KR790001594B1 - 16원환(員環)마크로라이드계 항생물질의 아실화유도체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

16원환(員環)마크로라이드계 항생물질의 아실화유도체의 제조방법

제 1 도, 제 2 도는 4"-n-부티릴타이로신 및 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신의 자외부 흡수스펙틀로를 나타내며,

제 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 도 및 제 10 도는 3-아세틸타이로신, 3-아세틸-4"-n-부티릴타이로신, 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신, 3-푸로피오닐타이로신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신, 4"-n-부티릴타이로신 및 4"-i-바레릴타이로신의 각각 적외선 흡수 스펙틀도를 나타내고,

제 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 도 및 제 18 도는 각각 상기 적외선 흡수 스펙틀도와 같은 순서로서 나타낸 헥자기 공명스펙틀(CDCl₃)도를 나타내며,

제 19, 20, 21 도는 각각 3-아세틸타이로신, 3-푸로피오닐타이로신, 및 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신의 화학이온화질량분석 스펙틀도를 나타내며,

제 22, 23 도는 3-아세틸타이로신 및 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신의 각각 C¹³핵자기 공명스펙틀도를 나타내고,

제 24, 25 도는 3-아세틸 앙고라마이신 및 3-아세틸-4"-i-바레릴 앙고라마이신의 자외선 흡수 스펙틀도를 나타내며,

제 26, 27 도는 3-아세틸 앙고라마이신 및 3-아세틸-4"-i-바레릴 앙고라마이신의 적외선 스펙틀도를 나타내며,

제 28, 29 도는 3-아세틸 앙고라마이신 및 3-아세틸-4"-i-바레릴 앙고라마이신의 핵자기 공명 스펙틀도를 나타내며,

제 30 도는 4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅱ의 자외선 흡수 스펙틀도를 나타내며,

제 31 도는 4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅱ의 자외선 스펙틀도를 나타내며,

제 32 도는 4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅱ의 핵자기 공명스펙틀도를 나타내며,

제 33 도는 본 발명의 16원환 마크로라이드계 항생물질 각 유도체의 박층 크로마토그램을 나타냄.

본 발명은 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3원 및 4"원의 적어도 한쪽을 생화학적으로 아실화하는 것에 의한다. 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 신규유도체를 포함하는 마크로마이드계 항생물질의 아실화유도체 및 그 산부가염의 신규 제조방법으로써, 새로이 발견된 상기 아실화의 능력에 대해서 선택된 스트렙토마이세스속의 미생물을 사용하여 생화학적 반응을 행하게 하고, 반응 혼합물에서, 마크로라이드계 항생물질회수의 상법에 의해 상기 유도체를 회수하는 것으로서 이루어지는 상기 제조방법에 관한 것이다.

16원환 마크로라이계 항생물질의 미생물에 의한 아실화법에 대해서 보고된 선행예로써는, 스피라마이신을 사용하는 것과, YL-704를 사용하는 것과 두 가지가 있다. 스피라마이신을 사용하는 방법은 미국특허 제2,943,024호「스피라마아신 ⅡI의 조제」, 미국특허 제2,943,025호「스피라마이신 Ⅱ의 조제, 프랑스특허 제1,262,571호「스피라마이신 Ⅱ에서 스피라마이신 Ⅱ 및 Ⅲ에의 생화학적전환」, 및 일본특허(공고)소화 36-349「스피라마이 Ⅱ, 스피라마이신 Ⅲ 및 그들의 혼합물의 제조방법」에 제출되고 있다. 이들의 특허는 다른 언어로 번역된 사실상 동일의 발명을 취급한 것이며, 공정을 총괄하면 다음과 같은 것이다.

스피라마이신 Ⅰ(3-수산기를 갖는다)과 아실화제가 첨가된 배지(培地)에서 스트렙토마이세스·앤보파션스 NRRL-2,420가 배양되며, 그 안에서 스피라마이신 Ⅱ(3-아세틸기를 갖는다) 및 스피라마이신 Ⅲ(3-푸로피오닐기를 갖는다)가 산생되었다.

스피라마이신 및 아실화제를 존재시키지 않고 배양된 균체가 반응배지에 현탁되며, 이것에 스피라마이신 Ⅰ 및 아실화제(化劑)가 첨가되었다. 효소반응의 뒤에 스피라마이신 Ⅱ 및 Ⅲ이 산생(産生)되었다.

상기 미생물에 의한 스피라마이신의 발효적 생산에 있어서, 아실화제의 첨가는 스피라마이신 Ⅱ 또는 Ⅲ의 생산비율을 높였다.

본 발명에 의한 방법은 다음과 같은 이유로서, 선행기술과는 원리적으로 명백히 구별될 수 있는 것이다.

그들은 스피라마이신의 직접 생산자인 미생물을 사용하고, 그 방법은 항생물질 발효와 근밀(近密)히 관계하고 있다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 네개의 균주(菌株)는 소망의 항생물질의 종류의 비생산자이기 때문에, 이런것은, 본 발명의 방법이 원리적으로는 효소적 방법이란 것을 나타내고 있다.

그들의 방법으로 사용되는 기질(基質)항생물질은 그 미생물의 직접생성물인 스피라마이신 Ⅰ에 한정되는데 대해, 본 발명의 방법은 16원환 마크로라이드계 항생물질의 거의 모든 것을 사용할 수 있으며, 이런 것은 기질특이성(基質特異性)의 점에서는 그 반응이 비특이성의 것임을 나타내고 있다.

그들의 방법은 스피라마이신 Ⅰ의 3위의 전환만을 행할 수 있음에 대해, 본 발명의 방법은, 만약 소망이라면 일종의 미생물에 의해 3위와 4"원의 동시 전한이 가능하다. 기질, 아실기 공여체 및 반응조건의 적절한 조합에 의해서, 훨씬 광범위한 생성물을 얻을 수가 있는 것이다. 또, 일종의 균사

로서 두개의 관능위치를 동시에 전환하는 간편한 방법을 제공하는 점에 있어서 달라져 있다.

로이코마이신계에 속하는 YL-704에 대해서는 일본특허 (공고)소화 49-13,992「항생물질 YL-794 A₁의 제조방법이 제시된다. 이 방법은, 스트렙토마이세스·유우로시디이커스(Streptomyces eurocidicus) NIHJ-267, 스트렙토마이세스·알비레티규리(Streptomyces albireticuli) IFO-12,737, 스트렙토마이세스·키타사토엔시스(Streptomyces Kitasatoensis) NRRL-2,486 및 스트렙토마이세스·서브스페이시스(Streptomyces sp.) MCRL-0737로서 되는 군(群)에서 선택된 미생물이,「DHP화합물」, 4"-디아실 YL-704 A₁, 또는 DHP화합물과 L-로이신을 포함한 배지에서 배양되며, 배양후 DHP화합물의 4"위에 i-바레릴기를 갖는 YL-704 A₁이 분리된다.

본 발명의 방법은, 스피라마이신법인 경우에 설명한 것처럼, YL-704 A₁에 대해서의 그들의 방법마저도, 사용하는 미생물, 방법의 효소적 특성, 기질비특이성(基質非特異性), 또는 소망 생성물의 다양성의 점에서, 또 3위 및 4" 위의 아실화가 일종의 균계로서 동시에 행하여지며, 실질적인 산업상의 유용성을 갖어오는 점에서 명확하게 다른 것이다.

본 발명에서 특허청구되는 타이로신 및 앙고라마이신의 생화학적아실화 및 타이로신, 앙고라마이신 및 스파라마이신의 신규유도체에 대해서는, 선행의 기술(記述)이 아직 존재치 않는다.

이하 본 명세서중에서 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위라 함은, 각각 마크로라이드계 항생물질의 16원환의 3위 및 마이카로우스의 4"위를 의미하고 있다. 이하 간단히 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위라 기재하고 있는 것은 이런 의미이다.

따라서 본 발명의 목적은, 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위의 적어도 한쪽을 생화학적으로 아실화하는것에 의한다. 마크로라이드계 항생물질의 아실유도체를 제조하는 신규방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 감염방제효과를 갖는 타이로신, 앙고라마이신 또는 스피라마이신의 신규유도체를 포함한 16원환 마크로라이드계 항생물질의 신규화합물 및 그들의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다시 다른 목적은, 이들의 항생물질을 유효성분으로 하는 신규인 의약조정물, 수의약(獸醫藥)조성물, 수의약조성물 및 사료첨가조성물 및 그들의 사용방법을 제공하는 것이다.

본 발명의, 3위 및 4"위에 적어도 한개의 아실기를 갖는 16원환 마크로라이계 항생물질의 제조방법인 것이며, 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위를 아실화하는 능력을 갖는 스트렙토마이세스속의 미생물을 이 속미생물(屬微生物)의 배양에 상용되는 배지에서 배양하고, 그와 같은 아실화반응을, 효소원(酵素源), 예컨데 배양된 상기 미생물의 증식계 또는 비증식계의 균체 또는 그것으로 부터의 효소제품, 3위 및 4"위에 적어도 한개의 수산기를 갖는 16원환 마크로라이드계 항생물질로서된 기질항생물질 및 C₂~C₅아실화합물로서된 아실기공여체, 예컨데 아실보효소(補酵素)(이하 보효소를 COA라 약기한다) 또는 그 대사전구체(代謝前驅體)의 3자의 조합에 있어서 행하게 하고, 반응혼합물에서 아실화생성물을 마크로라이드계 항생물질 회수의 상법에 의해서 회수하는 것으로서 이루어지는 상기 방법을 제공한다.

따라서 본 발명에 의해, 타이로신 및 앙고라마이신의 신규 아실화합물, 즉 3-아세틸타이로신, 3-아세틸-4"-n-부티릴라이로신, 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신, 3-푸로피오닐타이로신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신, 4"-n-부티릴타이로신, 4"-i-바레릴타이로신, 3-아세틸앙고라마이신, 3-아세틸-4"-n-부티릴앙고라마이신, 3-아세틸-4"-i-바레릴앙고라마이신, 3-푸로피오닐 앙고라마이신, 3-푸로피오닐-4"-n-브티릴앙고라마이신, 3-푸로피오닐-4-i-바레릴앙고라마이신 4"-n-부티릴앙고라마이신, 4"=i-바레릴 앙고라마이신, 및 의약으로서의 무독성 산부가염으로써,

(a) 약제 내성균을 함유한 미생물의 생장을 억제하고,

(b) 경구 및 경장(經腸)투여에 의해 높은 혈중농도를 갖어오게 하는

상기 산부가염의 제조방법 및 스피라마이신의 아실화합물, 즉 3-아세틸스피라마이신 Ⅰ(스피라마이신 Ⅱ), 3-푸로피오닐 스피라마이신 Ⅰ(스피라마이신 ⅡI), 3-아세틸-4"-n-부티릴 스피라마이신 Ⅰ, 3-아세틸-4"-i-바레릴 스피라마이신, t, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴 스피라마이신 Ⅰ, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅰ, 4"-n-부티릴 스피라마이신 Ⅰ, 4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅰ(이들의 중 최후의 여섯개의 화합물은 신규이다) 및 의약으로의 그 무독성염의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 그외의 실시태양(態樣)은, 그람 양성미생물에 의한 감염에 대향하는 의약, 수의약조성물 및 사람이나 동물에 투여하는 사료 첨가조성물으로써, 그람양성미생물에 의해서 일어나는 감염중의 방제 또는 동물의 생장의 촉진에 충분한 량으로서 그와 같은 화합물을 함유한, 상기 조성물을 제공한다.

본 발명의 다시 다른 실시태양은, 이러한 화합물을 상기의 감염의 방제나 동물의 생장의 촉진에 충분한 량으로서 상기의 사람이나 동물에 투여하는 것에 의해, 그람 양성미생물에 의한 사람이나 동물의 감염중을 화학료법적으로 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 16원환마크로라이드계 항생물질의 생화학적 아실화법에 관한 것이며, 다시 상세하게로는 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위의 수산기를 특이적으로 아실화하는 능력을 갖는 스트렙토마이세스속의 미생물을, 그것의 배양에 쓰여지는 배지에서 배양하고, 효소원, 예컨데 배양된 상기 미생물의 증식계나 비증식균체 또는 그것으로 부터의 효소조제품과, 3위 및 4"위에 적어도 한개의 수간기를 갖는 아실화되는 기질(基質) 16원환 마크로라이드계 항생물질과, 다시 C₂~C₅아실화합물로서된 아실기공여체, 예컨데 아실 COA는 그것의 대사전구체와의 조합에 있어서 아실화반응을 행하고, 반응혼합물에서, 마크로라이드계 항생물질의 회수의 상법에 의해서 아실화 생성물을 회수하는 것으로서 이루어진다. 3위 및 4"위에 C₂~C₅아실기를 적어도 한개 갖는 16원환 마크로라이드계 항생물질의 아실화유도체의 제조방법에 관한다.

본 발명은 특히, 다음의 일반식 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ

식중, R₁은 수소원자, 아세틸기 또는 푸로피오닐기를 나타내며, R₂는 수소원자, n-부티릴기 또는 i-바레릴기를 나타냄. 단 R₁과 R₂의 양쪽이 함께 수소원자인 경우를 제외한다.

로서 나타내는 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 아실화유도체, 외약으로서 적용 가능한 그 무독성 산부가염 및 사람이나 동물에 투여하는 그 의약, 수의약조성물 및 사효첨가조성물의 제조방법에 관한 것이다.

마크로라이드계 항생물질의 수산기를 아실화하는 방법은, 신규인 항생물질을 제조하는 경우의 주요한 방법의 하나인 것이나. 일반적으로 쓰여지는 화학합성적인 방법에 의해서 목적으로 하는 임의의 위치만을 특이적으로 아실화하는 것은 곤란한 경우가 말으며, 아실화가 모든 수산기에 대해서 균일하게 일어나는 경향이 있기 때문에 목적으로 하는 위치를 아실화한 화합물을 얻기 위해서는, 예컨데 관능기의 선택적 보호 및 그 제거등의 불필요한 공정이 필요한 것이었다. 특히 마크로라이드계 항생물질의 마크로라이드환의 3위 및 마이카로우스의 4"위의 수산기만을 특이적으로 아실화하는 일은 곤란으로 되어져 있다. 이에 대해 생화학적 방법은, 효소반응의 특이성에 의해서 목적으로 하는 위치만의 선택적인 아실화를 갖어오게 하며, 수율도 보통은 높아진다.

발명자등은 미생물을 이용하여, 즉 미생물중의 유기촉매인 효소에 의해서 이 3위 및 4"위의 수산기를 아실화하는 일을 꾀하고, 상기의 기질특이성, 특히 작용부위 특이성을 갖는 효소가 미생물에 존재하는 것을 발견하고, 이 성질을 이용하는 것에 의해, 마크로라이드계 항생물질의 중, 마크로라이드환의 3위 및 마이카로우스의 4"위를 아실화하는 방법을 발명하고, 그것에 의거하여 신규인 항생물질을 발명하기에 이른 것이며, 이와 같은 능력을 갖는 미생물, 즉 미생물중에 이와같은 능력을 갖는 효소의 존재의 발견은 본 발명자에 의해서 처음 이루어진 것이다. 본 발명자는 다시 연구를 진행시켜, 마크로라이드계 항생물질의 생화학적 전환을 공업적 규모로서 확립하고, 특히 이를 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 유도체등의 제조에 적용한 것이 본 발명이다.

본 발명자들은 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위의 수산기의 생화학적아실화에 대해서 연구의 일환으로써 이들의 3위 및 4"위를 아실화하는 미생물을 검색의 결과, 스트렙토마이세스에 속하는 미생물이 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위에 수산기가 있으면 3위와 4"위를, 또는 그 한쪽의 아실화하고, 3위가 이미 아실기를 갖고 있으면 4"위의 수산기만을, 4"위가 아실기를 갖고 있으면 3위 수신기만을 아실화하는 능력을 갖는 것을 발견하고, 이 발견에 의거하여, 다시 이들의 능력을 갖는 방선균의 태양조건 및 반응조건을 검토하고, 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 3군 및 그외의 마크로라이드계 항생물질에서, 3위 및/또는 4"위를 아실화한 유도체를 제조하는 방법 및 그 제조된 어느 종류인가의 신규항생물질의 발견을 완성함에 이르렀다.

아울러, 본 발명에 있어서는 아실기를 도입하는 기질의 3위 및 4"위의 아실기는, 입수할 수 있는 마크로라이드계 항생물질의 관계상 C₂~C₅의 아실기를 갖는 것에 한정했으나, 본 발명의 아실기 전이(轉移)효소의 기능으로 하여 이것보다 큰 탄소수를 갖는 아실기를 3위 및/또는 4"위에 갖는 마크로라이드계 항생물질에 대해서도 C₂~C₅의 아실기의 도입이 가능한 것이라는 것은 물론이다.

본 발명자들은 16원환을 갖는 마이크로라이드계 항생물질의 중, 타이로이신, 앙고라마이신 및 스피라마이신에서 유도되는 신규항생물질 3-아세틸타이로신, 3-아세틸-4"-n-부틸타이로신, 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신, 3-푸로피오닐타이로신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신, 4"-n-부티릴타이로신, 4"-i-바레릴타이로신, 3-아세릴 앙고라마이신, 3-푸로피오닐 앙고라마이신, 3-아세틸-4"-n-부티릴 앙고라마이신, 3-아세틸 4"-i-바레릴 앙고라마이신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴 앙고라마이신, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴앙고라마이신, 4"-n-부티릴앙고라마이신, 4"-i-바레릴 앙고라마이신, 4"-n-부티릴 스피라마이신 Ⅰ, 4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅰ, 4"-n-부티릴스피라마이신 Ⅱ, 4"-i-바레릴스피라마이신 Ⅱ, 4"-n-부티릴 스피라마이신 Ⅱ 및 4"-i-바레릴스피라마이신 Ⅲ에 대해, 다시 상세히 이 화학적성질 및 생물학적 성질을 명확하게 하고 그 결과에 의거하여 전기 신규항생물질의 제조방법을 제공코저 하는 것이다.

이하 본 발명의 방법을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 의한 마크로라이드계 항생물질의 아실화반응은, 3종의 기본요건, 즉 증식계 또는 비증식계의 균체 또는 효소제품의 형으로서의 아실화를 위한 효소활성을 갖는 것, 기질(基質)로써의 16원환 마크로라이드계 항새물질, 예컨데 타이로신, 앙고라마이신 또는 스피라마이신등 및 아실기 공여체의 3종의 요건의 존재와 접촉등이 필요하다.

상기의 아실화능(化能)을 갖는 미생물은, 공지의 이미 분리된 균주, 혹은 야생분리주에서, 아실화능을 시험하는 것에 의해서 선정된다. 이 아실화능을 갖는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 방선균으로서는, 예컨데, 스트렙토마이세스·서어모트레랜스(St. thermotolerans) ATCC 11,416, 스트렙토마이세스, 판기시디이커스·서브스페이시스·에스피노미세티이커스(St. fangicidicus Subsp. espinomyceticus) ATCC 21,574, 스트렙토마이세스·미카로패시엔스(St. mycarofaciens) ATCC 21,454 및 스트렙토마이세스, 하이그로스코피커스(St. hygroscopicus) ATCC 21,582등이 있다.

아울러, 본 발명의 방법에 의거하여 검색(檢索)하면 다시 많은 방선균에 본 효소의 존재를 발견할 수가 있는 것이다.

본 발명에 있어서의 사용균은 상기의 균 뿐만이 아니라, 이들의 변종 및 자연, 인공적인 변이균(變異菌)등의 모든 것을 함유한다.

예컨데, 이들을 원주(原株)로 하여, 다시 목적의 아세틸화활성의 강력한 균을 육성하겠금, 자외선 조사법(照射法), (엑스)선 조사법등의 물리적 수법, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-Nitrosoguanidine), 나이트로젠 마스타아드등에 의해서 처리하는 화학적인 방법등에 의해 인공 돌연변이주(突然變異柱)를 만들고, 원주에 비하여 아실화능이 강력한 변이주를 얻을 수가 있는 것이다.

상기 방선균을 배양하자면, 탄소원으로서는 이들의 균이 자화(資化)할 수 있는 것이면 좋고, 예컨데 그루코오스, 말토오스, 규크로우스, 전분, 물엿등의 탄수화물류, 에타놀, 그리셀린등의 알코올류, 식물성 또는 동물성의 유지류, 초산, 쿠엔산등의 유기산류 또는 이들 유시간의 염류등이 사용될 수 있다. 이들의 탄소원은 단독으로, 혹은 2종류이상 혼합해서 사용한다. 탄소원의 농도로서는 종류에 의해 다르나, 통상 0.5~10g/dl의 범위에서 사용할 수 있으며, 2~6g/dl의 범위가 바람직하다.

질소원으로서는 이들의 균이 자화할 수 있는 것이라면 무엇이든지 좋으며, 예컨데 카제인, 펩톤등의 동물성질소원, 대두(大豆), 옥수수, 면실등에 유래하는 식물성질소원, 효모, 세균등에 유래하는 미생물질소원등의 유기성질소원, 다시는 암모늄염의 무기질 질소원을 사용할 수 있다. 이들의 질소원은 단독으로서, 혹은 2종류이상 혼합해서 사용할 수 있다. 질소원의 농도로서는 종류에 의해서 달라지나 통상 0.1~10g/dl의 범위에서 사용할 수 있으며, 바람직한 범위로서는, 유기질 질소원에서는 종류에 의해 달라지나 1~6g/dl, 무기질 질소원에서는 종류에 따라 달라지나 더욱 엷은 농도로서 사용한다.

이외에, 소량첨가물로써, 인산염, 마그네슘염, 그외의 미량원소, 효모엑키스, 육(肉)엑키스등의 미량영양소 및 소량의 비타민류 또는 비타민 함유물을 필요에 응해서 가한다. 이들의 소량첨가물의 첨가농도로서는 0.01~0.5g/dl의 범위가 바람직하다.

배양온도는 일반적인 방선균의 배양온도인 20~35℃에서 배양할 수 있으나, 스트렙토마이세스, 서어모토레랜스에서는 20~45℃의 범위에서 배양가능하다. 특히 바람직한 배양온도는 일반적인 방선균의 배양온도로써는 25~30℃인 것이나, 스트렙토마이세스·서어모토레랜스에서는 특히 30~40℃가 바람직하다.

배양살균후 및 배양중의 pH는 4.5~9.0의 범위에서 좋으나 6~8의 범위가 바람직하다.

배양는 호기(好氣的)으로 행하여지며, 통기, 교반, 진탕등에 의한 산소의 공급을 필요로 한다.

목적으로 하는 16원환 마크로라이드계 항생물질의 아실화능은 증식초기에서 중식종료후까지 확인되지만, 특히 3위의 수산기의 아실화는 증식초기에서 후기, 4"위의 수산기의 아실화능은 증식후기에서 증식정지후에 걸쳐서 강력한 것이며, 아실화하려고 하는 부위의 목적에 맞추어서 이들의 최적한 시기에 반응개시 혹은 균체의 회수등을 행하는 일이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 상기의 미생물과 함께, 아실화에 필요한 아실기공여체의 존재가 필요하다. 여기서 말하는 아실기 공여체란 직접적 아실기 공여체인 여러가지의 아실 COA, 예컨데 아세틸 COA, 푸로피오닐 COA, n-부티릴 COa, i-바레릴 COA 등, 및 균의 대사작용에 의해 효율좋게 아실 COA의 아실기로 될 수 있는 전구체(前驅體)를 나타내는 것이며, 예컨데 그 아실기를 이루는 초산, 푸로피온산, n-낙산, i-바레리안산등의 유기산류, 이들의 유기산의 Na염, K염, 암모늄염등의 염류, 이들의 유기산의 메타놀, 에타놀등과의 에스텔류, 이들의 유기산의 아미드류, 그 아실기와 탄소골격이 유사하고 있는 아미노산류 예컨데 α-아미노낙산, 놀바린, L-로이신등 혹은 그 아실기와 탄소골격이 유사하고 있는 α-케토산류 예컨데 α-케토낙산, α-케토-바레리안산등, 혹은 그 염류등이다.

일반적으로 아실 COA는, COA와 아실 전구체로써 개개의 아실 COA를 생성하는 능력의 뒤떨어지는 효소계로서 반응이 행하여지는 때에 반응 배지에 첨가된다. 한편 아실 전구체는, 당해 아실 COA를 재생하는 계(系)가 완전히 작용하고 있을 때, 예컨데 균의 증식계등에 사용된다. 반응배지에 첨가하는 아실기공여체의 량은, 보통 아실 COA인 경우에는 기질항생물질의 몰비와 등량(等量) 또는 그것에 가까운 량인 것이며, 전구체의 경우에는 높은 몰비, 예컨데 3~10몰비를 사용한다.

아실기가 아세틸기인 경우에는, 아세틸 COA는 일반의 자화할 수 있는 탄소원에서 용이하게 생성하기 때문에 특히 아세틸 전구체를 가할 필요가 없다. 즉 생균체는 그 대사 싸이클에 의해서 탄소원에서 아세틸 COA를 생성할 수 있으므로, 배양후의 배양액이나 균체현탁액이 든 어떤 것의 형의 생균체를 사용하는 반응으로서 충분량의 탄소원이 존재한다면, 아세틸화는 보통 내생적(內生的)으로 생성하는 아세틸 COA를 사용해서 진행한다.

또, 이와같은 반응계에서는 푸로피오닐 COA 그외의 COA가 아세틸 COA보다 훨씬 소량 생성하고, 그와같은 아실화생성물로 반응생성물중에 확인된다. 반응에 아실 COA를 사용할 경우, 반응 정지시에 COA 분리의 방법에 의해서 반응 배지에서 COA를 회수할 수 있으며, 아실 COA의 합성에 재사용할 수가 있는 것이다.

[실험 I]

대두분(大豆粉) 40g, 그루코오스 50g, 효모엑키스 1g, MgSO₄·7H₂O 0.5g K₂HPO₄0.5g을 용해해서 수용액 1,000ml로 한 배지(pH 7.0)를 조제했다. 이 배지 100ml를 500ml입의 진탕배양 프라스코에 넣고, 120℃에서 20분간 살균하였다. 이어서 이것에 스트렙토마이세스·서어모토레랜스 ATCC 11,416을 접종하고 진탕해 가면서 37℃로서 배양하였다. 1일간 배양하고 그루코오스의 약 반량이 소비되었을 때에, 로이코마이신 A₁의 용액을 배지중의 최종농도가 2g/ℓ로 되도록 첨가하고, 반응을 다시 6시간 행하게 하였다. 얻어진 반응혼합물에서 원심분리에 의해 청징액을 얻고, 희(希) NaOH수용액으로서 pH를 8.5로 조제하고, 등용(登容)의 초산에틸로서 추출하였다. 추출액을 원래의 용적의 약 1/3이 되기까지 감압농축하고, 일부를 실카겔(멜크사 상표)의 박층판상에 스폿트하였다. 이어서 이를 n-헥산 : 아세톤 : 메타놀 : 벤젠 : 초산에틸(30:10:8:25:20)의 용제혼합물로서 전개하고, 완전히 건조시켜, 10% 유산(硫酸)에 침지하여 가열하였다. Rf값이 약 0.50과 0.65의 두개의 스폿트가 검출되어, 표준시료와의 사이에서 분석적으로 비교하는 것에 의해, 이들은 각각 로이코마이신 A₁및 로이코마이신 A₃(3-아세틸로이코마이신 A₁)이란 것을 알았다.

[실험 2]

실험 1에서 증식한 균체(실험 1의 항생물질을 첨가하기 직전의)를 원심분리하여 집균(集菌)하고, pH 6.5의 0.0.5M인산염 완충액으로서 1회 세정하고, 2g/ℓ의 농도로서 그루코오스를 첨가한 상기의 완충액에 재현탁하였다. 완충액중의 균의 농도는 약 10g(고형물)/ℓ이었다. 이어서 로이코마이신 V와 L-로이신을 각각 0.5g/ℓ과 1g/ℓ의 농도로서 첨가하고, 균배양과 같은 조건에서 호기적으로 효소반응을 행하였다. 3시간 후에 반응을 정리하고, 실험 1의 조작을 행하였다. 박층 크로마토판상에 두개의 스폿트가 나타났으며, 각각 약 0.3과 0.65의 Rf값을 갖고 있으며, 이들은 기질인 로이코마이신 V 및 생성물인 로이코마이신 A₃(3-아세틸-4"-i-바레릴로이코마이신 V)이라는 것이 고정되었다.

[실험 3]

실험 2와 같이하여 취득한 세정을 끝낸 균체를 상기의 인산염 완충액의 소량에다 현탁하고, 프렌치푸레스를 사용하여 호모게나이즈 하였다. 이것에서, 3,000×G, 10분간의 원심분리에 의해 상징액(上澄液)을 얻었다.

이 상징액의 희석액에, 로이코마이신 U과 i-바레릴 COA를 어느 것이든 0.2g/ℓ의 농도로서 첨가하고, 실험 2와 같이 반응을 행하게 하였다. 로이코마이신 A₃(4"-i-바레릴로이코마이신 U)의 생성이 박층 크로마토그램에 의해서 확인되었다.

[실험 4]

실험 3과 같이 조제한 균체 호모게네이트의 상징액의 희석액 20ml식을, 500ml입의 엘렌마이야 프라스코 27 본의 각각에 넣고, 프라코에 1~27의 번호를 붙였다. 이들의 프라스코에 3종의 항생물질을 20mg식 첨가했다. 즉 1~9의 프라스코에는 타이로신을 10~18의 프라스코에는 앙고라마이신을, 19~27의 프라스코에는 스피라마이신 I을 첨가했다. 또 이것에 아실 COA를 다음과 같이 어느것이든 20mg식 첨가했다. 즉 프라스코 2,11,20에는 아세틸 COA를, 프라스코 3,12,21에는 푸로피오닐 COA를, 프라스코 4,13,22에는 n-부티릴 COA를, 프라스코 5,14,23에는 i-바레릴 COA를, 프라스코 6,15,24에는 아세틸 COA와 n-부티릴 COA를, 프라스코 7,16,25에는 아세틸 COA과 i-바레릴 COA를, 프라스코 8,17,26에는 푸로피오닐 COA와 n-부티릴 COA를, 프라스코 9,18,27에는 푸로피닐 COA와 i-바레릴 COA를 각각 첨가하고, 프라스코 1,10,19에는 아실 COA를 첨가하지 않었다.

효소반응은 느슨하게 진탕해 가면 37℃에서 3시간 행하고, 이어서 반응한 용액을 약알칼리성으로하고 각각 30ml의 초산에틸로서 추출했다. 추출액을 감압하에 약 2ml까지 농축하고, 농축물을 박층판상에 차아지 한후 실험 1과 같이 전개를 하행하였다. 전개후, 건조한 판을 자외선 램프의 밑에서 조사하고, 주생성물의 스폿트의 위치를 판상에 정했다. 주생성물을 아세톤에 녹이고, 아세톤을 증발시켜서 주생성물을 남기고, 그 각 물질을 약산성물에 용해했다. 이 용액을 약 알칼리성으로 한후 벤젠으로 추출하고, 추출액을 건고점(乾固點)까지지 농축하여 각 프라스코에서 7~10mg의 주생성물을 얻었다. 각 반응에 수개의 프라스코를 사용하는 것에 의해 각 생성물의 분말 약 50mg이 얻어졌다. 그 고정은, 자외선 스펙톨, 적외선 스펙톨핵자기 공명스펙톨, 융점, 비선광도, 가스크로마토그래피에 의한 유기산의 검출, 박층크로마토그래피에 의한 Rf값등 각종의 분석에 의해서 행하였다. 박층크로마토그래피의 결과를 그림 33에 나타냄. 1~27의 번호는 각각 제 1 표의 갈호내의 그것의 스폿트이다. 분석결과를 제 1 표에 나타내며, 기질의 항생물질, 아실 COA 및 주생성물의 관계를 나타냄.

실험 1~4에 나타낸 것처럼 아실화반응은, 상기의 아실화능을 갖는 균주의 증식중, 또는 배지중 혹은 배지에서 분리한 레스팅셀상태의 균주에 의해서, 또는 여러가지의 형의 효소제품, 예컨데 건조균체, 균체호모게네이트, 호모게네이트로부터의 상징액 및 여러가지의 형의 효소제품을 사용하여 행할수가 있는 것이다. 또 불용화(不溶化)효소제품, 예컨데 아크릴아미드 중합제충에 고정한 것등도 사용할 수 있는 것이다.

다음에 본 발명에 관한 개개의 신규항생물질을 제조할 경우의 아실화에 있어서의 배양계에 있어서의 배양 및 반응의 조건에 대해, 타이로신을 예로써 상세히 설명한다.

[표 1a]

[표 1b]

4"-n-부티릴 타이로신을 제조할 경우에 있어서는 탄소원 및 질소원을 제한한 조건하에서 예를들면 전기의 균주를 배양하고, 탄소원이 거의 소비되어 버린 시기에, 이 배양액이 갖는 3위의 아실화능을 초과하는 량의 타이로신 및 부티릴기 공여체로써 n-부티릴 COA 또는 그 전구체를 가하여, 배양과 같은 조건하에서 반응시킨다. 이것에 의해 먼저 타이로신의 일부는 3-아세틸타이로신으로 되며, 3위의 아실화능을 초과하는 량의 타이로신은 3위가 아실화되지 않고 남는다. 다시 이들의 일부는 각각 4"위가 n-부틸화되며, 각각 4"-n-부티릴타이로신과 3-아세틸-4"-n-부티릴타이로신이 생성한다.

이 반응액은 뒤에 상세히 기재하는 타이로신 유도체의 분리, 정제, 채취법에 의거하여 처리하는 것이 의해, 4"-n-부티릴타이로신을 얻을 수가 있는 것이다. 또 본법에 있어서는 이외에 반응액중에 부생(副生)하는 다른 타이로신 유도체 마저도 채취할 수가 있는 것이다.

4"-i-바레릴이로신을 제조하자면 전기의 4"-n-부티릴타이토신을 제조할 경우와 같은 방법에 의해, 단 n-부티릴 COA 또는 그 전구체의 대신에 i-바레릴기 공여체로써 i-바레릴 COA 또는 그 전구체를 사용하는 것에 의해, 4"-i-바레릴타이로신을 제조할 수가 있으며, 또 같이 다른 부생한 타이로신 유도체마저도 채취할 수 있는 것이다.

3-아세틸타이로신을 제조하면, 탄소원 및 질소원을 충분히 밸랜스좋게 함유한 배지에 예컨데 스트렐토마이세스·서어모토레랜스(ATCC-11416)등의 전기의 균을 배양하고, 균이 충분히 중식하고, 아울러 또한 탄소원이 충분히 잔존하고 있을시기에 이 배양액중에 생성하는 아세틸 COA에 의한 3위의 아세틸화능을 초과하지 않는 량의 타이로신을 가하고, 배양과 같은 조건하에서 충분히 반응시킨후, 반응액을 타이로신 유도체의 분리, 정제, 채취법에 의거 처리하는 것에 의해 3-아세틸타이로신을 얻을 수가 있는 것이다.

3-아세틸 4"-n-부티릴타이로신을 제조하자면, 비교적 저농도의 탄소원과 이것에 조화하는 농도의 질소원을 함유하는 배지에 예컨데, 전기의 아실화능을 갔는 균주를 배양하고, 균이 충분히 증식하고, 아울러, 또한 탄소원이 소량 잔존하고 있을 시기에, 이 배양액이 4"를 아실화할 수 있는 능력의 범위내의 량의 타이로신 또는 3-아세틸타이로신을 가하여, 다시 부티릴기 공여체로써 n-부티릴 COA 또는 그 전구체를 가하고, 배양과 같은 조건하에서 충분히 반응시키고, 이 반응액을 타이로신 유도체의 분리, 정제, 채취법에 의거하에 처리하는 것에 의해 3-아세틸-4"-n-부티릴 타이로신을 얻을 수가 있는 것이다. 또 기질로써 4"-n-부티릴 타이로신을 사용하고, 3-아세틸타이로신의 제조방법에 준하여 3위를 아세틸화하는 것에 의해 3-아세틸-4"-n-부티릴타이로신을 얻을수도 있는 것이다.

3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신을 제조하자면, 전기의 3-아세틸-4"-n-부티릴타이로신의 제조법에 준하고, 단 n-부티릴 COA 또는 그 전구체의 대신에 i-바레릴기 공여체로써 i-바레릴 COA 또는 그 전구체를 사용하는 것에 의해 3-아세틸-4"-바레릴타이로신을 얻을 수가 있는 것이다. 또 3-아세틸타이로신의 제법에 준하여 4"-i-바레릴타이로신의 3위를 아세틸화하는 것에 의해 3-아세틸-4"-i-바레릴라타이로신을 얻을수도 있는 것이다.

3-푸로피오닐타이로신을 제조하자면, 베지로써는 충분한 질소원과, 제한된 탄소원을 함유한 것을 사용하고, 이것에 예컨데 본 발명에 사용하는 균주를 배양하고, 균이 충분히 증식하고, 탄소원이 완전히 소비된 시기에 이 배양액이 갖는 3위의 푸로피오닐화능의 범위내의 량의 타이로신과 푸로피오닐 공여체로써 푸로피오닐 COA 또는 그 전구체를 가하여, 배양과 같은 조건에서 반응시키며, 이 반응액을 타이로신유도체의 분리, 정체, 채취법에 의거하여 처리하는 것에 의해 3-푸로피오닐타이로신을 얻을 수가 있는 것이다.

3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신을 제조하자면 3-푸로오닐타이로신의 제조의 경우와 같이하여, 타이로신에서 3-푸로피오닐타이로신을 생성시켜, 거의 모든 타이로신이 3-푸로피오닐타이로신으로 되었을 시기에, 다시 n-부티릴 공여체로써 n-부티릴 COA 또는 그 전구체 및 필요하다면 소량의 탄소원을 추가하여 반응을 계속해서 3-푸로푸오닐-4"-n-부티릴타이로신을 생성시킬 수가 있는 것이다. 또 같은조건하에서 3-푸로피닐타이로신을 기질로써 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신을 생성시킬 수가 있는 것이다. 이 반응액을 타이로신 유도체의 분리, 정제, 채취법에 의거하여 처리하는 것에 의해, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신을 얻을 수가 있는 것이다.

3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신을 제조하자면 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신의 제법에 준하며, 단 4"위의 아실화의 반응의 단계에 있어서는 n-부티릴 COA 또는 그 전구체의 대신에 i-바레릴 공여체로써 i-바레릴 COA 또는 그 전구체를 가하는 것에 의해 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신을 얻을 수가 있는 것이다. 또 3-푸로피오닐 타이로신의 제법에 준하며, 4"-i-바레릴타이로신의 3위를 푸로피오닐화하는 것에 의해 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신을 얻을수도 있는 것이다.

발명자들은 다시 본 발명의 제조방법의 기본을 이루는 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위의 아실화의 기구를 연구한 결과, 어떤 경우에 있어서도 그 아실기의 직접의 공여체는 아실 COA이라는 것을 발견하였다. 즉 마크로라이드계 항생물질의 3위 및 4"위의 아실화에는 각각 다른 2종류의 아실기 전이효소가 관여하고 있으며, 이들의 효소는 어느 것이든 발명자등에 의해 처음의 3위를, 아세틸기, 푸로피오닐기, 부티릴기의 중에서, 소망의 아실기에 의해 아실화할 수 있것 것이다. 또 마크라이드 4"-아실트랜스페라아제에 의해, 4"에 OH기를 갖는 마크로라이드계 항생물질의 4"위를 푸로리오닐기, n-부티릴기, i-바레릴기의 중, 소망의 아실기에 의해 아실기에 의해 아실화할 수가 있는 것이다. 또 양효소를 따로 따로로 2단계로 사용하는 것에 의해 3위 및 4"위가 함께 OH기인 마크라이드계 항생물질의 3위 및 4"위로 따로 따로 상기의 아실기중 소망의 아실기에 의해 아실화할 수가 있는 것이다. 그 반응액의 조성으로서는, 물 또는 물을 주로하는 용액중에 아실화하려고 하는 부위에 의해 마크로라이드 3-아실트랜스페라아제, 또는 마크로라이드 4"-아실트랜스페라아제, 혹은 이들을 함유한 배양액, 균체, 여러가지의 단계의 정제품의 어느것이든, 기질인 타이토신 또는 그 유도체의 1종 및 아실화하려고 하는 소망의 아실기를 갖는 아실 COA의 3자가 공존하는 것이 필요하다. 이 아실화반응의 화학적, 물리적조건은, 개개의 균체에 특유의 효소반응에 관련하는 각 미생물의 균체배양에 호적한 조건과 거의 같은 것이다. 반응의 온도는 25~43℃의 범위에서 좋으나 특히 28~40℃의 범위가 바람직하다. 반응액중의 pH는, 3위의 아실화인 경우에는 5.0~8.5의 범위에서도 반응하나 특히 5.5~8.0의 범위가 바람직하다. 4"위의 아실화는, 3위의 아실화에 비하여 약간 높으며, pH 6.5~8.5의 범위가 바람직하다.

반응계에는 완충액의 존재를 필수조건으로 하지 않으나, 반응을 순조롭게 진행시키기 위해서는 완충액을 사용하는 것이 바람직하며, 이런 경우의 완충액으로서는 인산염, 쿠엔산염등, 그의 통상적으로 쓰여지는 종류의 것을 사용할 수 있으나, 목적으로 하는 아실화가 아세틸하 이외의 경우에는 초산 또는 그 염을 함유한 완충액을 사용하는 것은 바람직하지 못하다. 반응시간으로서는 30분~10시간정도이다.

아실화하려고 하는 아실기의 종류로서는, 3위에 대해서는 아세틸기, 푸로피오닐기, n-부티릴기등이 있으며, 각각 아세틸 COA, 푸로피오닐 COA, 부티릴 COA등의 소망의 1종류의 형으로서 사용할 수 있으며, 탄소수가 크질수록 그 전이는 곤난해진다. 4"위에 대해서는, 푸로피오닐기, n-부티릴기, i-바레릴기등이 있으며, 각각 푸로피오닐 COA, n-부티릴 COA, i-바레릴 COA, 등이 사용할 수 있으며, 탄소수의 감소와 함께 전이(轉移)는 곤난하게 된다.

이들의 아실 COA는, 상법(常法)에 의해 COA와 그외의 아실공여체가 화학합성적으로, 혹은 아실기 전이효소반응에 의해 공급할 수가 있는 것이다.

마크로라이드계 항생물질의 아실화에 수반하여 생성하는 COA는 적당한 방법에 의해 탄수한 후, 다시 아실 COA의 합성에 사용하고, 순환사용하는 것도 가능하다.

기질인 16원환 마크로라이드계 항생물질로서는, 지금까지 설명한 중에 기술한 바와같이 16원환 마크로라이드환의 5위에 결합한 두개의 당(糖)을 갖는 것, 예컨데 로이코마이신, 마리도마이신, 스피라마이신, 앙고라마이신, 타이로신, 캄보마이신 A 및 칼보마이신 B 등이며, 이들에 있어서는 3위 및 4"위의 적어도 한개의 기가 본래의 수산기이든지, 또는 화학적 방법이나 생화학적 방법으로 생성한 수산기를 갖는 것이다. 이들의 항생물질을 기질로써 반응액에 가하는 형항로써는, 이들의 기질을, 물 또는 약산성수태 용해해서 가하는 방법, 수중에서 현탁상에 내지는 스랄리상으로 해서 가하는 방법, 이들의 기질을 용해하고, 물과 상호용해하고, 다시 반응에 대해서 저해성이 적은 용제, 예컨데 메타놀, 에타놀등에 용해해서 가하는 방법, 미분말로 해서 직접 가하는 방법등 여러가지의 방법에 의해 실시할 수 있는 것이다. 반응혼합물에 사용하는 기질 항생물질의 농도는 0.15~0g/ℓ, 특히 0.5~30g/ℓ이 바람직하다. 또 본 발명에서는, 일단 균주가 충분히 증식할 수 있는 배지내에 배양한 균체 또는 전기의 방법에 의해서, 반응을 종료한 반응액중의 균체를 적당한 방법에 의해 집균하고 이 생균체를 적당히 물 또는 완충액 또는 배양액으로 재현탁하고, 전기의 배양계에 있어서의 각각의 경우에 준하는 반응조건하에서, 생세포계 또는 증식계하의 아실화반응에 사용할 수가 있는 것이다.

본 발명에 관한 16원환 마크로라이드계 항생물질 유도체를 반응액 또는 배양액에서 분리, 정제, 채취하자면, 모든 16원환 마크로라이드계 항생물질 유도체에 대해 거의 같은 방법에 의해, 일반적인 마크로라이드계 항생물질을 제조할 경우에 쓰여지는 방법으로서 행할수가 있는 것이다.

예컨데, 반응액 또는 배양액은 필요가 있으면, 약산성으로 한 뒤에 여과, 원심분리등의 방법에 의해 균체 기타의 불용물(不溶物)을 제거하고, 액을 중성 내지 약 알칼리성으로 하고, 생성한 마크로라이드계 항생물질 유도체를 용해하고 물과 상호응해하기 힘든 용계, 예컨데 초산에틸벤젠토루엔등에 의해 추출한다. 필요가 있으면, 이 용제를 약산성의 물 또는 완충액과 혼합하는 것에 의해 타이로신 유도체를 수층(水層)으로 옮기고, 이 수층을 중성 내지 약 알칼리성으로 하고 재차 상기 용제로서 추출한다.

이 조작에 의해 마크로라이드계 물질 이외의 불순물 예컨데 배지에 유래하는 착색물질, 기타를 분리, 제거할 수가 있는 것이다.

다른 마크라이드계 항생물질 유도체생성물을 상호간서 분리할 필요가 있을 경우에는, 예컨데 물과 유기용제에 대한 분배계수의 차가 비교적 큰 물질을 분리하자면 분별추출법, 교류분배추출법등에 의해 분리할 수가 있는 것이다. 또 물과 유기응제에 대한 분배계수의 차가 비교적 적은 마크로라이드계 항생물질, 유도체끼리를 분리하자면 실카겔 그외를 사용한 컬럼크로마토그래피등이 사용될 수 있으며, 물질의 량이 적은 경우에는 샘플조제용 박층크로마토그래피등을 사용할 수도 있는 것이다.

생성물 마크로라이드계 항생물질 유도체를 용액에서 취출하자면, 용액을 농축건고해서 얻을 수가 있으나, 보다 순도의 높은 물질로써 얻자면 결정화해서 분리하는 것이 바람직하다. 생성물마크로라이드계 항생물질 유도체를 정석(晶析)시키자면, 마크라이드계 항생물질 유도체를 용해하기 쉬운 용등 예컨데 아세톤, 메타놀등에 용해한 뒤, 마크로라이드계 항생물질 유도체를 용해하기 힘드는 용제 예컨데 물, n-헥산 등을 서서히 가해가서 응해도를 내리는 것에 의해 정석시킬수가 있는 것이다. 또 마크로라이드계 항생물질 유도체를 비교적 용해하기 힘드는 용제 예컨데 에틸 에텔 또는 에틸에텔과 이소푸로필 에텔의 혼합 용매등에서 정석시킬 수가 있는 것이다. 또, 3-아세틸 유도체는 다른 유도체에 비해서 특히 정석하기 쉬우며, 벤젠, 토루엔등으로서도 정석시킬 수가 있는 것이다.

같은 방법으로 제조한 앙고라마이신, 스피라마이신 및 그외의 항생물질의 유도체도, 타이로신 유도체에 사용한 것과 같은 방법으로서 분리해서 정제했다. 이들 유도체의 정석에는, 토루엔, 벤젠, 초산, 에틸등의 용제도 사용할 수 있는 것이다.

유도체의 결정은 여취하고, 충분히 건조하는 것에 의해 백색결정성 분말로서 얻어진다.

다음에 본 발명의 방법에 의해서 얻어진 타이로신 유도체의 중, 신규인 화학물질은, 3-아세틸타이로신, 3-아세틸-4"-n-부티릴타이로신, 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신, 3-푸로피오닐 타이로신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로로신, 4"-n-부티릴타이로신 및 4"-i-바레릴타이로신의 8물질인 것이나, 그들의 이화학적물질, 구조에 대해서 설명하고, 다시 이들이 모두가 신규인 물질이란 것을 설명한다. 이화학적 성질에 관한 분석등은, 원소분석, 융점, 비선광도, 자외선흡수, 적외선흡수, 핵자기공명, C₁₃핵자기공명, 질량분석(전자충격 및 화학이온화), 염기성화에 있어서 유리하는 유기산의 가스 크로마토그래피에 의한 분석, 용제에 대한 용해성, 정색반응(呈色反應), 산성중성염기성의 별(別), 외관 및 결정정형의 관찰등에 대해서 행하고, 분자량은 화학이온화분석에 있어서의 QM⁺로써 구했다. 이들의 결과는 제 2 표 및 제 1 도~제 23 도에 나타냈다.

[표 2a]

[표 2b]

[표 2c]

[표 2d]

자외선 흡수 스펙틀의 형은 어느 물질에 대해서도 거의 차가 없으며, 28~285nm부근에 최대흡수를 나타내며, 이는 타이로신과 같은 것이며, 마크로라이드환의 케톤 및 2중결합 구조로 변화가 없는것을 나타내고 있으며, 4"-n-부티릴타이로신(제 1 도) 및 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신(제 2 도)를 예로써 나타냈다. 가스 크로마토 그래피의 결과는 어느것이든 각각의 물질의 에스텔결합이 가수분해에 의해 생성하는 유기산을 나타내며, 다시 분자량 측정의 결과와 함께 고찰하는 것에 의해, 각각의 물질은 타이로신이 아세틸기, 푸로피오닐기, n-부티릴기, i-바레릴기의 1종 또는 2종에 의해 아실화되어 있는 것이 명확해졌다. 다시 적외선 흡수스펙틀 및 핵자기 공명 스펙틀의 해석(解析)의 결과, 전기의 구조이란 것이 확인되었다.

다시, 1예로써 3위가 아실화된 물질로써 3-아세틸 타이로신(제 19 도), 3-푸로피오닐타이로신(제 20 도)를 3위 및 4"위가 아실화된 물질로서 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신(제 21 도)를 들어, 화학 이온화 질량분석의 결과를 기지(旣知)물질 타이로신의 그것과 대비하는 것에 의해 각각의 주된 프라그멘트의 귀속(歸屬)을 명확하게 한 결과, 타이로신 및 그 유도체인 신규물질에 있어서 함께 C₅-0사이, 0-C"₁사이, 0-C"'₁사이의 개열(開裂), 탈수 및 탈아실이 주로 해서 일어나는 일이 명확해져, 아세틸기 및 푸로피오닐기는 마크로라이드환에 결합하고, i-바레릴기는 마이카로우스에 결합하고 있는 것을 나타냈다. 아울러, 여기에 예시하지 않았던 모든 물질에 대해서 같이 화학질량분석을 행하여 같은 해석결과를 얻었다.

다음에 3위가 아실화된 물질로써 3-아세틸타이로신(제 22 도), 3위 및 4"위가 아실화된 물질로써 3-아세틸-4"-i-바레릴타로이신(제 23 도)를 예롤들어 기지물질(旣知物質)타이로신과 대비하는 것에 의해 C¹³핵자기 공명스펙틀의 시그널의 귀속을 해석의 결과, 아세틸기는 3위에, i-바레릴기는 4"위에 결합하고 있는 것이 명확해졌으며, 예시하지 않았던 물질에 대해서도 같은 결과가 얻어졌으며, 전기 구조를 지지하는 결과가 얻어졌다.

이미 보고되어 있는 타이로신의 아실화 유도체의 제조방법 예컨데 특허공보 소화 36-22,649「타이로신의 제조방법」중의 참고예 4에 기재되어 있는 타이로신의 아세틸 에스텔의 제법, 즉 아세틸화제로써 염화아세틸을 사용하여 타이로신을 아세틸화하는 방법에 의해 얻어지는 물질은, 아세틸함량 약 8,22(중량%), PK'a는 약 5.1(디메틸포름아미드-물=2:1용량의 용액중에서의 전기적정(電氣滴定)으로 기재되어 있으나, 발명자들은, 이 참고예 4와 전혁 같은 조작에 의해 전기 참고예에 기재된 것과 동일하다고 생각되는 물질을 합성하여다. 또 전기 특허공보 참고예 5에 기재되어 있는 타이로신의 아세틸에스텔의 제법, 즉, 아세틸화제로써 무수초산을 사용하여 타이로신을 아세틸화하는 방법에 의해 얻어지는 물질은 아세틸함량 약 8.91(중량 %) PK'a는 약 5.2로 되어 있으나, 발명자들은, 이 참고예와 동일한 방법에 의해 동 참고예에 기재되어 있는 것과 동일하다고 생각되는 아세틸화 타이로신을 합성하고, 본 발명에 있어서의 3-아세틸타이로신과의 동이(同異)를 조사하였다. 멜크사제 박층 크로마토판 Art 5715를 사용하고, 전개용매로써 초산에틸(85), 메타놀(15), 피리딘(2) (C)는 용매의 용량비를 나타냄)을 사용한 박층크로마토그래피에 있어서, 본 발명에 있어서의 3-아세틸타이로신의 Rf값이 0.59인데 대하여 전기 특허공보 소화 36-22649중의 참고예 4에 기재된 물질은 Rf가 0,71이며, 참고예 5에 기재된 물질은 Rf값이 0.70, 0.75, 0.83을 나타낸 3물질을 주로하는 혼합물이며, 모두가 본 발명에 있어서의 3-아세틸타이로신과는 다른 물질이란 것이 명확해졌다. 또 전기 특허공보 소화 36-22649중의 참고예 6에 기재되어 있는 타이로신의 푸로피오닐에스텔의 제법에 의거한 타이로신의 푸로피온산 에스텔은 융점 약 104~111℃로 기재되어 있으며, 이 물질은 본 발명에 있어서의 3-푸로피오닐타이로신(융점 187~192℃)와 그 융점에 있어서 명확하게 달라져 있으며, 본 발명에 있어서의 타이로신 유도체는 모두가 신규인 항생물질인 것이다.

다시, 본 발명에서 제조한 앙고라마이신 및 스피라마이신 Ⅱ의 아실화유도체의 이화학적분석 및 측정의 결과를 각각 제 3 표 및 제 4 표에 나타냄.

[표 3-1a]

[표 3-1b]

주 1. 색상크로마토그래피에 의한 유기산의 검출 : 용액을 0.5N KOH-에타놀용액에 조제하고, 70-75℃로 20분간 처리하여 분석에 적용했음.

2. (12)의 용제에서 얻어진 결정체를 상기(1) 내지 (11)의 시험에 사용했음.

3. 분자량은, CH₄를 반응기체로 사용한 화학적 이온화 질량 스펙틀에서 QM⁺로 얻어진 것임.

[제 3-2 표]

[제 4-1 표]

[제 4-2 표]

3-아세틸 앙고라마이신(제 24 도), 3-아세틸-4"-i-바레릴 앙고라마이신(제 25 도) 및 3-아세틸-4"-i-바레릴 스피라마이신 Ⅱ(제 30 도)에 대해서의 자외선 흡수 스펙틀도; 및 3-아세틸 앙고라마이신(제 26 도), 3-아세틸-4"-i-바레릴 앙고라마이신(제 27 도) 및 4"-i-바레릴스피라마이신 Ⅱ(제 31 도)의 각각 적외선 흡수 스펙틀도; 및 3-아세틸 앙고라마이신(제 28 도), 3-아세틸-4"-i-바레릴 앙고라마이신(제 29 도) 및 4"-i-바레릴스피라마이신 Ⅱ(제 32 도)의 핵자기공명 스펙틀도를 도면 24~32에 나타냄. 이들에 대해서도 상기타이로신 유도체에 대해서와 같은 고정법에 의해, 본 발명에 의한 앙고라마이신 및 스피라마이신의 아실화유도체에 대해, 일반식 Ⅱ 및 Ⅲ과 같은 화학구조가 결정되었다.

다음에 이들 신규항생물질의 항균성을 최소 생육저지농도(mcg/ml)로서 기재한 것을 제 5,6,7 표에 나타냄.

[제 5 표]

[제 5 표]

[제 6 표]

[제 6 표]

[제 7 표]

[제 7 표]

이들의 표에서 명확한 바와같이, 이들 신규 항생물질은 모두가 주로서 그람 양성균에 대해서 비교적 광범위의 항균성을 가지고 있다.

이들 신규항생물질의 동물에 대한 독성은 어떠한 물질에 있어서도, 마우스에 대한 LD₅₀으로써 정맥주사로서 400mg/kg이상이었다. 또, 이들의 물질의 마우스에의 스타피로콕커스·아우레우스의 인공감염에 대한 치료효과는 어떠한 물질에 대해서도 경구투여된 경우 ED₅₀으로서 50mg/kg이하이었다.

이상과 같이 본 발명에 있어서의 신규성 항생물질은 모두가 항생물질로써 유용한 것이다.

본 발명에 있어서의 항생물질이 그외의 기지(旣知)항생물질에 비하여 특히 뛰어나고 있는 점이 하나는 기지물질에 대해 내성을 갖는 내성균에 대해서 현저한 항균성을 나타낸 점에서 발견할 수 있는 것이다. 표-5,6,7에 있어서 사용한 균주명의 중에서 우단에 ※인을 붙인 것은 모두가 환자의 몸에서 임상적으로 분리한 약제내성균이며, 다시 상세하게로는, 스타피로콕커스·아우레우스 MS-9610은 앙고라마이신, 페니실린, 에리스로마이신, 테트라싸이클린, 로이코마이신, 스피라마이신, 죠사마이신, 타이르신등에 내성을 가지며, 스타피로콕커스·아우레우스 MS-8710은 앙고라마이신, 페니신린, 테트라싸이클린, 에리스로마이신, 로이코마이신, 타이로선등에 내성을 가지며, 스트렙토콕커스·피오게네스 MH 771주(株)는 앙고라마이신, 에리스로마이신, 오레안도마이신, 로이코마이신, 타이로신등에 내성을 나타내는 것이다. 본 발명에 있어서의 신규항생물질은, 어느 것이든 내성균의 어떤 종류의 것에 대해서 항균선을 나타내나, 특히 4"위에 아실기는 갖는 신규항생물질인 4"-n-부티릴 타이로신, 4"-i-바레릴타이로신, 3-아세틸-4"-n-부티릴타이로신, 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신, 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴타이로신, 4"-n-부티릴앙고라마이신, 4"-i-바레릴앙고라마이신, 3-아세틸-4"-n-부티릴앙고라마이신, 3-아세틸-4"-i-바레릴앙고라마이신, 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴앙고라마이신 및 3-푸로피오닐-4"-i-바레릴 앙고라마이신은 어느것이든 광범위한 내성균에 대해서 현저한 항균성을 나타내며, 이점에 있어서 기지 항생물질에 비해서 현저한 진보성을 갖는 것이다.

또, 특히 뛰어나고 있는점의 또하나는, 동물에 있어서의 높은 혈중농도이다. 이들의 신규항생물질을 마우스(생쥐)에 100mg/kg의 경구투여하고, 투여물질의 혈중농도를 측정했든바. 타이로신 및 앙고라마이신에 있어서는 최고값 1mcg/ml 이하임에 대해, 본 발명의 신규항생물질에 있어서는 5~20mcg/ml로 타이로신 및 앙고라마이신에 비교하여 높으며, 특히 4" 위에 n-부티릴기 또는 i-바레릴기를 갖는 물질에 있어서는 투여 1시간후에 있어서 15~20mcg/ml로 높은 수준에 달했으며, 본 발명에 있어서의 신규항생물질은 어느것이든 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신에 비하여, 높은 흡수성을 가지며, 현저한 진보성을 갖는 것이다.

아울러, 타이로신은 마이코푸라즈마병의 예방, 치료를 위한 동물약으로써 널리 사용되고 있으며, 본 발명에 있어서의 8종류의 신규 항생물질을 타이로신과 동일의 기본고주를 갖는것이므로, 타이로신과 같이 마이코푸라즈마병의 예방, 치료약으로써 사용할수 있는것은 용이하게 유추(類推)할수 있는 것이다.

본 발명에 관한 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 유도체는 어느것이든 염기성 물질인것이며, 주석산, 초산, 푸로피온산, 쿠엔산, 호박산등의 유기산류, HCl, H₂SO₄, 인산등의 무기산류와 무독성의 부가염을 형성하고, 어느것의 유도체도 같은 방법에 의해 여러가지의 염으로서 채취(採取)할수가 있는 것이다. 예컨데 상기 항생물질의 유도체 및 염을 만들려고 하는 산을 함께 용해하고, 이들의 염을 용해하기 힘드는 용매, 예컨데 에틸에텔, 아세톤등 혹은 이들을 적당히 혼합한 혼합용매에 항생물질의 유도체 및 산을 각각 따로 따로 용해하고, 이 양자를 (필요가 있으면 냉각해 가면서) 혼합하는 것에 의해 염을 형성시키고 (필요가 있으면 농축하고)냉각하는 것에 의해 염을 정석(晶析)시키고, 이를 여취하는 것에 의해 목적으로 하는 염을 백색결정성분말로써 얻을수가 있는 것이다.

이들의 염은 어느것이든 원래의 유도체에 비하여 수용성이 증가하고 있으며, 약제로써의 사용형태로써 뛰어나고 있다. 또, 이들의 여중 예컨데 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신의 염산염은 융점이 129~133℃이며, 3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신의 주석산염은 융점이 119~122℃이었다.

본 발명의 화합물은 그 특유의 항균활성에 의해, 사람이나 가축의 의료에 있어서의 감염예방제로써 유용한 것이며, 예컨데, 기지의 항생물질과 같은 방법으로 감염증의 경장(徑腸) 비경구, 또는 국소적 투여에 의한 치료에 사용할수 있다. 또, 동물의 생장촉진제로써 타이로신이 특히 유효한것에서 생각하여, 본 발명의 타이로신 화합물은 동물 사육에 있어서의 사료첨가제로써도 사용할 수 있는 것이다.

본 발명의 화합물은 상용(常用)의 부형약(賦形藥)이나 담체(擔體), 즉 경장, 비경구 또는 국소적 투여에 알맞게 되어 있으며 또한 항생물질과의 사이에서 유해한 반응을 일으키지 않는 의약으로의 유기 또는 무기의 담체와 혼합해서 사용할수 있다.

이들의 의약으로서 응용할수 있는 적당한 담체에는, 물, 염용액, 알코올, 식물유, 폴리에틸렌, 그리콜, 제라틴, 락토오스, 아미로우스, 스테알릴산마그네슘, 탈크, 규산, 파라핀, 향유, 지방산모노그리세리드 및 디그리세리드 및 히드록시메틸셀루로우즈 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 의약용 조제품은 살균되며, 또 소망이라면 조제(助劑), 예컨데 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 완충제, 착색제, 부향제(賦香劑) 등으로서 활성물질과의 사이에서 유해한 반응을 일으키지 않는 조제(助劑)와 혼합할 수가 있는 것이다.

본 발명의 화합물은 또 상용의 배합법에 의한 사료의 프레믹스등의 사료 첨가물의 형태로서도 사용할수 있다.

투여는 경구, 경장 및 근육내가 바람직하며, 예컨데, 정제(錠劑), 당의정, 캅셀, 시럽, 에리키실등의 형 또는 주사액의 형 또는 사람, 가축, 애완동물, 실험동물, 사조류(飼鳥類)등을 포함한 동물의 식이(食餌) 첨가 혼합물의 형등에 의한다. 사람에게 경구투여할 경우의 이들의 화합물의 유효 1일량은 체중 1kg당 1~20mg이 바람직하다. 이 량은 1회로서 복용하여도 좋으며, 몇회로 나누어서 복용하여도 좋다.

다음에 본 발명에 관한 마크로라이드계 항생물질 유도체의 제조방법을 실시예를 들어 구체적으로 설명하겠다.

[실시예 1] (타이로신-4"-n-부티릴타이로신)

종모(種母) 배지로서는 대두분 2g/dl, 그루코오스 2g/dl, 효모엑키스 0.1g/dl, K₂HPO₄, 0.05g/dl, MgSO₄7H₂0.05g/dl(pH 7.0)의 조성의 것을 500ml 삼각프라스코에 100ml식 넣어 120℃ 20분 증기살균한것을 사용하였다.

이 종모배지에 스란트위에 생육한 스트렙토마이세스 서어모트레란스 ATCC-11416을-백금이(白金耳) 접종하고, 37℃의 토오타리 쉐커로서 1일간 배양하여 종모로 하였다.

본 백지의 조성은 종모배지와 같이하고, 이를 전용 30ℓ의 자아파멘터에 15ℓ사입(仕入)하고, 다시 소포제(消泡劑) (아데카놀(아사히전화 KK 사제)를 0.05g/dl 첨가한후 120℃ 15분 증기살균하고 냉각해서 본 배지로 하였다. 이것에 상기의 종모를 100ml 첨가하여 37°로서 통기교반 해가면서 배양하였다. 약 1일 배양하고, 그루코오스농도가 0.3g/dl 이하로 되었을 때에, 타이로신 60g을 1ℓ의 물에 현탁해서 첨가하고, 동시에 n-부티릴기 공여체로서의 n-부티릴기의 전구체, DL-놀바릴을 15g 첨가하여 이어서, 배양과 동일조건으로서 6시간 반응시켰다.

이 반응액을 자파멘터에서 취출하고, 희 H₂SO₄로서 pH 3.5로 하고 원심분리기로서 균체를 제거하고, 세정액을 포함해서 약 16ℓ의 여액을 얻었다. 이 여액을 희(稀) NaOH 수용액으로서 pH 6.0로 하고 30℃로서 10ℓ의 벤젠으로 4"-n-부티릴 타이로신을 추출했다. 이 벤젠층을 pH 3.5의 쿠엔산 완충액 2ℓ의 수층(水層) (쿠엔산 완충액층)에 반응생성물을 전용(轉容)하고 (5℃)이 수층을 희 NaOH로서 pH 7.0으로 한 뒤, 30℃로서 1ℓ의 초산에틸로서 추출하고, 분액후, 초산에틸을 농축하고 다시 건고하는 것에 의해 황갈색의 4"-n-부티릴타이로신을 함유하는 건고물 약 5g을 얻었다. 이를, Wakogel C-200을 사용하고, 용출액으로서 벤젠(97), 메타놀(3), (이하 ( )내의 숫자는 용량비)를 사용한 컬럼 크로마토그래피(ø2.1×60cm)에 걸어서 4"-n-부티릴타이르신만을 함유한 용출구분을 모아, 농축건고하고, 이 건고물을 에틸에텔과 이소푸로필에텔(4:1)의 혼합용매에 가열 용해한 뒤, 정치(靜置)하여 에틸에텔을 서서히 증발시키는 것에 의해, 4"-n-부티릴타이로신을 정석, 여취, 건조하는것에 의해 약 1.5g의 백색결정을 얻었다.

한편 pH 6.0으로서 벤젠 추출한후의 여액은 pH8.0으로 하고, 30℃로서 15ℓ의 초산에틸로서 추출하고 주로 3-아세틸타이로신과 미반응(未反應)의 타이로신을 취출하였다. 이 초산에틸층을 pH 3.5의 쿠엔산 완충액 15ℓ 수층에 전용하고, (5℃)이 수층을 회 NaLH로서 pH8.0으로 하고, 30℃로서 10ℓ의 벤젠으로서 추출하고, 분액후 벤젠층을 약 150ml까지 감압농축하고, 7℃로서 정치하는것에 의해 3-아세틸타이로신만을 정석시키고, 이 결정을 여취하고, 건조하는것에 의해 약 25g의 백색결정을 얻었다.

융점 : 4"-n-부티릴타이로신 149℃

3-아세틸타이로신 216℃

[실시예 2] (앙고라마이신-4"-n-부티릴 앙고라마이신)

타이로신으로 바꾸어서 앙고라마이신을 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 배양, 반응 및 회수를 행하는 것에 의해, 4"-n-부티릴 앙고라마이신의 백색결정 약 1.2g과 3-아세틸앙고라마이신의 백색 결정 약 21g을 얻었다.

[실시예 3] (스피라마이신 Ⅰ→4"-n-부티릴스피라마이신 Ⅰ)

타이로신으로 바꾸어서 스피라마이신 Ⅰ을 사용해서 실시예 1과 같은 방법으로 배양, 반응 및 회수를 행하는 것에 의해, 4"-n-부티릴스피라마이신 Ⅰ(스피라마이신 Ⅱ)의 백색결정 0.9g과 3-아세틸스피라마이신 Ⅰ(스피라마이신 Ⅱ)의 백색분말 18g을 얻었다.

[실시예 4] (타이로신→4"-i-바레릴 타이로신)

실시예 1과 같은 방법에 의해, 단 n-부티릴 COA의 전구체 DL-놀바린으로 바꾸어서 i-바레릴기의 공여체로서의 i-바레릴 COA의 전구체로써 L-로이신을 사용하는것에 의해 60g의 타이로신에서 4"-i-바레릴타이로신의 백색결정 약 900mg과 3-아세틸타이로신의 백색결정 약 17g을 얻었다.

융점 : 4"-i-바레릴타이로신 155℃

3-아세틸타이로신 218℃

[실시예 5] (앙고라마이신→4"-i-바레릴 앙고라마이신)

타이로신으로 바꾸어서 앙고라마이신을 사용하여 실시예 4와 같은 방법으로서 배양 및 반응을 행하는 것에 의해, 4"-i-바레릴 앙고라마이신의 백색결정 1.1g과 3-아세틸 앙고라마이신의 백색결정 약 19g을 얻었다.

[실시예 6] (스피라마이신→4"-i-바레릴스피라마이신 Ⅰ)

타이로신으로 바꾸어서 스피라마이신 Ⅰ을 사용하여 실시예 4와 같은 방법으로 배양 및 반응을 행하는 것에 의해, 4"-i-바레릴스피라마이신 Ⅰ의 백색결정 0.8g과 3-아세틸스피라마이신 Ⅰ의 백색분말 약 17g을 얻었다.

[실시예 7] (3위의 수산기의 아세틸화와 4" 위의 수산기의 아실화)

한천(寒天)스란트상의 스트렙토마이세스, 서어모트레랜스 ATCC 11416을 실시예 1과 같은 조성의 종모배지에 접종하고, 로오타리 쉐커로서 37℃에서 배양하였다. 구루코오스 5g/dl, 대두분 1g/dl, 효모엑키스 0.1g/dl, K₂HPO₄, 0.1g/dl, MgSO₄7H₂O 0.1g/dl, MnSO₄4~6H₂O 0.02g/dl 및 CaCO₃0.1g/dl로서 이루어진 배지(pH 7.0)의 15ℓ를 자퍼멘터(30ℓ)에 넣어 살균하였다. 이것에 상기 종모배지의 150ml를 가하여, 통기교반 해가면서 37℃에서 배양하였다. 24시간후, 배지중의 구루코오스의 농도가 2g/dl로 되었을때, 2ℓ의 자퍼멘터 9개의 각각에 상기 배양액의 1ℓ를 무균적으로 주입하였다. 3개의 자퍼멘터의 각각에 2g의 타이로신을, 다음의 3개의 각각에는 2g의 앙고라마이신을, 최후의 3개의 각각에는 2g의 스피라마이신 I을 각각 첨가했다. 반응은 통기교반 해가면서 37℃에서 행하게 하였다. 3시간후에 박층 크로마토그래피에 의해 항생물질의 전환율을 조사했다. 12개의 자퍼멘터에 첨가한 항생물질의 약반량이 전환되었을때에, 마크로라이드환의 3위에 아세틸기를 갖는 대응하는 화합물이 생성하였다. 이때, 소망의 아실기의 각 전구체, 즉 DL-놀바릴과 L-로이신의 1g을, 일균의 3개의 자퍼멘터의 각각에 가하여, pH를 8.0으로 조정하였다. 다른 3개의 퍼멘터에는 전구체를 첨가하지 않었다. 반응은 상기와 같은 조건에서 행하게 하였다. 반응이 정지했을 때, 반응혼합물의 각부분을 초산에틸로서 추출하고, 첨가한 기질과 생성한 화합물과의 비율을 박층 크로마토그래피로서 조사했다. 최후의 반응혼합물을 따로 따로 취출하고, 약산성으로서 여과하고, 여액을 약알칼리성으로 하여 30℃에서 5ℓ의 초산에틸로서 추출했다. 초산에틸층을 1.5ℓ의 약 산성물과 혼합했다. 회수된 수층을 pH 7.5의 초산에틸 0.4ℓ로서 추출하고, 초산에틸층을 농축건고하여 1.5~1.7g의 조제 황백색분말을 얻었다. 이 분말에서, 실카겔컬럼크로마토그래피에 의해, 실시예 1의 n-부틸타이로신의 정제방법에 따라서 주생성물을 분리해서 정제했다. 정석을 위해 이 타이로신유도체의 분말을 에틸에텔에 녹여, 앙고라마이신유도체는 초산에틸에, 스피라마이신 유도체는 시크로헥산에 각각 녹여, 그들의 백색결정 0.5~0.8g을 얻었다.

기질(基質) 아실 COA의 전구체 및 생성물의 관계를 제 8 표에 나타냄.

[제 8 표]

[실시예 8] (3위 및 4위의 아실화)

실시예 1과 같은 조성의 종모배지를 같은 미생물을 사용하여 조제했다. 전분 2g/dl, 펩톤 1g/dl, 효모엑키스 0.1g/dl, K₂HPO₄0.2g/dl, MgSO₄7H₂O 0.02g/dl, MnSO₄4~6H₂O 0.02g/dl 및 CaCO₃0.1g/dl로서 이루어진 배지(pH 7.0)의 10ℓ을 전용(全容) 20ℓ의 자퍼멘터에 삽입하여 살균했다. 이것에 상기 종모배지 30ml를 접종하고, 통기교반 해가면서 37℃에서 배양을 행하게 하였다. 30시간후에 미생물의 생장이 정지기에 달하고, 첨가한 구루코오스가 거의 완전히 소비되었을 때(30시간후), 전용 1ℓ의 자퍼멘트 9개의 각각에 500ml의 배양액을 무균적으로 주입했다. 3개의 퍼멘터의 각각에 500mg의 타이로신을, 다음의 3개의 퍼멘터의 각각에는 500mg의 앙고라마이신을, 남어지 3개의 퍼멘터의 각각에는 500mg의 스피라마이신 I을 각각 첨가해서 반응을 행하게 하고, 다시9개의 퍼멘터의 각각에 100mg의 α-아미노낙산을 첨가해서, 배양과 같은 조건에서 반응을 행하게 하였다. 반응중, 전환율을 박층크로마토 그래피로서 일정시간마다로 조사했다. 6시간후에, 첨가한 항생물질기질은 3위에 푸로피오닐기를 갖는 대응하는 화합물으로 거의 완전히 아실화되었다. 이 시점에서 자퍼멘터의 전부에 1g/dl의 농도에서 그루코오스를 첨가하고, 반응혼합물의 pH를 8.0으로 조제했다.

타이로신이 들어간 3개의 자퍼멘터의 각각에 DL-놀바린과 L-로 이신의 200mg식을 첨가해서 반응을 계속시켰다. 세번째의 퍼멘터는 대조시료로써 남겼다. 같은 일을 앙고라마이신과 스피라마이신 I이든 퍼멘터의 군(群)에도 적용하였다. 반응을 상기와 같이 계속시켰다. 48시간(즉 항생물질의 첨가후 12시간)배양한후에 반응을 정지했다. 반응혼합물에서 실시예 7과 같은 방법으로 주생성물을 분리했다. 생성물의 백색결정 각 70~120mg을 얻었다. 기질, 아실 COA의 전구체 및 생성물의 관계를 제 9 표에 나타냄.

[제 9 표]

주(注) 실시예 1~8에서 얻은 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 유도체는 각각 UV스펙톨, IR스펙톨, NMR스펙톨, 매스·스펙톨, 융점, 비선광도, 원소분석, 알칼리가수분해에 의한 유리유기산의 가스크로마토그래피 등에 의해 분석하여 구조를 고정했다. 또, 필요가 있으면 혼융점의 측정이나 박층크로마토그래피에 의해서 화합물을 비교하여 고정을 행하였다.

[실시예 9]

실시예 1과 같은 미생물을 같은 배양법으로서 배양하고, 배양액 10ℓ를 원심분리하여 균체를 모우고, 이를 인산염완충액(pH 7.0) 5ℓ에 현탁했다. 이 현탁액 100ml을 500ml입의 프라스코 46개의 각각에 분주(分注)했다. 이 프라스코에 표 10에 나타낸것 처럼 100mcg/ml의 기질과 0.1g/dl의 아실전구체를 가하고, 진탕 해가면서 37℃에서 12시간 반응을 행하게 하였다. 반응혼합물을 약알칼리성으로 하고, 생성물을 벤젠으로서 추출하여 박층크로마토그래피로서 분석했다. 생성물을, 병행 전개법 및 겹친 전개법에 의해, 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신의 구조의 확정한 유도체와 비교하는 것에 의해서 고정했다. 기질, 아실 전구체 및 생성물의 관계를 제 10 표에 나타냄.

[제 10-1 표]

[제 10-2 표]

[제 10-3 표]

[실시예 10]

균주스트렙로서는 토마이세스·서어모트레란스(ATCC-11416), 스트렙토마이세스·판기시디이커스·서보스페이시스, 에스피노미세디이커스(ATCC-21574), 스트롭토마이세스·하이그로스코피커스(ATCC-21852),스트렙토마이세스·미카로파션스(ATCC-21454)를 각각 사용하고, 제각기의 균에 대해 똑같이 다음처럼 실시하였다.

종모, 본배양의 배지조성은 실험 1과 같이하고, 스트렙토마이세스·서어모트레란스 ATCC-11416은 37℃로써, 다른 균은 28℃로써 어느것이든 로우타리 쉐커로서 배양했다. 약 30시간 배양후 1,200ml(프라스코 12본분)의 배양액을 사용하고, 이를 여과해서 균체를 모우고 이를 1,200ml의 트리스(히드록시메틸) 아미노-메탄-HCl 완충액

으로 현탁하고 이를 프렌치 프레스로서 파쇄하고, 이 파쇄액을 3ml식 L자형 시험관에 분주(分注)하고, 각각의 L자형 시험관에는 기질로서의 항생물질을 40mcg/ml의 농도에 가하고, 다시 아실기 공여체로써 제 11 표에 나타낸 여러가지의 아실 COA를 기질과 거의 등(等) 몰량식 가하고, 서서히 진탕해 가면서 1시간 반응시키고, 그리신-NaOH 완충액을 가해서 반응을 정지한후 벤젠으로서 추출하고, 실험과 같이하여 반응생성물을 조사했다. 결과는 모든 균에 대해 거의 같은것이었다.

제 11 표에 기질 및 아실 COA의 종류와 반응 생성물의 관계를 나타냄.

[제 11-1 표]

[제 11-2 표]

[제 11-3 표]

[실시예 11]

다음의 성분을 함유하며, 경구투여에 알맞는 2종의 정제(A 및 B)를, 정제제조의 상법에 의해 조제하였다.

성 분 중량(mg)

A) 3-아세틸-4"i-바레릴 앙고라마이신 200

나트륨 칼복시메틸셀루로우스 8

락토오스 172

코온스탓치 20

스테알린산 마그네슘 2

B) 3-푸로피오닐-4"-n-부티릴타이로신 100

트라간토 4

락토오스 82.4

코온스탓치 10

스테알린산 마그네슘 1.5

[실시예 12]

다음의 성분을 함유하여 경구투여에 알맞는 분말 충전 캡셀을 상법에 의해 조제하였다.

성 분 중량(mg)

3-아세틸-4"-i-바레릴타이로신 200

비반응성 고체희석제(전분, 락토오스등) 198

스테알린산 마그네슘 2

이리하여 조제한 캡셀을 1일 2~4개의 복용량으로 환자에게 투여한다.

상술한 실시예는, 일반적 또는 특징적으로 기재한 본 발명의 반응체 및 조작조건을 상술한 실시예에서 사용한 것과 치환하는 것에 의해서 반복할 수 있으며, 같은 성과를 얻을 수가 있는 것이다.

Claims (1)

1. 다음의 일반식 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ으로 나타내어지는 타이로신, 앙고라마이신 및 스피라마이신으로 이루어지는 군에서 선택된 기질(基質) 16원환 마크로라이드계 항생물질의 3위 또는 4"위의 수산기의 적어도 하나를, 아실화하는 능력을 갖는 스트렙토마이세스 서어모트레랜스(St. thermotolerans)(ATCC 11416), 스트렙토마이세스·판기시디이커스·삽스페이시스·에스피노미세디이커스(St. fungicidicus subsp espionomyceticus)(ATCC 21574), 스트렙토마이세스·미카로패시엔스(St. mycarofaciens)(ATCC 21454) 및 스트렙토마이세스·하이그로스코피커스(St. hygroscopicus)(ATCC 21582)로써 이루어진 군에서 선택된 스트렙토마이세스속의 미생물에 의해서, 아세틸 Co-A, 푸로피오닐 Co-A, n-부티릴 Co-A 및 이소-바레릴 Co-A 및 이들의 아실 Co-A의 전구(前驅) 물질로서 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 C₂-C₅아실공여체의 존재하에 아실화하는, 16원환 마크로라이드계 항생물질의 유도체 및 그 산부가염의 제조방법.

   

   

   (식중, R₁은 수소원자, 아세틸기 또는 푸로피오닐기를 나타내며, R₂는 수소원자, n-부티릴기 또는 이소-바레릴기를 나타냄. 단 R₁과 R₂의 양쪽이 함께 수소원자인 경우를 제외함.)

Images