CZ294843B6

CZ294843B6 - Bromtiacumicinové sloučeniny, způsob jejich přípravy, farmaceutické kompozice je obsahující a jejich použití

Info

Publication number: CZ294843B6
Application number: CZ199928A
Authority: CZ
Inventors: Jill E. Hochlowski; Marianna Jackson; James B. Mcalpine; Ronald R. Rasmussen
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 2005-03-16
Also published as: EP0923594A1; KR20000023662A; DE69716094D1; AU730839B2; KR100476799B1; EP0923594B1; AR007854A1; ZA975861B; HUP9903902A3; CA2257984A1; AU3504697A; BR9710250A; WO1998002447A1; CN1225096A; HU224966B1; DK0923594T3; JP2000515512A; DE69716094T2; HUP9903902A2; US5767096A

Abstract

Jsou popsány bromtiacumicinové sloučeniny vzorce I, kde R.sup.1.n. a R.sup.2.n. jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku a C.sub.1.n.-až-C.sub.4.n. alkanoyl; R.sup.3.n. a R.sup.4.n. jsou vybrány ze skupiny sestávající z (a) R.sup.3.n. je vodík a R.sup.4.n. je hydroxy, (b) R.sup.3 .n. je hydroxy a R.sup.4.n. je vodík, (c) R.sup.3.n. a R.sup.4.n. dohromady jsou =O; nebo vybrané ze skupiny sestávající z vodíku a hydroxy; a R.sup.5.n. a R.sup.6.n. jsou vybrány ze skupiny skládající se z vodíku, bromu a chloru, s podmínkou, že alespoň jeden z R.sup.5.n. a R.sup.6.n. musí být brom. Také jsou popsány farmaceutické kompozice obsahující takové sloučeniny, a použití sloučenin pro výrobu léčiva pro léčení bakteriální infekce. Způsob přípravy uvedených sloučenin zahrnuje kultivaci mikroorganismu náležejícího k druhu Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis v bromidem obohaceném živném médiu.ŕ

Description

Bromtiacumicinové sloučeniny, způsob jejich přípravy, farmaceutické kompozice je obsahující a jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových bromtiacumicinových antibiotik, farmaceutických kompozic obsahujících takové sloučeniny a jejich použití v léčbě bakteriálních infekcí a způsobů jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

O jistých antibioticích, která jsou aktivní proti širokému spektru Gram-pozitivních a jiných bakterií je známo, že jsou produkovány druhy mikroorganizmů izolovanými ze vzorků půdy z celého světa. Existuje nicméně potřeba nových antimikrobiálních činidel, která by vykazovala lepší aktivitu, která by měla lepší nebo specifické spektrum účinnosti a/nebo která by vykazovala lepší farmakokinetické vlastnosti při podání pacientovi.

Existuje zejména potřeba antimikrobiálních činidel, která by byla použitelná v léčbě s antimikrobiálními činidly asociované nebo jiné nosokomiální kolitidy, která je často způsobena organizmem Clostridium diffícile, zejména takových činidel, která by umožňovala obnovení částečné nebo úplné normální flory.

Tiacumicinová antibiotika jsou popsána v patentu US 4 918 174 (uděleném 14. 4. 1990 a zde uvedeném jako odkaz) a zahrnují sloučeniny tiacumicin A, tiacumicinB, tiacumicin C, tiacumicin D, tiacumicin E a tiacumicin F. Příbuznými sloučeninami jsou lipiarmycinová antibiotika (cf., Arnone et al., J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 1987: 1353-1359 (1987) a Cavalleri et al., J. Antibiotics, 41: 308-315 (1988)) a clostomycinová antibiotika (cf., Omura et al., J. Antibiotics 39: 1407 - 1412 (1986)).

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že nová bromtiacumicinová antimikrobiální činidla mohou být získána modifikací procesu pro produkci tiacumicininových antibiotik, která jsou izolována z fermentačního bujónu a mycelií Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis subsp. nov. Bylo zjištěno, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které jsou brómované deriváty výše uvedených tiacumicinů, mají in vitro aktivitu proti různým bakteriálním patogenům a zejména proti Clostridium, pokud je tato aktivita hodnocena v testu využívajícím Wilkins-Chalgrenův agar za anaerobních podmínek. Proto se očekává, že tyto sloučeniny budou užitečné v léčbě bakteriálních infekcí u savců.

-1 CZ 294843 B6

Jedním aspektem vynálezu jsou bromtiacumicinové sloučeniny vzorce I

(I) nebo jejich farmaceuticky přijatelná proléčiva, kde

R¹ a R² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku a C₄-až-C₄ alkanoylu;

R³ a R⁴ jsou vybrány ze skupiny sestávající z (a) R³ je vodík a R⁴ je hydroxy, (b) R³ je hydroxy a R⁴ je vodík; a (c) R³ a R⁴ dohromady jsou =0; nebo nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z vodíku a hydroxy skupiny;

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, bromu a chloru, s podmínkou, že alespoň jeden z R⁵ a R⁶ musí být brom.

V dalším aspektu předkládaného vynálezu jsou popsány farmaceutické kompozice obsahující farmaceuticky účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Vynálezem je tedy rovněž bromtiacumicinová sloučenina popsaná výše, pro použití jako léčivo, jakož i použití této bromtiacumicinové sloučeniny pro výrobu léčiva pro léčení bakteriální infekce u pacienta potřebujícího takové léčení. Bakteriální infekce je způsobena Gram-pozitivními bakteriemi, zejména infekce způsobené patogenem Clostridium diffícile, přičemž léčení spočívá v podání terapeuticky účinného množství bromtiacumicinové sloučeniny pacientovi.

V ještě jiném aspektu vynálezu je popsán způsob přípravy sloučenin, podle kterého se kultivuje mikroorganizmus náležící k druhu Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis mající schopnost produkovat bromtiacumicinovou sloučeninu v bromidem obohaceném živném médiu a akumuluje se bromtiacumicinová sloučenina na uvedeném médiu.

Podrobný popis vynálezu

Jedním výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde jeden z R¹ a R² je C]-až-C4 alkanoyl a druhý je vodík.

Jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde R⁵ je brom a R⁶ je vodík.

Ještě jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou sloučeniny vzorce I, kde R⁵ je chlor a R⁶ je brom.

Reprezentativními sloučeninami podle předkládaného vynálezu jsou následující:

Sloučenina podle vzorce I, kde R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy skupina, R⁵ je chlor a R⁶ je brom;

Sloučenina podle vzorce I, kde R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ a R⁴ dohromady jsou =0, R⁵ je chlor a R⁶ je brom;

Sloučenina podle vzorce I, kde R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy skupina, R⁵ je brom a R⁶ je vodík; a

Sloučenina podle vzorce I, kde R¹ 2-methylpropanoyl a R² je vodík, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy, R⁵ je brom a R⁶ je vodík; nebo jejich farmaceuticky přijatelné pro léčivo.

Nej výhodnějším provedením vynálezu je sloučenina podle vzorce I, kde R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy, R⁵ je chlor a R⁶ je brom.

Jak jsou použity v této přihlášce a v připojených nárocích, mají následující termíny tento význam:

Termín „alkyl“, jak je zde použit, označuje monovalentní uhlovodíkový radikál o 1 až 12 atomech uhlíku s přímým nebo s rozvětveným řetězcem, včetně, ale bez omezení, methyl, ethyl, npropyl, izopropyl, n-butyl, sec. butyl, izobutyl, t-butyl, pentyl, hexyl, heptyl a podobně.

Termín „alkanoyl“, jak je zde použit, označuje monovalentní radikál vzorce -C(O)R, kde R” je vodík nebo alkylová skupina jak je definována výše, včetně, ale bez omezení, acetyl, propionyl, izobutyryl a podobně.

Termín „Ci-až-C₄ alkanoyl“, jak je zde použit, označuje alkanoylový radikál jak je definován výše, kde R je vodík nebo alkylová skupina o 1 až 3 atomech uhlíku.

Termín „nižší alkyl“ jak je zde použit, označuje alkylový radikál jak je definován výše mající od 1 do 6 atomů uhlíku.

Termín „farmaceuticky přijatelná proléčiva“, jak je zde použit, označuje sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které jsou, v rozsahu lékařských znalostí, vhodné pro použití ve tkáních lidských a ve tkáních nižších zvířat bez nežádoucí toxicity, iritace, alergické odpovědi a podobně, s přijatelným poměrem zisk/riziko, a která jsou účinná pro zamýšlený účel, stejně jako obojetné

-3 CZ 294843 B6 formy, tam kde jsou možné, sloučenin podle předkládaného vynálezu. Termín „proléčivo“ označuje sloučeniny, které jsou rychle transformovány in vitro za zisku původní sloučeniny výše uvedeného vzorce, například hydrolýzou v krvi. Podrobná diskuze je uvedena v T. Higuchi andV. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, svazek 14 A.C.S. Symposium Series, a v Edward, B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, Američan Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, které jsou zde oba uvedeny jako odkaz.

Pokud je to vhodné, mohou být deriváty sloučenin podle předkládaného vynálezu připraveny jakoukoliv vhodnou metodou. Pro ty sloučeniny, kde skupinou proléčiva je aminokyselinová nebo peptidová funkce, je provedena kondenzace amino skupiny s aminokyselinou a peptidy podle běžných metod kondenzace jako je azidová metoda, metoda se směsí kyseliny a anhydridu, DCC (dicyklohexyl-karbodiimid) metoda, metoda využívající aktivního esteru (/>-nitrofenyl esterová metoda, metoda využívající imidester kyseliny A-hydroxyjantarové, kyanomethyl esterová metoda a podobně), metoda využívající Woodeardova činidla K, DCC-HOBT (1-hydroxy-benzotriazol) metoda a podobně. Klasické metody pro kondenzační reakce jsou popsány v M. Bodansky, Y. S. Klausner and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Second Edition, NY, 1976.

Ve sloučeninách podle předkládaného vynálezu mohou existovat asymetrická centra. Kromě výše uvedených sloučenin zahrnuje předkládaný vynález různé stereoizomery a jejich směsi. V souladu s tím, pokud je vazba uvedena nestereospecifícky, pak zahrnuje obě orientace.

Při výše uvedeném použití nebo v jiných způsobem léčby může být terapeuticky účinné množství jedné ze sloučenin podle předkládaného vynálezu použito v čisté formě nebo, pokud takové formy existují, ve formě farmaceuticky přijatelných solí, esterů nebo proléčiv. Alternativně, sloučenina může být podána jako farmaceutický přípravek obsahující požadovanou sloučeninu v kombinaci s jednou nebo více farmaceuticky přijatelných přísad. „Terapeuticky účinným množstvím“ sloučeniny podle předkládaného vynálezuje míněno množství sloučeniny dostatečné pro léčbu onemocnění, s přijatelným poměrem zisk/riziko použitelným na jakoukoliv terapii. Mělo by být nicméně jasné, že celková denní dávka sloučenin a přípravků podle předkládaného vynálezu bude určena ošetřujícím lékařem podle řádného lékařského postupu. Přesné terapeuticky účinné dávky pro jakéhokoliv jednotlivého pacienta budou záviset na mnoha faktorech jako je typ léčeného onemocnění a jeho závažnost; aktivita určité použité sloučeniny; typ použitého přípravku; věk, tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví a dietní zvyklosti pacienta; doba podání, způsob podání a iychlost vylučování konkrétní podané sloučeniny; trvání léčby; léky použité v kombinaci nebo současně s konkrétní použitou sloučeninou; a na podobných faktorech, které jsou v oboru známé. Například, v oboru je běžné začít léčbu s dávkami sloučeniny, které jsou nižší než jsou dávky nutné pro dosažení požadovaného terapeutického účinku a postupně zvyšovat dávky, dokud není dosaženo požadovaného účinku.

Celková denní dávka sloučenin podle předkládaného vynálezu podaná lidem nebo nižším živočichům orálním způsobem podání může být v rozsahu od přibližně 0,01 do přibližně 100 mg/kg/den. Přesněji může být dávka v rozsahu od přibližně 0,1 do přibližně 10 mg/kg/den. Pokud je to žádoucí, může být účinná denní dávka rozdělena pro podání do několika dávek; v souladu s tím, přípravky jedné dávky mohou obsahovat taková množství nebo více menších množství tak, aby vytvářely denní dávku.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují sloučeninu podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu, které mohou být podány orálně, rektálně, parenterálně, intracistemálně, intravaginálně, intraperitoneálně, lokálně (ve formě prášků, mastí nebo kapek), bukálně nebo jako nasální spray. „Farmaceuticky přijatelným nosičem“ je míněno netoxické solidní, semisolidní nebo kapalné plnidlo, ředidlo, obalový materiál nebo pomocné formulační činidlo jakéhokoliv typu. Termín „parenterální“, jak je zde použit, označuje způsoby podání, které zahrnují intravenózní, intramuskulámí, intraperitoneální, intrasternální, subkutánní a intraartikulámí injekci a infuzi.

-4CZ 294843 B6

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu pro parenterální injekci zahrnují farmaceuticky přijatelné sterilní nevodné roztoky nebo vodné disperze, suspenze nebo emulze, stejně jako sterilní prášky pro rekonstituci v sterilních injikovatelných roztocích nebo disperzích těsně před použitím. Příklady vhodných vodných nebo nevodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehikul zahrnují vodu, ethanol, polyoly (jako je glycerol, propylenglykol, polyethylenglykol a podobně), karboxymethylcelulózu a její vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injikovatelné organické estery jako je ethyloleát. Správná tekutost může být udržována, například, použitím potahových materiálů jako je lecitin, udržováním požadované velikosti částic v případě disperzí a použitím surfaktantů.

Tyto přípravky mohou také obsahovat pomocná činidla jako jsou konzervační činidla, zvlhčovači činidla, emulzifíkační činidla a dispergační činidla. Zabránění působení mikroorganizmů může být provedeno obsažením různých antibakteriálních a antimykotických činidel, jako je například paraben, chlorbutanol, kyselina fenolsorbová a podobně. Také může být žádoucí, aby byla obsažena izotonická činidla jako jsou cukry, chlorid sodný a podobně. Prodloužená absorpce injikovatelných farmaceutických forem může být provedena tak, že jsou obsažena činidla oddalující absorpci, jako je monostearan hlinitý a želatina.

V některých případech, pro zajištění prodlouženého účinku léčiva, je žádoucí zpomalit absorpci léku ze subkutánní nebo intramuskulární injekce. Toto může být provedeno za použití kapalné suspenze krystalického nebo amorfního materiálu se špatnou rozpustností ve vodě. Rychlost absorpce léčiva potom závisí na jeho rychlosti rozpouštění, která, nakonec, může záviset na velikost krystalů a krystalické formě. Alternativně, oddálení absorpce parenterálně podané formy léčiva může být dosaženo rozpuštěním nebo suspendováním léčiva v olejovém vehikulu.

Injikovatelné depotní formy mohou být vytvořeny vyrobením mikroobalové matrice léčiva v biodegradovatelných polymerech jako je polyaktid-polyglykolid. Podle poměru léčiva k polymeru a podle charakteru použitého polymeruje kontrolována rychlost uvolňování léčiva. Příklady jiných biodegradovatelných polymerů zahrnují poly(ortoestery) a poly(anhydridy). Depotní injikovatelné přípravky jsou také vyrobeny obalením léčiva do liposomů nebo mikroemulzí, které jsou kompatibilní s tělesnými tkáněmi.

Injikovatelné přípravky mohou být sterilizovány, například filtrací přes antibakteriální filtr, nebo obsažením sterilizačního činidla ve formě sterilního solidního přípravku, který může být rozpuštěn nebo dispergován ve sterilní vodě nebo v jiném sterilním injikovatelném médiu těsně před použitím.

Pevné dávkové formy pro orální podání zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule.

V takových pevných dávkových formách je aktivní sloučenina smísena s alespoň jednou inertní, farmaceuticky přijatelnou přísadou nebo nosičem, jako je citrát sodný nebo střední fosforečnan vápenatý a/nebo a) plnidly nebo nastavovadly jako jsou škroby, laktóza, sacharóza, glukóza, manitol a kyselina křemičitá, b) pojivý jako je například karboxymethylcelulóza, algináty, želatina, polyvinylpyrrolidon, sacharóza a akacie, c) zvlhčovacími činidly jako je glycerol, d) činidly podporujícími rozpadavost jako je agar-agar, uhličitan vápenatý, bramborový nebo topiokový škrob, kyselina alginová, některé křemičitany a uhličitan sodný, e) roztokem retardačních činidel jako je parafin, f) urychlovačů absorpce jako jsou kvartémí amoniové sloučeniny, g) smáčivými činidly jako je například cetyl alkohol nebo glycerol monostearát, h) absorbens jako je kaolin a bentonitová klovatina a i) kluznými činidly jako je talek, stearát vápenatý, stearan hořečnatý, solidní polyethylenglykoly a lauryl síran sodný, a jejich směsi. V případě kapslí, tablet a pilulek může dávková forma také obsahovat pufrovací činidlo.

Pevné přípravky podobného typu mohou být také použity jako plnidla v kapslích z tuhé nebo měkké želatiny za použití přísad jako je laktóza nebo mléčný cukr, stejně jako polyethylenglykoly o vysoké molekulové hmotnosti a podobně.

-5CZ 294843 B6

Pevné dávkové formy tablet, dražé, kapslí, pilulek a granulí mohou být připraveny s potahy a obaly jako jsou enterální potahy a jiné potahy dobře známé v oboru přípravy farmaceutických přípravků. Tyto mohou volitelně obsahovat činidla nepropustná pro světlo a mohou to být také přípravky, které uvolňují aktivní složku pouze (nebo přednostně) v určitých částech gastrointestinálního traktu, volitelně oddáleným způsobem. Příklady potahových substancí, které mohou být použity, zahrnují polymerické substance a vosky.

Aktivní sloučeniny mohou být také přítomny ve formě mikrokapslí, pokud je to vhodné, pak spolu s jednou nebo více z výše uvedených přísad.

Kapalné dávkové formy pro orální podání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry. Kromě aktivních sloučenin mohou kapalné dávkové formy obsahovat inertní ředidla běžně používaná v oboru, jako je například voda nebo jiná rozpouštědla, solubilizační činidla a emulzifikátory jako je ethylalkohol, izopropylalkohol, ethylkarbonát, ethylacetát, benzylalkohol, benzylbenzoát, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, dimethylformamid, oleje (zejména ze semen bavlníku, podzemnicový olej, kukuřičný olej, kličkový olej, olivový olej, ricinový olej a sezamový olej), glycerol, tetrahydrofurfurylalkohol, polyethylenglykoly a sorbitanové estery mastných kyselin a jejich směsi.

Kromě inertních ředidel mohou také orální přípravky obsahovat pomocné látky jako jsou smáčivá činidla emulzifíkační a suspendační činidla, a sladidla, chuťová korigens a činidla upravující vůni.

Suspenze mohou, kromě aktivních sloučenin, obsahovat suspendační činidla jako jsou, například, ethoxylovaný izostearylalkohol, polyoxyethylensorbitol a sorbitanové estery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragant, a jejich směsi.

Lokální podání zahrnuje podání na kůži nebo na sliznici, včetně povrchu plic a oka. Přípravky pro lokální podání, zahrnující přípravky pro inhalaci, mohou být připraveny jako suché prášky, které mohou být tlakované nebo netlakované. V netlakovaných práškových přípravcích může být aktivní složka v jemně dělené formě použita ve směsi s větším farmaceuticky přijatelným inertním nosičem obsahujícím částice velikosti, například, více než 100 pm v průměru. Vhodné inertní nosiče zahrnují cukry jako je laktóza. Je žádoucí, aby alespoň 95 % hmotnosti částic aktivní složky mělo efektivní velikost částic v rozmezí od 0,01 do 10 pm.

Alternativně může být přípravek tlakovaný a může obsahovat stlačený plyn, jako je dusík, nebo zkapalněné plynné hnací médium. Kapalné hnací médium a celkový přípravek jsou výhodně takové, aby se v nich žádným významným způsobem nerozpouštěla aktivní složka. Tlakovaný přípravek může také obsahovat povrchově aktivní činidlo. Povrchově aktivní činidlo může být kapalné nebo solidní neiontové povrchově aktivní činidlo, nebo to může být solidní aniontové povrchově aktivní činidlo. Výhodné je použití solidního aniontového povrchově aktivního činidla ve formě sodné soli.

Přípravky pro rektální nebo vaginální podání jsou výhodně čípky, které mohou být připraveny smísením sloučenin podle předkládaného vynálezu s vhodnými nedráždivými přísadami nebo nosiči, jako je kakaové máslo, polyethylenglykol nebo vosk pro čípky, které jsou v pevném stavu při pokojové teplotě, ale v kapalném stavu při tělesné teplotě a proto tají v rektu nebo ve vagíně a uvolňují aktivní sloučeninu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také podány ve formě liposomů. Jak je v oboru známo, liposomyjsou obecně odvozeny od fosfolipidů nebo jiných lipidových substancí. Liposomy jsou tvořeny mono- nebo multi-lamelárními hydratovanými kapalnými krystaly, které jsou dispergovány ve vodném médiu. Mohou být použity jakékoliv netoxické, fyziologicky přijatelné a metabolizovatelné lipidy schopné tvorby liposomů. Předkládané přípravky ve formě

-6CZ 294843 B6 liposomů mohou kromě sloučenin podle předkládaného vynálezu obsahovat stabilizátory, konzervační činidla, přísady a podobně. Výhodnými lipidy jsou fosfolipidy a fosfatidylcholiny (lecitiny), jak přirozené, tak syntetické. Způsoby pro tvorbu liposomů jsou v oboru známé. Viz, například, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, svazek XIV, Academie Press, New York, N. Y., 1876, str. 33 a dále.

Způsoby pro přípravu bromtiacumicinu

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny za použití jednoho nebo více z následujících procesů. Fermentační proces pro tiacumiciny je popsán ve výše uvedeném patentu US 4 918 174. Příprava bromtiacumicinu může být provedena modifikací výše uvedeného procesu náhradou chloridu sodného bromidem sodným ve fermentačním médiu. Koncentrace bromidu sodného v médiu může být v rozmezí od 0,25 do 1,0 %, nejlépe přibližně 0,48 %.

Bromtiacumiciny mohou být extrahovány z fermentační kapaliny za použití běžných organických rozpouštědel nemísitelných nebo pouze částečně mísitelných s vodou jako je ethylacetát, diethylether, methylenchlorid nebo chloroform. Výhodně je provedení lýzy mycelií přidáním středního množství rozpouštědla mísitelného s vodou jako je methanol nebo aceton před provedením extrakce. Tento krok zajistí extrakci antibiotika z intramyceliálního rezervoáru. Separace příbuzných tiacumicinových antibiotik může být provedena chromatografíckými metodami.

Pokusná část

Optické rotace byly měřeny na Perkin-Elmer Model 241 polarimetru v 10 cm kyvetě. Hmotnostní spektrum při ostřelování rychlými atomy bylo měřeno na Kratos MS-50 hmotnostním spektrometru. Ultrafialové spektrum bylo zaznamenáváno na Perkin-Elmer Lambda 3B UV-viditelné světlo spektrofotometru a infračervené spektrum na Nicolet model 60SX FT-IR připojeném na Nicolet počítač. NMR spektrum bylo získáno buď na Generál Electric GN500, nebo GN300 spektrometru. Data NMR spektra jsou uvedena v tabulce 1 (po příkladu 6, dále). Uvedené R_fhodnoty byly získány na Analtech TLC plotnách vyvíjených za použití chloroformrmethanol (9:1, obj.:obj.) a byly vizualizovány za použití síranu ceričitého postřikového činidla. Body tání byly určeny na Hoover Unimelt a jsou uvedeny bez korekce. Minimální inhibiční koncentrace byly určeny dvojnásobným agarovým ředěním, „brain-heart“ infůzní agar byl použit pro aeroby a Wilkins-Chalgren agar pro anaeroby.

Sloučeniny, způsoby a použití předkládaného vynálezu bude lépe pochopeno v souvislosti s následujícími příklady, které jsou míněny jako ilustrace a nikoliv jako omezení rozsahu předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba bromtiacumicinů fermentací

Brómované tiacumiciny byly produkovány submerzní fermentací ve 42 litrovém fermentačním tanku z nerez oceli (LH Fermetation) v médiu skládajícím se z monohydrátu glukózy 2 %, sojového oleje 0,1 %, sojové moučky 1 %, hovězího extraktu 0,3 %, K₂HPO₄ 0,05 %, MgSO₄.7H₂O 0,05 %, KBr 0,48 % a CaCO₃ 0,3 %. Tato formulace je podobná formulaci použité pro přípravu tiacumicinů ve výše uvedeném patentu US 4 918 174, se substitucí KBr místo KC1. Fermentační tank byl naplněn 30 litry média. Sterilizace proběhla při 121 °C a 1,05 kg/cm² po dobu 1 hodiny. Monohydrát glukózy byl sterilizován odděleně a byl přidán do fermentačního tanku před inokulaci. Produkující organizmus, Dactylosporangium aurantiacum subsp.

-7CZ 294843 B6 hamdenensis AB 7180-41, byl kultivován na šikmých agarech zATCC média 172 po dobu lOdní při 30 °C. Kultivace na šikmém agaru byla použita pro inokulaci nasazovacího média skládajícího se z glukosamonohydrátu 0,1 %, rozpustného škrobu 2,4 %, kvasinkového extraktu 0,5 %, tryptonu 0,5 %, hovězího extraktu 0,3 % a CaCO₃ 0,4 %. Inokulum bylo připraveno ve dvou fázích. První fáze, inokulace s kulturami na šikmém agaru, byla inkubována po dobu 96 hodin. Tato vegetativní kultura byla použita v koncentraci 5% pro inokulaci 2 litrových Erlenmeyerových zkumavek obsahujících 600 ml média pro násadu. Tyto zkumavky byly inkubovány po dobu 72 hodin. Obě fáze byly inkubovány při 30 °C na rotační třepačce při 225 ot/min (5,08 cm rázy). Druhá fáze růstu byla použita v koncentraci 5% pro inokulaci fermentačního tanku. Během fermentace byla teplota udržována na 30 °C, míchání bylo 250 ot/min, průtok vzduchu byl 0,7 vol/vol/minutu a tlak na víko byl udržován na 0,35 kg/cm². Tvorba pěny byla kontrolována silikonovým protipěnivým činidlem, XFO 371 (Ivanhoe, Industries), které bylo přidáno nejprve v koncentraci 0,01% a potom podle potřeby. Fermentace byla sklízena po sedmi dnech. Při odběru bylo pH, které bylo 7,9, upraveno na 7,0.

Příklad 2

Izolace bromtiacumicinů

Při odběru bylo pH celého živného média (30 litrů) upraveno na pH 7 a byl přidán aceton (15 litrů). Po hodině míšení byla směs acetonu a fermentačního živného média extrahována ethylacetátem (3 x 15 litrů). Kombinované extrakty byly koncentrovány do sucha a zbytek byl rozdělen mezi chloroform-methanol-vodu (1200 ml každý). Nejnižší vrstva tohoto dělení byla koncentrována za zisku světle žluté amorfní solidní substance. Tato solidní substance byla zavedena do silikagelové kolony a byla eluována postupným gradientem od 1 % do 50 % methanolu v chloroformu. Aktivní frakce byly kombinovány podle TLC analýzy do tří souborů. První soubor byl zaveden na silikagelovou kolonu a byl eluován postupně gradienty 10 %, 20 % a 50 % methanolu v chloroformu. Aktivní frakce z této kolony byly kombinovány a koncentrovány za zisku bílé solidní substance. Tato solidní substance byla podrobena protiproudé chromatografií na Ito mnohovrstvé spirální planetové centrifuze v systému rozpouštědel chloroform-tetrachlormethan-methanol-voda (7:3:7:3), kde nejnižší fáze byla stacionární. Aktivní frakce z této kolony byly kombinovány a koncentrovány za zisku 2 mg čisté sloučeniny 3 (viz příklad 5, dále). Při podobné chromatografií druhého souboru byl získán čistý tiacumicin B (58 mg) a čistá sloučenina 2 (3 mg) (viz tabulka 4, dále). Třetí soubor byl podroben protiproudové chromatografií za stejných podmínek za zisku čisté sloučeniny 4 (45 mg) (viz příklad 6, dále) a surové sloučeniny 1, která byla dále přečištěna chromatografií na Sephadex LH-20 koloně a byla eluována dichlormethammethanol (1:1). Aktivní frakce z této LH-20 kolony byly kombinovány a koncentrovány za zisku 42 mg čisté sloučeniny 1 (viz příklad 3, dále).

Příklad 3

Charakterizace sloučeniny 1

Sloučenina podle vzorce I, kde R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy, R⁵ je chlor a R⁶ je brom

Pozitivní iontové hmotnostní spektrum s ostřelováním rychlými atomy (FAB) 1 mělo nejvyšší molekulovou hmotnost iontu při m/z = 1123. Tento nejvyšší pík mohl být posunut na m/z =1139 přidáním draslíku do vzorku a proto se předpokládá, že 1123 je sodná sůl původní sloučeniny, která má molekulovou hmotnost 1100 (Mass-Na). Charakter izotopové distribuce představovaný 1123 iontovým uspořádáním odpovídá vzorci, který obsahuje jeden atom bromu a jeden atom chloru. Protože molekulová hmotnost 1100 odpovídá rozdílu molekulové hmotnosti 44 hmotnostních jednotek od původních tiacumicinů (rozdíl atomové hmotnosti mezi bromem a

-8CZ 294843 B6 chlorem), je tento rozdíl interpretován jako substituce jednoho bromu ve sloučenině 1 zajeden atom chloru. Významný fragmentační pík pozorovaný v pozitivním iontovém hmotnostním spektru při m/z = 437 zobrazuje charakter distribuce odpovídající jednomu atomu bromu a jednomu atomu chloru. Tento je analogický s m/z = 393 pikem s dichloro izotopickým charakterem, který je pozorován v hmotnostním spektru tiacumicinů a který je přiřazen cukernému fragmentu spolu s připojeným aromatickým kruhem (a, b dále).

'H-NMR spektrum sloučeniny 1 spolu s pokusem korelační spektroskopie (COSY) naznačuje základní strukturu v podstatě ekvivalentní struktuře tiacumicinu B (viz tabulka 1). Jediný zaznamenání hodný rozdíl mezi PMR spektrem tiacumicinu B a sloučeniny 1 je v C-8' protonových signálech z dvou. U tiacumicinu B se tyto dva protonové signály jeví jako symetrický komplex 2H multipletů centrovaný na d 2,95. U sloučeniny 1 se odpovídající protonové signály jeví jako 1H pentety v d = 3,04 a d 2,97. Tato data naznačují, že sloučenina 1 obsahuje brom v C-6' na aromatickém kruhu (6'-dechloro-6'-bromtiacumicin B).

[a]_D ²⁵ = +3° (c = 0,33, MeOH), bílá amorfní solidní substance, T_t 145 až 151 °C, Rf = 0,34. M_w 1123 (sodná sůl). UV (MeOH): l_max 224 nm (e 9900), 232 (raménko) (9700), 266 (raménko) (5900), 314 (2400) v kyselém methanolu l_max 206 nm (raménko) (e 9400), 222 (11 000), 230 (raménko) (10 800), 266 (6500), v bazickém methanolu při l_max 206 nm (e 13 500), 226 (raménko) 10 300), 232 (10 800), 312 (10 100). IR u_max (CDC1₃): 3690, 3605, 3665, 3497, 2976, 2935, 2876, 1733, 1684, 1601, 1575, 1468, 1456, 1411, 1385, 1371, 1322, 1312, 1244, 1196, 1159, 1143, 1113, 1087 a 1023 cm“¹.

-9CZ 294843 B6

Příklad 4

Charakterizace sloučeniny 2

Sloučenina podle vzorce (1), kde R¹ je vodík a R² je C]-až-C₄ alkanoyl, R³ a R⁴ dohromady jsou =0, R⁵ je chlor a R⁶ je brom

Pozitivní iontové hmotnostní spektrum s ostřelováním rychlými atomy (FAB) sloučeniny 2 mělo nejvyšší molekulovou hmotnost iontu při m/z= 1021. Tento nej vyšší pík mohl být posunut na m/z = 1037 přidáním draslíku do vzorku a proto byla molekulová hmotnost sloučeniny 2 určena jako 1098 nebo o dvě hmotnostní jednotky nižší než pro sloučeninu 1. Charakter izotopové distribuce sodných aduktů sloučeniny 2 naznačuje, že tato struktura obsahuje jeden atom bromu a jeden atom chloru.

Srovnání PMR a COSY spektra sloučenin 1 a 2 ukázalo, že tyto sloučeniny se liší v C-15 a C-19 regionu. Serie párových protonových signálů, které definují atomy C-15 až C-19 ve sloučenině 1 jsou ukončeny vC-17 ve sloučenině 2, kde d 5,13 protonový signál vykazuje párování pouze s methylenovými protony na C-16. Dále, doubletový methylový protonový signál pro C-19 ve sloučenině 1 při d 1,16 je nahrazen singletovým methylovým protonovým signálem při d 2,21. Tato data jsou interpretována jako oxidace na C-18 ve sloučenině 2 vůči sloučenině 1. Tato struktura může být proto popsána jako 6'-dechlor-6'-brom-18-ketotiacumicin B.

[a]_D ²⁵ = +13° (c = 0,21, MeOH), bílá amorfní solidní substance, T_t 139 až 144 °C, R_f = 0,35. M_w 1121 (sodná sůl). UV (MeOH): l_max 222 nm (e 10 300), 266 (6800), v kyselém methanolu l_max222nm (e 8800), 230 (raménko) (8500), 240 (raménko) (8200), 316 (raménko) (5500) v bazickém methanolu při l_max 206 nm (e 13 500), 238 (10 800), 270 (raménko) (6700), 316(4600). IR u_max (CDC1₃): 3690, 3608,3665,2974, 2931,2874, 1705, 1601, 1457,1383, 1376, 1312, 1251,1196, 1162, 1147, 1136, 1111,1068 a 1022 cm“¹.

Příklad 5

Charakterizace sloučeniny 3

Sloučenina podle vzorce (I), kde R¹ je vodík a R² je Ci-až-C₄ alkanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy, R⁵ je brom a R⁶ je vodík, R⁴ je hydroxy, R⁵ je brom a R⁶ je vodík

Molekulová hmotnost sloučeniny 3 byla určena jako 1064. Charakter izotopové distribuce sodných aduktů hmotnostního spektra naznačuje, že sloučenina 3 obsahuje jeden atom bromu a žádný atom chloru. Významný fragmentační pík pozorovaný v pozitivním iontovém hmotnostním spektru při m/z = 403 zobrazuje charakter izotopové distribuce odpovídající jednomu bromu. Tento je analogický s m/z = 393 pikem s dichlor izotopickým charakterem, který je pozorován pro cukerný fragment (c, dále) v hmotnostním spektru tiacumicinů. Srovnání protonového a COSY spektra sloučenin 1 a 3 ukazuje, že tyto dvě sloučeniny se liší pouze v části aromatických struktur svých struktur. Konkrétně, sloučenina 3 obsahuje singletový methinový protonový signál při d 6,35, který ukazuje jednovazebné párování v HMQC pokusu na uhlíkový signál při d 11,5. Stejný protonový signál (d 6,35) ukazuje trojvazné párování v HMBC pokus na 8' methylen uhlíkový signál při d 27,7, stejně jako dva aromatické uhlíkové signály při d 98,0 (Q) a d 107,6 (Q). Tato data ukazují, že tento proton musí být na uhlíku 6' ve sloučenině 3 a určují strukturu jako 4',6'-didechlor-4'-bromtiacumicin B.

-10CZ 294843 B6

[a]_D ²⁵ = +3° (c = 0,16, MeOH), bílá amorfní solidní substance, T, 138 až 140 °C, R_f = 0,42. M_w 1087 (sodná sůl). UV (MeOH): l_max 226 nm (e 6000), 266 (3800), v kyselém methanolu při l_max 226 nm (e 6700), 266 (4200) v bazickém methanolu při l_max 206 nm (e 7700), 236 (6300), 278 (raménko) (3800), 304 (3600), 312 (raménko) (3500). IR u_max (CDC1₃): 3690, 3606, 3501, 2987, 2935, 2875, 1731, 1692, 1653, 1603, 1570, 1469, 1456, 1423, 1386, 1323, 1312, 1295, 1256, 1233, 1187, 1162, 1116, 1069, 1022 a 789 cm¹.

Příklad 6

Charakterizace sloučeniny 4

Sloučenina podle vzorce (I), kde R¹ je Ci-až-C₄ alkanoyl, R² je vodík, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy, R⁵ je brom a R⁶ je vodík

Molekulová hmotnost a charakter izotopové distribuce původního píku sloučeniny 4 byly shodné s pikem sloučeniny 3 s molekulovou hmotností 1064 a jedním bromem jako jediným halogenem. Stejný m/z = 403 (5c) fragmentační pík s izotopovým charakterem ukazujícím na jeden atom bromu je pozorován v hmotnostním spektru sloučenin 4. Srovnání protonového a COSY spektra sloučeniny 4 s tiacumicinem C ukázalo, že tyto dvě sloučeniny se liší pouze v části aromatického kruhu svých struktur. Srovnání protonového a COSY spektra sloučeniny 3 se sloučeninou 3 ukázalo, že tyto dvě se liší pouze v cukerných skupinách připojených na C-l 1 v těchto dvou sloučeninách. Sloučenina 4 obsahovala singletový methinový protonový signál při d 6,39, který ukazuje jednovazebné párování na uhlíkový signál při d 111,8. Stejný protonový signál (d 6,39) ukazuje trojvazné párování na 8' methylen uhlíkový signál při d 31,0. Tato data určují strukturu 4',6'-didechlor-4'-bromtiacumicin C pro sloučeninu 4.

[a]_D ^{25 =} -5° (c = 0,42, MeOH), bílá amorfní solidní substance, T_t 143 až 150 °C, Rf = 0,30. M_w 1087 (sodná sůl). UV (MeOH): l_max 226 nm (e 11 500), 266 (7600), 306 (raménko) (2300), v kyselém methanolu při l_max 226 (e 11 800), 266 (7800), 306 (raménko) (2000) v bazickém methanolu při l_max 204 nm (e 11 500), 226 (raménko) (10 400), 238 (11 800), 270 (6500), 306(7200). IR u_max (CDC1₃): 3619, 2976, 2935, 2895, 1733, 1700, 1652, 1646, 1603, 1447, 1388, 1371, 1323, 1311, 125, 1188, 160, 1145, 1114, 1068 a 1047 cm’¹.

-11 CZ 294843 B6

Tabulka 1 ’Η NMR hodnoty pro sloučeniny z příkladů 3 až 6

Chemické posuny jsou uvedeny jako díly na milion dílů od TMS. Kapling konstanty (J hodnoty) jsou uvedeny v Hz.

H na C č.	Sloučenina př. 3	Sloučenina př. 4	Sloučenina př. 5	Sloučenina př. 6
3	7,21 (d, J= 11,2)	7,42 (d, J= 11,6)	7,21 (d, J = 11,2)	7,18 (d, J = 11,7)
4	6,59 (dd, J= 14,8; 11,2)	6,64 (dd, J = 15,2; 11,6)	6,59 (dd, J = 14,3; 11,2)	6,58 (dd, J = 14,8; 11,2)
5	5,94 (ddd, J= 14,7; 9,8; 5,4)	6,08 (ddd, J= 15,2; 7,6; 6,7)	5,94 (ddd, J = 14,3; 9,4; 4,9)	5,92 (ddd, J = 14,8; 9,8; 5,3)
6	2,70 (mult)	2,70 (mult)	2,66 (mult)	2,65 (mult)
	2,49 (mult)	2,53 (mult)	2,48 (mult)	2,48 (mult)
7	4,21 (brmult),	4,26 (br mult)	4,21 (brmult)	4,20 (br mult)
9	5,13 (brd, J = 10,3)	5,21 (brd, J= 10,7)	5,13 (brd, J= 10,7)	5,10 (dt, J = 11,2; 1,8)
10	2,70 (mult)	2,70 (mult)	2,68 (mult)	2,55 (ddd, J= 13,0; 8,4; 3,1)
11	3,69 (d, J = 10,3)	3,73 (d,J= 10,2)	3,70 (d, J = 10,3)	3,65 (d, J = 9,8)
13	5,82 (br s)	5,89 (br s)	5,82 (br s)	5,84 (br s)
15	5,57 (t, J = 8,0)	5,34 (dd, J = 9,4; 7,2)	5,57 (br t, J = 8,0)	5,57 (brt, J = 8,0)
16	2,70 (mult)	2,80 (mult)	2,70 (mult)	2,74 (mult)
	2,42 (mult)	2,70 (mult)	2,41 (mult)	2,42 (mult)
17	4,71 (mult)	5,13 (dd, J = 9,8; 3,6)	4,68 (mult)	4,72 (ddd, 1 ⁼ 6,4; 4,8; 4,5)
18	4,01 (pentet, J = 6,3)		4,01 (pentet, J = 6,7)	4,03 (pentet, J = 7,0)
19	1,16 (d, J = 6,7)	2,21 (s)	1,17 (d, J = 6,7)	1,20 (d, J = 7,0)
20	4,60 (d, J= 11,6)	4,58 (d, J= 11,6)	4,61 (d, J= 11,6)	4,61 (d, J= 11,6)
	4,42 (d, J= 11,6)	4,50 (d, J= 11,6)	4,42 (d, J = 11,6)	4,41 (d, J= 11,6)
21	1,64 (brs)	1,62 (br s)	1,64 (br s)	1,63 (brs)
22	2,00 (mult)	2,02 (mult)	1,99 (mult)	1,82 (mult)
	1,25 (mult)	1,29 (mult)	1,27 (mult)	1,14 (mult)
23	0,87 (t, J = 7,2)	0,86 (t, J = 7,6)	0,87 (t, J = 7,6)	0,80 (t, J = 7,6)
24	1,80 (br s)	1,87 (br s)	1,80 (br s)	1,76 (brs)
25	1,75 (br s)	1,68 (br s)	1,75 (br s)	1,76 (brs)
1'	4,62 (s)	4,62 (br s)	3,56 (br s)	4,65 (br s)
2'	3,54 (mult)	3,58 (mult)	3,56 (mult)	3,56 (mult)
2'-OCH3	3,54 (s)	3,58 (s)	3,56 (s)	3,55 (s)
3'	3,72 (dd, J = 9,8; 3,4)	3,80 (dd, J = 9,8; 3,6)	3,76 (dd, J = 9,8; 3,6)	3,76 (dd, J = 9,8; 3,2)
4'	5,11 (t, J = 9,8)	5,13 (d, J = 9,8)	5,13 (t, J = 9,8)	5,14 (dt, J = 9,8; 3,1)
5'	3,52 (dq, J = 9,8; 6,3)	3,56 (mult)	3,58 (mult)	3,56 (mult)
6'	1,30 (d, J = 6,3)	1,29 (d, J = 6,2)	1,27 (d, J = 6,3)	1,22 (d, J = 6,3)
1	4,71 (br s)	4,72 (br s)	4,70 (br s)	4,77 (d, J= 1,4)
2	3,91 (br d, J = 2,7)	3,92 (brd, J = 3,2)	3,91 (brd, J = 3,1)	5,34 (dd, J = 3,6; 1,3)

- 12CZ 294843 B6

Tabulka 1 - pokračování

H na C č.	Sloučenina př. 3	Sloučenina př. 4	Sloučenina př. 5	Sloučenina př. 6
3	3,69 (dd, J= 10,3; 2,7)	3,73 (mult)	3,70 (d, J= 10,3)	3,74 (dd, J = 10,3; 4,2)
4	5,01 (d,J= 10,3)	5,02 (d, J= 10,3)	5,00 (d, J= 10,3)	3,45 (d, J= 10,3)
6	1,15 (s)	1,16 (s)	1,17 (s)	1,26 (s)
7	1,12 (s)	1,10 (s)	1,13 (s)	1,08 (s)
6			6,35 (s)	6,39 (s)
8'	3,04 (pentet, J = 7,2)	3,15 (br mult)	2,83 (mult, 2H)	2,83 (mult, 2H)
	2,97 (pentet, J = 7,2)	3,03 (pentet, J = 7,2)
9'	1,20 (t, J = 7,2)	1,14 (t, J = 7,2)	1,19 (mult)	1,20 (t, J = 7,2)
2	2,58 (hept, J = 6,7)	2,61 (hept, J = 6,7)	2,58 (hept, J = 7,2)	2,68 (hept, J = 7,2)
3^ff,f	1,18 (d, J = 6,7)	1,18 (d, J = 6,7)	1,18 (d, J = 7,2)	1,20 (d, J = 7,2)
4^ff,f	1,17 (d,J = 6,7)	1,17 (d, J = 6,7)	1,16 (d, J = 7,2)	1,19 (d, J = 7,2)

Příklad 7

In vitro test antibiotické aktivity proti aerobním a fakultativním bakteriím

Pro primární vyšetřování sloučenin podle předkládaného vynálezu proti vybraným aerobním mikroorganizmům byly určeny minimální inhibiční koncentrace (MIC) následující metodou ředění agaru: Serie dvojnásobných ředění testovaných sloučenin byla přidána do „brain hearth“ infuzního agaru. Agarové plotny byly inkubovány přibližně 10⁴ organizmů na skvrnu z každého testovaného organizmu. Tyto inokulované agarové plotny byly potom inkubovány při 37 °C po dobu přibližně 20 hodin. MIC byly určeny jako minimální koncentrace testované sloučeniny (v mg/ml), které inhibovaly viditelný růst.

Pro primární vyšetřování sloučenin podle předkládaného vynálezu proti anaerobním bakteriím jako je Clostridium byly minimální inhibiční koncentrace (MIC) určeny následující metodou ředění agaru: Serie dvounásobných ředění testovaných sloučenin byla přidána do Wilkins-Chalgren agaru. Agarové plotny byly inkubovány přibližně 10⁵ organizmů na skvrnu z každého testovaného organizmu. Tyto inokulované agarové plotny byly potom inkubovány při 37 °C po dobu přibližně 48 hodin. MIC byly určeny jako minimální koncentrace testované sloučeniny (v mg/ml), které inhibovaly viditelný růst.

Data ukázaná v tabulce 2 ukazují, že brómované tiacumiciny si zachovávají vynikající aktivitu proti kmenům Clostridium, ale jsou méně aktivní proti Staphylococcus a Enterococcus než tiacumicin B. Sloučenina příkladu 3, 6'-dechlor-6'-bromtiacumicin B, je nejúčinnější sloučeninou podle předkládaného vynálezu a její účinnost je srovnatelná s tiacumicinem B.

- 13 CZ 294843 B6

Tabulka 2

MIC data (gg/ml) pro vybrané organizmy

Organizmus	tiacumicin B MIC (mg/ml)	Slouč. př. 3 MIC (mg/ml)	Slouč. př. 4 MIC (mg/ml)	Slouč. př. 5 MIC (mg/ml)	Slouč. 6 MIC (mg/ml)
Staphylococcus aureus ATCC 6538P	0,78	6,2	50	6,2	50
Staphylococcus epidermidis 3519	1,56	6,2	100	12,5	50
Enterococcus faecium ATCC 8043	1,56	6,2	50	12,5	25
Streptococcus pyogenes EES61	6,2	6,2	50	25	50
Escherichia coli JUHL	>200	>200	>200	>200	>200
Bacteroides fragilis ATCC 25285	>128	>128	>128	>128	>128
Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741	>128	>128	>128	>128	>128
Clostridium perfringens ATCC 13124	0,06	0,03	0,015	<=0,06	0,06
Clostridium diffícile ATCC 9689	0,06	0,06	0,25	0,12	0,5
Clostridium diffícile ATCC 17857	0,12	0,06	0,25	0,25	1
Clostridium	0,12	0,06	1	0,5	2

diffícile ATCC 2532

Mělo by být jasné, že výše uvedený podrobný popis a připojené příklady jsou pouze ilustrativní a nejsou omezením rozsahu vynálezu, který je definován pouze připojenými patentovými nároky a jejich ekvivalenty. Různé změny a modifikace popsaných provedení budou odborníkům v obo10 ru zřejmé a mohou být vytvořeny bez odchýlení se od rozsahu a duchu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Bromtiacumicinová sloučenina mající vzorec I nebo její farmaceuticky přijatelné proléčivo, kde

R? a R² jsou nezávisle vybrány ze skupiny skládající se z vodíku a Ci-až-C₄ alkanoylu;

R³ a R⁴ jsou vybrány ze skupiny sestávající z (a) R³ je vodík a R⁴ je hydroxy skupina, (b) R³ je hydroxy skupina a R⁴ je vodík; a (c) R³ a R⁴ dohromady jsou =0; nebo nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z vodíku a hydroxy skupiny; a

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, bromu a chloru, s podmínkou, že alespoň jeden z R⁵ a R⁶ musí být brom.
2. Bromtiacumicinová sloučenina podle nároku 1, obecného vzorce I, kde jeden z R¹ a R² je Ci~až-C₄ alkanoyl a druhý je vodík.
3. Bromtiacumicinová sloučenina podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R⁵ je brom a R⁶ je vodík.

-15 CZ 294843 B6
4. Bromtiacumicinová sloučenina podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R⁵ je chlor a R⁶ je brom.
5. Bromtiacumicinová sloučenina podle nároku 1, která je vybrána ze skupiny sloučenin majících obecný vzorec I, kde (a) R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy skupina, R⁵ je chlor a R⁶ je brom;

(b) R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ a R⁴ dohromady jsou =0, R⁵ je chlor a R⁶ je brom;

(c) R¹ je vodík a R² je 2-methylpropanoyl, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy skupina, R⁵ je brom a R⁶ je vodík; a (d) R¹ 2-methylpropanoyl a R² je vodík, R³ je vodík, R⁴ je hydroxy skupina, R⁵ je brom a R⁶ je vodík;

nebo její farmaceuticky přijatelné proléčivo.
6. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
7. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 5 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
8. Bromtiacumicinová sloučenina podle jednoho z nároků 1 a 5 pro použití jako léčivo.
9. Použití bromtiacumicinové sloučeniny podle jednoho z nároků 1 a 5 pro výrobu léčiva pro léčení bakteriální infekce u pacienta potřebujícího takové léčení.
10. Způsob výroby bromtiacumicinové sloučeniny podle nároku 1, vyznačující se t í m, že zahrnuje kultivaci mikroorganizmu náležícího k druhu Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis mající schopnost produkovat bromtiacumicinovou sloučeninu v bromidem obohaceném živném médiu a akumulovat bromotiacumicinovou sloučeninu na uvedeném médiu.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedeným mikroorganizmem je Dactylosporangium aurantiacum NRRL 18085.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený bromotiacumicin se izoluje z uvedeného kultivačního média.
13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený mikroorganizmus se kultivuje při teplotě 25 °C až 35 °C a při pH 6 až 9, s koncentrací bromidové soli od 0,25 do 1,0 % hmotnostních.
14. Způsob podle nároku 13,vyznačující se tím, že uvedená koncentrace bromidové soli je 0,48 % hmotnostních.