PL161784B1 - Sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo/a/naftacenowegoR Z E C Z P O S P O L IT A POLSKA PL PL PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo/a/naftacenowegoR Z E C Z P O S P O L IT A POLSKA PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL161784B1
PL161784B1 PL89295767A PL29576789A PL161784B1 PL 161784 B1 PL161784 B1 PL 161784B1 PL 89295767 A PL89295767 A PL 89295767A PL 29576789 A PL29576789 A PL 29576789A PL 161784 B1 PL161784 B1 PL 161784B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibiotic
serine
antibiotics
culture
acetone
Prior art date
Application number
PL89295767A
Other languages
English (en)
Inventor
Yosuke Sawada
Masatoshi Kakushima
Maki Nishio
Takeo Miyaki
Toshikazu Oki
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of PL161784B1 publication Critical patent/PL161784B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P29/00—Preparation of compounds containing a naphthacene ring system, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/244—Anthraquinone radicals, e.g. sennosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Sposób wytwarzania serynopochod- nych antybiotyku benzo(a)naftacenowego o ogólnym wzorze 3, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, znamien- ny tym, ze hoduje sie szczep Actinomadura hibisca zdolny do wytwarzania tego antybio- tyku w osrodku zawierajacym przyswajalne zródla wegla i azotu oraz D- lub DL-seryne, w warunkach aerobowych, po czym wydzie- la sie antybiotyk z bulionu hodowlanego. Wzór 3 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo(a)naftacenowego wykazujących działanie grzybobójcze.
W literaturze znaleźć można kilka przykładów benzo(a)naftacenochinonów pochodzących ze źródeł drobnoustrojowych, w tym związków oznaczonych symbolami G-2N i G- 2A oraz KS-619-1. Podczas gdy w odniesieniu do G-2N i G-2A nie opisano aktywności biologicznej, to stwierdzono, że KS-619-1 jest inhibitorem jonu wapniowego i cyklicznej fosfodiesterazy nukleotydowej uzależnionej od kalmoduliny. W opublikowanym ostatnio europejskim zgłoszeniu patentowym nr 277 621 ujawniono antybiotyki o działaniu grzybobójczym, o ogólnym wzorze 1 i oznaczonych symbolami BU-3608 (la), BU-3608 B (Ib) oraz BU-3608 C (Ic). Antybiotyki benanomycyna A i B opisano w J. Antibiotics 1988,41:807-811. Stwierdzono, że benanomycyna B jest identyczna z BU-3608 C, podczas gdy benanomycyna A ma grupę hydroksylową zamiast aminowej grupy cukrowej.
Poszczególne postacie antybiotyku BU-3608 o ogólnym wzorze 1 przedstawiają się następująco:
R = CH3 r = h la: R’ = CH3; R” = β -D-ksylozyl Id: R’ = CH3; R” = β -D- ksylozyl
Ib: R’ = CH3; R” = H Ic: R’ = H; R” - β -D-ksylozyl
Ic: R’ = H; R” = β -D-ksylozyl.
W zgłoszeniu patentowym St. Zj. Ameryki nr 203 776 z 7 lipca 1988 ujawniono BU-3608 D (Id) oraz BU-3608 E (Ie). Związki o wzorze 2, w którym seryna3 oznacza D-serynę, R1 i R2 oznaczają niezależnie atomy wodoru lub grupy Ci-6 alkilowe, a r3 oznacza atom wodoru lub grupę β-D-ksylozylową, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole mają podobną budowę.
Grupa β-D-ksylozylowa oznacza fragment o wzorze 5.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo(a)naftacenowego o wzorze 3, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę metylową, albo ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, obejmującego hodowlę szczepu Actinomadura hibisca, zdolnego do wytwarzania antybiotyku o wzorze 3, w ośrodku zawierającym przyswajalne źródło węgla i azotu oraz D- lub DL-serynę, w warunkach aerobowych, oraz wydzielenie tego związku o wzorze 3 z bulionu hodowlanego.
Związek o wzorze 4 lub jego sól jest aglikonem BU-3608 FA-1 i FA- 2 i jest przydatny w syntezie macierzystych środków grzybobójczych oraz ich pochodnych.
Na fig. 1 przedstawiono widmo magnetycznego protonowego rezonansu jądrowego antybiotyku BU-3608 FA-1 w DMSO-ó (sześciodeutero-dwumetylosulfotlenku przy 400 MHz). Na fig. 2 przedstawiono widmo magnetycznego protonowego rezonansu jądrowego antybiotyku BU-3608 FA-2 w DMSO--6>x przy 400 MHz.
Antybiotyki wytwarzane sposobem według wynalazku są środkami o działaniu grzybobójczym. Związki o wzorze 3, to znaczy antybiotyki BU-3608 Fa-1 i BU-3608 FA-2 wytwa161784 rżane są w wyniki hodowli szczepu Actinomadura hibisca zdolnego do wytworzenia antybiotyków, jego wariantu lub jego mutanta w ośrodku zawierającym D- lub DL-serynę. Jako przykłady szczepów Actinomadura hibisca wytwarzających antybiotyki wymienić można szczep P157-2 oraz pochodzące od niego szczepy mutantowe, oznaczone jako A2660, A2493 i B0012. Szczep P157-2 wytwarzający antybiotyk BU-3608 FA-1, korzystnie w ośrodku uzupełnionym o źródło D-seryny, wydzielono z próbki gleby pobranej na wyspie Fidżi na Południowym Pacyfiku. Biologicznie czystą hodowlę Actinomadura hibisca szczep P157-2 zdeponowano w American Type Culture Collection w RockviUe, MD, gdzie wprowadzono ją pod symbolem ATCC 53557 do stałego zbioru drobnoustrojów. Szczegółowy opis hodowli i właściwości fizjologicznych szczepu P157-2 ujawniono w zgłoszeniu patentowym St. Zj. Ameryki nr 115 273 z 2 listopada 1987.
Szczepy mutantowe A2660, A2493 i B0012, zdolne do wytwarzania antybiotyku BU-3608 zarówno FA-1 jak i FA-2, w ośrodku zawierającym źródło D-seryny, otrzymano ze szczepu macierzystego P157-2 działając na ten szczep w ciągu 1 godziny N-metylo-N’- nitro-N-nitroguanidyną (1000 gg/ml). Szczepy wybrano w oparciu o ich zdolność do wytwarzania kompleksu antybiotyków BU-3608, to znaczy samego BU-3608 lub jego składników B, C, D i E, bez dodatkowego źródła D-seryny. Biologicznie czyste hodowle A2660, A2493 i B0012 zdeponowano w ATCC, gdzie przypisano im liczby 53762 (A2660), 53815 (A2493) i 53816 (B0012).
Charakterystyki hodowlane wyżej wymienionych szczepów Actinomadura hibisca wytwarzających antybiotyki przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
Charakterystyka hodowlana niektórych wytworzonych szczepów
Ośrodek Wzrost hodowli
P157-2 A-2660 A-2493 B-0012
Agar z ekstraktem drożdżowym i ekstraktem słodowym (ISP-2) ++ ++ ++ ++
Agar glicerynowo-asparaginowy (ISP-5) + ++ - ++
Agar sacharozowo-azotanowy + + - ++
Agar glikozowo-asparaginowy ++ ++ - ++
D-ryboza ++ ++ - ++
D-glikoza ++ ++ - ++
Sacharoza + + - ++
Celebioza ++ ++ - ++
Trebaloza ++ ++ - ++
Skrobia rozpuszczalna ++ ++ - ++
Inizytol + + - +
Salicyna + + - +
L-ramnoza + + - NT
D-mannoza + + - -
+ + : dobry wzrost; + : wzrost; -: brak wzrostu NT - me badano.
Należy zdawać sobie sprawę, że sposób wytwarzania antybiotyków BU-3608 FA-1 i FA-2 według wynalazku nie ogranicza się do konkretnych organizmów wspomnianych powyżej, ale obejmuje również zastosowanie wariantów i mutantów otrzymanych z tych szczepów różnymi metodami, takimi jak promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie nadfioletowe oraz zastosowanie mutanenów chemicznych. Dotyczy to również drobnoustrojów z grupy BU-3608 oraz ich wariantów i mutantów, zdolnych do przyswajania D-seryny.
Organizmy wytwarzające antybiotyki hoduje się w ośrodku pożywkowym zawierającym źródło D-seryny obok znanych źródeł odżywczych dla actinoraycetes, to znaczy przyswajalnych źródeł węgla i azotu oraz dodatkowych soli nieorganicznych i innych znanych czynników wzrostowych. Wytwarzanie antybiotyku w dużych ilościach prowadzi się korzystnie w warunkach aerobowych w zanurzeniu. Przy wytwarzaniu niewielkich ilości wykorzystywać można również hodowlę powierzchniową lub w butelkach.
W sposobie według wynalazku wykorzystuje się ogólne metody stosowane w hodowli innych actinomycetes.
Ośrodek pożywkowy powinien zawierać odpowiednie przyswajalne źródło węgla, takie jak ryboza, glikoza, sacharoza lub celobioza. Jako źródło azotu stosować można chlorek amonowy, siarczan amonowy, mocznik, azotan amonowy, azotan sodowy itp. same lub w kombinacji z organicznymi źródłami azotu, takimi jak pepton, ekstrakt mięsny, ekstrakt drożdżowy, ciecz z moczenia ziarna, mączka sojowa, mączka z nasion bawełny itp. Można również dodawać w razie potrzeby odżywkowe sole nieorganiczne zapewniające źródło sodu, potasu, wapnia, jonów amonowych, fosforanu, siarczanu, chlorku, bromku, węglanu cynku, magnezu, kobaltu, żelaza itp. Jako źródło D-seryny stosować można D-serynę lub DL-serynę.
Antybiotyki BU-3608 FA-1 i FA-2 wytwarzać można w dowolnej temperaturze zapewniającej prawidłowy wzrost wytwarzających je organizmów, to znaczy w 25-40°C, a najkorzystniej w temperaturze w zakresie 27-32°C. Zazwyczaj optymalne wytwarzanie antybiotyków uzyskuje się w wytrząsanych kolbach po okresie inkubacji 5-8 dni, choć w pewnych przypadkach wymagany okres może być dłuższy. Napowietrzanie w wytrząsanych kolbach uzyskać można przez mieszanie, stosując np. wytrząsanie w wytrząsarce rotacyjnej. Jeśli fermentacja ma być prowadzona w kadziach fermentacyjnych, pożądane jest przygotowanie zaczynu w pożywce bulionowej przez zaszczepienie hodowli bulionowej hodowlą stokową lub liofilizowaną hodowlą organizmów. Po uzyskaniu w ten sposób aktywnego zaczynu przenosi się go w warunkach aseptycznych do ośrodka w kadzi fermentacyjnej.
Wytwarzanie antybiotyków w kadziach fermentacyjnych osiąga zazwyczaj optimum po
3-6 dniach inkubacji. Zawartość kadzi fermentacyjnej miesza się za pomocą mieszadła, a napowietrzanie osiągnąć można wprowadzając powietrze lub tlen do mieszaniny. Wytwarzanie antybiotyku można śledzić technikami chromatograficznymi lub spektroskopowymi albo przeprowadzając zwykłe testy biologiczne.
Wydzielanie i oczyszczanie antybiotyków
Antybiotyki wytwarzane sposobem według wynalazku wydzielać można z pożywki bulionowej dowolnym odpowiednim sposobem. Ogólny schemat jednej z metod wydzielania z pożywki bulionowej i oczyszczaniu antybiotyków BU-3608 FA-1 i FA-2 przedstawiono na schemacie.
Postępując zgodnie z tym schematem technologicznym, pełny bulion fermentacyjny rozdziela się na placek micelamy i ciecz znad osadu zwykłym sposobem, takim jak wirowanie. Ciecz znad osadu zakwasza się a wydzielony w ten sposób osad odrzuca się. Przesącz doprowadza się do pH 5 w celu wytrącenia surowego antybiotyku, który ponownie rozpuszcza się w zalkalizowanej wodzie i sączy w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przesącz zakwasza się do pH 2 i poddaje chromatografii w kolumnie adsorpcyjnej zawierającej np. Diaion HP-20 uzyskując w ten sposób surowy kompleks antybiotyku BU-3608. Surowy kompleks antybiotyczny można rekrystalizować, np. z octanu etylu, a produkt rozdzielać na poszczególne składniki antybiotyczne z wykorzystaniem chromatografii cieczowej wysokiej sprawności (HPLC) na żelu krzemionkowym, z odwróceniem faz. Frakcje zawierające antybiotyki BU-3608 fA-1 i BU-3608 FA-2 można dalej oczyszczać metodą chromatografii na Diaion HP-20. Chlorowodorki antybiotyków można następnie przekształcać w postaci amfoteryczne, doprowadzając pH wodnego roztworu chlorowodorku do 5,5.
Antybiotyki BU-3608 FA-1 i FA-2 charakteryzują się następującymi właściwościami fizykochemic znym i.
161 784
Tabela 2
Właściwości fizykochemiczne antybiotyków BU-3608 FA-1 i FA-2
Wygląd BU-3608 FA-1 BU-3608 FA-2
bezpostaciowy proszek 0 barwie ciemno czerwonej bezpostaciowy proszek 0 barwie ciemno czerwonej
Temperatura topnienia: (rozkład) 215-220°C 186-190°C
(a)24: +919° (c 0,1,0, IN HC1) +79° (c 0,1,0,1N HC1)
Widmo masowe SIMS (m/z): 857 (M+H)+ 843 (M+H)+
Wzór sumaryczny: C40H44N2O19 C39H42N2O19
'h nmr zasadniczo jak przedstawiono zasadniczo jak przedstawiono
na fig. 1 na fig. 2
13cNMR/100MHz
DMSO-dte/: 16,3(q), 20,3(q), 36,4(q), 16,4(q), 20,4(q),
54,9(d), 56, 1(q), 61,6(t), 55,00, 56,2(q),
63,1(d), 65,9(q), 67,8(d), 61,7(t), 54,3(d),
69,3(d), 69,9(d), 71,7(d), 65,9(q), 67,3(d),
73,6(d), 75,8(d), 80,5(d), 69,40, 69,7(q),
82,1(d), 104, 1(d), 71,8(d), 73,5(d),
104,2(d), 105,2(d), 75,9(d), 79,l(d),
106,0(d), 110,3(s), 82,5(d), 104,2(d),
111,40, 117,l(d), 104,3(d), 105, 1(d),
119,0(s),119,2(s), 106,10, 110,4(s),
126,3(s), 132,l(s), 111,5^),117,20,
133,0(s), 136,8(s), 119,1(s), 119,3(s),
137,6(s), 137,9(s), 126,3(s), 132,1(s),
143,5(s), 158,0(s), 133,1(s), 136,8(s),
163,6(s), 165,8(s), 137,8(s), 138,6(s),
166,2(s), 168,5(s), 143,5(s), 158,2(s),
172,2(s), 180,2(s), 163,7(s), 165,8(s),
187,3(s), 166,2(s), 168,2(s), 172,3(s), 180,1(s), 187,4(s),
UV: Xmaxnm(e)
w 50% metanolu: 221(32,100),276(27,400) 223(27,700), 277(25,400)
499(12,900) 499(12,200)
w 0,01n HC1 w 234(37,400), 299(31,100) 234(34,500), 296(28,900)
50% metanolu 360(12,900) 460(12,000)
w 0,01n NaOH w 244(34,100), 320(15,700) 233(37,200), 319(16,600)
50% metanolu 498(14,900) 498(13,100)
Widmo IR(KBr)cm1: 3400,2920, 1605, 1385, 3400,2920, 1600,1385,
1295, 1260, 1160, 1040 1295, 1255, 1160,1040
Chromatografia cienkowarstwowa
S1O2, Rf: 0,26 0,22
(S-l 14, octan metylu-n-propanol-28%NH4OH 45:105:60 objętościowo) 8,61 7,65
HPLC - czas retencji, Rt (minuty)
DS, acetomiryl-0,15% KH2PO4, PH 3,5 (25:75)
161 784
Antybiotyki BU-3608 FA-1 i FA-2 można poddawać dalszej modyfikacji chemicznej. W wyniku ogrzewania BU-3608 FA-1 lub FA-2 albo ich mieszaniny w kwaśnym środowisku przez okres czasu niezbędny do odszczepienia grupy ksylozylowej uzyskuje się odpowiednie pochodne desksylozylowe oraz niewielkie ilości aglikonu o wzorze 4; stosowanym rozpuszczalnikiem może być np. dioksan, czterohydrofuran, woda, niższy alkohol lub mieszaniny tych rozpuszczalników. Katalizatorem kwasowym może być np. kwas solny, kwas siarkowy lub kwas trójfluorooctowy. Proces można prowadzić w temperaturze od około 60 do około 100°C lub w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika.
Czas reakcji może wynosić od około 0,5 do około 10 godzin i zależy od warunków reakcji. N,N-dwumetylo-BU-3608 FA-2 otrzymany metodą redukcyjnego alkilowania opisaną poniżej przekształcać można w podobny sposób w odpowiedni związek desksyłozylowy. Stwierdzono, że w wyniku hydrolizy kwasowej N,N-dwumetylo-BU-3608 FA-2 uzyskuje się z praktyczną wydajnością aglikon o wzorze 4.
Grupę aminową w antybiotykach BU-3608 FA-1 i FA-2 oraz w ich odpowiednich pochodnych desksylozylowych można alkilować metodą alkilowania redukcyjnego poddając najpierw wyjściową substancję antybiotyczną reakcji z aldehydem lub ketonem, z wytworzeniem iminy, a następnie redukując uzyskaną w ten sposób iminę. Kondensację i redukcję przeprowadzić można w tym samym reaktorze w jednym etapie lub w dwóch odrębnych etapach.
Pierwszorzędową grupę aminową w BU-3608 FA-2 lub w jego pochodnych desksylozylowych przekształcić można w trzeciorzędową grupę aminową zawierającą dwie identyczne grupy alkilowe działając na antybiotyk co najmniej dwoma równoważnikami związku karbonylowego, a następnie prowadząc redukcję. Trzeciorzędową aminę zawierającą dwa różne podstawniki alkilowe otrzymać można stosując odpowiednią ilość pierwszego związku karbonylowego w celu przekształcenia aminy pierwszorzędowej w aminę drugorzędową, którą poddaje się następnie reakcji z drugim, innym związkiem karbonylowym, w celu otrzymania aminy trzeciorzędowej. Jeśli nie dodaje się drugiego związku karbonylowego, uzyskuje się aminę drugorzędową.
Reagentem karbonylowym może być aldehyd lub keton zawierający od 1 do 6 atomów węgla, np. formaldehyd, aldehyd octowy, aldehyd propionowy lub aceton. Redukcję iminy przeprowadzić można za pomocą redukujących, takich jak wodorki metali, np. za pomocą borowodorku sodowego, cyjanoborowodorku sodowego i wodorku litowo-glinowego. Reakcję prowadzi się w polarnym rozpuszczalniku organicznym lub w mieszaninie rozpuszczalników, takich jak woda, acetonitryl, niższe alkohole oraz dwumetylosulfotlenek. Temperatura reakcji nie jest szczególnie ograniczona i może być to temperatura w zakresie od temperatury pokojowej do około 100°C.
Wyniki doświadczeń wykazały, że reakcja alkilowania prowadzona w temperaturze pokojowej przebiega zazwyczaj do końca w ciągu 24 godzin. Optymalne warunki reakcji będą oczywiście zależały od rodzaju i reaktywności stosowanych konkretnych reagentów. Oczywiste jest, że N,N-dwumetylo-BU-3608 FA-2 otrzymać można z BU-3608 FA-1 lub FA-2 albo ich mieszaniny nie rozdzielonej na poszczególne składniki. Podobnie, Ν,Ν-dwumetylo- desksylozylo-BU-3608 FA-2 otrzymać można z desksylozylo-BU-3608 Fa-1 lub FA-2 albo i ich mieszaniny.
Aktywność biologiczna
Działanie grzybobójcze reprezentatywnych antybiotyków wytwarzanych sposobem według wynalazku oceniano zarówno w próbach in vitro jak i in vivo. Minimalne stężenia hamujące (MIC) w stosunku do różnych grzybów określano metodą kolejnych rozcieńczeń przy zastosowaniu agaru dekstrozowego Sabouraud’a. Około 0,003 ml zawiesiny grzybów zawierającej 106 komórek/ml wprowadzano na powierzchnię płytek agarowych zawierających badany antybiotyk. Wielkości MIC rejestrowano po inkubacji hodowli przez 40 godzin w 28°C. Wyniki podano w tabeli 3.
161 784
Tabela 3
Działanie grzybobó)cze m vitro w agarze dekstrozowym Sabouraud’a (ph 7,0) MIC (gg/ml)
Badany organizm BU-3608 FA-1 BU-3608 FA-2 N,N- dwumetylo- BU-3608 FA-2 Des- ksylozylo- BU-3608 FA-1 Des- ksylozylo- BU-3608 FA-2 Dcs- ksylozylo- N,-N-dwu- metylo- BU-3608 FA-2
Candida albicans IAM4888 6,3 6,5 3,1 3,1 3,1 6,3
C. Albicans A9540 12,5 6,3 6,3 3,1 3,1 6,3
Cryptococcus neoformans D49 0,8 0,8 0,8 1,6 3,1 1,6
C. neoformans IAM4514 0,8 0,8 0,8 1,6 3,1 1,6
Aspergillus fumigatus
IAM2530 3,1 3,1 3,1 6,3 12,5 6,3
A. fumigatus 1AM2034 6,3 6,3 3,1 6,3 12,5 6,3
A. flavus FA21436 6,3 6,3 25,0 50 50 12,5
Fusarium momliforme A2284 6,3 6,3 25,0 >100 >100 50
Trichophyton mentagrophytes
D155 6,3 6,3 12,5 12,5 12,5 6,3
T. mentagrophytes ψ Ψ 4329 6,3 6,3 6,3 12,5 12,5 6,3
Blastomyces dermatitidis D40 3,1 3,1 6,3 6,3 6,3 3,1
Sporothrix schenckn IF08158 1,6 1,6 1,6 6,3 6,3 3,1
Petnellidium boydu IF08073 12,5 25,0 ND >100 >100 100
Mucor spinosus IF05317 >100 >100 ND 12,5 25 25
ND: nie badano
Działanie grzybobójcze in vivo oceniano w przypadku dożylnych infekcji Candida albicans A9540, Cryptococcus neoformans IAM514 i Aspergillus fumigatus IAM2034 u myszy. Candida albicans i Cryptococcus neoformans hodowano odpowiednio przez 18 i 48 godzin w 28°C w ośrodku YGP [ekstrakt drożdżowy (0,2%), glikoza (1,5%), pepton (0,5%), K2HPO4 (0,05%) i MgSO4 (0,05%)J, a następnie dyspergowano w roztworze soli. Aspergillus fumigatus hodowano przez 7 dni w 28°C na stoku agaru YGP, a następnie dyspergowano w roztworze soli. Spory oddzielono sącząc zawiesinę grzybów przez gazę. Samce myszy 1CR o wadze 20-24 g infekowano dożylnie grzybami w dawce około 10 razy większej od średniej dawki śmiertelnej. Badane związki podawano grupie 5 myszy w, różnych dawkach dożylnych albo raz tuż po zainfekowaniu grzybami (dzień 0) albo raz dziennie przez 5 dni od dnia 0 do dnia 4 (qd x 5). 50% dawkę ochronną (PD50) wyliczano na podstawie dawek powodujących przeżycie myszy, przy rejestracji w 20 dniu po zainfekowaniu grzybami. Wszystkie zwierzęta kontrolne zmarły w ciągu 7-15 dni od zainfekowania grzybami.
Wyniki prób in vivo przedstawiono w tabeli 4.
Tabela 4
Działanie in vivo przy dożylnych infekcjach Candida, Cryptococcus 1 Aspergillus PD50 (mg/kg przy wstrzykiwaniu dożylnym)
C. albicans C. neoformans A. fumigatus
pojedynczo qdx5 pojedynczo qdx5 poiedynczo qdx5
BU-3608 FA-1 18
BU-3608 FA-2 7,4 - - - - -
N,N-dwumetylo- -
BU-3608FA-2 9,0 7,5 11 2,8 36 15
161 784
LDso (50% dawka śmiertelna) dla N,N-dwumetylo-BU-3608 FA-2 określano w przypadku myszy stosując pojedynczą dawkę dożylną. Przy 600 mg/kg, największej stosowanej dawce, nie zaobserwowano toksyczności powodującej śmierć ani żadnych wyraźnych objawów toksyczności.
Przy leczeniu infekcji grzybowych u zwierząt i ludzi antybiotyki wytwarzane sposobem według wynalazku podawać można w grzybobójczo skutecznej ilości dowolnym, odpowiednim sposobem. Dotyczy to, ale nie wyłącznie, podawania dożylnego, domięśniowego, doustnego, donosowego, a w przypadku infekcji powierzchniowych, stosowania miejscowego. Do środków do podawania pozajelitowego należą sterylne, wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Środki można również wytwarzać w postaci sterylnych stałych kompozycji, które rozpuszcza się w sterylnej wodzie, fizjologicznym roztworze soli lub w pewnych innych sterylnych nośnikach do zastrzyków, bezpośrednio przed użyciem. Środki doustne mogą być w postaci tabletek, kapsułek, żelatynowych proszków, pastylek, syropów itp. Przy podawaniu miejscowym związki można wprowadzać do płukanek, maści, żeli, kremów, balsamów, nalewek itp. Wytwarzać można leki w postaci dawek jednostkowych, wykorzystując przy tym metody powszechnie stosowane w technice farmaceutycznej.
Jest oczywiste, że przy leczeniu osobnika zainfekowanego grzybem wrażliwym na antybiotyki wytwarzane sposobem według wynalazku, konkretny korzystny sposób podawania oraz dawka, będą ustalane przez lekarza - specjalistę w dziedzinie infekcji grzybowych, przy czym będzie to zależne od takich czynników, jak organizm powodujący infekcję, jego wrażliwość na antybiotyki, ostrość i miejsce infekcji oraz cechy pacjenta, takie jak wiek, masa ciała, szybkość wydalania, leczenie konkurencyjne oraz ogólny stan fizyczny.
Następujące przykłady ilustrują sposób według wynalazku bez ograniczenia jego istoty.
Przykład I. Wytwarzanie antybiotyku BU-3608 FA-1 na drodze fermentacji.
a) Stok agarowy. Actinomadura hibisca P157-2 (ATCC 53557) hodowano na stoku agarowym o pH 7,0, o następującym składzie:
0,5% skrobi rozpuszczalnej 0,5% glikozy
0,1% ekstraktu mięsa rybiego 0,1% ekstraktu drożdżowego 0,2% NZ-case *
0,2% NaCl
0,l%CaCO3 1,6% agaru
Hodowlę inkubowano w 28°C przez 10 dni.
b) Hodowla zaczynu. Część hodowli drobnoustrojów z hodowli na stoku przeniesiono do
500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml pożywki o pH 7,0, o składzie:
% glikozy 3 % mączki sojowej 0,5% Pharmamedia 0,1% ekstraktu drożdżowego 0,3% CaCO3
Hodowlę inkubowano w 32°C przez 6 dni w wytrząsarce obrotowej obracającej się z szybkością 200 obrotów/minutę.
c) Hodowla produkcyjna. 5 ml hodowli drobnoustrojów przeniesiono z hodowli zaczynu do 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml sterylnej pożywki o składzie:
3% glikozy 3% mączki sojowej 0,5% Pharmamedium 0,1% ekstraktu drożdżowego 0,3% CaCO3 0,25% D-seryny *nazwa handlowa roztwarzalnego produktu kazeinowego f-my Scheffield Chemical Co., stanowiącego źródło azotu w procesie fermentacji.
161 784
Hodowlę inkubowano w 28°C przez 6 dni na wytrząsarce obrotowej obracającej się z szybkością 200 obrotów/minutę. Uzyskano antybiotyk w ilości 443 pgml, zawierający 72,9% BU-3608 FA-1, 26,0% BU-3608 i 1,1% BU-3608C. Wytwarzanie antybiotyku określono mierząc gęstość optyczną cieczy z bulionu fermentacyjnego przy 500 i 600 nm. Rzeczywistą gęstość optyczną wyznaczano odejmując gęstość optyczną (GO) przy 600 nm od GO przy 500 nm. Stężenie antybiotyku podawano w przeliczeniu na zawartość wolnej zasady BU-3608. Antybiotyki identyfikowano metodą HPLC opisaną w przykładzie V.
Przykład Π. Wytwarzanie antybiotyku BU-3608 FA-1 i FA-2 na drodze fermentacyjnej z zastosowaniem szczepu A-2493.
Hodowlę na stoku agarowym oraz hodowlę zaczynu argininowego auksotrofowego mutanta Actinomadura hibisca P157-2 oznaczonego jako szczep A-2493 (ATCC 53815) prowadzono w ośrodkach o składach podanych w przykładzie I, w warunkach podanych w przykładzie I.
Sposób A. 5 ml hodowli drobnoustrojów przeniesiono z hodowli zaczynu do 100 500 ml kolb Erlenmeyera, z których każda zawierała 100 ml pożywki opisanej w przykładzie I (c). Hodowlę inkubowano w 28°C przez 6 dni na wytrząsarce rotacyjnej obracającej się z szybkością 200 obrotów/minutę. Uzyskano antybiotyk w ilości 261 gg/ml, o składzie 29,8% bU-3608 FA-1, 28,9% BU-3608 FA-2,19,5% BU-3608C i 21,8% BU-3608.
Sposób B. Wytwarzanie antybiotyku przez szczep A2493 prowadzono również w ośrodku o pH 7,0, o składzie:
3% glikozy
3% białka S (mączka sojowa, Ajinomoto)
0,3% CaCOs 0,5% DL-seryny
Uzyskano antybiotyk w ilości 890 gg/ml po inkubowaniu hodowli przez 11 dni w 28°C. Skład antybiotyku był następujący: 17,7 BU- 3608 FA-2,17,0% FA-1,33,5% BU-3608 i 31,8% BU-3608 C.
Przykład ΠΙ. Wytwarzanie antybiotyków BU-3608 FA-1 i FA-2 na drodze fermentacji z zastosowaniem szczepu B-0012.
Sposób A. W warunkach i ośrodkach hodowli opisanych w przykładzie I, części a), b) i c) zastosowano wariantowy szczep oznaczony jako B-0012(AtCC 53816)zamiast szczepu macierzystego P157-2. Po 6 dniach uzyskano antybiotyk w ilości 1150 pg/ml, o składzie: 33,7% BU-3608 FA-1,21,2% FA-2, 24,0% BU-3608 oraz 21,1% BU-3608 C.
Sposób B. Część hodowli drobnoustrojów przeniesiono z hodowli na stoku szczepu B-0012 do 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml ośrodka o pH 7,0, o następującym składzie:
1% skrobi rozpuszczalnej 1% glikozy
0,5% ekstraktu drożdżowego 0,5% peptonu 0,3% NaCl 0,2% CaCO3
Hodowlę zaczynu prowadzono w 32°C przez 6 dni, po czym 5 ml hodowli drobnoustrojów przeniesiono do 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml pożywki hodowlanej o pH 7,0, zawierającej:
3% glikozy
3% białka S (mączka sojowa, Ajinomoto)
0,3% CaCOs 0,25% D-seryny
Hodowlę prowadzono w 28°C przez 11 dni; uzyskano 1970 pg/ml antybiotyku o składzie: 20,0% BU-3608 FA-2, 10,0% FA-1, 39,0% BU- 3608 C oraz 31,0% BU-3608.
Przykład IV. Wytwarzanie antybiotyków BU-3608 FA-1 i FA-2 na drodze fermentacji z zastosowaniem szczepu A-2660.
Stok agarowy i hodowlę zaczynu szczepu mutantowego Actinomadura hibisca A-2660 (ATCC 53762) uzyskano w warunkach i w ośrodkach podanych w częściach a) i b) w przykładzie I. 5 ml hodowli zaczynu przeniesiono do 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml pożywki hodowlanej o składzie:
3% glikozy 3% mączki sojowej 0,5% Pharmamedia 0,1% ekstraktu drożdżowego 0,3% CaCCb 0,5% DL-seryny
Hodowlę prowadzono w 28°C przez 7 dni. Uzyskano 620 gg/ml antybiotyku o składzie: 17,0% BU-3608 FA-1,15,6% FA-2, 23,9% BU- 3608,24,7% BU-3608 C, 8,3% D i 10,5% E.
Przykład V. Wydzielanie antybiotyków BU-3608 FA-1 i FA-2 z bulionu fermentacyjnego oraz ich oczyszczanie.
dm3 bulionu fermentacyjnego otrzymanego sposobem A według przykładu Π rozdzielono na placek micelamy i ciecz znad osadu przez wirowanie. Ciecz znad osadu zakwaszono do pH 2,0 za pomocą 6n kwasu solnego, po czym wytrącony bezpostaciowy osad odsączono. Klarowny przesącz doprowadzono do pH 5,0 za pomocą 6n NaOH i pozostawiono w 5°C na 2 godziny. Wytrącony osad o barwie ciemno czerwonej odsączono. Osad ten rozpuszczono w 4,1 dm3 wody doprowadzonej do pH 9,0 za pomocą 6n NaOH i uzyskany roztwór przesączono w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Przesącz doprowadzono do pH 2,0 i wprowadzono do kolumny zawierającej 2,0 dm3 Diaion HP-20. Kolumnę przemyto wodą i eluowano 60% uwodnionym acetonem o pH 3,0. Po zatężeniu eluatu o barwie czerwonej uzyskano 3,lg bezpostaciowej substancji stałej - chlorowodorku kompleksu BU-3608. 3,0g tego kompleksu rozpuszczono w 120 ml metanolu, po czym przesączono. Do mieszanego przesączu wkroplono 720 ml octanu etylu i uzyskany roztwór pozostawiono na 15 godzin w 5°C. Wytrącony osad odsączono i wysuszono uzyskując l,28g substancji stałej.
l,28g tej substancji rozpuszczono w 100 ml wody i poddano chromatografii z odwróceniem faz w kolumnie zawierającej 10 dm3 YMC GEL ODS A 60 (Yamamura Chemical,Lab.) wysyconego do stanu równowagi mieszaniną 21:79 CH3CN-O, 15% KH2PO4 o pH 3,5. Do eluowania stosowano tę samą mieszaninę rozpuszczalników zbierając frakcje eluatu po 1 dm3. Frakcje analizowano metodą HPLC (kolumna: YMC Ά-301-3, średnica wewnętrzna 4,6 mm x 100 mm, 3 gm, ODS Yamamura Chemical Lab.) faza ruchoma: CH3CN-O, 15% KH2PO4 (25:75), o pH 3,5; szybkość przepływu: 0,8 ml/minutę; detekcja: absorpcja w nadfiolecie przy 254 nm; czas retencji: BU-3608 FA-2 - 7,65 minuty; bU-3608 FA-1 - 8,61 minuty, BU-3608 A 19,11 minut. Frakcje zawierające jednorodny BU-3608 FA-2 lub BU-3608 FA-1 połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia CH3CN. Każdy z koncentratów odsolono metodą chromatografii na Diaion HP-20 uzyskując prawie jednorodny chlorowodorek BU-3608 FA-2 w ilości 75 mg i chlorowodorek BU-3608 fA-1 w ilości 50 mg.
W celu przekształcenia chlorowodorku w postać wolną i usunięcia soli nieorganicznych stanowiących zanieczyszczenie, wodny roztwór każdej z soli doprowadzono do pH 5,5 za pomocą 0,ln NaOH w celu wytrącenia czystej postaci amfoterycznej BU-3608 FA-2 w ilości 48 mg i BU-3608 FA-1 w ilości 11 mg.
Przykład VI. Wytwarzanie N,N-dwumetylo-BU-3608 FA-2.
510 mg mieszaniny BU-3608 FA-1 i BU-3608 FA-2 w stosunku 45:55 rozpuszczono w 50 ml wody, po czym roztwór doprowadzono do pH 7,9 za pomocą ln wodorotlenku sodowego i rozcieńczono 50 ml acetonitrylu. Do roztworu tego dodano kolejno 1,6 ml ponad 35% formaliny i 240 mg cyjanoborowodorku sodowego w temperaturze pokojowej. Roztwór mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej śledząc przebieg reakcji metodą HPLC. Rozpuszczalnik organiczny usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a wodną pozostałość doprowadzono do pH 10,9.40 ml roztworu wkroplono do 240 ml acetonu z mieszaniem, po czym pozostawiono na 2 godziny w 5°C. Wytrącony osad odwirowano i ponownie rozpuszczono w 40 ml wody. Po usunięciu śladów acetonu pod zmniejszonym ciśnieniem roztwór doprowadzono do pH 5,0 i pozostawiono na 24 godziny w 5°C. Wytrącony osad odwirowano, przemyto kolejno wodą i acetonem, po czym wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 60°C uzyskując 80 mg amfoterycznego N,N-dwumetylo-FA-2 o temperaturze topnienia 214-218°C (z rozkładem);
UV λ™ NaOH nm (ε) 232,8 (32 900), 320,0 (15 500), 498,4 (15 200).
Przykład VH. Wytwarzanie desksylozylo-BU-3608 FA-1.
Roztwór 54 mg BU-3608 FA-1 w 5,4 mg dioksanu i 5,4 ml ln HCL ogrzewano w stanie wrzenia na łaźni parowej przez 8 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 30 ml wody i wprowadzono do krótkiej kolumny o wymiarach 1,8 x 25 cm z Diaion HP-20 (Mitsubishikesei). Kolumnę przemyto wodą, po czym eluowano kwaśnym 80% acetonem o pH 3, zakwaszonym ln HCL. Zebrano eluat o barwie czerwonawo-pomarariczowej, który odparowano uzyskując proszek o barwie ciemno-czerwonej. Proszek rozpuszczono w 35% acetonitrylu w buforze fosforanowym o pH 3,5, po czym chromatografowano w kolumnie o wymiarach 2,1 x 25 cm z YMC-ODS. Do eluowania zastosowano ten sam rozpuszczalnik. Frakcje zawierające pożądany produkt połączono i przepuszczono przez kolumnę z HP-20. Kolumnę przemyto wodą i eluowano 80% acetonem o pH 3. Po odparowaniu eluatu uzyskano proszek o barwie ciemno czerwonej, który rozpuszczono w 8 ml wody i roztwór doprowadzono do pH 5,3 za pomocą 0, ln NaOH. Wytrącony osad odwirowano, przemyto acetonem i wysuszono uzyskując 23,3 mg (51 %) proszku o barwie ciemno czerwonej o temperaturze topnienia ponad 180°C (z rozkładem). Czystość oznaczona metodą HPLC - ponad 95%. IR: v max (KBr) cm'1: 3400, 1605, 1290, 1255, 1060. UV: λ (0,01n NaOH) nm ( ε): 212 (35 400), 319 (15 300), 298 (14 500). !H NMR (400 MHz, DMSO-de): 1,26 (3H, d, J=6Hz, 6’-CHs), 2,32 (3H, s, CH5-CH3), 2,65 (3H, s, NCH3), 3,75 (2H, m, OCH2), 3,91 (3H, s, OCH3), 4,68 (1H, d, J=8Hz, l’-H), 6,72 (1H, d, J=2Hz, 10-H), 6,87 (1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=2Hz, 12-H), 7,71 (1H, s, 7-H).
Przykład VIII. Wytwarzanie desksylozylo-BU-3608 FA-2.
Roztwór 54 mg BU-3608 FA-2 w 5,4 ml dioksanu i 5,4 ml ln HCL ogrzewano w stanie wrzenia na łaźni parowej przez 8 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 30 ml wody, zaabsorbowano w krótkiej kolumnie o wymiarach 1,8 x 25 cm z Diaion HP-20 (Mitsubishikasei), którą przemyto wodą i eluowano 80% acetonem o pH 3. Eluat o barwie cynobru połączono i zatężono, a pozostałość rozpuszczono w 8 ml wody. Roztwór doprowadzono do pH 5,3 za pomocą 0,ln NaOH, po czym wytrącony osad odwirowano, przemyto acetonem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 37,7 mg (85%) proszku o barwie ciemno czerwonej, o temperaturze topnienia ponad 180°C (z rozkładem). Czystość oznaczona metodą HPLC 8 ponad 95%. IR: λ max (KBr) cm'1 3400,1605, 1290. 1265,1035 UV: λ max (0,01n NaOH) nm (ε): 214 (33 000), 234 (32 300), 319 (14 900), 498 (14 100). 1H NMR (DMSO-de): 1,15 (3H, d, J=7Hz, 6’-CH3), 2,32 (3H, s, C6H5-CH3), 3,75 (2H, m, OCH2), 3,91 (3H, s, OCH3), 4,67 (1H, d, J=8Hz, Γ-Η), 6,72 (1H, d, J=3Hz, 10-H), 6,93 (1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=3Hz, 12-H), 7,71 (1H, s, 7-H).
Przykład IX. Wytwarzanie desksylozylo-N,N-dwumetylo-BU- 3608 FA-2.
Sposób A. Roztwór 50 mg N,N-dwumetylo-BU-3608 FA-2 (produktu z przykładu VI) w 5 ml dioksanu i 5 ml ln HCL ogrzewano w stanie wrzenia na łaźni parowej przez 8 godzin. Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury otoczenia i przesączono uzyskując 7,2 mg osadu. Przesącz wprowadzono do suchej kolumny o wymiarach 4 x 30 cm z żelem krzemionkowym Merck Kieselgel 60, którą eluowano mieszaniną n-butanol-kwas octowy-woda 3:1:1. Eluat zbierano w porcjach po 10 ml. Frakcje 2-14 oraz uzyskany wcześniej osad poddano obróbce w sposób opisany w przykładzie X. Frakcje 21-32 połączono i wprowadzono do kolumny o wymiarach 1,8 x 25 cm z HP- 20. Kolumnę przemyto wodą i eluowano 80% acetonem o pH 3. Po zatężeniu eluatu o barwie cynobru uzyskano osad, który oczyszczono kolejno w kolumnie chromatograficznej ODS (YMC-ODS, 2 x 37 cm, eluowanie 20% CH3CN w buforze fosforanowym o pH 3,5) oraz w kolumnie chromatograficznej z Diaion HP-20 (1,8 x 25 cm, eluowanie 80% acetonem o pH 3) uzyskując 7,8 mg (17%) tytułowego związku w postaci proszku o barwie ciemno czerwonej. Temperatura topnienia: ponad 180°C (z rozkładem); czystość metodą HPLC: ponad 95%. IR: λ max (KBr) cm 1 3400, 1730, 1610, 1380, 1260, 1070. UV:Xmax (0,01n NaOH) nm (ε ): 211 (38 100),318(14 200),496(12 500). ’Η NMR (DMSO-ds): 1,23 (3H,d, J=7Hz, 6’-CH3), 2,29 (3H, s, C6H5-CH3), 2,75 (6H, s, NOH3), 3,74 (2H, m, OCH2), 3,91 (3H, s, OCH3), 4,60 (1H, d, J-8Hz, l’-H), 6,73 (1H, d, J=3Hz, 10- H), 6,89 (1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=3Hz, 12-H), 7,77 (1H, s, 7- H).
Sposób B. Roztwór 71 mg desksylozylo-BU-3608 FA-2 (produktu z przykładu VIII) w 7 ml wody i 7 ml acetonitrylu doprowadzono do pH 7 za pomocą 0,ln NaOH. Do roztworu tego dodano 0,3 ml 35% formaliny i 45 mg cyjanoborowodorku sodowego w temperaturze pokojowej.
161 784
Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc, po czym rozpuszczalnik organiczny usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Wodną pozostałość doprowadzono do pH 10 za pomocą NaOH i wkroplono do 70 ml acetonu. Osad wytrącony odsączono i rozpuszczono w wodzie o pH 2,5. Roztwór wprowadzono do kolumny o wymiarach 1,8 x 25 cm z Diaion HP-20, którą przemyto wodą i rozwijano zakwaszonym acetonem (pH 3, zakwaszony ln HCL). Eluat o barwie ciemno czerwonej zebrano, zatężono do około 5 ml i doprowadzono do pH 5,3 za pomocą rozcieńczonego NaOH, po czym wkroplono do 70 ml acetonu. Wytrącony osad odsączono i ponownie wytrącono z uwodnionego acetonu uzyskując 66 mg (90%) tytułowego związku w postaci proszku o ciemno czerwonej barwie, identycznego pod każdym względem z produktem uzyskanym sposobem A. Czystość metodą HPLC: ponad 95%.
Przykład X. Aglikon BU-3608 FA.
Frakcje 2-14 eluatu z kolumny z żelem krzemionkowym z przykładu IX (sposób A) połączono i zatężono do sucha uzyskując proszek. Proszek oraz osad wytrącony z przykładu IX (sposób A) rozpuszczono w 0,01n NaOH i wprowadzono do kolumny o wymiarach 1,8 x 25 cm z Diaion HP-20, którą przemyto wodą i eluowano 80% acetonem o pH 3. Eluat o barwie cynobru połączono i aceton odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując zawiesinę. Zawiesinę zakwaszono do pH 3 za pomocą ln HCL i wyekstrahowano butanolem. Po zatężeniu ekstraktu butanolowego uzyskano 11,5 mg (33%) aglikonu w postaci bezpostaciowego proszku o barwie ciemno czerwonej. Temperatura topnienia ponad 200°C (z rozkładem). Czystość metodą HPLC: ponad 95%. IR: νπ^ΚΒΟοη'’: 3240,1720,1605,1340,1305,1185. UV: Xmax (0,01n NaOH) nm (ε): 212 (34 500), 319 (15 200), 498 (14 000). 1 H NMR (DMSO-de): 2,34 (3H, s, C6H5CH3), 3,73 (2H, m, OCH2), 3,91 (3H, s, OCH3), 4,24 (2H, AB-q, J=llHz, 5H i 6-H), 4,46 (1H, m, N-OH -COOH), 6,92 (1H, d, J=2Hz, 10-H), 7,06 (1H, s, 4-H), 7,28 (1H, d, J=2Hz, 12H), 8,08 (1H, s, 7-H).
Przykład XI. Ogólnym sposobem opisanym w przykładzie VI przy zastosowaniu reagentów podanych poniżej uzyskano następujące alkilowane analogi antybiotyków BU-3608 FA-1 iFA-2.
A + B-------> związek o ogólnym wzorze 2
A B Π
BU-3608 FA-1 aldehyd octowy (1 równoważnik)* R3= β-D-ksylozyl, R^Cł-b, R2=CH3OH2
rt aldehyd propionowy (1 równoważnik) r3= P-D-ksylozyk R^Clfe, R2=CH3CH2CH2-
tt aceton (1 równoważnik) r3= e-D-ksytozyk R^Cft, r2=-CH(CH3)2
BU-3608 FA-2 aldehyd octowy (1 równoważnik) R3= β-D-ksylozyl, rCr2:^CH3CH2-
II aceton (1 równoważnik) r3= p-D-ksylozyk rJ=h, R2=CH(CH3)2
tt aldehyd propionowy (1 równoważnik) R3= β-D-ksylozyl, R*= r2=CH3OH2OH2-
aldehyd masłowy (1 równoważnik) r3= e-E>-ksylozyl, R^H, R2=CH3(CH2)3-
Desksylozylo- aldehyd octowy r3=h, r-=ch3,
BU-3608 FA-1 (1 równoważnik) r2=CH3CH2-
tt aldehyd propionowy (1 równoważnik) r3=h, r^cu, r2=CH3OH3CH2-
161 784 (ciąg dalszy)
A B II
tl aceton R3=H, R=CH3,
(1 równoważnik) R2=CH(CH3)2
Desksylozylo- aldehyd octowy rŁh, r1=r2=
BU-3608 FA-2 (1 równoważnik) =CH3CH2-
It aceton r3=H, R^H
(1 równoważnik) R2=-OH(CH3)2
It aldehyd propionowy r3=H, r‘=R2=
(2 równoważniki) CH3CH2CH2-
Desksylozylo- aldehyd masłowy r3=H, r]=H,
BU-3608 FA-2 (1 równoważnik) r2=CH3(CH2)3-
* minimalna ilość w stosunku do reagenta BU-3608.
............
11
Fig. 2
PPM
Fig .1
161 784
Oscd
Bulion fermentacyjny .______________| rozdzielanie_
Ciecz znad osadu Placek micelarny · doprowadzani pH do 2,0 2 .filtracja
Przesącz |1. doprowadzanie pH do 5,0 2.filtracja
Przesącz
Osad
1. rozpuszczanie w wodzie i doprowadzanie pH do 9,0
2. filtracja
Przesącz Zanieczyszczenia
1. doprowadzanie pH do 2,0 2 chromatografia w kolumree z HP 20 Diaion
Surowy kompleks chlorowodorkow BU-3608
11. rozpuszczan'ie w metanolu 2 filtracja λ I
Przesącz | octan etytu
Przesącz
Zanieczyszczenia
Oad
1. rozpuszczanie w wodzie
2. chromatografia na żelu krzemionkowym z odwróceniem faz
Chlorowodorek innych składników kompleksu BU-3608
Chlorowodorek BU-3608 FA-1 | KP-20
Jedno rodny chlorowodorek BU-3608 FA-1 doprowad zanie pH do 5,5
BU-3608 FA-1
Chlorowodorek BU-3608 FA-2 | HP-20
Jednorodny chlorowodorek BU-3608 FA-2 doprowadzanie pH do 5,5
BU-3608 FA-2
161 784
Wzór 4
Wzór 5
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 10 000 zł

Claims (1)

  1. Zastrzeżenie patentowe
    Sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo(a)naftacenowego o ogólnym wzorze 3, w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę metylową, znamienny tym, że hoduje się szczep Actinomadura hibisca zdolny do wytwarzania tego antybiotyku w ośrodku zawierającym przyswajalne źródła węgla i azotu oraz D- lub DL-serynę, w warunkach aerobowych, po czym wydziela się antybiotyk z bulionu hodowlanego.
PL89295767A 1988-11-10 1989-11-09 Sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo/a/naftacenowegoR Z E C Z P O S P O L IT A POLSKA PL PL PL PL PL PL161784B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/269,821 US4973673A (en) 1988-11-10 1988-11-10 Serine analogs of BU-3608 antibiotics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL161784B1 true PL161784B1 (pl) 1993-07-30

Family

ID=23028793

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL89295767A PL161784B1 (pl) 1988-11-10 1989-11-09 Sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo/a/naftacenowegoR Z E C Z P O S P O L IT A POLSKA PL PL PL PL PL
PL89282227A PL161779B1 (pl) 1988-11-10 1989-11-09 Sposób wytwarzania serynopochodnych zwiazku benzo /a/ naftacenowego PL PL PL PL PL

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL89282227A PL161779B1 (pl) 1988-11-10 1989-11-09 Sposób wytwarzania serynopochodnych zwiazku benzo /a/ naftacenowego PL PL PL PL PL

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4973673A (pl)
EP (1) EP0368349B1 (pl)
JP (1) JP2817064B2 (pl)
KR (1) KR930006995B1 (pl)
CN (1) CN1044299A (pl)
AT (1) ATE94556T1 (pl)
AU (1) AU628418B2 (pl)
CA (1) CA2001714C (pl)
CY (1) CY1884A (pl)
DE (1) DE68909170T2 (pl)
DK (1) DK173464B1 (pl)
EG (1) EG19153A (pl)
ES (1) ES2059681T3 (pl)
FI (1) FI98147C (pl)
HK (1) HK151595A (pl)
IE (1) IE63305B1 (pl)
IL (1) IL92240A (pl)
MY (1) MY110238A (pl)
NO (1) NO172393C (pl)
OA (1) OA09246A (pl)
PL (2) PL161784B1 (pl)
PT (1) PT92263B (pl)
ZA (1) ZA898566B (pl)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5109122A (en) * 1987-11-02 1992-04-28 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Antibiotics, dexylosylbenanomicin B
US5061624A (en) * 1988-11-10 1991-10-29 Bristol-Myers Company Serine analogs of BU-3608 antibiotics
US5114857A (en) * 1988-11-10 1992-05-19 Bristol-Myers Company Actinomadura hibisca microorganism useful for preparing serine analogs of BU-3608 antibiotics
US5183808A (en) * 1988-11-10 1993-02-02 Bristol-Myers Squibb Company Method for treating fungal infections with serine analogs of BU-3608 antibiotics
JP2643404B2 (ja) * 1989-01-13 1997-08-20 財団法人微生物化学研究会 新抗生物質ｎ―アセチルベナノマイシンｂならびにその製造法
FI92207C (fi) * 1989-11-14 1994-10-10 Squibb Bristol Myers Co Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten pradimisiinijohdannaisten valmistamiseksi
US5227370A (en) * 1989-11-14 1993-07-13 Bristol-Myers Squibb Company Pradimicin derivatives
CA2162186C (en) * 1989-11-22 1998-12-15 Shimpei Aburaki Pradimicin derivatives
JP3035313B2 (ja) * 1990-03-14 2000-04-24 財団法人微生物化学研究会 ベナノマイシンａ４▲′′′▼‐ｏ‐硫酸エステルの塩類およびそれらの製造法
US5843908A (en) * 1990-09-28 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Pradimicins l and fl, and derivatives thereof
US5696096A (en) * 1990-09-28 1997-12-09 Bristol-Myers Squibb Company Pradimicin derivatives
US5217877A (en) * 1990-09-28 1993-06-08 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of α-glucosidase inhibitor, pradimicin Q
CA2068484A1 (en) * 1991-05-29 1992-11-30 Osamu Tenmyo Pradimicin s antibiotics
US5194371A (en) * 1991-07-31 1993-03-16 Bristol-Myers Squibb Company Production of pradimicin antibiotics
JP3134010B2 (ja) * 1991-11-26 2001-02-13 財団法人微生物化学研究会 デスアラニンベナノマイシンａ誘導体およびそれらの製造法
US5837828A (en) * 1992-04-08 1998-11-17 Bristol-Myers Squibb Co. Pradimicin derivatives
US5420261A (en) * 1992-05-29 1995-05-30 Schering Corporation Glycosides of 3'-deoxyaquayamycin antibiotics
US5326867A (en) * 1992-07-16 1994-07-05 Bristol-Myers Squibb Company Pradimic acids, amides, and pradimicin derivatives
US5338728A (en) * 1992-08-14 1994-08-16 Bristol-Myers Squibb Pradimicin compounds
ZA938725B (en) * 1992-11-30 1994-05-23 Bristol Myers Squibb Co C-11 Modified pradimicin derivatives

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58154582A (ja) * 1982-03-10 1983-09-14 Yakult Honsha Co Ltd 新規なカンプトテシン誘導体およびその製造法
US4870165A (en) * 1987-02-02 1989-09-26 Bristol-Myers Company Antifungal antibiotics

Also Published As

Publication number Publication date
FI98147B (fi) 1997-01-15
CY1884A (en) 1996-04-05
DK173464B1 (da) 2000-11-27
PL161779B1 (pl) 1993-07-30
DK561289D0 (da) 1989-11-09
ES2059681T3 (es) 1994-11-16
US4973673A (en) 1990-11-27
IE893617L (en) 1990-05-10
EP0368349A3 (en) 1991-04-24
IE63305B1 (en) 1995-04-05
NO894417D0 (no) 1989-11-07
AU4461589A (en) 1990-05-17
KR900008049A (ko) 1990-06-02
JP2817064B2 (ja) 1998-10-27
NO894417L (no) 1990-05-11
EP0368349A2 (en) 1990-05-16
HK151595A (en) 1995-09-29
DK561289A (da) 1990-05-11
PT92263A (pt) 1990-05-31
DE68909170D1 (de) 1993-10-21
FI98147C (fi) 1997-04-25
CN1044299A (zh) 1990-08-01
IL92240A0 (en) 1990-07-26
CA2001714C (en) 1999-01-26
IL92240A (en) 1994-02-27
AU628418B2 (en) 1992-09-17
MY110238A (en) 1998-03-31
OA09246A (fr) 1992-06-30
KR930006995B1 (ko) 1993-07-26
FI895281A0 (fi) 1989-11-07
DE68909170T2 (de) 1994-03-10
NO172393B (no) 1993-04-05
EP0368349B1 (en) 1993-09-15
PT92263B (pt) 1995-07-06
NO172393C (no) 1993-07-14
ATE94556T1 (de) 1993-10-15
EG19153A (en) 1994-07-30
ZA898566B (en) 1990-10-31
JPH02188596A (ja) 1990-07-24
CA2001714A1 (en) 1990-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL161784B1 (pl) Sposób wytwarzania serynopochodnych antybiotyku benzo/a/naftacenowegoR Z E C Z P O S P O L IT A POLSKA PL PL PL PL PL
US4870165A (en) Antifungal antibiotics
AU612189B2 (en) New antibiotics, benanomicins a and b and dexylosylbenanomicin b, and production and uses thereof
KR940000759B1 (ko) 신규 글리코펩티드계 항생물질의 제조방법
EP0602597B1 (en) Process for preparation of indolopyrrolocarbazole derivatives
RU2032693C1 (ru) N-алкилпроизводные антибиотиков или их фармацевтически приемлемые соли, обладающие противогрибковой активностью, соединение в качестве промежуточного соединения в синтезе n-алкилпроизводных антибиотиков и способ получения n-алкилпроизводных антибиотика или их фармацевтически приемлемых солей
CA1338085C (en) Antibiotics bu-3608d and bu-3608e from actinomadura
US5114857A (en) Actinomadura hibisca microorganism useful for preparing serine analogs of BU-3608 antibiotics
US5061624A (en) Serine analogs of BU-3608 antibiotics
US5183808A (en) Method for treating fungal infections with serine analogs of BU-3608 antibiotics
EP0420552B1 (en) New antifungal antibiotic, and the production and uses of same
US5843908A (en) Pradimicins l and fl, and derivatives thereof
US5096817A (en) Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E
NZ231319A (en) Serine analogs of bu-3608 antibiotics, production by culture and the pure culture of the microorganism actinomadura hibisca
US5110960A (en) Antifungal antibiotics
IL107367A (en) Aglycone of d-serine intermediate for the synthesis of bu-3608 antibiotics
IL106806A (en) History of amino and N-alkyl of the antibiotic compounds from the complex of UB-8063 and their preparation
IE42207B1 (en) Aminoglyoside antibiotic complex