CZ285281B6

CZ285281B6 - Minoritní složky skupiny A streptograminů

Info

Publication number: CZ285281B6
Application number: CZ983059A
Authority: CZ
Inventors: Pascal Anger; Bertrand Bonnavaud; Alain Callet; Patrick Lefevre
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date: 1993-02-17
Filing date: 1994-02-15
Publication date: 1999-06-16
Also published as: EP0614910A1; CN1159197A; DK0614910T3; US5726151A; BR1101176A; IL121821A; WO1996005219A1; DE69414622D1; PL175016B1; EP0614910B1; AT406052B; DE69414622T2; MX9401171A; ATA30594A; IE80462B1; OA10400A; IE940144A1; PL175020B1; SG81198A1; HK1006500A1

Abstract

Vynález se týká nových minoritních složek skupiny A streptogramů obecného vzorce I, ve kterém R.sup.¨.n. znamená atom vodíku nebo ethylenovou skupinu. Minoritní složky skupiny A jsou způsobilé vytvořit v kombinaci se složkami skupiny B streptograminů purifikované a stabilní antimikrobiální činidlo mající zlepšenou účinnost in vivo a dobrou biodisponibilitu.ŕ

Description

Minoritní složky skupiny A streptograminů

Oblast techniky

Vynález se týká nových minoritních složek skupiny A streptograminů, které jsou způsobilé vytvořit v kombinaci se složkami skupiny B streptograminů purifikované a stabilní antimikrobiální činidlo mající zlepšenou účinnost in vivo a dobrou biodisponibilitu.

Dosavadní stav techniky

Ze známých streptograminů byl pristinamycin (RP 7293), který je antibakteriální účinnou látkou přírodního původu produkovanou mikroorganismem Streptomyces pristinaespiralis, poprvé izolován v roce 1955. Tento pristinamycin, který je komerčně dostupný pod označením Pyostacine^R, je v podstatě tvořen pristinamycinem IA a pristinamycinem ΠΑ.

Další antibakteriálně účinná látka ze skupiny streptograminů, virginiamycin byl připraven z mikroorganismu Streptomyces virginiae, ATCC 13161 /Antibiotics and Chemotherapy, 5, 632(1955)/. Uvedený virginiamycin (Staphylomycine^R) je v podstatě tvořen faktorem Sa faktorem Mp

V patentu US 3 325 359 jsou popsané farmaceutické kompozice obsahující antibiotické látky tvořící antibiotikum 899: faktor S a faktor Ml.

V patentu FR 2 619 008 je popsáno použití složek skupiny A a skupiny B pro léčení akné.

Antibakteriálně účinné látky přírodního původu skupiny streptograminů jsou tvořeny směsí dvou skupin složek, tj. směsí složek skupiny B a složek skupiny A, přičemž každá z těchto skupin má vlastní antibakteriální účinnost. Bylo prokázáno, že kombinace tvořená oběma skupinami těchto složek vyvolává synergii účinku, přičemž důsledkem této synergie je bakteriostatická účinnost, zesílení bakteriálního účinku a rozšíření spektra účinnosti.

V Streptogramine ais Modelsysteme fůr den Kationentransport durch Membranen, Dissertation zuř Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Facultat der GeorgAugust Universitat zu Gottingen, Gottingen 1979, v Antibiotics ΠΙ, 521 (1975) a v Antibiotics of the virginiamycin family, Inhibitors which contain synergistic component, C. Cocito, Microbiological Reviews, 145-98 (1979) jsou popsané složky skupiny A a skupiny B streptograminů. Přírodní pristinamycin, jakož i jednotlivé složky, které ho tvoří, byly rovněž popsané J. Preud'Homme-m, P. Tarridec-em a A. Belloc-em v Bull. Soc. Chim. Fr., 2, 585 (1968).

Všechny pokusy připravit purifíkovanou kombinaci streptograminů vždy zahrnovaly majoritní složku skupiny A /pristinamycin ΠΑ (PILA)/, o které se předpokládá, že je zodpovědná za uvedenou účinnost a synergii účinku. Ostatně existují studie, ve kterých se dochází k závěru, že pro vyvolání nejlepšího synergického účinkuje nejdúležitější právě tato složka.

Nicméně tyto pokusy připravit purifíkovanou účinnou kombinaci streptograminů nebyly nikdy korunovány úspěchem, a to jednak vzhledem k těžkostem, ke kterým dochází při její průmyslové výrobě, a zejména vzhledem ktomu, že purifikovaný pristinamycin ILA je krystalickým produktem, o kterém bylo zjištěno, že jeho dostupnost pro biologický organismus je příliš omezená na to, aby s ním mohlo být počítáno jako s účinnou látkou léčiva.

-1 CZ 285281 B6

Z hlediska průmyslové přípravy takových produktů neumožňují techniky, které jsou až dosud k dispozici, získat v preparativním měřítku dostatečně purifíkovanou formu a produkci dostatečně stálých a reprodukovatelných kvalitních šarží, která by splňovala zákonné požadavky registračního řízení v některých zemích.

Jako příklad lze uvést, že průmyslové šarže přírodního pristinamycinu obsahují po purifikaci množství nečistot, které může dosahovat až 20 %. Až dosud provedené pokusy vyčistit tento produkt se vždy setkaly s neúspěchem nebo měly často za následek degradaci některé ze skupin složek vzhledem k tomu, že se jedná o křehké produkty, u kterých mohou purifikační operace způsobit otevření cyklické struktury nebo dehydrataci složek skupiny A. Vzhledem k těmto skutečnostem panuje již mnoho let přesvědčení, že již nebude dosaženo dalšího zlepšení stupně čistoty uvedených šarží. Ještě v roce 1988 byla purifikace uvedených šarží stále považována za problém (o tom viz: J. of Liq. Chromatography, 11(11), 2367 (1988). Rovněž v roce 1988 uvedli N. K. Sharma a M. J. O. Anteunis, že také separace a purifikace složek virginiamycinu jsou možné pouze pro analytické účely, avšak nerealizovatelné pro výrobu těchto produktů a to vzhledem k potížím, se kterými se při separaci a purifikaci těchto složek setkali (Bull. Soc. Chim. Belg., 97(3) 193 (1988).

V důsledku této situace, byla komerční využitelnost pristinamycinu (Pyostacine*) definitivně omezena pouze na některé země, jakými jsou Francie a Belgie. Stejně je tomu v případě virginiamycinu (Staphylomycine*), který je komerčně využíván pouze v omezeném počtu zemí, a to pokud jde o humánní medicínu, jakož i v případě mikamycinu, jehož komerční využitelnost (omezená na Japonsko) je v současné době pozastavena. Pro určitou část lidské populace to má tudíž za následek, že je zbavena možnosti léčení těžkých infekcí způsobených grampozitivními koky (zejména infekcí způsobených stafylokoky rezistentními na methicilllin) nebo léčení nemocí přenosných sexuálním stykem.

V oblasti antibakteriálně účinných látek praktičtí lékaři velmi dobře znají, že po podávání některých skupin antibiotik může dojít k alergiím nebo rezistencím na podávaná antibiotika /The New England Joumal of Medicine, 324 (9), 601 (1991)/. V klinické praxi jsou zejména známé četné rezistentní kmeny mikroorganismu Staphylococcus aureus. Vzhledem ktomu je pro praktického lékaře velmi důležité mít k dispozici široké spektrum chemicky odlišných skupin antibiotik, aby bylo možné přizpůsobit léčení konkrétní léčené nemoci. Nemožnost komerční využitelnosti uvedené skupiny antibakteriálně účinných látek může mít velmi vážné, ba i dramatické následky, poněvadž zbavuje možnosti léčení těch pacientů, které nesnáší ostatní skupiny antibiotik.

Provedené purifikační pokusy měly takto vždy za cíl odstranit minoritní složky streptograminů, neboť tyto minoritní složky jsou považované za postradatelné a spíše za nečistoty.

Z těchto minoritních složek skupiny A přírodních streptograminů představuje pristinamycin ΠΒ (ΡΠΒ) dále uvedeného obecného vzorce I, ve kterém R znamená methylovou skupinu, minoritní složku, jejíž hmotnostní obsah je nižší než 10% hmotnosti, vztaženo na celkovou hmotnost přírodního prystinamycinu, zatímco ve virginiamycinu je jeho obsah nejčastěji roven asi 8 % hmotnosti nebo dokonce asi 6 % hmotnosti.

Nyní byly z přírodního pristinamycinu odvozeny nové, dosud neznámé minoritní složky, které tvoří podstatu vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou minoritní složky skupiny A streptograminů obecného vzorce I

-2CZ 285281 B6 (I)

ve kterém R znamená atom vodíku nebo ethylovou skupinu.

Produkt obecného vzorce I, ve kterém R znamená ethylovou skupinu a který je dále nazýván pristinamycin IIF (PUF) a produkt obecného vzorce I, ve kterém R znamená atom vodíku a který je dále nazýván pristinamycin IIG (PIIG) jsou nové produkty, které tvoří velmi minoritní složky streptograminů, přičemž jejich hmotnostní obsah v šaržích přírodního produktu je nižší než 0,5 %.

V souvislosti s vynálezem byly také získány puntíkované formy tvořené kombinacemi získanými společnou krystalizací alespoň jedné složky skupiny B streptograminů a alespoň jedné složky skupiny A definované obecným vzorce I. Tato společná krystalizace se provádí při zachování konstantní stechiometrie 1 molu složky nebo složek skupiny B streptograminů a 2 molů složky nebo složek skupiny A streptograminů obecného vzorce I. Společně vykrystalizovaná kombinace může být použita jako purifikované a stabilní antimikrobiální činidlo, které má zlepšenou účinnost in vivo, jako i dobrou biodisponibilitu. Ve skutečnosti nebylo doposud nikdy možné purifikovat složky skupiny A streptograminů krystalizací. Až dosud byly známé pro přípravu purifikované složky skupiny A streptograminů pouze chromatografické postupy a rovněž nebyl znám postup umožňující izolaci této složky ve velkém měřítku.

Nyní bylo prokázáno, že složka skupiny A obecného vzorce I může být získána v čistém stavu postupem zahrnující přípravu výše uvedené společně vykrystalizované kombinace. Přitom se postupuje tak, že surová směs obsahující alespoň 30 % minoritní složky skupiny A odpovídající obecnému vzorci I se uvede do roztoku v organickém rozpouštědle, jakým je keton (aceton, methylethylketon, methylisobutylketon a podobně), ester (například ethylacetát, isopropylacetát, butylacetát a isobutylacetát), chlorované rozpouštědlo (methylen chlorid, chloroform, 1,2— dichlorethan a podobně) nebo nitril (například acetonitril), načež se přidá složka skupiny B uvedených streptograminů, načež se krystalizací získá společně vykrystalizovaná kombinace s výše uvedeným poměrem složek. Je samozřejmé, že množství zavedené složky B streptograminů se vhodně zvolí tak, aby reziduální koncentrace tohoto produktu (po společné krystalizací) byla nižší, než je jeho rozpustnost v uvedeném prostředí. Je rovněž samozřejmé, že variace ve vzájemných obsazích výchozího prostředí vzhledem k produktu obecného vzorce I a vzhledem ke složce B streptograminů nezpůsobí modifikaci získané společně vykrystalizované kombinace. Takto získaná společně vykrystalizovaná kombinace uvedená do roztoku v rozpouštědle, jakým je například methylisobutylketon nebo dichlorethan a uvedená do styku s kyselým prostředím (například kyselina sírová nebo kyselina chlorovodíková) umožňuje po zpracování organické fáze rozpouštědlem, jakým je například hexan, získat purifikovanou minoritní složku skupiny A, která je prosta složky skupiny B.

Výhodou této společně vykrystalizované kombinace je výrazně zvýšená stabilita, zvýšená čistota a zejména skutečnost, že umožňuje snadnou industrializaci.

-3CZ 285281 B6

Příprava a separace složek skupin A a B se provádí fermentací a izolací složek z fermentačního rmutu metodou popsanou J. Preuďhomme-m a kol. v Bull. Soc. Chim. Fr., sv. 2, 585(1968), v Antibiot. and Chemother., 5, 632 (1955) nebo 7, 606 (19577, vChromatog. Sym., 2° Brusel, 181 (1962), v Antibiot. Ann., 728-784 (1954-55), v patentu US 3 299 047 nebo v Streptogramine ais Modelsysteme fur den Kationentransport durch Membranen, Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Matematisch-Naturwissenschaftlichen Facultát der GeorgAugust Universitát zu Gottingen, Gottingen 1979 nebo postupy, které jsou analogické s těmito postupy anebo postupy popsanými v dále uvedených příkladech. Obzvláště v případě pristinamycinů se separace složek skupiny A a B provádí suspendováním surového streptograminu v organickém rozpouštědle, jakým je acetát (například ethylacetát), následným odfiltrováním nebo odstředěním surové složky skupiny A a extrakcí této složky skupiny B v kyselém vodném prostředí a následnou reextrakcí v chlormethylenovém prostředí. Separace složek skupin A a B může být rovněž provedena kyselou extrakcí roztoku surového streptograminu v methylisobutylketonu a potom izolací extrakcí složky skupiny B z vodné fáze a izolací složky skupiny A precipitací z organické fáze.

Po separaci, purifikace složek skupiny B streptograminů může být provedena krystalizací v alkoholu, jakým je například ethanol, methanol nebo isopropanol, v acetátu (například v isopropylacetátu nebo butylacetátu), v ketonu (například v methylethylketonu) nebo v acetonitrilu, nebo chromatograficky. Purifikace složek skupiny A obecného vzorce I může být provedena chromatografícky za použití eluční soustavy tvořené směsí acetonitrilu a vody.

Alternativně se příprava složek skupin A a B streptograminů provádí postupem popsaným ve francouzském patentu 2 689 518 a spočívajícím ve fermentací rozdělené do následujících stupňů:

- první stupeň (fakultativní), mutageneze na neselektivním produkčním mikroorganismu streptograminů a

- druhý stupeň, selekce selektivních mikroorganismů.

Neselektivními mikroorganismy jsou obecně Actinomycetes a houby. Výchozími mikroorganismy, které jsou použitelné při tomto způsobu, jsou zejména neselektivní produkční mikroorganismy streptograminu, zvoleného z množiny zahrnující pristinamycin, virginiamycin, mukamycin, ostreogrycin, viridogrisein, vemamycin a etamycin. Příklady použitelných neselektivních mikroorganismů jsou uvedeny v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Mikroorganismy	Antibiotika
Houby
Micromonospora sp.	vemamycin
Streptomyces
Streptomyces alborectus	virginiamycin
Streptomyces griseus (NRRL2426)	viridogrisein
Streptomyces lavendulae	etamycin
Streptomyces lodensis (ATCC11415)	vemamycin
Streptomyces mitakaensis (ATTC15297)	mikamycin
Streptomyces ostreogriseus (ATCC27455)	ostreogrycin
Streptomyces pristinaespiralis (ATCC25486)	pristinamycin
Streptomyces virginiae (ATCC13161)	virginiamycin
Actinomyces
Actinomyces daghestanicus	etamycin

-4CZ 285281 B6

Uvedená příprava se zejména provádí za použití mikroorganismů zvolených z množiny zahrnující Streptomyces alborectus, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces ostreogriseus a Streptomyces virginiae.

První stupeň přípravy spočívá v modifikaci neselektivního mikroorganismu v tom smyslu, aby se zvýšila jeho globální schopnost produkovat antibiotikum nebo/a aby syntetizoval pouze jednu z obou složek streptograminů. Toho může být dosaženo genetickou modifikací (mutace v úrovni genů s enzymovou strukturou implikovaných biosyntézou nebo v úrovni sekvencí umožňujících expresi takových strukturních genů nebo podobně) nebo biochemickou modifikací (modifikace post-translačního mechanismu, alterace retroinhibičního mechanismu a podobně). Za tím účelem se používají různé mutagenezní nástroje:

- fyzikální činidla: rentgenové paprsky, ultrafialové paprsky nebo

- chemická činidla: alkylační činidla, jakými jsou například: ethylmethansulfonát (EMS), N- methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (Delic a kol., Mutation Res. 9 (1970) 167-182) nebo 4-nitrochinolin-l-oxid (NQO), bialkylační činidla, interkalační činidla, nebo

- libovolný systém mutační inserce do DNA a zejména transposony, integrační plasmidy, fagy nebo profagy, nebo také

- fuze protoplastů (Cohen, Nátuře 268 (1977) 171-174).

Tyto nástroje (samotné nebo v kombinaci) mohou být aplikovány na neselektivní mikroorganismy ve stavu spor, vyklíčených nebo klíčících spor neba na mycelium. Tato příprava může také využívat manipulací (náhodných nebo řízených) umožňujících získat mikroorganismy schopné selektivně produkovat jednu složku streptograminů z neselektivních mikroorganismů.

Druhý stupeň přípravy se týká identifikace a izolace selektivních mikroorganismů. Tento stupeň může být uskutečněn zejména použitím testu citlivosti vůči určitému mikrobu. Existují různé mikroby, které jsou specificky senzitivní na složky skupiny A nebo na složky skupiny B streptograminů: například Bacillus subtilis (ATCC6633), Bacillus circulans, Bacillus cereus (Watanabe, J. Antibio. Ser. A ΧΠΙ(1) (1960) 62), nebo C. xeroxis (citovaný Watanabe), které jsou specificky senzitivní na složky skupiny B, zatímco Streptococcus agalactiae B96 (Antimicrob, Agents Chemother. 10(5) (1976) 795), Micrococcus luteus (citovaná Přikrylová) nebo Sarcina lutea (ATCC9341) jsou specificky citlivé na složky skupiny A. Rovněž je možné uměle připravit mikroby specificky senzitivní na některou složku streptograminů, a to inzercí do mikrobu senzitivního na obě složky streptograminů genu s rezistencí vůči jedné z těchto složek. Některé z těchto genů již byly klonovány (Le Goffic a kol., J. Antibio. XXX(8), 665 (1977); Le Goffic a kol., Ann. Microbiol. Inst. Pasteur 128B, 471 (1977); Solh a kol., Path. Biol. 32(5), 362 (194) a takové geny se do jednotlivých mikrobů zavádí klasickými postupy molekulární biologie. Selekční stupeň může být rovněž proveden testem ELISA za použití specifických protilátek složek A nebo B nebo také analytickými postupy, jakými jsou chromatografie (kapalinová chromatografie, chromatografie na tenké vrstvě a podobně). V případě testu citlivosti vůči mikrobu je navíc výhodné vyhodnotit selekci chromatografickým stanovením.

V rámci vynálezu je takto možné v průmyslovém měřítku získat novou purifikovanou formu streptograminů, jejíž obsah nečistot a definice a stálost složení odpovídá zákonným požadavkům pro registrační řízení a která má vyšší účinnost in vivo, zlepšenou biodisponovatelnost a nižší toxicitu. Tato nová kombinace takto v četných zemích umožní na rozdíl od minulé doby léčení za použití antibakteriálně účinných látek této skupiny sloučenin.

-5CZ 285281 B6

Nová kombinace složky skupiny B streptograminů a složky skupiny A streptograminů obecného vzorce I vykazuje obzvláště zajímavou účinnost in vivo vůči gram-pozitivním mikrobům. Bylo prokázáno, že in vivo u myší má vůči mikroorganismu Staphylococcus aureus IP 8203 účinnost při perorálních dávkách od 30 do 50 mg/kg.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, které mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují předmět vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků. V těchto příkladech jsou obsahy uvedeny ve hmotnostních procentech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 kg surového pristinamycinu /pristinamycin IA (PIA): 20,7 %, pristinamycin IB (PIB): 3,9 %, pristinamycin IC (PIC): 0,6 %, pristinamycin ID (PID): 0,3 %, pristinamycin IIB (ΡΠΒ): 8 %, pristinamycin ΠΑ (PILA): 45 %, pristinamycin UF (PUF): méně než 0,5 % (nestanoven), pristinamycin IIG (PIIG): méně než 0,5 % (nestanoven)/ se suspenduje ve 210 litrech ethylacetátu a míchá po dobu 15 hodin při okolní teplotě. Suspenze se zfiltruje a ethylacetátový filtrát se dvakrát extrahuje 20 litry IN kyseliny sírové a potom 20 litry destilované vody. Sloučené vodné fáze se 6 krát promyjí 15 litry ethylacetátu, načež se jejich pH nastaví na hodnotu 7 přidáním 30 litrů 10% hydrogenuhličitanu sodného a potom se extrahují třikrát 30 litry methylenchloridu. Methylenchloridové fáze se sloučí a promyjí 10 litry destilované vody. Methylenchlorid se potom oddestiluje a nahradí 50 litry ethanolu. Směs se potom zahřívá k varu pod zpětným chladičem v přítomnosti 0,8 kg aktivního uhlí L3S po dobu 30 minut. Po filtraci a dvojnásobném promytí 5 litry ethanolu se směs ochladí v průběhu 15 hodin až na teplotu 10 °C. Po jedné hodině na teplotě 10 °C se suspenze zfiltruje a třikrát promyje 7 litry ethanolu. Po vysušení pevného podílu při teplotě 40 °C za sníženého tlaku se získá 5,7 kg purifikovaného pristinamycinu I (dále je nazýván PI).

Čistota: 96,8 % (PIA: 81,1 %, PIB 12 %, PIC: 2,6 %, PID: 1,1 %);

Výtěžek vztažený na PIA: 74 %.

1500 g purifikovaného PI se vyjme 9 litry 1,2-dichlorethanu, načež se přidá 1,5 ekvivalentu anhydridu kyseliny jantarové a 0,015 ekvivalentu dimethylaminopyridinu. Získaný roztok se udržuje po dobu jednoho týdne při teplotě 20 °C, načež se zavede do kolony obsahující 10 kg silikagelu (20 až 45 pm, výška sloupce: 1 m a průměr sloupce: 20 cm). Eluce se provádí perkolací směsi 1,2-dichlorethanu a methanolu po dobu 6 hodin při průtoku 18 litrů za hodinu. Obsah methanolu (obsah vody 5 %) se zvyšuje v průběhu chromatografie z 0 na 4 %. Jímá se 47 frakcí o objemu 2,4 litru.

Frakce 5 až 15 se sloučí, 1,2-dichlorethan se odpaří a nahradí 5 litry ethanolu. Po krystalizaci se získá 365 g PIA o čistotě 99,8 %.

Příklad 2

Frakce 36 až 39 jímané při chromatografii popsané v příkladu 1 se sloučí a 1,2-dichlorethan se oddestiluje, přičemž se takto získá 210 g pevného podílu. 40 g tohoto pevného podílu se vyjme 8 litry vody, ke které se přidá 9 cm³ 10N kyseliny chlorovodíkové. Po třech hodinách zahřívání na teplotu 90 °C se roztok neutralizuje na hodnotu pH 6,5 přidáním hydrogenuhličitanu sodného.

-6CZ 285281 B6

Roztok se extrahuje třikrát 1 litrem ethylacetátu a získaný extrakt se dvakrát promyje 0,2 litru vody. Po zpracování aktivním uhlím se odpaří ethylacetát a nahradí se 600 cm³ ethanolu. Po rekrystalizaci se získá 20 g PIB o čistotě 97 %.

Příklad 3

Frakce 22 až 26 jímané při chromatografii popsané v příkladu 1 se sloučí a 1,2-dichlorethan se odpaří, přičemž se získá 139 g pevného produktu. Tento pevný produkt se vyjme minimálním množstvím 1,2-dichlorethanu a směs se zavede na sloupec silikagelu. Eluce se provádí perkolací směsi 1,2-dichlorethanu a methanolu po dobu 6 hodin při průtoku 18 litrů za hodinu. Obsah methanolu (obsah vody 5 %) se v průběhu chromatografie zvýší z 0 na 5 %. Jímá se 48 frakcí o objemu 2,4 litru. Frakce 38 až 43 se odpaří a pevný zbytek se vyjme 300 cm³ ethanolu. Po rekrystalizaci se získá 22 g PI obsahujícího 40 % PIC. Následné chromatografie na silikagelu (20 až 45 pm) za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a methanolu v objemovém poměru 98/2 poskytnou 5 g pevného produktu, který po vytřepání do methylisobutylketonu a rekrystalizaci z ethanolu má obsah PIC rovný 95 %.

Příklad 4

1000 g PI získaného postupem popsaným v příkladu 1 se rozpustí v minimálním množství chloroformu a purifikuje v následných frakcích na sloupci silikagelu (20 až 45 pm). Po eluci chloroformem obsahujícím 2 až 5 % methanolu se získá produkt, který se zahustí k suchu. Tento produkt se potom purifikuje dvěma následným průchody sloupcem pryskyřice Diaion^Rperkolovaným směsí acetonitrilu a vody v objemovém poměru 60/40. Frakce jsou monitorované chromatograficky. Frakce obsahující PID se sloučí a zahustí k suchu. Takto se získají asi 3 g produktu obsahujícího 60 % PID. Dodatečná purifíkace se provádí protiproudou chromatografii za použití směsi rozpouštědel tvořené methylisobutylketonem, acetonem a kyselinou mravenčí v objemovém poměru 40/2/40. Po koncentraci k suchu frakcí obsahujících PID se získá 1 g pevného produktu obsahujícího 95 % PID.

Příklad 5

400 g Staphylomycinu^R (ve formě tablet - výchozí složení: virginiamycin SI (Sl): 3,4%, virginiamycin S4 (S4): 0,9 %) se zavede do 4 litrů vody.

Tablety se desintegrují mícháním po dobu 15 minut při teplotě 20 °C. Přidá se 1 litr methylenchloridu a v míchání se pokračuje ještě po dobu jedné hodiny. Methylenchloridová fáze se potom dekantuje a zfíltruje, načež se v průběhu 30 minut nalije do 5 litrů míchaného hexanu. Po jednohodinovém míchání se suspenze zfíltruje, přičemž se jímá pevný podíl, který se třikrát promyje 250 cm³ hexanu. Po vysušení se získá 52 g pevného produktu, který se suspenduje ve 370 cm³ ethylacetátu. Potom se provedou dvě následná intenzivní míchání při teplotě 20 °C v délce 10 hodin. Filtrát odpovídající každému zobou míchání se zahustí k suchu, načež se rozpustí v 850 cm³ methanolu zahřívaného na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po postupném snížení teploty až na - 20 °C v průběhu 16 hodin se filtrací izoluje pevný podíl, který se promyje malým množstvím methanolu. Po vysušení pevného podílu při teplotě 35 °C a za sníženého tlaku se získá 9 g faktoru S (virginiamycin S).

Čistota: 96 % (Sl: 75,4 %, S4: 20,6 %).

Výtěžek vztažený na faktor Sl (virginiamycin Sl): 50 %.

-7CZ 285281 B6

Příklad 6 g faktoru S získaného postupem popsaným v příkladu 5 se převede do roztoku v acetonitrilu v množství odpovídající koncentraci 125 mg/cm³ a purifíkuje ve 4 operacích chromatografii na sloupci produktu Nucleosill5C8^R (výška sloupce 25 cm a průměr sloupce 2,54 cm) za nástřiku cm³ a při použití eluční soustavy tvořené směsí vody a acetonitrilu v objemovém poměru 60/40 a průtoku 7,5 cm³ za minutu. V každém případě se jímá 120 cm³ eluátu obsahujícího faktor Sl, což je celkem 480 cm³. Chromatografie se opakuje čtyřikrát, aby se zpracoval celkem 1 g faktoru S. Takto se jímá objem asi 500 cm³ obsahující faktor Sl. Acetonitril se odstraní v rotační odparce. Vodná fáze se třikrát extrahuje 50 cm³ dichlormethanu. Methylenchloridové fáze se sloučí, promyjí 50 cm³ destilované vody, vysuší nad síranem sodným a zfiltrují. Dichlormethan se odstraní v rotační odparce za sníženého tlaku (665 Pa). Takto se získá 0,67 g faktoru Sl s čistotou 99,6 %.

Příprava surových složek skupiny A

Příklad 7

500 g surového pristinamycinu /pristinamycin IA (PIA): 20,7 %, pristinamycin IB (PIB): 3,9 %, pristinamycin IC (PIC): 0,6 %, pristinamycin ID (PID): 0,3 %, pristinamycin IIB (PIIB): 8 %, pristinamycin IIA (ΡΠΑ): 45 %/ se uvede do roztoku v 50 litrech methylisobutylketonu. Tento roztok se pětkrát extrahuje vodnou fází tvořenou 2,5 litru vody a 2,5 litru IN kyseliny sírové a potom promyje třikrát 10 litry vody. Methylisobutylketon se potom zpracuje 7,5 litru vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného o koncentraci 35 g/1 a potom promyje 5 litry vody. Pokaždé se vodná fáze smísí s organickou fází, dekantuje a oddělí.

Získaná organická fáze se uvede do styku se 750 g oxidu hlinitého, zfiltruje, zahustí až na objem asi 4 litrů a vyjme 5 objemy hexanu. Vyloučená sraženina se odfiltruje a vysuší. Získá se 300 g produktu, který se suspenduje v 1 litru isopropanolu. Po míchání při teplotě 55 °C po dobu 45 minut se suspenze zfiltruje při teplotě 4 °C. Filtrační matečné louhy se zahustí k suchu, vyjmou 500 cm³ methylisobutylketonu, do kterého se nalije 5 objemů hexanu. Sraženina se odfiltruje, promyje hexanem a vysuší za sníženého tlaku při teplotě 40 °C. Získá se 69 g surového PIIB obsahujícího 36 % PIIB a 6 % ΡΠΑ a neobsahujícího již PIA.

Příklad 8 g surového ΡΠΒ získaného v předcházejícím příkladu 7 se purifíkuje v několika operacích chromatograficky na sloupci produktu Nucleosil5C8^R (průměr sloupce 5 cm, výška sloupce 30 cm) za použití eluční soustavy tvořené směsí vody a acetonitrilu v objemovém poměru 60/40. Takto se získá 250 mg pristinamycinu KF (PKF).

Příprava společně vykrystalizovaného produktu

V následujících příkladech bylo prokázáno, že difřakční rentgenové spektrum společně vykrystalizovaného produktu je odlišné od spektra složky skupiny B, která vykrystalizovala samotná ve stejném rozpouštědle, pokud tato složka existuje.

-8CZ 285281 B6

Příklad 9

Produkt ΡΠΒ v surovém stavu získaný v předcházejícím příkladu 7 se rozpustí ve 190 cm³acetonu. K získanému roztoku se přidá 33 g purifíkovaného Pl (PIA: 81,1 %, ΡΠ3: 12 %, PIC: 2,6 %, PID: 1,1 %). Po 17 hodinách míchání při teplotě 20 °C se získá suspenze, která se zfiltruje při teplotě 4 °C. Produkt se promyje a vysuší. Po rekrystalizaci z acetonu obsahujícího 100 g produktu v jednom litru acetonu se získá 10 g bílých krystalů obsahujících 55 % PIIB+PUF+PIIG a 43 % PIA+PIB+PIC+PID.

Příklad 10

250 mg purifíkovaného PIIB získaného postupem popsaným v příkladu 18 se rozpustí v 17 cm³ethylacetátu. K získanému roztoku se přidá 300 mg purifíkovaného Pl (PIA: 81,1 %, PIB: 12 %, PIC: 2,6 %, PID: 1,1 %). Po 20 hodinách míchání při teplotě 20 °C, filtraci, promytí a vysušení se získá 125 mg bílých krystalů.

Obsah PUB+PUF+PIIG: 56 %, z toho obsah ΡΠΒ: 54 %.

Obsah PIA+PIB+PIC+PID: 43 %.

Příklad 11

500 mg PIIB v čistém stavu získaného postupem popsaným v příkladu 18 se rozpustí v 5 cm³acetonu. K roztoku se přidá 480 mg PIA (čistota: 99,8 %). Směs se míchá po dobu 20 hodin při teplotě 20 °C, načež se zfiltruje. Po promytí 1 cm³ acetonu a vysušení po dobu 30 hodin při teplotě 40 °C za sníženého tlaku (nižší než 1 kPa) se získá 590 mg bílých krystalů.

Obsah: PIIB+PIIF+PIIG: 56 %, z toho obsah PIIB: 54 %.

Obsah PIA: 43 %.

Matečný louh z předcházející krystalizace se vyjme a doplní novou šarží 560 mg ΡΠΒ. Hmotnostní poměr PIIB/PIA je blízký 4. Po 20 hodinách míchání, filtraci, promytí a vysušení se získá 195 mg krystalů, jejichž čistota a složení jsou stejné jako čistota a složení krystalů pocházejících z prvního zpracování.

Příklad 12

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, avšak s tím, že se PIA nahradí 480 mg PIB (čistota 97 %), přičemž se získá 820 mg bílých krystalů, jejichž obsah ΡΠΒ+PEIF+PIIG činí 56 % (z toho obsah ΡΠΒ = 54 %) a jejichž obsah PIB činí 43 %.

Příklad 13

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, přičemž se za použití 680 mg ΡΠΒ a 580 mg PIC (čistota 95 %) ve 4 cm³ acetonu získá 315 mg bílých krystalů, jejichž obsah PIIB+PIIF+PIIG činí 57 % (z toho obsah ΡΠΒ = 55 %) a jejichž obsah Pl činí 42 % (z toho obsah PIC činí 37 %).

-9CZ 285281 B6

Příklad 14

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, avšak s výjimkou spočívající vtom, že se PIA nahradí 480 mg PID (čistota 95 %), přičemž se získá 475 mg bílých krystalů, jejichž obsah 5 ΡΠΒ+PIIF+PIIG činí 55 % (z toho obsah ΡΠΒ činí 53 %) a jejichž obsah PID činí 39 %.

Příklad 15 io Postupuje se stejně jako v příkladu 11, přičemž se za použití 450 mg ΡΠΒ a 380 mg faktoru S (Sl: 75,4%, S4: 20,6%) ve 4 cm³ acetonu získá 550 mg bílých krystalů, jejichž obsah ΡΠΒ+PIIF+PIIG činí 58 % (z toho obsah ΡΠΒ činí 56 %) a jejichž obsah faktoru S činí 41 % (z toho obsah Sl činí 37 %).

Příklad 16

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, avšak s výjimkou spočívající vtom, že se PIA nahradí 480 mg faktoru Sl, přičemž se získá 750 mg bílých krystalů, jejichž obsah PIIB+PHF+PIIG činí 20 58 % (z toho obsah PIIB činí 54 %) a jejichž obsah faktoru S1 činí 41 %.

Příklad 17

Postupuje se stejně jako v příkladu 11, přičemž se za použití 224 mg PUF a 192 mg faktoru S ve 2 cm³ acetonu získá 220 mg bílých krystalů, jejichž obsah PUF činí 55 % a jejichž obsah faktoru S Činí 39 % (z toho 31 % faktoru Sl a 5 % S4).

Rentgenové difrakční diagramy produktů z příkladů 9 až 17

V následující tabulce 5 jsou uvedeny relativní intenzity základních čar. Tyto rentgenové difrakční diagramy byly změřeny difraktometrem Phillips PW1700 s kobaltovou antikatodou. Referenční hodnota 100 je přiřazena čáře při 15,8 Á. Uvedené relativní hodnoty čar se stanoví změřením výšky každé čáry po odečtení kontinuálního pozadí.

Tabulka 5

Interplanámí vzdálenost	Produkt z příkladu:
(A)	Př. 9	Př. 11	Př. 12	Př. 13	Př. 14	Př. 15	Př. 16	Př. 17
15,8	100	100	100	100	100	100	100	100
11,8	40	34	35	32	43	28	36	21
10,3	69	52	63	65	50	70	80	87
9,7	38	45	47	44	43	40	49	45
6,4	44	41	51	41	37	40	51	39
6,1	38	41	40	38	43	30	40	35
5,9	75	64	70	63	67	74	89	71
5,8	38	39	47	49	50	44	54	35
5,2	92	75	79	71	70	70	91	81
5,0	67	59	60	60	57	54	69	52
4,7	50	43	53	49	47	50	40	42

-10CZ 285281 B6

Uvedené rentgenové difrakční diagramy jsou obdobné pro libovolné společně vykrystalizované produkty (interplanámí vzdálenosti hlavních čar se výrazně neliší).

Pufrikace složky skupiny A

Příklad 18

9,3 g produktu získaného v příkladu 9 se rozpustí ve 490 cm³ methylisobutylketonu. Tento roztok se extrahuje dvakrát 370 cm³ vodného roztoku (0,5N) kyseliny sírové, načež se dvakrát promyje 150 cm³ vody. Organická fáze se potom zahustí až na objem asi 80 cm³ a takto zahuštěný podíl se nalije do 5 objemů hexanu. Vyloučená sraženina se promyje, zfiltruje a vysuší. Za účelem eliminace methylisobutylketonu se produkt vyjme acetonem k dosažení koncentrace 100 g/1, roztok se nalije do 10 objemů hexanu, promyje a vysuší. Získá se 3,5 g produktu obsahujícího purifikovaný ΡΠΒ, který již neobsahuje Pí.

Obsah PIIB+PIIF+PIIG: asi 95 %, z toho obsah ΡΠΒ: 92 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Minoritní složky skupiny A streptograminů obecného vzorce I (I) ve kterém R znamená atom vodíku nebo ethylovou skupinu.