PT92263B

PT92263B - Processo para a preparacao de analogos da serina com actividade antibiotica

Info

Publication number: PT92263B
Application number: PT92263A
Authority: PT
Inventors: Takeo Miyaki; Toshikazu Oki; Yosuke Sawada; Masatoshi Kakushima; Maki Nishio
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1995-07-06
Also published as: FI98147B; CY1884A; DK173464B1; PL161779B1; DK561289D0; PL161784B1; ES2059681T3; US4973673A; IE893617L; EP0368349A3; IE63305B1; NO894417D0; AU4461589A; KR900008049A; JP2817064B2; NO894417L; EP0368349A2; HK151595A; DK561289A; PT92263A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 92.263

REQUERENTE: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY, norte-americana, com sede em 345 Park Avenue, New York, New York 10154, Estados Unidos da América,

EPÍGRAFE: Processo para a preparação de análogos da serina com actividade antibiótica

INVENTORES: Yosuke Sawada,

Masatoshi Kakushima,

Maki Nishio, Takeo Miyaki, Toshikazu Oki,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4? da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

U.S.A., 10.11.1988, sob o No 269,821, tNPI. MOO 113 RF 1C732

BRISTOL₌MYERS_SQUIBB__ÇOMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DA SERINA COM ACTIVIDADE ANTIBIÓTICA

Antecedentes da invenção

A presente invenção refere-se a antibiótios anti-fúngicos, à sua preperaçao, a sua aplicaçao farmcêutica e a composiçoes fa_r macêuticas que os contêm. Mais particularmente, os antibióticos sao produzidos por Actinomadura hibisca e possuem um núcleo benzo Γ a Ί naf taceno.

Têm sido referidos poucos exemplos de benzo £ a naftaceno-qui nonas derivadas de fontes microbianas e estas incluem os compostos designados por G-2N e G-2A e KS-619-1. Embora nao tenha sido referida a actividade biológica para G-2N e G-2A o KS-619-1 foi des^ crito como um inibidor do iao cálcio e da fosfodiesterase núcleo-

tidica cíclica dependente da calmodulina. Recentemente, o pedido de patente de invenção europeia publicado n^s 277.621 descreve antibióticos anti-fúngicos BU-3608 (I ), BU-3608(I.) e BU-3608 C

D (I ). Os antibióticos benanomicinas A e B foram descritos em c

J.Antibiotics, 41 (1988) 807-811; a benanomicina B parece ser igual a BU-3608 C, enquanto a benanomicina A tem um grupo hidroxi_ lo em vez do grupo amino açúcar.

^R=^CH3

Ia : R'=CH₃: R- ^-D-xilosila

Ib : R'=CH₃; R=H

Ic : R'=H; R=ô-D-xi1osila

Id : R’=CH₃; R= -D-x i 1 os i lé

Ie : R'=H; R=|^-D-xilosila nosso pedido de patente de invenção co-pendente U.S.S.N.

203.776 depositado a 7 de Junho de 1988 descreve BU-3608D (Id) e

BU-3608E (Ie).

3.

proporciona compostos de fórmula geral

Resumo da invenção

A presente invenção

II na qual a serina é a D-serina; e ^{e R}2 representam cada um, independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo

1-6 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo

D-xilosilo;

ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

D-xilosilo é um fragmento de fórmula

Outro aspecto da presente invenção proporciona um processo

para a preparaçao do compostos de fórmula geral

III

BU-3608 FB-1: R^CH,

8U-3608 Ffl-2 : R]_»H na qual representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, que coji siste em se cultivar uma estirpe de Actinomadura hibisca capaz de produzir um composto de formula geral III em um meio contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto e D- ou DL-serina sob condições aeróbias e em se recuperar o referido composto de formula geral III do caldo da cultura.

Ou outro aspecto da presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que contem um composto de fórmula geral II e um veículo aceitável em farmácia.

Ainda um aspecto da presente invenção proporciona um método para o tratamento de infecçoes provocadas por fungos em hospedeiros mamíferos, que consiste na administraçao de uma dose anti-fúngica eficaz de um composto de formula geral II, ao referido hospedeiro.

5.

Ainda um outro aspecto da presente invenção proprociona esti_r pes de Actinomadura hibisca capaz de produzirem antibióticos de fórmula geral III em um meio contendo D- ou DL-serina.

A presente invenção também proporciona um composto de fórmula

IV ou um seu sal

composto de fórmula IV representa a aglicona de BU-3608

FA-1 e FA-2 e é utilizável na síntese dos agentes anti-fúngicos iniciais ou dos seus derivados.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 representa um espectro de ressonância magnética nuclear de protão de 400 MHz de BU-3608 FA-1 em dimetilsulfóxido

Figura 2 representa um espectro de ressonância magnética nuclear de protão de 400 MHz de BU-3608 FA-2 em dimetilsulfóxido

Descrição pormenorizada da invenção

Os antibióticos da presente invenção sao agentes anti-fungicos .

Os compostos de formula geral III, isto é BU-3608 FA-1 e BU-3608 FA-2, sao produzidos por cultura de uma estirpe de Actinomadura hibisca capaz de produzir antibióticos, ou uma sua variante ou mutante em um meio contendo D- ou DL- serina. Como exemplo de antibióticos produzidos por estirpes de Actinomadura hi bisca pode-se referir a estirpe P157-2 e as estirpes mutantes derivadas desta designadas A2660, A2493 e B0012. A estirpe P157-2, que produz BU-3608 FA-1 de preferência num meio suplementado com uma fonte de D-serina, foi isolada numa amostra de solo obtida nas ilhas Fiji, no Sul do Pacífico. Foi depositada uma cultura biologicamente pura de Actinomadura hibisca da estirpe P157-2 na American Type Culture Collection, em Rockville MD e adicionada â sua colecçao permanente de microrganismos sob o número de aceitaçao ATCC 53557. No pedido de patente de invenção co-pendente série número 115 273 depositado a 2 de Novembro de 1987 estão descritas as características da estirpe P157-2, o qual aqui se incorpora co mo referência. As estirpes mutantes A2660, A2493 e B0012, que sao capazes de produzirem BU-3608 FA-1 e Fa-2 em um meio contendo uma fonte de D-serina, obtiveram-se da estirpe-mae P157-2 por exposição desta estirpe a N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina a

7.

/ tf (1.000 yug/ml) durante 1 hora; seleccionaram-se as estirpes com b_a se na sua capacidade para produzir o complexo antibiótico BU-3608, isto é BU-3608 ou os componentes B, C, D e E na ausência da fonte de D-serina de adiçao. As culturas biologicamente puras de A2660, A2493 e B0012 foram depositadas na ATCC e designadas com os números de aceitação 53762 (A2660), 53815 (A2493) e 53816 (B0012).

As características de cultura das estirpes produtoras de antibióticos, citadas anteriormente, de Ac t i nomad ura hibisca estão referidas no Quadro I.

+ + + + + + E-I + + + + + + + +Z I ω

u ο 4-) □ Ό

Ο Ui

Qm cn

0) cu u

4—) cn cu cn

J

OQ rH

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Φ	cu	CU	u
	00	00	cu
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□	3	cn	cu
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Φ	00	u	•H
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Φ	U(	o	cu
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	CX	cn	CU
Φ	cn		cu
Ό	cu	Φ	cn
	1	O	CU
O	f—<		1
4-J	o	o	Φ
CJ	Ui	4J	cn
CU	Φ	CU	o
Ui	O	Ui	u
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X	r^-H	•H	T—i
W	O		o

+ + + + + + + + + + + + + + + o ~a •H e

cu

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	Φ	φ	Ό	φ
Φ	cn	Φ	cn	Φ		r—1	CU	cn	Φ
cn	o	cn	o	cn	O	O	3	o	cn
o	CJ	o	•H	o	t CU	4-4	•H	3	o
	3	u	-CJ	r-H	o	•H	υ	ε	3
Ή	r—1	cu	O	CU	3	cn	Ή	3	3
C£	o	υ	f—<	Φ	t—1	o	r—1		S
1	1	CU	Φ	u	o	3	3	1	1
Q	Q	cn	o	E-	cn	1—1	cn		Q

++: Bom desenvolvimento +:Desenvolvimento Sem desenvolvimento NT:Nao Testada.

/ ⁹·

Compreende-se que para a produção de BU-3608 FA-1 e FA-2 a prj? sente invenção nao está limitada ao organismo particular citado anteriormente mas inclui o uso de variantes e mutantes produzidas a partir destas estirpes por diversos meios tais como por radiaçao X, radiaçao UV e mutagénios químicos. Também estão incluídas outras produtoras de antibióticos da família de BU-3608 e suas variantes e mutantes capazes de incorporar a D-serina.

organismo produtor desenvolve-se em um meio nutriente que contém uma fonte de D-serina além dos elementos nutritivos conhecidos para os actinomicetas, isto é, fontes assimiláveis de carbono e azoto mais, eventualmente, sais inorgânicos e outros facotres de crescimento conhecidos. Preferem-se para a produção de grandes quantidades de antibiótico , a utilização de condiçoes aerobicas submersas, embora a produção de quantidades limitadas possa ser efe£ tuada em culturas de superfície e em frascos. Sao aplicáveis a presente invenção os processos gerais utilizados para a cultura de outros actinomicetas.

meio nutriente deve conter uma fonte de carbono assimilável apropriada tal como ribose, glucose, sacarose ou celobiose. Como fonte de azoto pode utilizar-se cloreto de amónio, sulfato de amónio, ureia, nitrato de amónio, nitrato de sodio etc., isoladamente ou em associaçao com fontes de azoto orgânico tal como a peptona, extracto de carne, extracto de levedura, xarope de milho, soja em pó, farinha de semente de algodao, etc.. Também se pode adicionar, se apropriado , sais inorgânicos nutritivos para proporcionar fontes de sódio, potássio, cálcio, amónio, fosfato, sulfato, cloreto, brometo, carbonato, zinco, magnésio, manganésio, cobalto, ferro e outros. Como

10.

fontes de D-serina pode-se utilizar D-serina ou DL-serina.

A produção dos antibióticos BU-3608 FA-1 e FA-2 pode efectuar-se a qualquer temperatura capaz de satisfazer ao desenvolvimento do orgnaismo produtor, por exemplo entre 25° e 40° e sendo mais conveniente a uma temperatura compreendida entre cerca de 27° e 32° C. Habitualmente, a produção óptima de antibiótico obtém-se em frascos de agitaçao após períodos de incubaçao de 5 a 8 dias, embora, em certos casos, possa necessitar-se de um período mais lo_n go. 0 arejamento dos frascos em agitaçao obtém-se por agitaçao, por exemplo por meio de um agitador rotativo. Se a fermentação, se deve realizar em tanques de fermentação, é apropriado produzir um inoculo vegetativo num caldo nutritivo por inoculação do caldo de cultura a partir de uma cultura em lâmina em forma de cunha (slant) ou uma cultura liofilizada do organismo. Após se obter deste modo um inoculo activo, transferiu-se assepticamente para o meio no tanque de fermentação. A produção de antibióticos em tanques de fermentação atinge, habitualmente, o optimo apos 3 a 6 dias de incubaçao. A agitaçao do tanque de fermentação e obtida por meio de um agitador e o arejamento pode fazer-se por injecçao de ar ou de oxigénio na mistura agitada. A produção do antibiótico pode ser controlada mediante técnicas cromatográficas ou espectros cópicas ou por um ensaio biológico convencional.

Isolamento e purificação dos antibióticos

Os antibióticos da presente invenção podem recolher-se do ca^L

do de cultura por qualquer método apropriado para o efeito. 0 esquema geral de um método deste tipo, para isolamento e purificação dos antibióticos BU-3608 FA-1 e FA-2 a partir do caldo de fejr mentaçao está representado no Esquema I.

separaçao do caldo de fermentação

Esquema I Isolamento de BU-3608 FA-1 e FA-2

12.

sobrenadante bolo de micélio

1. ajustamento do pH para 2,0

2. Filtraçao

Γ I precipitado filtrado

1. ajustamento do pH para 5,0

2. filtraçao

Ί-------------------------------------) filtrado precipitado

1. dissolução em água e ajuste da solução para um pH 9,0

2. filtraçao »

1----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------I filtrado impurezas

1. ajuste do pH para 2,0

2. coluna de Diaion HP - 20 complexo de cloridrato de BU-3608 impuro

1. dissolução em metanol

2. filtraçao

1-------*— filtrado impurezas acetado de etilo filtrado precipitado

1. dissolução em água

2. cromatografia em gele de sílica de fase inversa cloridrato de outros compo nentes do complexo BU-3608

BU-3608 FA-1, HC1

HP-20

BU-3608 FA-1 homogéneo, HC1 ajuste do pH para

------------------------------1

BU-3608 FA-2.HC1 HP - 20

I

BU-3608 FA-2 homogéneo, HC1

5,5 ajuste do pH para 5,5

BU-3608 FA-1

BU-3608 FA-2

13.

Para realizar o Esquema I, o caldo de fermentação completo é separado no bolo de micélio e no sobrenadante por um método clássico tal como centrifugação. 0 sobrenadante é acidificado e o pre^ cipitado formado, deste modo, é recolhido. 0 filtrado é corrigido para pH 5 para depositar o antibiótico impuro que se redissolve em água alcalinizada e se filtra para retirar impurezas. Acidifica-se o filtrado para pH 2 e submete-se a cromatografia numa coluna de absorçao como, por exemplo, Diaion HP-20 para se obter um complexo impuro de BU-3608, sob a forma de cloridrato. 0 complexo de antibiótico impuro pode ser recristalizado, por exemplo, em acetato de etilo e separar-se o produto nos componentes antibióticos individuais uti1izando-se HPLC em gel de sílica de fase inversa. As frac çoes que contêm BU-3608 FA-1 e BU-3608 FA-2 podem ser ainda mais purificadas por cromatografia Diaion HP-20. 0 cloridrato dos antibióticos pode, em seguida, converter-se no iao complexo por ajuste do pH de uma solução aquosa do cloridrato para 5,5.

Os antibióticos de BU-3608 FA-1 e FA-2, sao caracterizados p_e las propriedades físico-químicas seguintes:

Quadro II - Propriedades físico-químicas de BU-3608 FA-1 e de FA-2

BU-3608 FA-1 BU-3608 FA-2

Natureza : Pó amorfo vermelho escuro Pó amorfo vermelho escuro

M.P.	(dec.)	: 215°-220° C	186° - 190° C
L°C	24 D	: + 919° (c	0,1 O,1N HC1) +	79° (c 0,1	, 0,lN HC1)
SIMS	m/z	: 857 (M +	H)⁺		843 (M + H)⁺
Fórmula, molecular	: C.H..N	0_in		C„„H.„N_O.
		40 44 2	19		39 42 2 iy
RMN¹	H	: como se mostra substancial	como se mostra substari
		mente.na Figura 1		cialmente na Figura 2
13 RMN	C (100MHz DMSO-dg)	: 16,3(q),	20,3(q),	36,4(q)	16,4(q),	20,4(q),
		54,9(d),	56,l(q),	61,6(t),	55,0(d),	56,2(q),
		63,l(d),	65,9(q),	67,8(d),	61,7(t),	54,3(d).
		69,3(d),	69,9(d),	71,7(d),	65,9(q),	67,3(d),
		73,6(d),	75,8(d),	80,5(d),	69,4(d),	69,7(q),
		82,l(d),	104,l(d),		71,8(d),	73,5(d),
		104,2(d),	105,2(d),		75,9(d),	79,l(d),
		106,0(d),	110,3(s),		82,5(d),	104,2(d),
		111,4(d),	117,l(d),		104,3(d),	105,l(d),
		119,0(s),	119,2(s),		106,l(d),	110,4(s),
		126,3(s),	132,l(s),		111,5(d),	117,2(d),
		133,0(s),	136,8(s),		119,l(s),	119,3(s),
		137,6(s),	137,9(s),		126,3(s),	132,l(s),
		143,5(s),	158,0(s),		133,l(s),	136,8(s),
		163,6(s),	165,8(s),		137,8(s),	138,0(s),
		166,2(s),	168,5(s),		143,5(s),	158,2(s),
		172,2(s),	180,2(s),		163,7(s),	165,8(s),
		187,3(s)			166,2(s),	168,6(s),
					172,3(s),	180,l(s),

187,4(s)

UV nm (&) Xmax

em	MeOH a 50%	: 221(32,100), 276(27,400)	223(27,700), 277(25,400)
		499(12,900)	499(12,200)
em	0,01N HCl-50% MeOH	: 234(37,400), 299(31,100)	234(34,500), 296(28,900)
		460(12,900)	460(12,000)
em	0,01N NaOH-50% MeOH	: 244(34,100), 320(15,700)	233(37,200), 319(16,600)
		498(14,900)	498(15,100)
IV	(KBr)cm ¹	: 3400, 2920, 1605, 1385,	3400, 2920, 1600, 1385,
		1295, 1260, 1160, 1040	1295, 1255, 1160, 1040
TLC Si0„ Rf	: 0,26	0,22

(S—114, MeOAc-n-PrOH-28% NH^OH = 45:105:60, v/v)

HPLC Rt (min)

8,61

7,65

(ODS, CH₃CN-0,15% KH₂PO₄, pH 3,5 (25:75) « · ♦

16.

Os antibióticos BU3608 FA-1 e FA-2 podem submeter-se a outras modificações químicas. 0 aquecimento de Bu-3608 FA-1 e FA-2 ou de uma sua mistura em meio ácido durante um periodo suficiente para cindir o grupo xilosilo proporciona os derivados desxilosilos correspondentes e pequenas quantidades da aglícona IV. 0 dissol vente utilizado pode ser, por exemplo, o dioxano, o tetrahidrof_u rano, a água, um alcanol inferior, ou as suas misturas; o catalisador ácido pode ser por exemplo ácido clorídrico, acido sulfúrico ou ácido trifluoroacético. A temperatura pode estar compreen dida entre cerca de 60° e cerca de 100° C ou ser a temperatura de refluxo do dissolvente. 0 tempo de reacçao pode estar compreejn dido entre cerca de 30 minutos e cerca de 10 horas e dependerá das condiçoes reaccionais utilizadas. 0 N,N-dimetil-BU-3608 FA-2, pre parado pelo processo de alquilaçao redutora descrito em seguida, pode converter-se no seu composto desxilosilo correspondente de um modo idêntico. Descobriu-se que a hidrólise ácida de N,N-dimetil-BU-3608 FA-2 resulta praticamente na produção da aglícona IV.

grupo amino de BU-3608 FA-1, FA-2 ou os seus derivados deq xilosilo correspondentes podem alquilar-se por alquilaçao reduto ra a qual consiste primeiro em fazer-se reagir o composto inicial antibiótico com um aldeído ou com uma acetona para se obter uma imina e, subsequentemente, reduzir-se a imina formada deste modo. A condensação e a redução pode conduzir-se no mesmo recipiente da reacçao numa unica fase ou em duas fases separadas. 0 grupo amina primária de BU-3608 FA-2 ou os seus derivados desxilosilo podem converter-se numa amina terciária contendo dois grupos alquilo idênticos, mediante tratamento com pelo menos dois equivalentes do composto carbonílico afim do antibiótico, seguido de redução; ou

17.

uma amina terciária comportando dois substituintes alquilo dife rentes pode obter-se mediante utilização de uma quantidade con trolada de um primeiro reagente carbonílico para converter a amina primária em uma amina secundária que, em seguida, se faz rea gir com um segundo grupo carbonilo diferente para se obter o composto de amina terciária. Se nao se adicionar o segundo composto carbonílico, obtém-se uma amina secundária.

reagente com um grupo carbonilo pode ser um aldeído ou uma cetona com um ou seis átomos de carbono, por exemplo, formaldeido, acetaldeído, propionaldeído ou cetona. A redução da imina pode realizar-se mediante a utilização de agentes redutores tais como os hidretos metálicos, por exemplo, boro-hidreto de sodio, cianoboro-hidreto de sódio, hidreto de alumínio e lítio. A reacçao realiza-se no seio de um dissolvente orgânico polar ou numa sua mistura, tal como água, acetonitrilo, alcanóis inferiores e dimetilsulfóxido. A temperatura da reacçao nao e particularmente restritiva e pode estar compreendida entre a temperatura ambiente e cerca de 100° C. Na nossa experiência, a reacçao de alquilaçao realizou-se ã temperatura ambiente completando-se habitualmente em 24 horas. As condiçoes reaccionais óptimas dependerão, evidentemente, da natureza e da reactividade dos reagentes utilizados. Será conveniente que possa obter N,N-dimetil-BU-3608 FA-2 a partir de BU-3608 FA-2, FA-1 ou de uma sua mistura sem ter que se separar os dois componentes. Do mesmo modo, pode obter-se Ν,Ν-dime til-desxilosil-BU-3608 FA-2 a partir de desxi1 osil-BU-3608 FA-2,

FA-1 ou de uma sua mistura.

18.

Actividade biológica

As actividades anti-fíngicas dos compostos representativos da presente invenção avaliaram-se in vitro e in vivo. As concentrações inibidoras mínimas (CIMS) sobre vários fungos determinaram-se pelo método de diluição de agar em serie utilizando-se dejc trose agar Sabourand. Assim, aplicou-se aproximadamente uma sus pensão de fungo de 0,003 ml contendo 10 células/ml à superfície de placas de agar contendo os antibióticos em ensaio.

Os valores da CIM registados após as culturas serem incubadas durante 40 horas a temperatura de 28° C estão indicados a seguir no Quadro III.

I—t

r—4

i—1

i—-4

uo

LO)

uo

CO

co

CM

o

CM

kO

o

uO

t—l

f—1

m

o

i-H

i—1

ω

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Quadro III. Actividade antifúngica, in vitro em dextrose agar de Sabourand (pH 7,0)

					uo
»—4	r—1 vQ	o	CO	co	·»	UO	CO	co	uo
					CM	*	*	*	*
CO	CO «—1	i—1		xO	o o —	CM		o o	CM

CO	00	co	r—1	·—1	o	o	UO	CO	co	xO
xO	o	o	co	co	uO CN	UO CM	CM ι—1	xO	xD	r—1

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Nao determinado.

20.

As actividades anti-fúngicas in vivo avaliaram-se nas infecçoes intravenosas com Candida albicans A9540 , Cr yptococcus neoformans IAM4514 e Aspergillus fumigatus IAM 2034 em murganhos. Cultivou-se a Candida albicans e Cryptococcus neoformans durante 18 e 48 horas, respectivamente, à temperatura de 28° C em meio YGP £ extracto de levedura (0,2%), glucose (1,5%), peptona (0,5%), I^HPO^ (0,05%) e MgSO^ (0,05%) J e suspenderam-se em solução de cloreto de sódio. Cultivou-se o Aspergillus fumigatus durante 7 dias à temperatura de 28° C em uma cunha de agar YGP e suspendeu.

-se em solução de cloreto de sódio. Recolheram-se os esporos por filtraçao da suspensão fúngica através de uma gase. Infectaram-se murganhos machos ICR com pesos compreendidos entre 20 a 24 g por via endovenosa com cerca de 10 vezes a dose letal média de fungos.

Administraram-se os compostos em ensaio a várias doses a gru. pos de 5 murganhos, por via endovenosa, uma vez exactamente a seguir à provocação (cha 11enge) fúngica (dia 0) ou uma vez por dia durante 5 dias desde o dia zero até ao 4^S dia (gd x 5). Calcula-se a dose protectora de 50% (ϋΡ^θ) a partir da percentagem de sobreviventes registada no 20² dia após a provocação fúngica. Todos os animais de controlo morreram após 7 a 15 dias depois da infecçao fúngica.

Os resultados dos estudos in vivo apresentam-se no Quadro IV.

/ ²¹

Quadro IV. Actividade in vivo sobre Candida Cryptococcus e

Aspergillus nas infecçoes endovenosas ^dp ₅₀ (mg/kg/inj. iv)

C.Albicans	C.neoformans	A.fumigatus
A9540	IAM4514	IAM2034
Dose única qd x 5	Dose única qd x 5	Dose única qd x 5

BU-3608 FA-1	18	-	-	-	-	-
BU-3608 FA-2	7,4	-	-	-	-	— -
N,N-dimetil-
-BU-3608 FA-2	9,0	7,5	11	2,8	36	15

A DLçjq para N,N-dimetil-BU-3608 FA-2 determinou-se em murganho após uma injecçao endovenosa única. Nao se observaram nem toxidade letal nem sinais tóxicos significativos com a dose mais alta, 600 mg/kg.

Os antibióticos da presente invenção para o tratamento de infecções fúngicas em animais e seres humanos, podem-se dar numa dose anti-fúngica eficaz por qualquer das vias de administraçao aceitáveis; estas incluem, mas nao estão limitadas a via, endove nosa, intramuscular, oral, intranasal.e aadministraçao tópica para as infecções superficiais. As preparações para administraçao parenteral incluem soluçoes aquosas ou nao aquosas, suspensões ou emulsões estéreis. Estas também se podem preparar sob a forma de composiçoes sólidas estéreis que se podem dissolvenr em água estéril ou em soro fisiológico ou em algum outro meio injectável es téril, imediatamente antes da utilização. As composiçoes orais p_o dem apresentar-se sob a forma de comprimidos, cápsulas de gelatina, pós, pastilhas, xaropes e outros. Para administraçao tópica, pode incorporar-se o composto em loçoes, pomadas, géis, cremes, emplastros, tinturas e outros. As formas de dosagem unitárias podem preparar-se por métodos conhecidos para a formulação farmacêu tica .

Será conveniente que quando se trata um hospedeiro infectado com um fungo susceptível aos antibióticos da presente invenção, a via preferida de administraçao e a dose utilizada sejam determina das pelo médico assistente, para o tratamento das infecções fúngj_ cas e poderão variar de acordo com o organismo infectante, a sua sensibilidade ao antibiótico, a gravidade e sitio da infecçao e com as características do doente tais como a idade, a massa corporal, a velocidade de excreção, as medicações concumitantes e a condição física geral.

23.

Os exemplos que seguem sao representativos mas não limitativos do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1

Produção por fermentação de BU-3608 FA-1 (a) Cunha de Agar

Actinomadura hibisca P157-2(ATCC 53557) desenvolveu-se em uma cunha de agar com pH 7,0 com a composição seguinte:

0,5% de amido solúvel

0,5 % de glucose

0,1% de extracto de peixe

0,1% de extracto de levedura

0,2 % de NZ - case (NZ - case é um nome comercial de o reageri

0,2% de NaCl te preparado pela Scheffield Chemical Co.

0,1% de CaC0₃ (USA). Constitui um produto de caseína di_

1,6% de agar gerida e é utilizado como fonte de azoto na fermentação).

A cultura foi incubada à temperatura de 28° C durante 10 dias.

(b) Cultura de Sementeira

Uma porção do crescimento microbiano proveniente da cultura inclinada transferiu-se para um balao Erlenmeyer de 500 ml

contendo 100 ml de meio vegetativo com pH 7,0 composto por

3% de glucose

3% de farinha de soja

0,5%	de	Pharmamedia
0,1%	de	extracto de	levedura
0,3%	de	carbonato de	cálcio

Incubou-se a cultura à temperatura de 32° C durante 6 dias num agitador rotativo regulado para 200 rpm.

(c) Cultura para produção

Transferiram-se 5 ml do crescimento microbiano proveniente da cultura de sementeira para um balao Erlenmeyer de 500 ml con tendo 100 ml de um meio de produção esteril composto por

3% de glucose

3% de farinha de soja

0,5%	de	Pharmamedia
0,1%	de	extracto	de	levedura
0,3%	de	carbonato	de	cálcio

0,25% de D-serina

Incubou-se a cultura à temperatura de 28° C durante 6 dias num ag_i tador rotativo regulado para 200 rpm. Na produção do antibiót^i co obtiveram-se 443 lig/ml, dos quais 72,9% eram de BU-3608 f 2 ι

-τ'

FA-1, 26,0% de BU-3608 e 1,1% de EU-3608 C. Avaliou-se a produção dos antibióticos por medição da densidade óptica do líquido proveniente do caldo de fermentação a 500 e 600 nm. A densidade óptica real obteve-se por subtraçao do valor de D0 a 600 nm ao valor a 500 nm. A concentração de antibióticos ex primiu-se sob a forma da quantidade equivalente de BU-3608 em base livre. Os antibióticos identificaram-se pelo método de HPLC descrita no Exemplo 5.

Exemplo 2

Produção por fermentação da BU-3608 FA-1 e FA-2 a partir da estir pe A-2493.

Desenvolveu-se em cultura de cunha de agar e em cultura de se menteira, utilizando-se meio de crescimento com a mesma composi çao da descrita no Exemplo le sob as condiçoes referidas no mesmo Exemplo, um mutante auxotrópico de arginina da estirpe Actinomadura hibisca P157-2 designada por A-2493 (ATCC 53815).

Produção A. Transferiram-se 5 ml niente da cultura de balões de Erlenmeyer mo meio de produção bou-se a do crescimento microbiano provesementeira para cada um de 100 de 500 ml contendo 100 ml do mes descrito no Exemplo 1 (c). IncuC durante 6 cultura à temperatura de 28 dias num agitador rotativo regulado para 200 rpm.

A produção do antibiótico atingiu 261^ig/ml distribuídos por 29,8% de BU-3608 FA-1, 28,9% de BU-3608

FA-2, 19,5% de BU-3608 C e 21,8% de BU-3608.

Produção B. A produção de antibióticos a partir da estirpe A2493 também se efectuou num meio (pH 7,0) composto por

3% de glucose

3% de proteína S (farinha de soja, Ajinomoto)

0,3% de CaCO^

0,5% de DL-serina

A produção de antibióticos atingiu 890 ^ig/ml após a incubaçao da cultura durante 11 dias à temperatura de 28° C. A proporção dos componentes era 17,7% de BU-3608 FA-2, 17,0% de FA-1_? 33,5% de BU-3608 e 31,8% de BU-3608C.

Exemplo 3

Produção por fermentação de BU-3608 FA-1 e FA-2 utilizando-se a est ir pe B-0012 .

27.

Produção A:

Aplicaram-se as condiçoes e os meios de cultura des critos no Exemplo 1, Partes (a), (b) e (c) e a estir- pe variante designada por B-0012 (ATCC 53816) em sub_s tituiçao da estirpe-mae P157-2. A produção do antibió^ tico atingiu l,150jJg/ml após 6 dias e a proporção dos componentes foi de 33,7% de BU-3608 FA-1, 21,2% de FA-2, 24,0% de BU-3608 e 21,1% de BU-3608C.

Produção Β: Uma porção do desenvolvimento microbiano proveniente da cultura em cunha da estirpe B-0012 foi também trans ferida para um balão Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de um meio com pH 7,0 com a composição seguinte :

1% de amido solúvel

1% de glucose

0,5% de extracto de levedura

0,5% de peptona

0,3% de NaCl

0,2% de CaCO^

A cultura sementeira desenvolveu-se a temperatura de 32° C durante 6 dias e transferiram-se 5 ml do crescimento microbiano para um Balaao Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de um meio de pro_ duçao pH 7,0 composto por:

/ 28.

3% de glucose

3% de proteína S (farinha- de. soja, Ajinomoto)

0,3% de CaCOg

0,25% de D-serina

Incubou-se a cultura à temperatura de 28° C durante 11 dias. A produção do antibiótico atingiu 1,970 ^ug/ml e a proporção dos coni ponentes foi de 20,0% de BU-3608 FA-2, 10,0% de FA-1, 39,0% de BU-3608C e 31,0% de BU-3608.

Exemplo 4

Produção por fermentação de BU-3608 FA-1 e FA-2 com a estirpe A-2660.

Aplicando-se as mesmas condiçoes e os meios descritos no Exemplo 1, nas Partes (a) e (b), produziram-se culturas em cunha de agar e sementeira da estirpe mutante de Actinomadura hibisca A-2660 (ATCC 53762). Transferiram-se 5 ml da cultura de sementeira para um balao Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de um meio de produção composto por:

3% de glucose

3% de farinha de soja

0,5% de Pharmamedia

0,1% de extracto de levedura

0,3% de CaCOg

0,5% de DL-serina

Incubaram-se as culturas ã temperatura de 28°C durante 7 dias. A produção do antibiótico atingiu 620 ^ig/ml com uma propor ção de 17,0% de BU-3608 FA-1, 15,6% de FA-2, 23,9% de BU-3608, 24,7% de BU-3608C, 8,3% de D e 10,5% de E.

Exemplo 5

Isolamento e purificação de BU-3608 FA-1 e FA-2 a partir do caldo de fermentação.

Separou-se por centrifugação o bolo de micelio e a fase sobrenadante de 10 litros de caldo fermentação obtidos pelo processo descrito no Exemplo 2, Produção A. Acidificou-se o sobrenadante até pH 2,0 utilizando-se ácido clorídrico 6N e depositou um precipitado amorfo que se retirou por filtraçao. 0 filtrado límpido foi ajustado para pH 5,0 com hidróxido de sódio 6N e mantido ã temperatura de 5° C durante duas horas. Depositou um precipitei do vermelho escuro que se recolheu por filtraçao. Dissolveu-se o precipitado em 4,1 litros de água, ajustou-se o pH para 9,0 com hidróxido de sódio 6N e filtrou-se a solução para retirar as imp_u rezas insolúveis. Ajustou-se o pH do filtrado para 2,0 e aplicou-se numa coluna de Diaion HP-20 (2,0 litros). Lavou-se a coluna

30.

5^* com água e eluiu-se com acetona aquosa a 60% de (pH 3,0). A con centraçao do eluato vermelho deu um solido amorfo de cloridrato de BU-3608 sob a forma de um complexo (3,1 g). 0 complexo sólido (3,0 g) dissolveu-se em (120 ml) de metanol e filtrou-se. Ao filtrado agitado adicionou-se 720 ml de acetato de etilo, gota a gg ta, e manteve-se a solução resultante à temperatura de 5° C durajn te 15 horas. Depositou o precipitado que se recolheu por filtração e se secou (1,28 g).

Dissolveu-se o sólido (1,28 g) em 100 ml de água e submeteu-se a uma cromatografia em coluna de fase inversa YMC GEL ODS A 60 (10 litros, Yamamura Chemical Lab.) que fora equilibrada com uma mistura de CH CN- 0,15% KH_? PO^, pH 3,5 (21:79). Realizou-se a eluiçao com a mesma mistura dissolvente e recolheu-se o eluato em fracçoes de 1 litro. Analisaram-se as fracçoes por HPLC (coluna: YMC A-301-3,4,6 mm d.i. x 100 mm, 3 yim, ODS Yamamura Chemical Lab. fase móvel: CH₃ CN-0,15% KH₂P0_ó, pH 3,5 (25:75), caudal: 0,8 ml/ /minuto, detecçao: absorçao no ultravioleta a 254 nm, tempo de re tenção: BU-3608 FA-2, 7,65 min; BU-3608 FA-1, 8,61 min; BU-3608A, 19,11 min). As fracçoes contendo BU-3608 FA-2 ou BU-3608 FA-1 homogéneas, reuniram-se e concentraram-se sob vazio para eliminar o cianeto de metilo. Cada fracçao concentrada foi dessalinizada por cromatografia de Diaion HP-20 para se obter o cloridrato de BU-3608 FA-2 próximo da homogeneidade, (75 mg) e cloridrato de BU3608 FA-1 (50 mg).

Para se converter o cloridrato na sua forma livre e eliminar sais inorgânicos contaminantes ajustou-se uma solução aquosa de cada sal para pH 5,5 com hidróxido de sódio 0,1 N para depositar sob a forma dipolar pura os BU-3608 FA-2 (48 mg) e BU-3608 FA-1 (11 mg).

Exemplo 6

Preparação de N,N-dimetil-BU-3608 FA-2

Dissolveu-se uma mistura de BU-3608 FA-1 e BU-3608 FA-2 (45:55', 510 mg) em 50 ml de água e ajustou-se o pH da solução para 7,9 mediante adiçao de hidróxido de sódio IN e diluiu-se com 50 ml de acetonitrilo. A esta solução adicionou-se sequencialmente 1,6 ml de formaldeído aquoso (^35£) e 240 mg de cianoboro-hidreto de sódio à temperatura ambiente. Agitou-se a solução durante 1 hora à temperatura ambiente e controlou-se o avanço da reacçao por HPLC. Retirou-se o dissolvente inorgânico sob vazio e ajustou-se o pH do resíduo aquoso para 10,9. Adicionou-se gota a gota, 40 ml da solução a 240 ml de acetona, com agitaçao, e manteve-se a temperatura de 5° C durante 2 horas. 0 precipitado resultante recolheu-se por centrifugação a (3,000 rpm) e redissolveu-se em 40 ml de água. Após eliminação de traços de acetona sob vazio, ajustou-se para 5,0 e deixou-se repousar durante 2^ horas à temperatura de 5° C. Depositou o precipitado que se recolheu por centrifugação e se lavou sequencialmente com água e acetona e se secou sob vazio ã temperatura de 60° C para se obterem 80 mg de N,N-dimetil-

-FA-2 sob a forma dipolar . P.F. 214° - 218° C (dec):

0,01N -NaOH ^uvX_max ^nm 232,8(32 900), 320,0( 15 500),498,4 (15 200).

Exemplo 7

Preparaçao de desxilosil-BU-3608 FA-1

Submeteu-se a refluxo uma solução de 54 mg de BU-3608 FA-1 em 5,4 ml de dioxano e 5,4 ml de ácido clorídrico IN num banho de vapor durante 8 horas, diluiu-se a mistura reaccional com 30 ml de água e introduziu-se numa coluna curta de Diaion HP-20 (Mitsubishikasei, l,8x 25 cm). Lavou-se a coluna com água, e em seguida, eluiu-se com acetona ácida a 80% (pH^, adicificada com ácido clorídrico IN). Recolheu-se o eluato laranja avermelhado e evaporou-se para se obter um pó vermelho carregado. Dissolveu-se o pó em acetonitrilo a 35% / tampao de fosfato (pH 3,5) e cromatografou-se numa coluna ODS (YMC - ODS, 2,1 x 25 cm, que se eluiu com o mesmo dissolvente). As fracções contendo o composto desejado reuniram-se e fizeram-se passar através de coluna HP-20. Lavou-se a coluna com água e eluiu-se com acetona a 80% (pH3). A evaporaçao do eluato deu um po vermelho escuro que se dissolveu em 8 ml de água, ajustando-se o pH da solução para 5,3 com hidr£ xido de sódio 0,lN. Recolheu-se o precipitado resultante por. centrifugação, lavou-se com acetona e secou-se para se obter um po vermelho escuro.

IV: ύ máx. (KBr) cm¹ : 3400, 1605, 1290, 1255, 1060

UV: X máx. (1/100N NaOH) nm (£): 212(35,400), 319(15,300), 498(14,500).

: (400	MHz,	DMSO-d , ) : o	1,	26 (3H, d, J=6Hz,	6' -CH₃),
2,32	(3H,	s, Ph-CH₃	),	2,65 (3H, s, NCH₃)	, 3,75 (2H,
m, 0C	:h₂),	3,91 (3H,	s ,	0CH₃), 4,68 (ÍH,	d, J=8Hz, 1' -H
6,72	(1H,	d , J = 2 Η z ,	10	-H), 6,87 (ÍH, s,	4-H), 7,12 (ÍH,
d, J=	2Hz,	12-H), 7,	71	(ÍH, s, 7-H) .

Exemplo 8

Preparaçao de desxilosil - BU-3608 FA-2

Uma solução de 54 mg de BU-3608 FA-2 em 5,4 ml de dioxano e 5,4 ml de ácido clorídrico IN foi submetida a refluxo em banho de vapor durante 8 horas. Diluiu-se a mistura reaccional com 30 ml de agua, e absorveu-se numa coluna curta de Diaion HP-20 (Mitsubishikasei, 1,8 x 25 cm), lavou-se com água e eluiu-se com acetona a 80% (pH3). Reuniu-se o eluato escarlate e concentrou-se, dissolvendo-se o resíduo em 8 ml de água. Ajustou-se o pH da soljj çao para 5,3 com hidroxido de sodio 0,1 N e recolheu-se por cen trifugaçao o precipitado resultante que se lavou com acetona e s_e cou sob vazio para se obterem 37,7 mg de um pó vermelho escuro (rendimento 85%).

IV: Omãx (KBr) cm ¹ : 3400, 1605, 1290, 1265, 1035

UV: X máx (1/100 N NaOH)nm (&)·. 214(33,000), 234(32,300),

319(14,900), 498(14,100).

RMN ¹H (DMSO-d,): 1,15 (3H, d, J=7Hz, 6'-CH„), 2,32 (3H, s, D J

Ph,CH₃), 3,75 (2H, m, OCHp, 3,91 (3H, s, OCH₃), 4,67 (1H, d, J=8Hz), l’-H), 6,72 (1H, d, J=3Hz, 10-H), 6,93 (1H, s, 4-H),

7,12 (1H, d, J=3Hz, 12-H), 7,71 (1H, s, 7-H).

Exemplo 9

Preparaçao de desxilosil-N,N-dimetil-BU-3608 FA-2

Método A

Uma solução de 50 mg de N, N-dimetil-BU-3608 FA-2 (produto o_b tido no Exemplo e) em 5 ml de dioxano e 5 ml de acido clorídrico IN foi submetido a refluxo em um banho de vapor durante 8 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente, depois do que se filtrou para se obterem 7,2 mg de um precipitado. Introduziu-se o filtrado numa coluna de gel de sílica anidra (Merck Kieselgel 60,4 x 30 cm) e eluiu-se com n-BUOH-AcOH-l^O (3:1:1). Recolheu-se o eluato em fracções de 10 ml. Trataram-se as fracções 2 a 14 e o rpecipitado obtido no início como descrito no Exemplo

10.

35.

As fracçoes 21 a 32 reuniram-se e introduziram-se numa colu na HP-2O de (1,8 x 25 cm). Lavou-se a coluna com água e eluiu-se com acetona a 80 % (pH3). A concentração do eluato escarlate deu um sólido que se purificou sucessivamente por cromatografia em co luna ODS (YMC - ODS, 2 x 37 cm, eluída com CH^CN a 20%/tampao fos^ fato pH 3,5) e cromatografia Diaion HP-20 (1,8 x 25 cm, eluída com acetona a 80% com pH3) para se obterem 7,8 mg do composto em título sob a forma de um pó vermelho escuro, (rendimento 17%).

P.F. ^180° C (dec.) Purificação por HPLC: ^95%

IV: Omax (KBr) cm ^-1 : 3400, 1730, 1610, 1380, 1260, 1070.

UV:Xmax (1/100N Na0H)nm (Ô): 211(38,100), 318( 14,200),

496(12,500).

RMN ^ΤΗ (DMSO-d,): 1,23 (3H, d, J=7Hz, 6’-CH_), 2,29 (3H, s, o 3

PhCH₃), 2,75 (6H, s, NCHp, 3,74 (2H, m, OCH₂), 3,91 (3H, s, 0CH₃), 4,60 (1H, d, J=8Hz, l'-H), 6,73 (1H, d, J=3Hz, 10-H), 6,89(1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=3Hz , 12-H),7,77 (1H, s, 7-H).

Método B

Uma solução de 71 mg dedesxilosil-BU-3608 FA-2 (produto do Exemplo 8) em 7 ml de água e 7 ml de acetonitrilo foi ajustada para pH 7 com hidróxido de sódio 0,1 N. Adicionou-se a esta solução formaldeido aquoso, (0,3 ml, 35%) e 45 mg de cianoboro-hidre to de sódio, à temperatura ambiente.

Agitou-se a mistura reaccional durante a noite e eliminou-se o dissolvente orgânico sob vazio. Ajustou-se o pH do resíduo aquoso para 10 com hidróxido de sódio e, em seguida, adicionaram-se 70 ml de acetona, gota a gota. Retirou-se o precipitado por filtração e dissolveu-se em água com pH 2,5. Introduziu-se a solu çao numa coluna de Diaion HP 20 (1,8 x 25 cm), lavou-se com água e desenvolveu-se com acetona ácida (pH3) acidificada com ácji do clorídrico IN). Recolheu-se o eluato vermelho escuro, concen trou-se para cerca de 5 ml, ajustou-se o pH para 5,3 com hidróxido de sódio diluido e, em seguida, adicionaram-se, gota a gota, a 70 ml de acetona. Recolheu-se o precipitado resultante por fil tração e reprecipitou-se com acetona aquosa para se obterem 66 mg (rendimento 90%) do composto em título sob a forma de um pó ver_ melho escuro que se identificou em todos os aspectos com o compos to obtido pelo Método A.

Purificação por HPLC: ^95%.

Exemplo 10

BU-3608 FA aglícona

Reuniram-se as fracções 2 a 14 do eluato provenientes da coluna de gel de sílica do Exemplo 9 (Método A) e concentraram-se até a secura para se obter um po.

£

37.

Ο pó e ο precipitado do Exemplo 9 (Método A) dissolveram-se em hidróxido de sódio 0,01 N e introduziu-se numa coluna de Diaion HP-20 (1,8 x 25 cm), lavou-se com água e eluiu-se com acetona a 80%, (pH3). Reuniu-se o eluato escarlate e evaporou-se a acetona sob vazio para se obter uma suspensão. Acidificou-se a suspensão com ácido clorídrico IN (pH3) e extraiu-se com butanol. A concentração do extracto de butanol deu 11,5 mg de aglícona (rendimento 33%) sob a forma de um pó amorfo vermelho escuro.

P.F. ^200° C(dec). Purificação por HPLC:^95%

IV: máx (KBr) cm^-1 : 3240, 1720, 1605, 1340, 1305, 1165.

UV:^\ max (1/100N NaOH) nm (&): 212(34,500), 319( 15,200), 498(14,000).

RMN ^ΤΗ (DMSO-d,): 2,34 O	(3H, s,PhCH₃)	, 3,73	(2H, m,	och₂),
3,91	(3H, s, 0CH₃)	, 4,24	(2H, AB-	q»
J=llHz, 5-H & 6-H)	, 4,46	(1H, m,
N-CH	-COOH), 6,92	(1H, d,	J=2Hz,	10-H),
7,06	(1H, s, 4-H),	7,28 (1H, d, J	= 2Hz,

8,08 (1H, s, 7-H).

Exemplo 11

Seguindo o processo geral descrito no Exemplo 6 e utilizando-se os reagentes referidos em seguida obtêm-se os correspondentes análogos alquilados de BU-3608 FA-1 e FA-2.

> ΙΙ·

38.

II

BU-36O8 FA-1	acetaldeído (1 equiv)*	Rg-p-D-xilosilç; R₁=CH₃; R₂=CH₃CH₂-
11	propionaldeído (1	equiv)	R ₃ = ^-D-xilosilo R^CHgj R₂ = CH₃CH₂CH₂
II	acetona (1 equiv)		Rg= \|^-D-xilosilo; R^CHgj R₂ = -CH(CH₃)₂
BU-3608 FA-2	acetaldeído (2	equiv)	Rg= p-D-xilosilo; r₁=r₂=ch₃ch₂-
11	acetona (1 equiv)		Rg= j^-D-xilosilo; R₁₌H, R₂=CH( CH₃)₂
11	propionaldeído (2	equiv)	R ₃ = \|^-D-xilosilo; r₁=r₂=ch₃ch₂ch₂-
f!	butiraldeído (1 equiv)	R₃=P~D-xilosilo; R₁₌H; R₂=CH₃(CH₂)₃-

Desxilosi-BU-3608	acetaldeído (1	equiv) Rg = H; ^R1⁼⁽^^R3’ ^R2 ⁼
FA-1		=ch₃ch₂-
u	propionaldeído	(1 equiv) R₃=H; R^=CHg; Rg =
		=ch₃ch₂ch₂-

acetona (1 equiv) ^-ch(ch₃)₂ ^R3=H; R.^CH,.

J 9

A

Β

II

39.

Desxilosi-BU-3608

FA-2 fl ff ff acetaldeído (2 equiv) acetona (1 equiv) propionaldeído (2 equiv) butiraldeído (1 equiv) * Mínimo em relaçao ao BU-3608 reagente.

R₃=H; R₁=R₂=CH₃CH₂R₃=H; R₁₌H, R₂=-CH(CH₃)

R₃=H; R₁=R₂=CH₃CH₂CH₂R₃=H; R =H;

r₂=ch₃(ch₂)₃-

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.Processo para a preparação de compostos de fórmula geral na qual e

independentemente, um grupo alquilo C-^θ ; representaátomo hidrogénio ou um grupo e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico,

41.

caracterizado pelo facto:

a) de se fazer reagir um composto de fórmula geral na qual representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo -D-xilosilo; e

R^ representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo metilo, ou um seu sal, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, com um aldeído ou com uma cetona contendo 1 a 6 ãtomos de carbono, para formar uma imina; e

b) de se tratar a imina obtida em a) com um agente de redução.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ representa um grupo ^-D-xilosilo, ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

42.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ representa um átomo de hidrogénio, ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
4Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo e R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ e R₂ representam, cada um, independentemente, um grupo alquilo 0₂_θ; ou R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo e R₂ representa um grupo alquilo ^C2-6' ^{Ou urn Seu sa}^ ^30θ^6^νβ1 sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto de fórmula ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
7.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparaçao de um composto de fórmula ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corres pondentemente substituídos.
8.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto de fórmula

44.

ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
9.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto de fórmula ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
10./ ⁴⁵ ·

10.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto de fórmula r- ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
11.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto de fórmula ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
12.- Processo para a preparação de um antibiótico de fórmula geral

111 na qual representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo;

caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe de Actinomadura hibisca, capaz de produzir o antibiótico referido, em um meio contendo fontes de carbono e azoto assimiláveis, e D- ou DL-serina, sob condições aeróbias, e de se isolar o antibiótico referido do caldo de cultura.
13.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de infecções fúngicas em um hospedeiro mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar um composto de fórmula geral II, quando preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
14.- Cultura biologicamente pura de microrganismos

Actinomadura hibisca, caracterizada pelo facto de apresentar as características de identificação da ATCC 53815 e de ser capaz de

47.

produzir um antibiótico de fórmula geral III após cultura em um meio aquoso contendo uma fonte de carbono e azoto assimilável e D-serina.
15.- Cultura biologicamente pura do microrganismo Actinomadura hibisca, caracterizado pelo facto de apresentar as caracteristicas de identificação da ATCC 53816 e de ser capaz de produzir um antibiótico de fórmula geral III após cultura em um meio aquoso contendo uma fonte de carbono e azoto assimilável e

D-serina,

Novembro de 1989

RESUMO

48.

Processo para a preparação de análogos da serina com actividade antibiótica

Descreve-se um processo para a preparaçao de compostos de fórmula geral e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que consiste em se de fórmula geral fazer reagir um composto com um aldeido ou uma cetona com 1 a 6 átomos de carbono para se obter uma imina que, em seguida, se submete a um tratamento com um agente de redução.

Os compostos obtidos deste modo possuem actividade antibiótica e são utilizáveis como antifúngicos.