Ss2/2 us 4-5 mg de sólido a partir das íracçSss de eluato 18---23 de SP Sephadsx contendo MM 55272 foram retomados em tampão MaN^PO* η pH ό,Φ (25 ml) s carregados sobre uma coluna ds 22,5 ml contendo meio de oromatografia Mairan sílica C18 equilibrada com o mesmo tampão» A coluna foi eluida com um gradiente exponencial de NaH^PO^ Θ?1 ri pH a Na_HPOá Sul M pH 6J contendo 2®% de acetonitrilo C10® ml em recipiente de mistura)» Foram colhidas frscçSss de 1© ml» As fracçSss foram monitorizadas relativamenta & actividade biológica e por CLAR» As fracçSss 21-25 eram MM 55272 substancialmente puro» As fracçSss foram reunidas e o acetonitrilo foi removido por evaporação in vácuo» Os sais ds tampão foram removidos por tratamento com resina ds afinidade de D-alanil-D-alanina como previamente descrito de modo a obter-ss 17»4 mg ds MM 55272= A espsc trosccspia ds massa por boobardeamentD atómico rápido indicou um peso molecular de 1473±i = A actividade antibacteriana do Mn 55272 contra uma série ds organismos Sram positivos é mostrada na tabela que ss segue»

ftctividads antibactsrlana da HM 55272 contra uma série de organismos, determinada pelo método ds (uicratitulaçao ÍCIM ug/ml)

Organismos nH 55272 Bacilos subtillis hTCC 6633 Coynsbac: tsrxum zsrosis Νϋ ι ϋ ν/ϋΰ -•7 Bareina lutea MCTC 834Θ Staphyiococcus aursus 4 •sOKf ordSi .4. "Russeli! 4 !i V573 HR* 1 3 = sprophyticus "FLI“ 8 3 =:spidsrmidis 6Φ137 8 54815 16 Stapiococcus pyogenes CNi® S«agalactiae "Mester” 4 S«sanguis ATCC 1Φ556 8 3=pneumonias Pu7 4 B^íaecalis 1 16 ‘‘‘Muiti~resister»te (resistente à msticl 1 ina5 tstraciclina eritromicina e qsrtamisina> Métodos de Detacgjo a) Amostras de fsrmsntaçlo e fracçSes da coluna foram monitorizadas quanto a actividade antibiótica por bioensaio sm S t a o h v l cm: oc cus aursus V573? usando o orificio convencional no

método da placa, b) r in 55270, MM 55271 e MM 55272 tem um má tico a 280nm. Amostras pLU* X1 2.L-. -Sei w.i·"- podem ser icSo directa desta absc írvância» snsaiadas c) Prepato-^çcjes do rlH 52/3:. Hfl o*_j2/ i o ntM 353./.3 soram ensaiadas por cromatroqrafia líquida de alta resolução utilizando luna Waters í Cl 8 uhondpsk , HdSS i», OSA 3» com NaH.-JPDA 0,í t .. í·. OS j£. ml/min» giicupepuiusos 1 or «οι siuiaos a pareis aa pH 6,0 contendo ií% de acetonitriio a um ?luente foi monitorizado a 220 nm por monito de UV de comprimento de onda variável Cecil Instruments CE2112 ECecil Intruments Ltd„, Milton Technical Centre, Cambri-dge, Sob estas condições ο ΜΗ 5527Θ tinha um tempo de minutos e o MM 052/1 e o MM 5o2/2 tinham tempos iTs 1Π U tQS o retenção de 7 de retenção iqv AIternativamente, as preparações foram ensaiadas sobre uma coluna ds fase reversa Spherisorb 0DS2. £Pha.se Separations ltd., Deeside Industrial Park, Oueensferry, Clwyd, U.K.3. Os glicopeptideos foram eluidos a partir da coluna com NaH„P0. 0?1 M pH 6,Θ contendo 12¾ de acetonitriio a um caudal de 2 ml/min. Sob estas condições o MM 55270 tinha um tempo de retenção de 3,8 •1IV! atinuius « α í'il í=rcr-“*i"7 4

271 e o MH tinham temdos ds retenção idênticos de 9,Θ minutos»

yadGS,j^,_,Çaractg;rizacaQ

Propriedades físicas e espectrais de MM 5027®« EM-BAR <g1icerol/ iiag1icerol/àcido acético)

Mrf 1490+1

Peso molecular i489±l CLARs coaio anteriormente

Propriedades físicas e espectrais de MM 53271 Eít-BAR (glicerol/tioglicerol/ácido acético) MH+ 1517±í

Peso mo1seular 15i6±l CLARs como antariormsnts

Propriedades físicas © espectrais de MH 55272 EM-BAR < g1icsral/tiog1icsrol/álcool 3-nitrobencí 1 ico5 MH* Í474±l

Peso molecular 1473±i CLARs coma MM 55271

Classificaclo ao NCIB 4Φ086 Métodos utilizados 0-s métodos seguidos foram os recomendados pelo International Strepfcomvcss Project reiativamente á caractsricaçáo de espécies Strsptamycgs EBhirlinq, E = B» and Botilleb* D. "nethotis for the charactericafcion of Streptomyces species" Int« J _____Syst«

Bac:tsrioi c 16s 313-340 <Í966)j e os recomendados reiativamsnte à caractarisaçlo de espécies Amylcolata s Amycolatopsis CLschsva-1 iar - Prau5er= rL 5 Labedas D = A = and Ruan ? J=~S= íllma n&vi gsnsra of nocardioform acfcinomycsiss;; Amyolata ss~, παν, and ftmycolatcgsls geri:: nov. ” Zn 1=, J_= Syst = Bacteriol „ » -S6 a 29-37 í1906)3=

Os isómeros ds ácido diaminopimélico (dap) s os hidra-tos de carbono em hidrolizados ds células completas foram estabelecidos por Cromatografia ds Camada Fina \CCF> utilizando os ,métodos descritos por Komagata s Suzuki CKomaçata, K. and Suzuki* 2,.--1. “Lipid anel Csli-Wall Analysis in Bactsrial Systematics5' Hethods in flicrobiolouy19 s lé 1-207 (1987)3. Os ácidos micólicos foram determinados pelos métodos descritos por slinnikin et al » Flinnikin* D. E«» Hutchinson* I »©. and Caltíicott. A»8» "Thin Layer Chroaatography of Hethanolysates of Mycolic Acid Containing Bactéria55 J = Chromatoqr =,, 188§ 221-223 <1980)11 =

Bgsultados 1* Caracteristicas Culturais A cultura WCIB 40086 cresceu bem em todos os meios de crescimento recomendados pela ISP* formando micélio de substrato=, bem dssenvo1vi do * creme a castanho claro» e abundante micélio aéreo branco,, NSo foram detectados pigmentos solúveis em qualquer dos meios utilizados» As características culturais do riCIB 40Φ86 nos vários meios estio resumidas na Tabela 1= 2 . ÇaracMrl,sticas_BHmicas Células completas hidrolisadas da cultura NCIB 40086 continham o isómero rnsso do ácido diaminopimélico» A arafcinosa e a galactose eram os açúcares principais presentes* enquanto que a ribase foi detectada em quantidades mais pequenas» D ácido micólico nào estava presente. Estes resultados indicam que a cultura i'CIB 400S6 tem uma parede celular tipoi IV com padrão tís açúcar tipo h (Lechevalier st____al1986) a Contudo, a ausência ds ácidos micólácos coloca esta cultura firroeraents fora do género fe&rdia......sensurstrictp, 3 = Caractsristicas Fisiológicas

As caractsristicas fisiológicas principais da cultura NCIB 40Φ86 e AmvcQlatopsis orientalis ATCC 19795, apresentadas na Tabela 2, mostram que estas duas culturas se assemelham em muitas carac: teristicss,

r - I;3SMlÍ£idllcLJ3i3JdC|B_.12âÊI

Baseado nas caractsristicas fundamentais químicas, fisiológicas e morfológicas, a cultura NCIB 4ΘΘ86 é identificada como uma estirpe de ftmvcolatopsis orientalis. Embora o NCIB úiBBi difira da estirpe tipo de Amycolatopsis orientalis (ATCC 19795) em alguns testes as diferenças sao relativamente secundárias e5 deste modo, a cultura NCIB 4Φ080 ê identificada como uma nova estirpe da espécie Hâvcolatopsls orientalis. \ ·

Tabala.1

Caractari-stlcas da cr ase imanto do MC1B 40Θ8& agés 14 dias a 28 °C ;AA 10 CRESCIMENTO MICéLID AÉREO MICéLIO DE PIBMEMTO Formação Car SUBSTRATO íáOLCiVEL ISP2 Bom tíoa Branco Creme Nenhum T C* Γ~: Τζ Bom rléd i a Branco/ c ramo Branco/ creme Nsn h ISP4 Bom Boa Branco Creme Nen hur T rua Bmu P.n.-í 3 f.-.v-in <·">-* Γ>-34««.ν Nenhum v5D4 ríédlD Fraca Branco Branco/ creme Nsn hum ... >,>·· / Bom Bom Branca Creme/ branco Nan hum Arar Bom Nutriente naaxa oranca Crase ¥¥-£ii IV..juu " ; _.i :òf Bennett Bem r=...... Branco Creme Nsn hum Agar de Cxapeek· Bofíí Médio Branco Crs0ís/ branco Nenhum

X

Tate la..2.

Baratear is tic: as fisiológicas do NCIB 4ΒΘ8& asÃs 14 dias a 53°C ΝϋIB Amvcolatopsis CARACTERíSTICAS 40Θ86 orlsntal is ATCC 19795

EteSEitetlESteâE ‘

Adsnina - - Caseina 4. Hi poterantina ... •r Tircísina 4. Xsntina 4- ::':';:iduc:ãc5 das Nitrato redutass 4- 4. Afiiilass -f •i- Ursass + No: ar: ira ... .... Esculinaso 0 Gelatinass NB •Lite ditek i 1 ac5o _de = Banzoato — Citrato ... Macato - ~ Haiato «... 4.

Tabela 2 Ccopt, >_

*.*--*- ......a5ós^4.._dia.5.....a_2S.?_C NC1B ftm vcqI atopsis CARACTER íSTICAS 40086 orientalis ATCC 19795

Cr5sci;n5iits na grassnsa das

Lisosima Í5€>€> u.c/ml) Sal iailato NaCl <5%s p/ví Rifampicina

Crescimento a; “O Cm~* -wr w

37-C 55 *C

Uti1isacio da hidratos de carbono como únicas fontes da carbonot;

Atíonitol — Arabinoss - 4· Dextrina -· -i- Critritol - 4· Sa1ac tose 4- Glucose 4· 4· Inositol +/- 4'

Tabela.....2„ Ccont,)

MC 13 AmvcolatGosis CARACTERíSTICAS crientaUs ATCC 19735 jj§c 1d......::;s.....hidratss ds carbCRD únicas......fontes...tis, carbono........ΐcgntg L&ctoss J.. 4· Ha1tose - 4- Hani. tol 4- 4- Kanose 4· 4· Mslibioss -}· 4- «·«£ ti l -u-g lucésido 4· Raf j.noss - -;\-’ΐΐ!Τ:Π QSS - 4· Salxcina +/- 4- Sorbitol - ... Sacarose 4· 4· Tre-halose ->· 4· Xilsss 4- 4- (Controlo; sem açúcar) — MD = Hão determinada +/— = resultado variável §

Claims (1)

1. Heivind icações ião - Processo para a produção de um complexo da compostos glicQpsptídicos, ou o composto MM 5527®= MM 55271 =, au MM 53272;: caracterizado por compreender a cultura de um microor-g&nisiTiCi produtor s o isolamento subsequente da complexo ou. composto ou de um seu derivado a partir da cultura» 2â= “ Processo de acordo com a r e i v in d ic açlo 1, carac-r.erizatío por o complexo ou composto ser produzido numa forma substancia1mente pura* 31« - Processo ds acordo com a reivindicação 1 ou 2? caracteri zado par o micraarganisma ser ftmycolatcosis ss» NCIB 4®®Sfe ou um um seu mutante» 4ã» - Microorganismo» caracterizado por ser α Anycola-- . __ ” 'B 4®®Sé ou um seu mutante5 numa forma b iolog i camen- ta pura;; 5ã« ·” Processo para a preparação de uma composição farmac@uticas csractsrissdo por comprendsr a mistura ds uma quantidade antibacterianaments eficaz de um complexo ou composto ds acordo com a reivindicação 1= ou de um ssu derivado farmacsu·--ticamente aceitável? com um veiculo ou excipiente farmacêutica-mente aceitável. él= - Método para o tratamento de infecçoes faacterianas em animais» caracterizado por compreender a administração de uma quantidade antibacterianaments eficaz de um complexo ou composto da acordo com a reivindicação i, ou de um seu derivado farmsceu-ticamsnte aceitável $ a um animal que necessite desse tratamento. sendo a gama de dosagem tíe composto activo de desde i ΡΘ até 5-Φ mg por kg de peso corporal por dia. Lisboa, / de Dezembro de 1989

   i. PEREIRA DA CRUZ AgeRts Offcisá áa Praprisáaáô Industrial RUA ViCTOH CORD®N, 10-A, 1.· 1200 iiSBOA