PT85590B

PT85590B - Processo microbiologico para a preparacao de um novo antibiotico macrolido e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT85590B
Application number: PT85590A
Authority: PT
Inventors: Christopher Milton Math Franco; Sugata Chatterjee; Hans-Wolfram Fehlhaber; Richard Helmut Rupp; Goukanapalli Chandra She Reddy; Julia Gandhi; Bimal Maresh Ganguli; Herbert Kogler
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-08-27
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1990-05-31
Also published as: HUT46075A; HU199168B; KR880003010A; AT389319B; PT85590A; EP0257615A2; US4988677A; AU7743287A; IL83626A0; ATE70065T1; ES2038634T3; GR3003852T3; DK445987D0; IL83626A; AU601474B2; JPS6368596A; EP0257615B1; ATA260687A; ZA876350B; DK445987A

Description

A presente invenção refere-se ao antibiótico macrólido Swalpamicina, ao processo microbiológico para a sua preparação com o auxílio da estirpe de microrganismos Streptomyces species Y-84, 30967 (DSM 3740) e à sua utilização como medicamento e como aditivo para rações de animais.

I

A variedade de Streptomyces com o número de cultura HIL Y-84, 30967, em seguida designado como Str. sp. Y-84, 30967, foi isolado de uma amostra de terreno recolhida em Pune Maharashtra (índia). Pode obter-se variações e mutações desta estirpe procedendo de acordo com uma maneira de proceder em si conhecida, com utilização de um agente mutagénico como N-metil-N-nitro-UP-nitroso-guanidina ou por luz ultravioleta.

microrganismo Str. sp. Y-84, 30967 pertence à ordem dos Actinomycetales, à família dos Streptomycetac eas e à espécie dos Streptomyces.Sabe-se que algumas estirpes de Streptomyces produzem antibióticos do tipo macrólido e são referidos na literatura (T. Osono, Y. Oka, S. Watanabe, Y. Numazaki, K. Moriyama, H. Ishida, K. Suzuke, Y Okami e H. Umazawa j J. Antibiotics 20, 174 (1967); S. Omura, Y. Hironaki e T. Hata : J. Antibiotics 23, 511 (1970);

I. Haupt, H. Fricke, J. Oerna e I. Rychlik : J. Antibiotics 29, 1314 (1976); S. Omura e H. Tanaka in Macrolide Antibiotics (Makrolidantibiotika), páginas 3 - 35, S. Omura (Editor) Academic Press, Orlando, Florida, EUA (1984)).

Str. sp. Y-84, 30967 é considerado como uma nova estirpe porque se diferencia por meio de algumas propriedades fisiológicas e morfológicas do desenvolvimento das estirpes conhecidas, como é evidente a partir da seguinte descrição.

Uma outra razão para esse facto baseia-se no facto de produz um novo antibiótico macrólido designado como Swalpamicina e um novo macrolidaglição designado como Swalpanólido, como se indica na descrição seguinte.

Os antibióticos macrólidos são utilizados em medicina como agentes antimicrobianos contra um largo espectro de bactérias gram-positivas e microplasmas. Até aqui, foram descritos diversos antibióticos macrólidos, por

- 2 exemplo, Eritromicina, leucomicina, Oleandomicina, Espiramici na e Midecamicina que são utilizados clinicámente, assim como Tilosina, que se utiliza no tratamento de animais.

Rum certo número de artigos de revisão estão descritos macrólidos (Z. Vankek e J. Majer em Antibiotics”, Volume 2, páginas 154 - 188; D. Gottlieb e P. D. Shaw (Editores), Springer, Nova Iorque (1967); B. Vasquez em Antibiotics, Volume 3, páginas 459 - 479; J. W. Oorcoran e P. E. Hahn (Editores), Springer, Nova Iorque; J, Berdy in CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Volume 2, páginas 39 - 156, ORC Press, Boca Raton, Plorida, Ξ. U. A. (1980)).

Ainda se encontra um resumo dos antibióticos macrólidos em índex of Antibiotics from Aotinomycetes, Hamao Umezawa (Editor principal), Volume I, páginas 114 -

- 123, 135, 171, 172, 207, 223, 275, 573, 382 - 384, 604 - 605, 640 - 641 e 669, Univ. Park Press, State College, Pensilvânia, EUA (1967) e Volume II, páginas 254, 255, 287 - 289, 305,

357 - 362, 481, 483, 508, 509, 532 - 537, 549 - 550, 573 -

- 579, 630 - 635, 639 - 641, 809 - 823 e 1013 - 1014, Univ. Park Press, Baltimore, EUA (1978).

No livro editado por S. Omura e publicado por Academic Press, Orlaado, Florida, EUA (1984), com o título Macrolide Antibiotics - Ohemistry, Biology and Practice, encontra-se um resumo dos antibióticos macrólidos, a sua síntese, derivatização química, síntese química e o seu papel na clínica e na prática veterinária.

Os antibióticos macrólidos subdividem-se, de acordo com o tamanho do anel de lactose macrocíclico que forma o aglicão, em três grupos principais (A. K. Mallams in Macrolides, página 156, M. G-rayson (Editor), Wiley,

Nova Iorque, (1982)). 0 primeiro grupo compreende a Metimicina, Neometimicina e YC-17, que abrange os grupos dos macróli- 3 ϊ dos dodecagonais. Um segundo grupo consiste nos macrólidos tetradecagonais cujos exemplos mais importantes incluem Eritromicina, Oleandomicina, lancamicina, Kujimicina, Megalomicina, Picromicina e Narbomicina. 0 terceiro grupo compreende os matrólidos hexadecagonais, que se podem subdividir em;

a) os antibióticos macrólidos que contém, pelo menos, um radical de amino-açúcar básico, compreendendo este grupo um grande número de antibióticos dos quais, como componentes e compostos cientificamente mais importantes, se podem referir os compostos Angolamicina, Leucomicina, Espiramicina, Maridomicina, Carbomicina, Cirramicina, Rosamicina, Macinamicina, M-4365 ^e ^2’ ^ass^^{IJ1 Gomo}Tilosina;

b) antibióticos macrólidos neutros que não contém amino-açúcar.

Como componentes deste subgrupo, referem-se Chalcomicina (P. W. K. Woo e col., J. Amer. Chem. Soo. 84, 880, 1512,1U66 (1962), Keutramicina (D. V. Lefemine e col., Antimicrob. Agents Chemothr., página 41 (1961); Aldegamicina (M? P. Kunstmann e col., Antimicrob. Agents Ch.emoth.er., página 87 (1964) e Micinamicina (K. Kinoshita e col., J. Antibiotics 38, 522 - 526 (1985)).

Como se deduz da descrição seguinte mais pormenorizada da invenção, a Swalpamicina pertence a este subgrupo dos macrólidos neutros, mas diferencia-se da

Chalcomicina, Neutramicina, Aldegamicina e Miccinamicina, como se pode reconhecer a partir docromatograma obtido por cromatografia em fase líquida sob alta pressão (veja-se Fi gura 1), pelas suas propriedades físico-químicas e espectroscópias (veja-se Figuras 2 - 5). É por consequência objecto da presente invenção o antibiótico macrólido Swalpamicina da fórmula I

e o aglicão do macrólido Swalpanólido da fórmula II

É ainda objecto da presente invenção o processo para a preparação do antibiótico macrólido Swalpamicina da fórmula I e do aglicão do matrólido Swalpanolido da fórmula II, assim como de Calcomicina. 0 processo caracteriza-se pelo facto de se cultivar o microrganismo Str. sp. Y-84, 30967 (DSM 3740) em condições aeróbicas, a uma temperatura compreendida entre 18° e 37°C, num meio que compreende fontes aquosas de azoto e de carbono assimiláveis, assim como sais minerais importantes para os organismos vivos, a um valor de pH compreendido entre 6 e 9, até ao meio possuir uma actividade antibiótica essencialmente grande e se recuperar o produto de fermentação do meio.

novo antibiótico de acordo com a presente invenção é utilizável contra um grande numero de microrganismos patogénicos, incluindo bactérias gram-positivas e microplasmas activos e, por consequência, pode ser utilizado em medicina humana e em veterinária. A Swalpamicina é especialmente apropriada como remédio terapêutico para o tratamento de doenças infecciosas provocadas por bactérias gram-positivas e microplasmas, por exemplo, Ataphylococcus aureus, Streptococcus pyoqenes, Diplococcus pneumuniae, Legionella pneumoniae, estirpes de Richettgia, Spirochaeta, Toxoplasma, Ciostridium tetani, Bacteroides frágilis, Mycobacterium kansaii, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma pneumoniae, Chlamvdia trachomatis, etc.

novo antibiótico de acordo com a presente invenção é ainda activo contra estirpes que são resistentes a diferentes antibióticos, inclusive a Eritromicina. É também utilizável como aditivo para rações de animais. A Swalpamicina pode empregar-se sob qualquer forma biologicamente disponível, sozinha ou em combinação com a Calcomicina.

A estirpe Streptomyces sp Y-84, 30967 e obtida a partir de uma amostra de terra por desenvolvimento a um pH compreendido entre 6, 5 e 8, 5, num meio nutritivo que consiste em fontes de carbono e de azoto, sais nutritivos inorgânicos e agentes de soludificação e consolidação. Como fontes de carbono, interessam glucose, amido, dextrina, glicerina, açúcar de cana e melaço. As gontes de azoto que interessam são peptona, extracto de levedura, extracto de carne de vitela, extracto de malte e caseína. 0 agente de consoliLM dação pode, por exemplo, ser agar. Entre os sais inorgânicos nutritivos pode contar-se os sais de sódio, potássio, magnésio cálcio, fósforo e enxofre.

microrganismo de acordo com a presente invenção produz micélios aéreos incolores a partir de micé- 6 lios de substracto ramificados. Formam-se cadeias de esporos em espiral sobre os micélios aéreos. Nao se observam nem remoinhos nem tubos de esporos. As propriedades de desenvolvimento do microrganismo em diferentes meios contendo agar podem descrever-se da seguinte maneira:

1· Extracto de Levedura/Bxtracto de Malte-Aqar

Crescimento	Bastante
Micelio aéreo	Bastante, branco a cinzento rosado, pulverulento
Parte inferior	Castanha-clara
Pigmento solúvel	Negativo.

2.

Farinha de Ayeia-Agar

Desenvolvimento

Micelio aéreo

Parte inferior

Pigmento solúvel

Bastante

Bastante, branco a cinzento a acastanho-claro, pulverulento Amarela-clara

Negativo

3.

Sais Inorgânicos/Amido-Aqar

Desenvolvimento	Bastante
Micelio aéreo	Bastante, cinzento a cinzento acastanhado, pulverulento
Parte inferior	C_astanha clara
Pigmento solúvel	Negativo

4.

G1icerina/Asparaqina-Agar

Desenvolvimento

Micélio aéreo

Parte inferior

Pigmento solúvel

Bom

Fraco, branco, pulverulento

Amarela-clara

Negativo •5.

Peptona/Extracto de Levedura/Ferro-Agar

Desenvolvimento

Micélio aéreo

Parte inferior

Pigmento solúvel

Considerável

Negativo

C_astanho-escuro a preto

Preto-acastanhado

6.

Tirosina-Agar

Desenvolvimento

Micélio aéreo

Parte inferior

Pigmento solúvel

Bom

Bom, branco a cinzento rosado, pulverulento

Preto acastanhada

Castanho-claro

7.

Açúcar de C_ana/Nitrato-Agar

Desenvolvimento

Micélio aéreo

Parte inferior

Pigmento solúvel

Fraco

Escasso, branco, pulverulento

Castanha-clara

Negativo

8.

Glucose/AsParaqina-Agar

Desenvolvimento

Moderado

Micélio aéreo

Fraco, branco a castanho acinzentado, pulverulento

Amarela-clara

Negativo

Parte inferior

Pigmento solúvel

9. Agar Nutritivo

Desenvolvimento

Micélio aéreo

Parte inferior pigmento solúvel

Moderado

Negativo

Castanha-clara

Negativo intervalo de temperatura óptimo para o desenvolvimento do microrganismo de acordo com a presente invenção é de 25 até 35°C. 0 microrganismo liguefaz a gelatina num meio de glucose/peptona/gelatina, hidrolisa o amido num meio de amido/sais inorgânicos-agar e provoca a coagulação de leite magro.

Observa-se a formação de um pigmento melanóide em agar contendo tirosina, agar contendo peptona/ /extracto de levedura/ferro e caldos de triptão/extracto de levedura.

quadro de assimilação deste microrganismo em relação às fontes de carbono da fórmula I é o seguinte (num meio de Pridham-Gottlieb):

Positivo s D-glucose, L-arabinose, D-xilose, I-inosite, D-manite, D-fructose, rafinose, galactose, -maltose, celobiose, glutamato de Na, manose, lactose.

Fracamente positivo : Açúcar de cana

Negativo : Ramnose, celulose, salicina, dulcite.

Relativamente à formação dos antibióticos macrólidos neutros hexadecagonais conhecidos, como Calcomicina, Neutramicina, Aldgamicinas, Micinamicinas e Bandamicinas, os seguintes microorganismos conhecidos são comparáveis com Str. sp. Y-84, 30967 : Streptomyces bikiniensis, Streptomvces alboqriseolus, Streptomvces rimosus, Streptomyces qoshikiensis e Streptomvces lavendulas.

A_g micinamicinas são formadas pelo microrganismo Micromonospora qriseorúbida sp., como se sabe.

As indicações publicadas sobre as propriedades de desenvolvimento e as propriedades fisiológicas destes microrganismos conhecidos mostram existirem diferenças nítidas entre os microrganismos de acordo com a presente invenção e os microrganismos conhecidos acima mencionados. Por exemplo, os microrganismos Streptomyces lavendulas e Streptomyces goshikiensis pertencem à série vermelha e o microrganismo Streptomyces rimosus à série branca, enquanto o microrganismo de acordo com a presente invenção está incluído na série cinzenta. 0 Streptomvces alboqriseolus distingue-se de Streptomyces sp. Y-84, 30967 por causa da formação de pigmento melanóide. 0 microrganismo de acordo com a presente invenção possui nítidas diferenças em relação ao Streptomyces bikiniensis no quadro da assimilação das fontes de carbono. Além disso, o microrganismo de acordo com a presente invenção forma Calcomicina na fermentação a um antibiótico macrólido novo designado como Swalpamicina da fórmula I, que contém um novo aglicão matrólido hexadecagonal. Com base nas observações acima referidas, concluiu-se que o microrganismo de acordo com a presente invenção constitui um novo tipo de Streptomyces.

A estirpe de microrganismos foi depositada em 20 de Maio de 1986 na Colecção Alemã de Microrganismos (D-34OO Gottingen) sob o número de designação DSM 3740.

Para os peritos no assunto é evidente que a presente invenção nao se limita aos microrganismos acima definidos de maneira especial, mas que inclui todos os mutantes derivados do microrganismo mencionado, tanto espontâneas como artificiais que são susceptíveis de formar o novo antibió^ tico Swalpamicina ou o aglicão novo macrólido Swalpanólido.

processo para a preparação dos compostos que constituem a classe dos antibióticos macrólidos caracterizado pelo facto de se cultivarem microrganismos da estirpe Str. sp. Y-84, 30967 (DSM 3740) a um pC compreendido entre 6,0 e 7,0 e a uma temperatura compreendida entre 20 e 40°C, sob condições aeróbias, no seio de um meio nutritivo que contém fontes de carbono e de azoto, sais inorgânicos nutritivos e oligo-elementos e de se obterem os compostos a partir dos caldos de cultura e do micélio, procedendo de acordo com uma maneira de proceder em si conhecida, mas que se descreve seguidamente.

Para o meio nutritivo utilizado na preparação dos novos antibióticos interessam, como fontes de carbono, glucose, amido, dextrina, glicerina, açúcar de cana, melaço e óleo, farinha de soja, extracto de levedura, extracto de carne de vitela, extracto de malte# líquido de incbamento de milho, peptona e caseína; como sais inorgânicos nutritivos, cloreto de sódio# sulfato de magnésio# sulfato de amónio e carbonato de cálcio. Como oligo-elementos# podem utilizar-se ferro# cobre# zinco e cobalto.

A estirpe Str. sp. Y-48, 30967 (DSM 3740) cultiva-se, de preferência# a 25 - 3o°C e# de maneira especialmente preferida, a 27°C e a pH 6#5. Interrompe-se a fermentação depois de quarenta a quarenta e cinco horas, obtendo-se# nessas condições# o máximo de rendimento dos compostos. De preferência# a fermentação realiza-se como fermentação submersa. 0 prosseguimento da fermentação e a formação dos compostos macrólidos antibióticos pode seguir-se por meio da actividade antibacteriana do líquido de cultura e do micélio contra

Staphylococcus aureus 209 P.

A Swalpamicina pode ser recuperada do filtrado a pH 7,0 - 7,5, de preferencia a pH 6,5, sob a forma de mistura com Calcomicina, com utilização de métodos usuais, como, por exemplo, extracção com dissolventes não miscíveis com água, como clorofórmio, cloreto de metileno, n-butanol, acetato de etilo, ou acetato de butilo, sendo preferido o acetato de etilo como dissolvente não miscível com água.

complexo antibiótico pode ser obtido a partir do micelio ou do caldo de cultura global, por extracção do bolo de micelio com um dissolvente orgânico, por exemplo, uma cetona, de preferência, acetona. Neste caso, concentra-se o xetracto em acetona, regula-se a fase aquosa até pH 6,0 - 7,5, de preferência a pH 6,5 e extrai-se com dissolventes orgânicos não miscíveis como água como, por exemplo, clorofórmio, cloreto de metileno, n-butanol, acetato de etilo ou acetato de butilo, em que, como dissolvente, se prefere acetato de etilo. 0 extracto em acetato de etilo do micelio e do filtrado de cultura pode purificar-se ou processar-se separadamente.

Um outro método para a obtenção da Swalpamicina a partir do caldo de cultura baseia-se na adsorção, para esse efeito, empregar-se, sobre a substância líquida, por exemplo, o filtrado da cultura ou o extracto no dissolvente que contém o composto de acordo com a presente invenção, cromatografia em coluna ou cromatografia em fase líquida, etc., com utilização de agentes de adsorção apropria(R) das tais como por exemplo carvão activo, Diaion HP-20, ^^R^XAD 4, óxido de alumínio, gel de sílica ou Sephadex LH-20. 0 composto de acordo com a presente invenção é eluido dos agentes de absorção com utilização de fases móveis apropriadas, como clorofórmio, metanol ou acetona, sozinhos ou em combinação uns com os outros ou com água, e evapora-se o eluido até à secura

A partir do eluido concentrado ou dos extractos que contém as acima mencionadas Swalpamicina e Calcomicina, podem obter-se e purificar os compostos de acordo com a presente invenção, adoptando diferentes métodos operatórios. Por exemplo, para a obtenção e purificação, pode utilizar-se convenientemente processos de absorção e de eluição (r) (r) com carvão activo, ' 'Amberlite, ^k 'XAD-4 e 7 (Rohm und Haas (r)

Co.) ou Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries), fil(r) tração através de gel com Sephadex LH-2O (Pharmacia Fine Chemicals AB) e produtos com igual valência, assim como combinar-se com cromatografia de absorção sobre óxido de alumínio e gel de silica, etc. Interessam ainda a cromatografia em camada fina, a cromatografia em fase líquida sob média pressão, a cromatografia em fase líquida sob alta pressão com agentes de absorção apropriados, tais como gel de sílica e gel de sílica silanizado C18, com sistemas dissolventes apropriados. P_ode ainda empregar-se cromatografia em contracorrente com um determinado sistema dissolvente, para a referida finalidade.

A Swalpamicina é um pó amorfo incolor que é solúvel em metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, acetato de e tilo, acetato de n-butilo, acetona, etil-metil-cetona, metil-isobutilo-cetona, cloreto de metileno, clorofórmio, dimetil-formamida e sulfóxido de dimetilo. A Swalpamicina é muito dificilmente solúvel ou insolúvel em hexano, éter de petróleo (40 - 60°) e em água.

Nos seguintes sistemas de cromatografia em camada fina (DC) abaixo indicados, a Swalpamicina e a Cglcomicina apresentam os seguintes valores de R_fj

Placas de cromatografia em camada fina í placas prontas contendo gel de sílica (Artigo NÚmero 5554 de Ξ. Merck, Darmstadt)

Rf em MeOHsCHClg (7 : 93) em MeOHsCHClg em acetato (1 í 9) de etilo

Swalpamicina 0,5 0,6 0,7

Calcomicina 0,42 0,53 0,46

No ensaio de cromatografia em fase líquida de alta capacidade para fins analíticos, representada na Figura 1, a Swalpamicina e a Calcomicina apresentam os seguintes tempos de retenção:

E_nchimento da coluna

Caudal

Detecção

Dissolvente í Lichrosorb RP18 : 1 ml/minuto : a 216 nm : MeOHíHgO (7:3)

Tempo de Retenção

Swalpamicina : 5, 7 minutos

Calcomicina : 5,0 minutos

A Swalpamicina funde a 126 - 129°C e / — 20 possui um valor do coeficiente de rotação óptica de / a_7 = ® -3,8° (c, 0,21 em CHClg).

Os dados dos valores espectroscópicos para a Swalpamicina são os que se indicam em seguida s

1. 1J máximo do espectro de ultravioleta em metanol :

ver a Figura 2 anexa. Para a determinação dos máximos de absorção de ultravioleta da Swalpamicina, utilizou-se uma solução com uma concentração de 0,2 g/1. 0 espectro de absorção foi medido no intervalo de 200 a 800 nm.

2. 0 espectro de infravermelho (comprimido de KBr foi determinado num espectrómetro de infravermelho Perkin Ejmer P. Ξ. 521 - veja-se a Figura 3 anexa.

Os espectros de ressonância nuclear protónica e de C foram determinados em CDClg com um espectrómetro de ressonância nuclear transformada de Fourier Jeol Fx-90, a 90 MHz ou 22,5 Mríz, com Me^Si como padrão interno.

3. Espectro de ressonância magnética nuclear protónica - veja-se Figura 4 anexa.

4. Espectro de ressonância magnética nuclear de 13

C - veja-se a Figura 5 anexa.

5. Os ensaios de espectrografia de massa realizaram-se com o derivado sililado da Swalpamicina com ionização por choque de electrões e a fórmula bruta para cada pico, incluindo o pico

4.

M , foi determinada por medição de alta resolução.

Nestas condições, determinou-se o peso molecular e a seguinte fórmula bruta :

Swalpamicina - Peso molecular : 724

Formula bruta s

C_om base nos dados acima descritos e à disposição, concluiu-se que as fórmulas I e II acima referidas significam a fórmula de constituição para a Swalpamicina e para o swalpanólido respectivamente.

A Swalpamicina. no ensaio da placa de agar em laboratório, apresenta um espectro antimicrobiano que compreende bactérias, microplasmas e aationomicetas. In vitro, ela possui actividade contra estirpes sensíveis e resistentes de Staphylococcus aureus e Streptococcus faecalis, assim como de estirpes de Baciluus subtilis, Sarcina lutea, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus, Mycoplasma gallinarum e Mycoplasma pulmonis. Determinou-se a concentração de inibição mínima (CIM) de Swalpamicina contra diversos microrganismos. Os resultados são indicados na seguinte Tabela I.

TABELA I

Concentrações Inibitórias Mínimas de

Swalpamicina

NX!	4-------------------------------------------------- Microrganismos de ensaio '	................V Swalpamicina .
1.	S. aureus 2U9P		6, 3
2.	S. aureus 20424 Mac^R		50
3.	R S. aureus 3066 Meth,		3,2
4.	D S. aureus R 85,Em		12,5
5.	p S. aureus RB5/M, Em	>	50
6.	S. aureus 712 Meth^R	•	12,5
7.	S. aureus 789 Meth.^R	>	50
8.	Strçpt. faecalis UD 86	>	50
9.	Strept. faecalis Eder:Mac	>	50
10.	Micrococcus luteus		1 6 /
11.	Sarcina lutea		0»2
12.	Bacillus subtilis		0Ί
13.	R S. aureus MLS 11, Em		25
14.	S. aureus MLS 14,Em^R		25
15.	R S. aureus MLS 16,Em		12,5
16.	Candida albicans	>	50
17.	E. coli 9632	>	50
18.	E. coli ESS 2231	>	50
19.	Ps. aeruginosa M 35	>	50
20.	Pr. vulgaris	>	50
21.	Ent. cloacae	>	50
22.	Prov. stuartii	>	50
23.	Cit. freundii	>	50

- 16aA Swalpamicina é, portanto, activa contra bactérias gram-positivas, incluindo estirpes resistentes à Eritromicina e contra microplasma e pode ser utilizada para o tratamento de infecções provocadas pelas bactérias patogénicas acima mencionadas.

Os seguintes Exemplos esclarecem a presente invenção.

A invenção refere-se também a composições farmacêuticas que servem para o tratamento de infecções microbianas que se caracterizam por conter um teor do composto da fórmula I.

composto de acordo com a presente invenção pode também ser utilizado em combinação com outras substâncias activas, por exemplo, da série das penicilinas, cefalosporinas ou aminoglicósidos.

composto da fórmula I e os seus sais fisiologicamente aceitáveis podem administrar-se por via oral, intramuscular ou intravenosa. As composições farmacêuticas que contém a Swalpamicina como substância activa podem preparar-se misturando o composto da fórmula I com uma ou várias substâncias veiculares ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, cargas, agentes emulsionantes, substâncias auxiliares de deslizamento, agentes de correcção do paladar, agentes corantes ou substâncias tampão e transformando a mistura numa forma de apresentação galénica apropriada como, por exemplo, comprimidos, drageias, cápsulas ou uma suspensão ou solução apropriada para aplicação parentérica.

Gomo agentes veiculares ou diluentes podem mencionar-se, por exemplo, tragacanto, lactose, talco, agar-agar, poliglicóis, etanol e água. Para a administração por via parentérica, interessam, de preferência, suspensões ou soluções em água, E também possível aplicar as substâncias

- 17 activas sozinhas sem agente veicular ou diluente sob uma forma apropriada, por exemplo, sob a forma de cápsulas.

As doses apropriadas do composto da fórmula I ou dos seus sais de adição de ácido fisiologicamente aceitáveis estão compreendidos entre cerca de 0,4 até 20 g/dia, de preferência, entre 0,5 e 4 g/dia, para o caso de um adulto com cerca de sessenta quilogramas de peso corporal.

Podem administrar-se doses únicas ou, em geral, doses múltiplas, em que a dose individual pode conter a substância activa numa quantidade compreendida entre cerca de 50 e 1000 mg, de preferência entre cerca de 100 e 500 mg.

Exemplo 1

Isolamento de Streptomyces sp. Y-84, 30967 do solo

a)

Melo 1

Preparação do Meio de	Isolamento
Glucose	1,0	g
Glicerina	1,0	g
L-Arginina	0,3	g
k₂hpo₄	0,3	g
MgS0₄.7H₂0	0,2	g
NaCl	0,3	g
Extracto de levedura	2,0	g
Pe₂(S0₄)₅	10	mg
CuS0₄.5H₂0	1	mg
ZnS0₄.7H₂0	1	mg
MnSO .7H₂0	1	mg
Agar	15,0	g
Água destilada	1	litro
pH	6,5

Meio 2

Meio 3

Glucose

L-Asparagina k₂hpo₄

MgS0₄.7H₂0

Extracto do terreno Agar

Água destilada pH

Amido

Caseina kno₅

NaCl

K₂HP0₄

MgS0_A.7H₂0

CaCO₅

PeSO₄

Agar

Água destilada pH

2,0

1,0

0,5

200

15,0

800

8,0

10,0

0,3

2,0

0,05

0,02

0,01

15,0 g

g g

g ml g

ml g

g g

litro

7,2-7,5

Esterilizam-se os meios nutritivos a 121°C durante 1/2 hora.

b) Preparação da Suspensão de Solo

Suspendeu-se 1 destilada sob boa agitação. Deixa-se utiliza-se respectivamente o líquido nar um dos meios de isolamento acima gramas de solo em água assentar o solo e sobrenadante para vacimencionado.

c) Vacinação do Meio de Isolamento

- 19 Vacinam-se cápsulas de Petri que contém cada uma 50 ml de um dos meios de isolamento acima mencionados com respectivamente 1 ml da suspensão de terreno.

d) Isolamento de Streptomyces sp. Y-84, 30967

Incuba-se cada cápsula de Petri vacinada durante duas semanas a 30°C, e isola-se Streptomyces sp. Y-84, 30967 dos outros microrganismos que se desenvolveram.

Exemplo 2

Desenvolvimento de Streptomyces sp. Y-84, 30967 para a Preparação de Swalpamicinas por Fermentação

Mantem-se o Streptomyces sp. Y-84,

Y 30967 em agar contendo levedura/malte, com a seguinte composição :
Extracto de Malte	10,0	g
Extracto de levedura	4,0	g
Glucose	4,0	g
Agar	15,0	g
Água destilada	1	litro
pH	7,0

Distribui-se o meio nutritivo por tubos de ensaio e esteriliza-se a 121°C durante trinta minutos. Para a preparação de culturas iniciais em agar, arrefecem-se os tubos de ensaio em posição inclinada. Vacina-se um pedaço de agar respectivamente com a cultura e incuba-se a 28°C durante dez a quinze dias, observando-se durante este tempo um bom de envolvimento e formação de esporos. Utiliza-se uma suspensão de esporos de uma cultura inicial de agar em água destilada , cinco por cada balão de ^rlenmeyer de 500 ml que contem 100 mililitros de meio de cultura de vacinação, ou para vacinar um balão de cinco litros 1 litro do mesmo meio de cultura.

Composição do Meio de Cultura para Vacinar

Glucose	15,0	g
Parinha de soja	15,0	g
Agua de inchamento de milho	5,0	g
CaCO^	2,0	g
NaCl	5,01	g
Agua destilada	1	litro
pH	6,5

Distribui-se o meio acima mencionado em quantidades cada uma de 100 ml por balões de Erlenmeyer de 500 ml ou respectivamente 1 litro em balões de 5 litros e esteriliza-se a 121°C durante trinta minutos. Arrefecem-se os balões de 500 ml ou os balões de 5 litros, vacinam-se com suspensão de esporos e sacodem-se durante setenta e duas horas a 27°C (- I^o C), numa máquina de sacudir rotativa com o curso de 38 mm, a 240 rotações por minuto. 0 produto assim desenvolvido é utilizado para vacinar respectivamente dois recipientes de fermentação de vidro de 15 litros, contendo cada um 10 litros de 8 a 10% em volume de meio de cultura para a preparação da segunda fase de cultura de vacinação. A fermentação realizasse a 27°C (- I^o C), sob agitação a 180 - 200 rotações por minuto e a uma quantidade de ar de arejamento de 6 - 7 litros por minuto, durante um intervalo de tempo de vinte e quatro horas. 0 segundo material de cultura de vacinação assim obtido e bem desenvolvido é utilizado para a vacinação do meio de produção.

- 21 Composição do Meio de Produção

Glucose	15,0	g
Amido solúvel	20,0	g
Farinha de soja	5,0	g
Peptona	3,0	g
CaCO₅	2,0	g
NaCl	2,0	g
Agua de inohamento de milho	2,0	g
(nh₄)₂so₄	0,5	g
Agua destilada	1	litro
pH	6,5

Como agente anti-espuma, adiciona-se ao conteúdo do vaso de fermentação 0,025 % de Desmophen^^.

Introduzem-se 280 litros do meio acima mencionado num vaso de fermentação de 390 litros e esteriliza-se por meio de vapor indirecto e directo a 121°C durante vinte e oito minutos. Arrefece-se e vaso de fermentação e vacina-se com a segunda cultura de vacinação (/% em volume). A fermentação realiza-se a 27°C (- I^o C), sob agitação a 100 - 200 rotaçães por minuto, durante um intervalo de tempo de quarenta a quarenta e cinco horas. 0 caudal de ar de arejamento é igual a 170 litros por minuto, Ao terminar-se a fermentação, depois de decorridas quarente a quarenta e cinco horas, o diâmetro da zona de inibição contra Staphylococcus at. a?eus 209? é igual a 16 mm no ensaio do filtrado de cultura de acordo com o método das rodelas de agar (diâmetro 6 mm) a um pH do líquido de cultura compreendido entre 6,4 a 6,8.

volume das células que se separam é igual a 28 - 30% em volume.

0 caldo de cultura recolhido, que contém o complexo do antibiótico, é centrifugado para se separar do micélio e o líquido de cultura é, em seguida, processado como se descreve no Exemplo 6.

Exemplo 3

Cultura de Streptomyces sp. Y-84 30967 para a Preparação de Swalpamicina por Fermentação

Procede-se como se descreveu no Exemplo 2, com as seguintes diferenças:

Composição do Meio Contendo Agar

Amido (solúvel)

K₂HP0₄

MgS0₄.7H₂0

NaCl (nb₄)₂so₄

CaCOg

FeS0₄.7H₂0

MnCl₂.4H₂0

ZnS0₄·7H₂0

Agar

Agua destilada pH

Composição do Meio de

Glucose

Farinha de soja

CaCOg

CoClg.6H₂0

	10,0	g
	1,0	g
	1,0	g
	1,0	g
	2,0	g
	2,0	g
	0,1	mg
	0,1	mg
	0,1	mg
	15,0	g
	1	litro
	7,2
Produção
	20,0	g
	10,0	g
	0,2	g
	0,1	g

- 23 Água destilada pH litro

7,0

Colocam-se 100 litros do meio mencionado num vaso de fermentação de 150 litros e esteriliza-se por meio de vapor directo e indirecto. a 121°C, durante vinte e oito minutos.

Arrefece-se o vaso da fermentação e vacina-se com a segunda cultura de vacinação (9% em volume)₀Realiza-se a fermentação a 27° C (± I^o C), sob agitação, a 80 - 90 rotações por minuto, com um caudal de ar de arejamento igual a 60 - 70 litros por minuto. Depois de a fermentação terminar ao fim de quarenta a quarenta e três horas, o pH do caldo de cultura é igual a 6,45 e o diâmetro da zona de inibição contra Stapcylococcus aureus 209P é igual a 15 mm, no ensaio do filtrado da cultura de acordo com o método de placa de agar (6 mm de diâmetro). 0 volume das células separadas é igual a 18 - 24% em volume. 0 caldo de cultura processa-se como se descreve no Exemplo 7,

Exemplo 4

Cultura de Streptomyces sp. Y-84, 30967 para a Preparação de Swalpamicinas

Procede-se como se descreveu no Exemplo 2, com as seguintes diferenças:

Composição do Meio que Contém Agar

Farinha de levedura	20,0	g
Agar	15,0	g
FeSO₄.7H₂O	0,1	g
ZnS0₄.7H₂0	0,1	mg
MnCl₂.4H₂0	0,1	mg
Água destilada	1	litro
pH	7,2

- 24 Composição do Meio de Cultura de Vacinação

Amido			30,0	g
Açúcar de cana			10,0	g
Glucose			10,0	g
Peptona de soja			15,0	g
Água de inchamento	de	milho	10,0	g
K₂HP°4			3,0	g
NaCl			1,0	g
CaCOj			5,0	g
CuS0₄.5H₂0			7,0	mg
PeS0₄.7H₂0			1,0	mg
MnCl₂.4H₂0			8,0	mg
ZnSO₄.?H₂O			2,0	mg
Água destilada			1	litro
pH			7,2
Composição do Meio	de	Produção
Dextrina			20,0	g
Farinha de soja			10,0	g
Extracto de levedur	a		2,0	g
PeS0₄.7H₂0			0,1	g
Água destilada			1	litro
pH			6,5
		Ao fazer-se a	colheita	do vaso	de fer-
mentação, depois de	quarenta a nove	horas, o	valor do	pH do

caldo de cultura é igual a 6,75 e o volume dia s células separado é igual a 22$ em volume. 0 diâmetro da zona de inibição contra Staphylocoocus aureus 2092? é igual a 15 mm no ensaio do filtrado de cultura de acordo com o método da placa de

- 25 agar (6 mm) caldo de cultura colectado é processado como se descreve no Exemplo 6.

Exemplo 5

Cultura de Streptomyces sp. Y-84, 30967 para a Preparação De Swalpamicina por Fermentação

Procêde-se como se descreveu no Exemplo 3, com as seguintes diferenças:

Composição do Meio de Produção

Peptona	10,0	g
Extracto de carne de vitela	5,0	g
Glucose	20,0	g
NaCl	5,0	g
CaCO₅	3,0	g
Água destilada	1	litro
pH	6,5
Ao fazer-se a mentação, depois de quarenta e seis do caldo de cultura é igual a 6,5 e	colheita horas, o o volume	do vaso de fervalor do pH de células se-

paradas igual a 27% em volume e o filtrado da cultura possui uma actividade de 16 mm (diâmetro da zona de inibição), no ensaio de acordo com o método da placa de agar (6 mm de diâmetro).

caldo de cultura colectado é processado como se descreve no Exemplo 7·

Exemplo 6

Isolamento e Purificação da Swalpamicina

Centrifuga-se o caldo de fermerição obtido de acordo com o Exemplo 2 para separar o micélio do filtrado da cultura. Regula-se o filtrado da cultura assim obtido (232 litros), se isso for necessário, com HCl 2 N até pH 6,5 e extrai-se por duas vezes com 120 litros de acetato de etilo de cada vez. Rejeitam-se as fases aquosas e evapora-se à secura em vácuo os extractos em acetato de etilo depois de reunidos. A quantidade de extracto bruto assim obtido é igual a 165 gramas. Extrai-se duas vezes 0 mioélio (14,5 quilogramas) com 45 litros de acetona de cada vez. Para se iliminar a acetona, evaporam-se à secura em vácuo os extractos depois de reunidos. Regula-se a pH 6,5 a fase aquosa assim obtida com NaOH 2 N, mistura-se com 20 litros de água e extrai-se por três vezes com 20 litros de acetato de etilo de cada vez. Rejeitam-se as fases aquosas e evaporam-se até à secura em vácuo os extractos depois de reunidos. Nessas condições, obtem-se cerca de 110 gramas de extracto bruto. Reunem-se os extractos brutos provenientes do filtrado da oultura e do micélio (275 gramas), dissolve-se em 1 litro de metanol aquoso a 10% e trata-se por quatro vezes com 1 litro de heptano de cada vez. Rejeita-se a fase constituída pelo extracto em heptano e concentra-se a fase aquosa sob pressão reduzida. Depois de se eliminar o metanol, extrai-se a fase aquosa por duas vezes com 500 ml de clorofórmio de cada vez. Concentra-se 0 extracto clorofórmico assim obtido sob pressão reduzida, 0 que origina 110 gramas do composto que contém a mistura de antibióticos.

Adicionam-se estes 110 gramas, por duas vezes, uma a seguir à outra, a uma coluna que contém

3,5 quilogramas de gel de sílica (granulometria 300 - 400 malhas) e elui-se com um sistema dissolvente que consiste em clorofórmio : metanol (97 : 5). Desta maneira, obtem-se

- 27 - 6 gramas de fracção activa A e 80 gramas da fracção activa B.

Purifica-se a fracção B por cromatografia repetida em gel de sílica (2,4 kg de gel de sílica, granulometria 100 - 200 malhas), de maneira a obterem-se 9 gramas de Oalcomicina semi-pura e outras fracções activas.

Purifica-se um grama de Oalcomicina semi-pura por cromatografia em camada fina preparativa (placas de gel de sílica com 0,5 mm de espessura), de maneira a obterem-se 70 mg de Oalcomicina pura. Identifica-se a Calcomicina pelas suas propriedades físico-químicas e pelos resultados das análises espectroscópicas, Para posterior purificação, introduz-se a fracção A numa coluna contendo 600 gramas de gel de sílica RP18 e elui-se com um sistema dissolvente que consiste em metanol : água (7 í 3), em que se obtem 85 mg de Swalpamicina semi-pura. A sua posterior purificação realiza-se po-r cromatografia em camada fina preparativa (placas de gel de sílica com a espessura de 0,5 mm), usando como eluente uma mistura de clorofórmio e metanol (90 í 10) e subsequentemente cromatografia em fase líquida de elevada capacidade preparativa numa coluna -Bondapak

018 (Waters) com metanol/água (7 í 3) oomo agente eluente, com um caudal de passagem de 1 ml/minuto, com utilização de um detector de ultravioleta a 280 nm. Obtem-se assim 25 mg de Swalpamicina pura.

Exemplo 7

Isolamento e Purificação de Swalpamicina

Aproximadamente 62 litros do caldo de fermentação obtido de acordo com o Exemplo 3 são centrifugados para separação do micélio e do filtrado da cultura. Extrai-se 0 filtrado do caldo por duas vezes, com 30 litros de acetato de etilo de cada vez. Reunem-se os extractos em acetato de etilo e evaporam-se até à secura em evaporador de . rotação, o que proporciona 12 gramas de extracto bruto. Ex* trai-se 0 micélio por duas vezes com 6 litros de acetona de . - 28 ^— cade vez. Reunem-se os extractos em acetona e, depois de se eliminar a acetona, extrai-se a fase aquosa assim obtida com 10 litros de acetato de etilo. ^vapora-se até à secura a fase constituida pelo extracto em acetato de etilo, o que origina 8 gramas de extracto bruto.

Reunem-se os extractos brutos secos (20 gramas) provenientes do filtrado da cultura e do micélio e purificam-se por cromatografia em coluna repetida sobre gel de sílica (granulometria 100 - 200) com um agente eluente que consiste em clorofórmio e quantidades crescentes de metanol, até 10% de metanol. De acordo com este método, obtem-se 2 gramas de fracções bioactivas, Estes 2 gramas de mistura bioactiva são triturados com éter de petróleo (40 - 60°), o que origina 1,5 gramas de resíduo oleoso inactivo e 360 mg de um precipitado bioactivo. Dissolve-se este precipitado num pequeno volume de metanol e coloca-se numa coluna contendo ' 'Sephadex DH-20 (70 x 3,5 cm), da qual se eluem as fracções respectivamente com metanol. Assim, obtem-se cerca de 250 mg de mistura de antibióticos semi-pura e purifica-se esta por cromatografia em camada fina (placa de gel de sílica com 0,5 mm de espessura) num sistema dissolvente que consiste em 10% de metanol em clorofórmio. Proce) de-se desta forma, obtem-se 150 mg de Chalcomicina, identificada por cromatografia, ^análise espectral e suas propriedades fisico-químicas, e 10 mg de material bioactivo a 12 mg de Swalpamicina.

A Swalpamicina é identificada por análise química e métodos espectroscópicos.

Claims

Processo microbiológico para a preparação dum novo antibiótico maorólido da fórmula I caracterizado pelo facto de se fermentar a estirpe do micorganismo Streptomyces species Y-84, 30967 (DSM 3740) ou os seus variantes ou mutantes em condições aeróbias a um valor de pH compreendido entre 6 e 7 e a uma temperatura de 20 a 40°C no seio de um meio nutritivo usual contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e eventualmente oligoelementos e se isolar e se purificar o composto de acordo com a presente invenção por extracção do filtrado da cultura e do micélio com dissolventes orgânicos ou por utilização de métodos de adsorção sobre o filtrado da cultura e subsequente utilização de métodos cromatográficos sobre o extracto do dissolvente ou o eluido.

- 2a -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a fermentação do microrganismo Streptomyces sp. Y-84, 30967 (DSM 3740) como fermentação submersa a um valor de pH igual a 6,5, a uma temperatura de 25 - 30°0 e com uma duração de 40 - 45 horas.

- 5& _

Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo facto de se extrair o filtrado da cul| tura a um valor de pH compreendido entre 6,0 a 7,5 com um dissolvente orgânico não miscível com água, se extrair o miscélio com acetona, se evaporar o extracto para a eliminação da cetona, se diluir com água e se extrair a fase aquosa com um dissolvente orgânico não miscível com água e se isolar e se purificar o composto de acordo com a presente invenção a partir dos extractos reunidos por cromatografia em coluna contendo gel de sílica e por cromatografia em camada fina.

- 4a -

Processo para a preparação de composições farmacêuticas com actividade contra bactérias gram-posiI tivas, microplasmas e actinomicetas, caracterizado pelo facto de se incorporar o antibiótico macrólido da fórmula I quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, numa substância veicular e/ou diluente farmacològicamente aceitável.