FI92207C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten pradimisiinijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

92207

Menetelmå terapeuttisesti kåyttdkelpoisten pradimisiini-johdannaisten valmistamiseksi Tåmån keksinnbn kohteena on menetelmå puolisynteet-5 tisten pradimisiinijohdannaisten valmistamiseksi. Yksi- tyiskohtaisemmin, nåmå sieniå vastustavat yhdisteet ovat pradimisiinien johdannaisia.

Pradimisiinit, jotka myOs tunnetaan BU-3608 anti-biootteina, ovat ryhmå sieniå vastustavia antibiootteja, 10 joita muodostaa Actinomadura hibisca sp. nov. Joukko pra-dimisiinejå, jotka on eristetty Actinomadura hibisca:n tai sen muunnelmien tai mutanttien fermentaatioliemistå, ja niiden rakenteita kuvataan seuraavassa R1

15 CONHCHCOgH

H CL JL .CH, o ho cH=YYYUvi (I) νν^····^Η3 20 H° 0 H' \ NHR2 r3'o (a) Pradimisiini A: R1=CH3; R2=CH3; R3=B-D-ksylosyyli

(b) Pradimisiini B: R1»CH3; R2=CH3; R3=H

(c) Pradimisiini C: R^CHj; R2=H; R3=B-D-ksylosyyli 25 (d) Pradimisiini D: R3=H; R2=CH3; R3=B-D-ksylosyyli (e) Pradimisiini E: R3=H; R2=H; R3=B-D-ksylosyyli (f) Pradimisiini FA-1: R1=CH20H; R2=CH3; R3=B-D-ksylosyyli (g) Pradimisiini FA-2: R1=CH2OH? R2=H; R3=B-D-ksylosyyli

Pradimisiini A on kuvattu BMY-28567:nå tiivistel-30 måsså No. 984 27. kokouksesta Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, lokakuu 4-7, 1987, New York, New York. Pradimisiinit A, B ja C on esi-tetty EP-patenttihakemuksessa No. 277 621. Pradimisiinit D, E ja niiden vastaavat desksylosyylijohdannaiset on esi-35 tetty US-patentissa 4 992 425.

92207 2

Pradimisiinien A, B, C, D, E ja niiden desksylosyy-lijohdannaisten N-alkyloituja analogeja on kuvattu US-pa-tentissa 4 960 755.

Pradimisiinejå FA-1, FA-2, niiden vastaavia desksy-5 losyylijohdannaisia ja niiden N-alkyloituja analogeja on kuvattu US-patentissa 4 973 673.

Kahta yhdistettå, jotka tunnetaan benanomisiineinå A ja B, kuvattiin julkaisussa J. Antiblot., 1988, 41 (6): 807 - 811, ja ibid, 41 (8):1 019 - 1 028. Benanomisiini B 10 vaikuttaa olevan identtinen suhteessa pradimisiini C:aan, kun taas benanomisiini A:lla on hydroksyyliryhmå benanomi-siinin B sokeriaminoryhmån asemesta.

Taman keksinnOn kohteena on yhdisteen valmistami-nen, jolla on kaava 15 1 R1 conhchco2h ho. X. xh3 0 H0 il <II) u \ nr3r4 j?2b jossa R1 on valittu ryhmasta H, metyyli ja hydroksimetyy-li, ja kun R1 on metyyli tai hydroksimetyyli, saadulla ami-25 nohapolla on D-konfiguraaio; R2 on H tai β-D-ksylosyyli; R3 on H tai metyyli; ja R4 valitaan ryhmasta (C2.5)alkenyyli; (C2_5)alkynyyli; substituoitu (C1.5)alkyyli; substituoitu (C2_5)alkenyyli; jolloin substituentti seka alkyylille etta alkenyylille on ryhma, joka valitaan ryhmasta karboksi, 30 (C1_5)alkoksikarbonyyli, karbamyyli, (0Χ_5 )alkyylikarbamyyli, di(C1_5)alkyylikarbamyylli, ja sulfonyyli; (C^Jalkanoyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka on valittu ryhmasta amino, (Cj.j)alkyyliamino ja diiCi.jJalkyyliamino; L-gluta-myyli; formyyli; bentsyyli; ja p-tolyylisulfinyylikarba-35 myyli; tai sen farmaseuttisesti hyvaksyttava suola.

92207 3 Tåmån keksinndn yhdisteet osoittavat korkeampaa liukoisuutta veteen kuin låhtdainepradimisiinit A ja B.

Taman keksinnOn kohteena on kaavan (II) yhdisteiden edullinen suoritusmuoto, jossa R4 on (C^Jalkanoyyli, joka 5 on substituoitu ryhmaiia, joka on valittu ryhmasta amino, (C^Jalkyyliamino ja diiC^jJalkyyliamino. Edullisempaan suoritusmuotoon kuuluvat kaavan (II) yhdisteet, joissa R4 on (C2-3)alkanoyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka valitaan ryhmasta amino, (^_5)alkyyliamino ja di(C1.5)alkyy-10 liamino, joista aminoryhma on edullisin substituentti.

Edelleen edullinen suoritusmuoto ovat kaavan (II) yhdisteet, joissa R4 on (C1.5)alkyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka on valittu ryhmasta karboksi, karbamyy-li, (C1.5 )alkoksikarbonyyli ja sulfonyyli; (C3_5 )alkenyyli; 15 (C3_5 Jalkynyyli; tai (C3.5)alkenyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka on valittu karboksista ja ()alkoksikar-bonyylista.

Kaytettyna julkaisussa ja patenttivaatimuksissa, jollei muuta ilmoiteta, "alkyyli" kasittaa suorat ja haa-20 rautuneet hiiliketjut. "Farmaseuttisesti hyvaksyttava suo-la" voi olla sisåinen suola; orgaaninen tai epaorgaaninen emassuola, kuten natrium-, kalium-, litium-, ammonium- ja trialkyyliammoniumsuola; tai happoadditiosuola mineraali-hapon tai orgaanisen hapon kanssa, esim. vetykloridi-, : 25 sulfaatti-, vetysulfaatti-, fosfaatti-, formiaatti- ja asetaattisuola. Aminosubstituoitu (C1.5)alkanoyyli kasittaa karbamyyliradikaalin; vastaavasti, mono- tai dialkyy-liaminosubstituoitu (Cj.gJalkanoyyli kasittaa vastaavasti substituoidun karbamyyliradikaalin. "Pradimisiini" viittaa 30 luonnollisesti esiintyviin pradimisiineihin, niiden des-ksylosyylijohdannaisiin ja niiden vastaaviin suoloihin.

Pradimisiini-låhtdaineet ja niiden valmistusmene-telmia on esitetty US-patentissa 4 992 425, US-patentissa 4 960 755 ja US-patentissa 4 973 673. Naissa hakemuksissa 35 olevat esitykset on liitetty tahan viitteina. Pradimisii- 4 92207 nejå voidaan kåyttåå vapaana emåksenå, happo- tai emåsad-ditiosuoloina, kahtaisionina, tai karboksyyliryhmån este-reinå, riippuen kyseisista reaktio-olosuhteista. Emåssuo-lat voivat olla esim. natrium-, kalium-, litium-, kal-5 sium-, magnesium-, ammonium- ja trialkyyliammoniumsuoloja; happoadditiosuolat voivat olla esim. hydrokloridi, sul-faatti, nitraatti ja vastaavat. Karboksyylihappoesteri voi olla alempi alkyyliesteri, kuten metyyli, etyyli ja iso-propyyli; fenyyli, bentsyyli tai sykloalkyyli, esim. syk- 10 loheksyyliesteri.

Taman keksinnOn yhdisteita voidaan valmistaa alalla hyvin tunnettujen menetelmien avulla. Taten substituoitu alkyyli- tai alkenyyliryhma voidaan lisata suoralla nukle-ofiiliselia korvauksella tai pelkistavaiia alkyloinnilla, 15 kåsittaen sokeriaminoryhmån; N-asyylijohdannaisia voidaan valmistaa saattamalla sokeriaminoryhma reagoimaan halutun hapon tai sen vastaavan asyloivan yhdisteen kanssa. Jo-kaista edellå mainittua reaktiota kasiteliaan nyt yksi-tyiskohtaisemmin seuraavassa.

20 Pradimisiinien N-( substituoitu alkyyli ) johdannaiset voidaan valmistaa saattamalla pradimisiini reagoimaan yhdisteen kanssa, jota yleisesti kuvaa L-A, jossa L on jåt-tåvå ryhmå, kuten kloori, bromi tai jodi ja A on substituoitu (C^s)alkyyli tai (C2_5)alkenyyli, jossa substituentit 25 ovat kuten edellå on mååritetty kaavassa (II). Esimerkkejå L-A:sta ovat, mutta ei nåihin rajoittuen, jodietikkahappo, jodipropionihappo, jodiasetamidi, etyylijodiasetaatti ja metyylibromikrotonaatti. Reaktio toteutetaan inertisså orgaanisessa liuottimessa, kuten metyleenikloridissa tai 30 vedesså tai niiden seoksessa. Liuottimen valinta riippuu reagoivien aineiden luonteesta. ReaktiolåmpOtila ei ole tårkeå ja voi olla mikå tahansa, joka helpottaa tuotteen muodostumista kohtuullisessa ajassa. LåmpOtila voi vaih-della huoneen låmpOtilasta reaktioliuoksen palautusjååhdy-35 tyslåmpdtilaan ja reaktioaika voi vaihdella n. 30 minuu-

II

92207 5 tista η. 15 tuntiin, riipuen reagoivista aineista ja reak-tio-olosuhteista. Toteutettaessa alkylointireaktio, voi olla edullista suojata pradimisiinihydroksyyli- ja fenoli-ryhmåt. MitenkSSn rajoittamatta, suojaryhmå on edullisesti 5 trimetyylisilyyli (TMS)-ryhma, joka voidaan lisStå kåyt-tåen N,0-bis(trimetyylisilyyli)asetamidia (BSA). KSytetyn BSA:n moolimåara on våhintdin vastaava suojattavien OH-ryhmien lukumaaraan, mutta edullisesti sita kaytetaan yli-maarin, n. 1,2 - n. 3-kertaisesti tama lukumaara. Alky-10 lointireaktion toteutumisen jaikeen TMS-ryhma voidaan poistaa happohydrolyysilia tai kayttaen reagenssia, kuten tetrabutyyliammoniumfluoridia.

Vaihtoehtoisesti, pradimisiinin N-(substituoitu alkyyli) johdannaisia voidaan valmistaa pelkistavalia al-15 kyloinnilla, jossa ensin kondensoidaan pradimisiiniiahtd-aine tarkoituksenmukaisen yhdisteen kanssa, joka sisaltaa funktionaalisen aldehydin tai ketonin, mita seuraa nain saadun tuotteen kasittely pelkistimelia. Aldehydi tai ke-toni voi olla esimerkiksi glyoksaalihappo, palorypaiehap-20 po, asetetikkahappo ja etyyliasetasetaatti. Saatu aine voi olla esimerkiksi metallihydridi, kuten natriumboorihydri-di, natriumsyanoboorihydridi ja litiumalumiinihydridi; natriumsyanoboorihydridi on edullinen reagoiva aine. Kon-densaatioreaktio toteutetaan inertissa organisessa liuot-25 timessa, kuten asetonitriilisså, alemmassa alkanolissa, dimetyylisulfoksidissa tai niiden seoksessa, tai niiden vesipitoisessa liuoksessa. Reaktioiampdtilaa ei ole eri-tyisemmin rajoitettu ja se voi vaihdella huoneen lampOti-lasta reaktioseoksen palautusjåahdytysiampOtilaan. Reak-30 tioaika voi vaihdella useista minuuteista muutamaan tuntiin. Muodostunut kondensaatiotuote voidaan sitten pelkis-taa samassa reaktioastiassa. Pelkistys voidaan toteuttaa huoneen låmpdtilassa kunnes saadaan haluttu tuote. Olemme havainneet, etta pradimisiini B:n pelkistSva alkylointi 35 huoneen låmpOtilassa glyoksaalihapolla ja kayttaen nat- 92207 6 riumsyanoboorihydridiå pelkistavana aineena, toteutuu usean tunnin kuluessa. Optimi reaktio-olosuhteet riippuvat tietenkin kaytettyjen erityisten reaktioaineiden luontees-ta ja reaktiivisuudesta.

5 Taman keksinnOn N-asyloituja pradimisiineja voidaan valmistaa saattamalla pradimisiini reagoimaan aminohapon, N-alkyyli- tai N,N-dialkyyliaminohapon tai sen vastaavan asyloivan aineen, kanssa. Aminohappo voi olla esimerkiksi glysiini, β-aminoalaniini, N,N-dimetyyliglysiini ja vas-10 taava. Haposta johdetut vastaavat asyloivat aineet voivat olla esimerkiksi happohalidi, kuten happokloridi, N-hyd-roksisukkiini-imidin tai 1-hydroksibentsotriatsolin aktii-vinen esterijohdannainen, ja symmetrinen tai seka-anhydri-di. Kun karboksyylihappoa kaytetaan asyloivana aineena, on 15 edullista kMyttaa sita yhdessa kondensointiaineen, esimerkiksi karbodi-imidin, kuten disykloheksyylikarbodi-imi-din (DCC), kanssa. Reagoivan hapon aminoryhma on edulli-sesti suojattu. Aminoryhman suojaryhma ei ole erityisesti rajoitettu ja voi olla joku peptidivalmistuksen alalla 20 kaytetty. Suojaryhmien valintaa, kuten my5s suojaus- ja suojauksenpoistomenetelmia on kasitelty esim. neljannessa kappaleessa julkaisussa "Peptide Synthesis", toinen pai-nos, Bodanszky, et al. Olemme havainneet, etta t-butoksi-karbonyyli (t-Boc)-ryhma, joka on poistettavissa happamis-25 sa olosuhteissa, esim. kayttaen trifluorietikkahappoa, on tyydyttava tassa keksinnbssa. Asylointireaktio voidaan toteuttaa inertissa orgaanisessa liuottimessa, kuten dime-tyyliformamidissa, metyleenikloridissa ja dikloorietaanis-sa. Reaktioseos voi valinnaisesti siséltaa happoaksepto-30 rin, kun oletetaan, etta happo on sivutuote; sopivia hap-poakseptoreja ovat esimerkiksi tertiaariset amiiniemakset, kuten pyridiini, trietyyliamiini, di-isopropyylietyyli-amiini ja vastaavat, tai epaorgaaniset emakset, kuten natrium- ja kaliumkarbonaatit. ReaktioiampOtila voi vaihdella 35 huoneen lampbtilasta reaktioseoksen palautusjaahdytyslam- 7 92207 pbtilaan ja reaktioaika voi vaihdella n. 30 minuutista useisiin pSiviin; ndma parametrit eivat ole kriittisia ja niita voidaan saataa riippuen reagoivien aineiden luon-teesta tuotesaannon maksimoimiseksi. Pradimisiiniiahtbai-5 neen hydroksyyli- ja fenoliryhmat voivat olla joko suo-jattuja tai suojaamattomia. Edullinen suojaryhma OH-ryh-mille on TMS, kuten edelia on kasitelty. Kun suojaamatonta pradimisiinia kaytetaan, OH- ryhmat voidaan mybs asyloida estereiden muodostamiseksi. Nåin muodostuneet esterit voi-10 daan hydrolysoida emåksisisså olosuhteissa katkaisematta vasta muodostunutta amidisidosta.

Pradimisiinin N-karbamyylijohdannaisia voidan saada saattamalla pradimisiini reagoimaan tarkoituksenrnukaisen isosyanaatin kanssa. Reaktio toteutetaan inertissS orgaa-15 nisessa liuottimessa, kuten asetonitriilisså ja huoneen lampGtilassa. Reaktioaika voi vaihdella tunnista useisiin pSiviin.

Kuten edellS on mainittu, pradimisiineja voidaan kayttaa vapaana emaksena, emassuolana, happoadditiosuolana 20 tai karboksyylihapon esterina. Mikali esteria kaytetaan, esteriryhmå voidaan poistaa emaksiselia hydrolysoinnilla muodostamaan lopputuote.

On ymmarrettava, etta taman keksinnbn yhdisteiden valmistus ei rajoitu edelia kuvattuihin menetelmiin ja 25 reagoiviin aineisiin, vaan voi mybs kasittaa muita mene-telmia, joilla pystytaan alkyloimaan tai asyloimaan amino-ryhma pradimisiinien sokeriosassa. Reaktio-olosuhteet vaihtelevat tietenkin riippuen lahtOaineiden valinnasta, mutta alaan perehtynyt pystyy ne helposti toteamaan ilman 30 liiallisia kokeita.

Taman keksinnbn yhdisteiden in vitro sienia vastus-tava aktiivisuus maaritettiin erilaisia sienia vastaan agar-laimennussarjamenetelmaiia (serial agar dilution method). Ymppayksen koko saadettiin 106 solua/ml ja n.

35 0,003 ml:n tilavuus sienisuspensiota levitettiin anti- 8 92207 bioottia sis&ltavien agarlevyjen pinnalle moniymppaajaiia. Inkuboinnin jaikeen alhaisin pitoisuus antibioottia, joka aiheutti lahes taydellisen sienikasvun eston, maaritettiin minimiestovakevyytena (MIC). Tulokset on koottu taulukoi-5 hin 1 ja la.

II

92207 9

^ ro ro «—> uO lT> O O. ro ro O rO O O

. uoaDrOrocscsOOO'-OOsOOO

V *—t r—t LO U~1 LO lO li"> Λ Λ Λ Λ ro Ο Ο. Ο Ο 0_ Ο. Ο Ο. 0_ Ο Ο Ο ' Ο Ο Ο* U-) Ο Ο Q Ο Q Q Q Ο* Q Ο

LnoLnesoooooooooo ώ ΛΑΛΑ Λ Λ rs _ ·—‘ Ο. Γθ_ ro lT)_ ιΠ . Ο Ο Ο ιΛ Ο • lO lD lo so cs cs i n u~> os tn lD cs i_n i_n κ fsj CS r—1 «—I es rs *—I OS (S r—1 os rs fil Λ Λ Λ Λ Λ . ιΛ Π ι/) vD \£> Ο Ο 0„. Ο Ο Ο lT>^ ΓΟ Ο Ο Ο.

CS Ό es r—ι ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο rs \θ ο OlT> • ’ μ ·£) uOOOOOOO«—i Ο Ο es ώ Λ Vi Λ Λ Λ ο * ro L.O νΟ_^ sO LT> ο Ο Ο LO_^ LO LO t/5 o e '"'vO eSr—<*—»rsOOOescsesesQ o'"" <j* r—t . O O O ·—I ι—I ·—I ·—i 55 O ^ ώ " ^ ^ ~ :tc i-s Ή •k σ' o O LD^ o o o o_ O O O O O £

CO . u-> u-> lo es o o o o »-o I_n~ o o o o o"' -H

^ ^esescsr—*LnLnOOescsOLnSCOLn >(_l 3 Λ Λ Λ Λ U)

w c * ^ -H

•Hcyoo·—»«οοοοονβ»—«ro·—«ro*—«vO'Orooro ·-* £ ►> =l ·' r r - — - .* i- ^ --- ^ - - _ .Lj ^ V* . rovooo*—»rosaro^co·—'.—i\oosd '' ^ •H X u-ι — o Ti h i ώ >, ° *

P 31 „ „ p r» · L

c—· —<—i «**_ **»_ r—* O O ·—i 0_ O. O ·—* ·—<_ ^p.. O O fri p, (0 . ri ri ' o O n cΓ o~ ri o O in ri ri .-i o o QJ S3 ·Η S p CL P 3 rH (fl -H '— c -n

> ~ ^ ~ U M

O (0 «·> o. o ro ro o o o o o o o o o o. uootno ° °- :ίΰ Li p *3 ·* ic £ S ^ °·' S S 8 8 8 S 8 8 8 8 2 15 2 8 8 8 l<c to p Λ Λ Λ“ b ? 5 C)

HP „ „ „„„-HP

2 (β rs ΙΛ_ «—*_ LO o O.- O, O. O. O lO_ o, lo,. o o^o_ <D *H CJ W

fri fri · lo O es ro es O O © O O O O LO es LO es O OO M) O .—J

E-H > ώ ^ —* *-* ° LO ° o O O O O O U 'S

:3 λλολλ Λ^^ΟΟοοΡ H „ ^„„ZPCN>,

C o o o u-> o o, o o, o. o^_ o_ o. o_ o o o_ O +J

” O O tn rsa O O O O O Q o” ' O O O O O O O ·- [0 ·· 00 .,-{ (2 *^ ^ ^ " 2 ° tn o o o o otnotno ©Oq^^j

Ifl *H ✓N/sysys/s/s^'^'^'CijjQjmr^ C tt 3 Φ Ή o !h (D P Λί

*1 tn ^ Ό P M

-P ti^ ro o oo oo ·—« r-< ro ro r-» »—» so lo O lo C P (D

#r^ 6 ^OOOrorO'OrO'OrOrO^esO es' O fO W £

> H ^ "°CCLlO-H

^ -H 3 h tn

32 CJ -r- fC o O <D

Μλ 0*^βΐι OO ·" , i (Ο.—ί π u-ι ro ro ιλ i- nj « lOO -h W π • I ^ lo 03 o -·-> p σ\ «>- jj (fl jj f/j cq m er* o —. rs rs > w-. c: un c: es o go o ^ ~ TI -j

ez c δ in ae x n -^i OLnoro o Λ *HC/^CO

^ ro O ej v ΐ S ^ ·—* β *—· fc O Cu to rr, _i /ii

, - o o ae « ^ o« ^ c 3 u) *H(D

^ c c c %λ %λ 3 to r-i*.nrn E -Q X3 3C3nCQtOiOto|to O O to %0 w w ·« ·« ^ O w '«p u;

rn u ro U 333 e pi C-^<L*-->a>a)“Ot0 i-O C Π1 _Q I

, ro i æ er oeoto^-.j-»—n-u'itf\o >- —> >-*—> u — o J< *-i oo r~- z; Tj ' •H co Ok-ocr^ro^ro.Sros -e>-.e>«>-4-»<jo.-^r-.Oj«—. *·εΡΓ0 p- ro|c0rooO0(_>ro «o--^oi3^35:O-Æ0.-cc:ro «e—.Qtoro . l> i W *σ 2E ^ O'—I O B er·— O- *— 0-^ - æ Q CLO 0-0 C L- CL> OJC0 un -—' Ή Λ ·· I CD ·—I 2E — UO-U-J p -P k-ι L- S L- B i-.es L. es J2 OjC Oj-> i~. .c— O t-io ^ r· flj ClD T3i< T3CrQ.fijQ.OCJ3a;3i<P^rorS*J‘-UL-toCJO»w>L-.ti-. o U-. 1“i π Γ c—i cz *: >- cz >~s-i cl — o. s-· OUj io-c — er·— cjro-o t- Om—. ·«— -k H*

O'-1 ro ro L- Le MllO tO 3 Le Q. QJ 3 Γ—1 TH

^ o o! c_> o o -<i -<-<tJL,6— é—cqcoo- ae 92207 10 LT> S o o o UO o „ O_ O uo cvj Crj ? t? g tC rT » S ί N « ,3

H

s g *.u _ g g ->.-* s a s a « S _ ~ g ~ e S ~U S e ~~ S ^ e S > £ ti? c-) g ^ co S o λ r- g ,H ,_, c3 -η £ oj cvjooCOvOrocOc-OCO'i^POrococ-o — < cn~ o' ^T -o" o vrT cT r-, <rj ro ro m c K " .Π3 g rj< " ,— vo tvj co KO G m ._, ;;r: >s-ioo ^ u-> lo lo ro lo ro_^ o lo »-r> lo tA- . ·Η O C£>

, csj-' ^ ^ ^ vO ro *o oo ro if!3 £3CN

ώ ~ " CL, P < ~ O- O- ^ s O- O- s ^ S S ^ EH -h . cg CO sO csj CO ro nO CN3 ζ^) £ t3 " " "" „. u-, · O * (0

» - (NU

2ιΛΙΛ u"> <*J U, o O O O O o «NtNgol ^^gUJLOtit^ti? ™ ·'·

* se OS

0] « ·· rH

3 ro ο. Ό ro irj 00·**

3 Γ~ r- S *-r ·"- CO CO CO CV1 CL) CSiLO

0)<N

-Η <3 +J <; .* •H " 2~ Or. ®Λ Or O- Or Or Or Or O' "3 C ^ · so ro ro ^ »»o ro <O co so co co 3C0

(0 +j (S P rj P 0 0) VD

I-Η « * ; H 03 <N

<0 ^?crjC-)CrJCr3-O<r)-0-Orr, UD -O O ^ X (0 .onro-ro-»o««r>Sr-.« +j J g X > ώ C s

3 (C ·Η . <D

i—I 4-) \θ O S tø 3 U) ro cg so ro vc cO_ CO^ Ό u0_ ^ fO^ ^ CXi 1¾ 3 >: O rrT ^-iCO^-.nOO-—.Csj^ikOsO 3 ^

En -M ^ ^ ^ H t?

tø uo C

CO C0_ CO CO CO cvj 00^ C0_ CO so^ \o^ .,_( ·· .

> ύζ r-p O O ro O* ro O O ro ·—t *~i *-» 4-*S

:<0 “ ·* rd •H ^ > - C (rj so ·*£> crj vo OJ OO LTi ΓΠ L/^ UO O '“i N1

Oi . r .r ^ «Τ rr rr ,r <n .- .r r~. Γ) , •H ropjcrj 4-1.0·*

03 -Η ^ (XI

•H Q 3(0 +J m O 1 c -P nj 00

^ *H Ή m o oo^ cr,^ co^ <r)_ oo^ «3^ ln__ <*1_ * C G (N

Id 03 40 ^ o' ro" o~ <rT~ oo^ronro OdJGCN

Ή L Ή * Ή Ιί < > Λ E Γ* 03 x r-{ 03 c æ m ε tu ·

H .,_( o rn vO o n o oo. *r oo^ ^ ro_^ >1 & +1 03 -P

I c -c ti? ro" r-itr?rrTtr?oO<*ar-.^\j3 -l-J 03 Ή £>ί &\ •Η ·Η ^ 4-1 -H c X? ^

Τ3·Η d)pr0(0Qj(N

2.“3 4JiCg&'0(N

(ΓΞ -HCnÆLPrt: “ , U ίϋ ·Η o (71

·—· ro roe e i I SCO >-) rOCO

*^*1 -S ·” O P S O S ιλ £ *5 ^ 2<0 s '—' -p +J *H

3 a s £ ^ ™ i O W OS. c ·§ S E e iH >,cc S in ro re υ υ o N u Lj < cs* ro I- =.¾ W +J dl fl

3· ·Η t? -ϋ S. o. ’B1· S ro oa <u <u tri w| c «= Ή II KO Q) £ U

= c S £ £ £ BliQ is S £ ™ 51 Bl § i 3 SS m > -p m <0 ro ro -» -^> cp-^ 03 -H >. ·

— g3 moro" ro.S ro O ro I w I ro w £ > 8 o S. O 8- r^ J vD II G KO :r0 En S

* §· S s s & S S i£ S s|^:rs ^ S £ s! o o o g]2 i S i Si ή ακ *σ cn ό ro *σ I ro t? ro *01 «j 1 t? nj <u Oj <i> I l- ^ i— jc O rs lj j—j q ^ jj c-ic-iS-oc-ic ulcuoop^clugugr^.r.cji w /4 * * *

m ro ro ro rol ro ro i-ι -r >- *-· 2 * ^ Ί( (O (D

O O o|cj C-31 C—) Ml L, S 3C t— i-c " 92207 11

Monia yhdisteitå arvioitiin my6s laskimonsisaisesså Candida albicans A95040 hiiren infektiomallissa. Koeorga-nismi suspendoitiin suolaliuokseen ja kåytettiin n. kym-menkertaista mediaani-tappavaa annosta sienia (106 so-5 lua/hiiri) infektoimaan laskimonsisåisesti urospuolisia ICR hiiriå, jotka painoivat 20 - 24 g. Viiden hiiren ryh-mille, jokaista annostasoa kohti, annettiin koeyhdisteitå laskimonsisåisesti tai lihaksensisåisesti. 50 %:n suoja- annos (PD50) laskettiin eloonjååneistå rotista 20 tai 10 21 påivåå sienen antamisen jålkeen. Kontrollielåimet kuo- livat 7-15 pSivSn vålillå. In vivo koetulokset on koottu taulukkoon 2.

92207 12

Taulukko 2

In vivo sieniå vastustava aktiivisuus Candida albicans A9540 vastaan hiirissa ^ A. Yhdiste PD *(wq/kq. IV) B, Yhdiste PD^^*(mq/kq? Tie

Ex. 1 45 Ex. 4 >50** IY

Ex. 2 29 Ex. 5 >50** IY

Ex. 3 18 Ex. 21 >50 IV

Ex. 7 7.2 Ex,. 23 >50 IV

£x. 9 >50 Pradimisiini A 30 IV

10 Pradimisiini A 7.9 Pradimisiini B 32 IV

Ex. 10 30 Ex. 4 >50** IH

Ex. 11 36 Pradimisiini A IH

Pradimisiini A n Pradimisiini B >50 Ih

15 Taulukko A

*Maaritetty 20 påivåå Litchfield ja Wilcoxon menetelmån mukaisesti.

1) Koeorganismeja viljeltiin @ 28 °C:ssa 18 tuntia YGP

aineessa (hiivauute, glukoosi, peptoni, K2HP04, MgS04, 20 pH 6,6) 2) Lååke annettu kerran IV, heti infektion jalkeen.

Taulukko B

*Maaritetty 21 påivaå sienen antamisen jalkeen Spearman-25 Karberin menetelmån mukaisesti.

**Viivastynytta kuolemaa havaittiin.

1) Koeorganismeja inkuboitiin 18 tuntia Sabouraud dekst-roosiagarissa.

2) Laakkeet annettiin IM tai IV 1 ja 3,5 tuntia infektion 30 jalkeen ja kahdesti seuraavana påivånå sienen antamisen j ålkeen.

Tåmån keksinnon yhdisteiden liukoisuus veteen måå-ritettiin kåyttåen jotakin seuraavista menetelmista: 92207 13 I. Nåyte (1,0 mg tai 2,5 mg) suspendoitiin 250 μΐ:aan Dulbeccorn fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS, ilman CaCl2 ja MgCl2.6H20), ultraåånisekoitettiin huoneen lampotilassa 10 minuuttia ja sentrifugoitiin 10 minuuttia.

5 Ylin kerros (2 μΐ) analysoitiin HPLC:11S kåyttåen olosuh-teita, jotka on eritelty jokaiselle yhdisteelle koeosassa. Kun silmåmååråisesti liuennut liukoisuus mååritettiin >4 mg/ml (>10 mg/ml 2,5 mg kåytettyå nåytettå kohti). Kun ei liukoinen, ylimååråinen måårå PBS (x μΐ) lisåttiin, 10 ultraåånisekoitettiin ja sentrifugoitiin. Kun silmåmååråi-sesti liuennut, liuos (2 μΐ) injektoitiin HPLCchen ja hui-pun pinta-alaa kåytettiin nåytteen tunnettuna våkevyytenå. Vertaamalla huipun pinta-alaa, joka saatiin edeltåvåstå ylimmåstå kerroksesta, liukoisuus laskettiin seuraavasti: 15 A 8 . , liukoisuus = x mg/ml

Ao x 20 jossa A on 1,0 mg:n nåytteen 250 pl:ssa PBS ylimmån ker-roksen huipun pinta-ala ja A0 on 1,0 mg:n nåytteen x pl:ssa PBS koko liuoksen huipun pinta-ala.

II. Nåyte (3 - 3,5 mg) suspendoitiin 1 ml:aan PBS(-) tai PBS(+), ultraåånisekoitettiin 30 °C:ssa 10 mi- 25 nuuttia ja annettiin seistå huoneen låmpotilassa 2 tuntia. Saatua liuosta tai suspensiota sentrifugoitiin 12 000 kierrosta minuutissa 10 minuuttia. Ylin kerros (pH 6,7 - 7,2) laimennettiin (5 x tai 50 x) 0,01N NaOH:lla (pH n. 11,5) ja sen UV absorptio 500 nm:ssa mååritettiin. 30 Liukoisuus mååritettiin absorptiovakion arvolla suhteessa 1 y standardiin. Standardi: puhdas pradimisiini A " Elcm 180 500 nm:ssa emåksisesså liuoksessa. Nåytteen kahtaisioni-muotoa kåytettiin liukoisuuskokeissa sellaisenaan. Hydro-35 kloridisuolanåyte (3 mg) liuotettiin 3 ml:aan tislattua 14 92207 vetta ja neutraloitiin Ο,ΟΙΝ NaOH:lla ja sitten liuos lyo-filisoitiin antamaan koenåyte.

PBS(- ) ja PBS( + )-liuokset, joita kåytettiin mene-telmSsså II, valmistettiin seuraavasti: 5 Kåytettiin Dulbecco:n fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS). PBS(-)-liuoksen valmistus: 1 PBS(-)-tabletti (Flow Laboratories, Cat. No. 28-103-05) liuotettiin 100 ml:aan tislattua vetta ja liuos pidettiin autoklaavissa 10 mi-nuuttia 115 eC:ssa. Tamå liuos sisalsi 0,2 g/1 KC1, 10 0,2 g/1 KH2P04, 8 g/1 NaCl ja 1,15 g/1 Na2HP04. PBS( + )- liuoksen valmistus: 1 PBS(-)-tabletti liuotettiin 80 ml:aan tislattua vetta; 10 mg CaCl2 liuotettiin 10 ml:aan tislattua vetta; 10 mg MgCl2, 6H20 liuotettiin 10 ml:aan tislattua vetta. Nama liuokset laitettiin auto-15 klaaviin erikseen, kuten edelia on kuvattu ja sekoitet-tiin, kun ne olivat jaahtyneet.

Yhdisteiden liukoisuus veteen on annettu taulukossa 3.

Il 9220 7 15

Taulukko 3

Llukoisuus veteen

Yhdlste Menetelma _Liukoisuus (Vg/^.Ll 5 Ex 1 II (-)* >30,000 II (+) >31,000

Ex. 2 II (-) 11,000

Ex. 3 II (-) 11,000

Ex, 7** II (-) i?

Pradimisiini A II (-) 1' 10 -- Εχ 9 II (+) >32,000

Ex! 10 II (+) 1'00_°

Ex. 11 II (+) 2d0

Pradimisiini A II (+) 81 15 Ex. 4 I >10,000

Ex. 5 I >4,000

Ex. 6 I >4,000

Ex. 15 I 2,000

Ex. 18 I 4,000

Ex.21 I 2'000

Ex. 22 I 5,000

Ex. 23 I 500 20 Pradimisiini AI 17

Pradimisiini BI 70 *(-): PBS(-); (+): PBS(+).

**Hyvin liukoinen tislattuun veteen pH 9:sså antaen kirk-25 kaan liuoksen, mutta hajosi muodostaen pradimisiini C:n pH 7,0:ssa.

TåmSn keksinnon yhdisteillå on osoitettu olevan aktiivisuutta eri sieniS vastaan. Lisåksi ne ovat vesiliu-30 koisempia kuin nykyiset pradimisiinit.

Sieni-infektioiden hoidossa elåimisså ja ihmisissa tamån keksinnon antibiootteja voidaan antaa sieniå vastus-tavana tehokkaana mååranå mitå tahamsa hyvåksyttyå anto-tietå pitkin; kasittaen, mutta ei nåihin rajoittuen, las-35 kimonsisåisen, lihaksensisaisen, oraalisen, nenånsisåisen 92207.

16 antomuodon ja pinta-infektioita vårten ja paikallisesti sopivan antotien. Valmisteet ruoansulatuskanavan ulkopuo-lista antomuotoa vårten kåsitt&våt steriilit vesipitoiset tai ei-vesipitoiset liuokset, suspensiot tai emulsiot.

5 Niita voidaan myos valmistaa steriilien kiinteiden koostu-musten muotoon, jotka voidaan liuottaa steriiliin veteen, fysiologiseen suolaliuokseen tai johonkin muuhun steriiliin injektoitavaan vSliaineeseen, vaiittOmasti ennen kayttoa. Oraalinen formulointi voi olla tablettien, gela-10 tiinikapseleiden, jauheiden, siirappien ja vastaavien muo-dossa. Paikallista antomuotoa vårten yhdiste voidaan si-sallyttåS liuoksiin, geeleihin, voiteisiin, salvoihin, vaahtoihin, tinktuuroihin ja vastaaviin. Yksikkdannosmuo-toja voidaan valmistaa kSyttSen farmaseuttisten formuloin-15 tien alaan perehtyneiden yleisesti tuntemia menetelmiå.

On ymmårrettava, etta hoidettaessa potilasta, joka on infektoitunut sienilia, jotka ovat alttiita taman kek-sinnon antibiooteille, kåytetty edullinen antotie ja annos riippuu sieni-infektioiden hoitoon erikoistuneen 20 laåkarin arvostelukyvysta ja vaihtelee riippuen aiheutta-vasta organismista, sen herkkyydesta antibioottia kohtaan, tulehduksen sijainnista ja vakavuudesta ja potilaan omi-naisuuksista, kuten iasta, elopainosta. eritysnopeudesta, rinnakkaisesta laakityksesta ja yleisestå fyysisestå kun-25 nosta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintoa rajoittamat-ta sen piiria, joka maaritetaan patenttivaatimuksilla, jotka on liitetty tahan julkaisuun.

Esimerkki 1 30 N-(karboksimetyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, R1*^, R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R^-CHjCO^)

Jodietikkahappoa (75 mg, 0,4 mmoolia) lisattiin seokseen, jossa oli pradimisiini A HC1 (50 mg, 0,057 mmoolia) ja BSA (0,25 ml, 1 mmooli) metyleenikloridissa 35 (1 ml), ja seosta palautusjaåhdytettiin ycin yli. Metanolia 92207 17 (5 ml) ja IN HC1 (1 ml) lisSttiin. Reaktioseos vSkevoitiin alennetussa paineessa ja OljymSinen jåånniis kromatografoi-tiin C18 silikageelipylvéassS (prePAK pylvås (Waters), 20 mm x 250 mm) eluoiden vedellS ja sitten 30-%:sella ase-5 tonitriili-vedellå. Jakeet, jotka sisSlsivat haluttua tuo-tetta, yhdistettiin, våkevttitiin ja kylmåkuivattiin arvta-maan otsikkotuote (43 mg, 84 %) amorfisena jauheena.

IR r max (KBr) cm'1: 1 725 (heikko), 1 628 - 1 607, 1 388, 1 334, 1 296, 1 257, 1 050.

10 UV 2 „„ (1/100N NaOH) nm (Σ): 232 (32 400), 318 (15 000), 497 (14 400).

MS (SIMS): m/z 899 (M+H) + *H NMR (DMS0-d6 δ : 1,18 (3H, d, J=6,4 Hz, 5 '-CH3 ) , 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, alanyyli-CH3), 2,28 (3H, s, 3-CH3), 2,61 15 (3H, s, N-CH3), 3,69 (1H, dd, J=5,3 & 11 Hz, 5"-H), 3,95 (3H, s, 0CH3), 4,39 (IH, qui, J = 7,3 Hz, alanyyli-CH), 4,43 (1H, d, J=8 Hz, 1"-H), 4,43 (IH, d, J=12 Hz, 5-H), 4,56 (IH, br-d, J=12 Hz, 6-H), 4,60 (1H, d, J=8 Hz, l'-H), 4,99 (2H, br)\ 5,59 (1H, br)\ 6,02 (1H, br)\ 6,93 (1H, d, 20 3=2 Hz, 10-H), 7,05 (IH, s, 4-H), 7,28 (1H, d, J=2 Hz, 12-H), 8,04 (IH, s, 7-H), 8,58 (1H, d, 3=7 Hz, CONH)*, 12,0 (1H, br)\ 12,90 (1H, s)*, 13,80 (1H, br)\ *Katosi lisSttSessS D20.

Esimerkki 2 25 N-(karbamoyylimetyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, R1=CH3, R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4=-CH2C0NH2)

Jodlasetamldia (150 mg, 0,81 mmoolia) lisattiin seokseen, jossa on pradimisiini A HC1 (100 mg, 0,11 mmoolia) ja BSA (0,56 ml, 2,2 mmoolia) metyleenikloridissa 30 (4 ml), ja seosta palautusjaahdytettiin yGn yli. Lisåå BSA

(0,56 ml) ja jodiasetamidia (150 ml) lisåttiin sitten reaktioseokseen ja seosta palautusjååhdytettiin ylimSåråi-set 5 tuntia. Reaktioseosta kSsiteltiin IN HC1:11S (3 ml) ja metanolilla (10 ml) ja vSkevoitiin alennetussa painees-35 sa. JSSnnds kromatografoitiin C18 silikageelipylvSassa 18 92207 (20 mm x 200 mm) eluoiden vedellå, sitten 30-%:sella ase-tonitriili-vedellå. Jakeet, jotka sisSlsivåt haluttua tuo-tetta, yhdistettiin, våkevditiin ja kylmåkuivattiin anta-maan otsikkoyhdiste (81 mg, saanto 82 %) tummanpunaisena 5 amorfisena jauheena. Sp. 225 °C (haj.)· IR Ymax (KBr) cm'1 : 1 607, 1 296, 1 063.

UV Pj max (1/100N NaOH) nm (Σ): 319 (15 200), 497 (14 600) MS (SIMS): m/z 898 (M+H)+ XH NMR (DMS0-d6) δ : 1,20 (3H, d, J=6 Hz, 5'-CH3), 1,32 (3H, 10 d, J=7,3 Hz, alanyyli-CHj), 2,29 (3H, s, 3-CH3), 2,56 (3H, s, N-CH3), 3,71 (IH, dd, J=5 & 12 Hz, 5"-H), 3,95 (3H, s, 0CH3), 4,38 (IH, qui, J=6 Hz, alanyyli-CH), 4,45 (IH, d, J=8 Hz, 1"-H), 4,46 (IH, d, J=12 Hz, 5-H), 4,54 (IH, br-d, J=12 Hz, 6-H), 4,61 (IH, d, J=8 Hz, l'-H), 5,20 (2H, br)*, 15 5,63 (IH, br)*, 6,05 (IH, br)*, 6,93 (IH, d, J=2 Hz, 10-H), 7.05 (IH, s, 4-H), 7,20 (2H, br, C0NH2)*, 7,29 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,05 (IH, s, 7-H), 8,58 (IH, d, J=7 Hz, CONH)*, 12,55 (IH, br)*, 12,90 (IH, s)*, 13,80 (IH, br)*.

*Katoaa lisåttåesså D20.

20 Esimerkki 3 N-(etoksikarbonyylimetyyli)pradimisiini A:n valmis-tus (II, R1=CH3, R2=8-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4=-CH2C02C2H5)

Esimerkin 1 menetelmå toistettiin kSyttåen pradimisiini A · HC1 (50 mg, 0,05 mmoolia), BSA (0,28 ml, : 25 1,1 mmoolia) ja etyylijodiasetaattia (0,20 ml, 1,7 mmoo lia) antamaan otsikkoyhdiste (39 mg, saanto 74 %) tummanpunaisena amorfisena jauheena. Sp. 225 °C (haj.).

IR Ymax (KBr) cm'1 : 1 737, 1 607, 1 296, 1 066.

UV 2 aax (1/100N NaOH) nm (Σ): 320 (15 600), 498 (15 100). 30 MS (SIMS): m/z 927 (M+H)\ NMR (DMSO-d6) 6 : 1,17 (3H, d, J=7 Hz, 5 ’-CH3), 1,18 (3H, t, J=7 Hz, CH2CH3), 1,33 (3H, d, J=7 Hz, alanyyli-CH3), 2,28 (3H, s, 3-CH3), 2,61 (3H, s, N-CH3), 3,95 (3H, s, 0CH3), 4.06 (2H, m, CH2CH3), 4,39 (IH, qui, J= 7 Hz, alanyyli-CH), 35 4,52 (IH, br-d, J=12 Hz, 6-H), 4,59 (IH, d, J=8 Hz, l’-H),

II

92207 19 5,00 (3H, br)* 5,58 (IH, br)\ 5,99 (IH, br)\ 6,91 (IH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,04 (IH, s, 4-H), 7,28 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,03 (IH, s, 7-H), 8,59 (IH, d, J=7 Hz, CONH)\ 12,55 (IH, br)*, 12,92 (IH, s)*, 13,90 (IH, br)*.

5 *Katosi lisåttaesså D20.

Esimerkki 4 N-karboksimetyylipradimisiini B:n valmlstus (II, R1=CH3, R2=H, R3=CH3, R4=-CH2C02H)

Liuokseen, jossa oli pradimisiini B (1,00 g, 10 1,41 mmoolia) ja glyoksaalihappomonohydraattia (2,13 g, 23,1 mmoolia) vedessS (40 ml), lisSttiin IN NaOH (20 ml, 20 mmoolia) liukenemaan. Tåmå liuos laimennettiin aseto-nitriililia (40 ml) ja sita sekoitettiin huoneen låmpbti-lassa 10 minuuttia. TShån lisåttiin natriumsyanoboorihyd-15 ridia (0,353 g, 5,6 mmoolia) ja seosta sekoitettiin huoneen lampdtilassa 1 tunti. Asetonitriili poistettiin tyh-j5ssa ja seos laimennettiin vedelia (20 ml) ja tehtiin happamaksi pH-arvoon 3 lisaåmaiia IN HC1 (20 ml). Muodos-tunut sakka sentrifugoitiin, pestiin vedelia (2 x 20 ml), 20 suspendoitiin pieneen maaraan vetta (2 ml) ja kylmåkuivat-tiin antamaan 960 mg raakaa otsikkoyhdistetta punaisena jauheena. Tama liuotettiin veteen (5 ml), joka sisålsi IN NaOH (1,8 ml), ultraaånisekoittamalla ja puhdistettiin pylvaskromatografisesti (kaanteisfaasisilikageeli, 25 Lichroprep RP-18, 40 - 63 pm, EM Science) vedellå eluoi-den. Tarkoituksenmukaiset jakeet yhdistettiin, våkevditiin ja tehtiin happamaksi pH-arvoon 3 lisaamaiia IN HC1. Muo-dostunut sakka kerattiin sentrifugoimalla antamaan 139 mg otsikkoyhdistetta. Epapuhtaiden jakeiden toistettu pylvas-30 puhdistaminen antoi kokonaiset 669 mg (0,833 mmoolia, saanto 59,1 %) otsikkoyhdistetta.

Rt 1,90 minuuttia (puhtaus 93 %; HPLC, pylvas: Mic-rosorb Short One C18, eluentti: 50-%:nen puskuri (0,15 % KH2P04, pH 3,5 )/asetonitriili-H20 (4:1), virtausnopeus: 35 1,2 ml/minuutti).

92207 20 IR (KBr) Ynax: 3 420, 1 735, 1 630 cm'1.

UV (Me0H:H20; 1:1) ^ Bax: 234 (Σ 27,000), 290 (Σ 22,300), 466 (Σ 9,640).

MS (FAB): m/z 767 (M+H) + ; HRMS: laskettu C37H39N2016: Ile 5 (M+H)+ 767.2300, havaittu 767.2283.

XH NMR (300 MHz, DMSO-d6 δ (ppm): 1,17 (3H, d, J=6,3 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me), 2,67 (3H, s, N-Me), 3,2 - 4,0 (6H, m, 4'-H, 2'-H, 3'-H, 5'-H, CH2), 3,93 (3H, s, 11-OMe), 4,3 - 4,6 (4H, m, 17-H, 10 5-H, 6-H, l'-H), 5,54 (br s, vaihtuvat protonit vahvistet- tiin D20:lla), 6,14 (s, vaihtuvat protonit vahvistettiin D20:11a), 6,93 (IH, s, 10-H), 7,06 (IH, s, 4-H), 7,27 (IH, d, J=2,3 Hz, 12-H), 8,05 (IH, s, 7-H), 8,55 (IH, d, J=7,2 Hz, CONH, vaihtuvat protonit vahvistettiin D20:lla), 12,85 15 (IH, s, vaihtuvat protonit vahvistettiin D20:lla).

13C-NMR (300 MHz, DMSO-d6/CDCl3) δ (ppm): 17,1, 17,3 (5’-Me, 17-Me), 19,4 (3-Me), 42,6 (N-Me), 47,8 (C-17), 56,5 (11-OMe), 57,8 (NCH2), 65,3 (C-5'), 71,4 (C-2'), 71,8 (C-6), 72,7, 73,6 (C-4’, C-3’), 8,08 (C-5), 105,3 (C-l'), 20 106,7 (C-10), 107,7 (C-12), 110,1 (C-8a), 114,1 (C-7), 115,8 (C-4), 126,4 (C-2), 127,3 (C- ), 131,5 (C-14a), 134.6 (C-7a), 137,3 (C-4a), 138,5 (C-12a), 148,0 (C-6a), 151.6 (C- ), 157,8 (C-l), 164,8 (C-9), 166,0 (C-ll), 167,2 (C- ), 173,3 (C- ), 174,2 (C- ), 185,2 (C-13), 186,9 25 (C-8).

Esimerkki 5 N-(karbamoyylimetyyli Jpradimisiini B:n valmistus (II, R1=CH3, r2=h, r3=ch3, r4=-ch2conh2)

Suspensioon, jossa oli pradimisiini B (100 mg, 30 0,14 mmoolia; 85-%sesti puhdas HPLC:llå) 1,2-dikloorietaa- nissa (5 ml), injektoitiin BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia), ja seosta sekoitettiin 70 °C:ssa kuivan typen atmosfåarisså 1,5 tuntia. TShan tummaan liuokseen lisåttiin jodiasetami-dia (189 mg, 0,99 mmoolia) ja seosta sekoitettiin 35 100 °C:ssa 6 tuntia. Seos våkevoitiin tyhjdssS ja jaannos 92207 21 liuotettiin asetonitriiliin (10 ml) ja liuosta kSsiteltiin IN HCl:lia (1,5 ml) 10 minuuttia. Muodostunut sakka keråt-tiin ja puhdistettiin pylvåskromatografisesti (kåånteis-faaslsilikageeli, Lichroprep, RP-18 EM Science) eluoiden 5 35-%:sella asetonitriili/H20:11a antamaan 51 mg (0,067 mmoolia, saanto 48 %) otsikkoyhdistetta tumman-oranssisena jauheena: Rt 3,29 minuuttia (puhtaus 87,5 %; HPLCrlia, eluentti: A/B=l/1, jossa A=50 % asetonitrii- lia/0,15 % kaliumfosfaattipuskuria, pH 3,5, B=80 % aseto-10 nitriilia/H20, muut olosuhteet: samat kuin esimerkisså 4 annetut).

IR (KBr) ΥαΛΧ : 3 423, 1 697, 1 625 cm'1.

UV (Me0H:H20; 1:1) simax : 234 (Σ 29,300), 290 (Σ 24,000), 240 run (Σ 10,100).

15 MS (FAB): m/z 766 (M+H)\ *H NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 1,19 (3H, d, J=7,2 Hz, 5 ’ -Me), 1,32 (3H, d, J=6,8 MHz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me), 2,63 (3H, brs, N-Me), 3,2 - 3,8 (m), 3,93 (3H, s, 11-OMe), 4,3 - 4,6 (4H, m), 5,5 (1H, br, D20, vaihtuva), 20 6,0 (1H, br, D20, vaihtuva), 6,89 (IH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,03 (IH, s, 4-H), 7,25 (2H, br, 12-H ja yksi C0NH2:sta, osittain vaihtuva, D20), 7,6 (1H, brs, yksi C0NH2:sta vaihtuva, D20), 8,0 (IH, s, 7-H), 8,62 (IH, d, J=7 Hz, CONH, D20, vaihtuva), 12,92 (1H, s, D20, vaihtuva).

25 Esimerkki 6 N-(etoksikarbonyylimetyyliJpradimisiini B:n valmistus (II, R1=CH3, R2=H, R3=CH3, R^-CHjCO^^)

Esimerkin 5 menetelmS toistettiin kSyttSen pradi-misiini B (100 mg, 0,14 mmoolia; 85-%:sesti puhdistettua 30 HPLC:llå), BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia) ja etyylijodiasetaat-tia (0,12 ml, 1,01 mmoolia); ja eluenttina pylvSskromato-grafiaa vårten vettS, 20-%:sta asetonitriili/H20 ja 40-%:sta asetonitriili/H20 antamaan otsikkoyhdiste (32 mg, saanto 29 %) oranssisena jauheena: Rt 5,63 minuuttia (puh-35 taus >95 %; HPLC, eluentti: 50-%:nen asetonitrii- 92207 22 li/O,15-%:nen kaliumfosfaattipuskuri, pH 3,5, muut olosuh-teet: samat kuin esimerkisså 4 annetut).

IR (KBr) : 3 426, 1 731, 1 635, 1 608 cm'1.

UV (MeOH:H20; 1:1) 1 wax : 234 (Σ 32,000), 290 (Σ 26,000), 5 468 nm (Σ 11,000).

MS (FAB): m/z 795 (M+H)\- HRMS: laskettu C39H43N2016: Ile (Μ+ΗΓ 795.2613, havaittu: 795.2594.

:H NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 1,22 (3H, t, J = 7 Hz, CH3CH2-), 1,29 (3H, d, J=7,3 Hz, 5’-Me ), 1,37 (3H, d, J=6,6 10 Hz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me), 3,12 (3H, s, N-Me), 3,85 (IH, m), 3,92 (3H, s, 11-OMe), 3,93 - 3,98 (2H, m), 4,08 - 4.6 (5H, m), 4,7 (IH, d, J = 6,7 Hz, l'-H), 6,9 (IH, d, J = 2 Hz, 10-H), 7,03 (IH, s, 4-H), 7,26 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8.06 (IH, s, 7-H), 8,54 (IH, d, J=7 Hz, CONH, D20, vaihtu- 15 va), 12,8 (IH, s, D20, vaihtuva).

Esimerkki 7 N-(natriumsulfometyyli)pradimisiini C:n valmistus (II, R1=CH3, Rz=B-D-ksylosyyli, R3=H, R*=-CH2S03Na)

Liuokseen, jossa oli pradimisiini C (50 mg, 20 0,058 mmoolia) vedessa (10 ml), lisåttiin natriumbikarbo- naattia (14,6 mg, 0,174 mmoolia) ja hydroksimetaanisulfo-nihappo natriumsuolaa (11,7 mg, 0,087 mmoolia). Koko seos-ta sekoitettiin 30 minuuttia huoneen låmpotilassa ja kyl-måkuivattiin antamaan 80 mg kiinteåta ainetta. Sp. >100 °C 25 (asteittainen hajoaminen).

IR (KBr) cm'1 : 1 618, 1 623.

uv ^ »ex (1/100N NaOH) nm E1^ : 319 (115), 498 (112).

·*· om 30 :H NMR (400 MHz, DMS0-d6) 6 : 1,20 (3H, d, J = 6,5 Hz, 5' -CH3), 1,30 (3H, d, J=6,9 Hz, CH-CH3), 2,23 (3H, s, 3-CH3), 3,90 (3H, s, 11-0CH3), 4,59 (IH, d, J=7,7 Hz, l'-H), 6,71 (IH, d, J=2,0 Hz, 10-H), 6,93 (IH, s, 4-H), 7,13 (IH, d, J=2,0 Hz, 12-H), 7,71 (IH, s, 7-H).

92207 23

Esimerkki 8 N-(natriumsulfometyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, Rx=CH3, R2=8-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4 = -CH2S03Na)

Suspensioon, jossa oli pradimisiini A HC1 (50 mg, 5 0,057 mmoolia) H20:ssa (5 ml), lisåttiin natriumbikarbo- naattia (9,6 mg, 0,114 mmoolia) ja hydroksimetaanisulfoni- happo-natriumsuolamonohydraattia (8,7 mg, 0,057 mmoolia) ja koko seosta sekoitettiin huoneen låmpdtilassa 2 tuntia ja kylmakuivattiin sitten antamaan nåyte (63 mg; teoreet- 10 tisesti=59 mg), jonka havaittiin protoni-NMR:11a olevan seos, jossa oli otsikkoyhdistettå ja pradimisiini A suh- teessa, joka oli n. 1:3. Molempien komponenttien taydel- linen erottaminen ei onnistunut. Sp. >220 °C.

IR Ymax (KBr) cm’1 : 3 413, 1 618, 1 603, 1 442, 1 384, 15 1 355, 1 290, 1 256.

UV 3 „„ (H20) nm _1% : 222 (241), 276 (197).

^lcm XH NMR (DMS0-d6 + D20) 6 : 1,14 ja 1,23 [kokonaismåårå 3H (n. 3:1), kukin d, J5'.Me=6,4 Hz, 5'-Me] , 1,31 (3H, d, 20 Ji7.Me=^,8 Hz, 17-Me), 2,22 ja 2,24 [kokonaismåårå 3H (n.

1:3), kukin s, 4'-NMe], 2,40 (3H, s, 3-Me), n. 3,0 - 3,2 (3H, m, 2"-H, 5"-Hax, ja 3"-H), m. 3,6 (2H, m, 2'-H, ja 3' -H), 3,70 (1H, dd, J5-e*.5-eq=11'2 Hz, J4-.5 wq=5,4 Hz, 5"-Heq), 3,90 (3H, s, 11-OMe), 4,10 (IH, q, 17-H), 4,36 25 (1H, d, Jx».2- = 7,3 Hz, 1"-H), 4,39 (IH, d, J5 6=10,8 Hz, 5-H), 4,44 (1H, d, ^0.12=2/4 Hz, 10-H), 6,93 (IH, s, 4-H), 7,14 (IH, d, 12-H), 7,69 (IH, s, 7-H).

Esimerkki 9 N-formyylipradimisiini A:n valmistus (II, R1=CH3, 30 R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4=-C0H)

Seokseen, jossa oli pradimisiini A HC1 (100 mg, 0,11 mmoolia) ja BSA (0,50 ml, 2 mmoolia) metyleeniklori-dissa (2 ml), lisåttiin etikkamuurahaishappoanhydridia (0,1 ml) ja seosta sekoitettiin y5n yli huoneen låmpoti-35 lassa. Seokseen lisåttiin IN HC1 (1 ml) ja MeOH (3 ml), ja seos våkevoitiin alennetussa paineess~. Jåånnos liuotet- 92207 24 tiin pieneen mååråån vesipitoista NaHC03 ja kromatografoi-tiin pylvååsså, jossa oli C1B-silikageeliå (20 mm x 150 mm) kåyttåen vettå ja sitten 10-%:sta asetonitriili-vettå eluenttina. Asetonitriilijakeet tutkittiin HPLC:llå ja 5 halutut jakeet yhdistettiin, våkevditiin ja kylmåkuivat-tiin antamaan otsikkoyhdiste (78 mg, saanto 82 %) tumman-punaisena amorfisena jauheena. Sp. 250 °C (haj.).

IR /max (KBr) cm-1 : 1 653 - 1 607, 1 445, 1 162.

uv 2 max (1/100N NaOH) nm (Σ) : 319 (14 300), 497 (13 900).

10 MS (SIMS): m/z 891 (M+Na)*.

NMR (DMS0-d6) δ : 1,04 (3H, d, J=6,4 Hz, 6'-H)*\ 1,33 (3H, d, J=7,2 Hz, alanyyli-CH3), 2,26 (3H, s, 3-CH3), 2,97 (3H, s, N-CH3), 3,68 (IH, dd, J=5 & 12 Hz, 5M,-H), 3,90 (3H, s, 0CH3), 4,34 (IH, qui, J=7,2 Hz, alanyyli-CH), 4,40 15 (IH, d, J=8 Hz, 1"-H), 4,44 (2H, m, 5,6-H), 4,74 (IH, d, J=8 Hz, l'-H), 6,71 (IH, d, J=2,l 10-H), 6,85 (IH, s, 4-H), 7,11 (IH, d, J=2,1 Hz, 12-H), 7,75 (IH, s, 7-H), 7,92 (s, CHO)**, 8,65 (IH, br, CONH)*, 13,20 (IH, br)*, 15,15 (IH, br)*.

20 *Katosi lisåttåeså D20.

**yhdesså signaalin kanssa, joka johtuu alhaisesta rotaa-tiosta.

Esimerkki 10 N-glysyyli-pradimisiini A:n valmistus (II, R1=CH3, 25 R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R^-COCH^*)

Liuokseen, jossa oli pradimisiini A HC1 (105 mg, 0,12 mmoolia) ja BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia) kuivassa mety-leenikloridissa (3 ml), lisåttiin N-t-Boc-glysiinin 1-bentsotriatsolyyliesteriå (350 mg, 1,2 mmoolia). Seosta 30 kuumennettiin palautusjååhdyttåen y6n yli ja jååhdytettiin sitten huoneen låmpotilaan. 1M liuosta, jossa oli tetrabu-tyyliammoniumfluoridia tetrahydrofuraanissa (2,5 ml) lisåttiin ja seosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneen låmpo-tilassa ja våkevoitiin sitten alennetussa paineessa. Jåån-35 nos laimennettiin H20:lla, tehtiin happamaksi IN HCl:llå 92207 25 pH-arvoon 5 ja muodostunut kiinteå aine keråttiin suodat-tamalla. Suodos uutettiin etyyliasetaatilla, liuotin haih-dutettiin ja jåånnds yhdistettiin vasta saadun kiinteån aineen kanssa. Seos kromatografoitiin C18 pylvSSsså kåyt-5 tåen 40-%:sta asetonitriili-pH 3,5 puskuria. Jakeet, jotka sisålsivåt haluttua tuotetta, yhdistettiin ja haihdutet-tiin alennetussa paineessa. JåånnOs liuotettiin etyyliase-taattiin ja pestiin vedellå. Orgaaninen kerros kuivattiin Na2S04:llå ja haihdutettiin antamaan 52 rag (46 %) pradimi-10 siini A:n N-t-Boc-glysyylijohdannaista.

XH NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ : 1,03 (3H, d, J=6,0 Hz, 6' -H )**, 1,33 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-CH3), 1,37 ja 1,38 (9H, s, tert-butyyli), 2,29 (3H, s, 3-CH3), 3,0 - 3,2 (5H, m, 4' -H, 2"-5"-H), 3,71 (IH, dd, J=5,4 ja 11 Hz, 5"-H), 3,95 15 (3H, s, ll-OCHj), 4,39 (IH, qui, J=7,3 Hz, 17-H), 4,4 - 4,6 (3H, m, 5-H, 6-H, 1"-H), 4,71 (IH, d, J=6,8 Hz, 1'-H), 4,9 - 5,1 (3H, br-s, OH)*, 5,6 - 5,8 (IH, br-s, OH)*, 5,99 (IH, br-s, OH)*. 6,91 (IH, s, 10-H), 7,02 (IH, s, 4-H), 7,27 (IH, s, 12-H), 8,00 (IH, s, 7-H), 8,62 (IH, s, 20 16-NH)*, 12,57 (IH, br-s, OH)*, 12,94 (IH, s, OH)*.

*Katosi lisåttåesså D20.

**Yhdesså signaalin kanssa, joka johtui alhaisesta rotaa-tiosta.

Liuosta, jossa oli N-(N-t-Boc-glysyyli)-pradimisii-25 ini A (52 mg, 0,055 mmoolia) trifluorietikkahapossa (TFA) (1 ml), sekoitettiin 30 minuuttia huoneen låmpdtilassa. Sen jålkeen, kun TFA oli haihdutettu, isopropyylieetteriå lisåttiin jSannbkseen ja muodostunut sakka kerattiin suo-dattamalla. Seos puhdistettiin HPLC:lia (Nihon seimitsu, 30 pylvås NS-20250, liuotin 30-%:nen MeCN-pH 3,5 puskuri), mitå seurasi kromatografia C18 silikageelipylvSåså kSyttå-en 25 - 30-%:sta asetonitriili-H20: ta eluenttina antamaan otsikkoyhdiste (23,0 mg, saanto 46 %) eluaatin kylmåkui-vaamisen jålkeen. Sp. >220 °C (haj.).

92207 26 IR / »ax (KBr) cm'1 : 3 413, 2 390, 1 620, 1 380, 1 332, 1 054.

UV /, max (0,01N NaOH) nm (Σ) : 320 (12,300), 497 (12,000). MS (FAB): m/z 900 (M+3H)*.

5 *H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ : 1,08 (3H, d, J=6,4 Hz, 6' -H )**, 1,33 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-CH3), 2,26 (3H, s), 3,69 (IH, dd, J=5,6 & 11,1 Hz, 5"-H)**, 3,91 (3H, s, ll-OCH3), 4,25 (IH, br-m, 17-H), 4,4 - 4,5 (2H, 5-H, 6-H), 4,48 (IH, d, J=7,7 Hz, 1"-H), 4,73 (IH, d, J=7,3 Hz, l'-H)**, 5,0 -10 5,15 (3H, brs, OH)*, 5,72 (IH, br-s, OH)*, 5,80 (IH, br-s, OH)*, 6,71 (IH, d, J=2,6 Hz, 10-H), 6,83 (IH, s, 4-H), 7,13 (IH, d, J=2,6 Hz, 12-H), 7,74 (IH, s, 7-H), 8,6 (IH, br, 16-NH )*.

*Katosi lisSttåesså D20.

15 **Yhdessa signaalin kanssa, joka johtui alhaisesta rotaa-tiosta.

Esimerkki 11 N-(β-alanyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, R1=CH3, R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4=-C0(CH2) 2NH2) 20 Liuokseen, jossa oli pradimisiini A HCL (100 mg, 0,11 mmoolia) ja BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia) kuivassa mety-leenikloridissa (5 ml), lisåttiin N-t-Boc-B-alaniinin 1-bentsotriatsolyyliesteriS (349 mg, 1,1 mmoolia). Seosta palautusjååhdytettiin 2 påivåå ja jaahdytettiin sitten 25 huoneen lSmpbtilaan. 1M liuosta, jossa oli tetrabutyyliam-moniumfluoridia tetrahydrofuraanissa (3 ml), lisåttiin ja purppuranpunaista seosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneen lampotilassa. Liuottimen haihduttamisen jålkeen alennetus-sa paineessa etyyliasetaattia ja 10-%:sta sitruunahappoa 30 lisåttiin jSfinnokseen. Seosta sekoitettiin ja suodatettiin sitten liukenemattoman kiinteån aineen kerSSmiseksi ja orgaaninen kerros erotettiin ja pestiin vedellå ja suola-liuoksella. Liukenematon kiinteå aine lisåttiin orgaani-seen kerrokseen ja seos våkevoitiin. JSånnos kromatogra-35 foitiin C18 silikageelipylvååsså eluoiden 35-40-%: sella 92207 27 asetonitriili-H20:11a. Haluttua yhdistettS sisaltåvåt ja-keet yhdistettiin, haihdutettiin ja uutettiin etyyliase-taatilla. Uutteet våkevditiin ja kylmSkuivattiin 1,4-diok-saanista antamaan 100 mg (87 %) N-t-Boc-8-alanyylijohdan-5 naista.

XH NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ : 1,3 - 1,4 (tert-butyyli), 2,28 (3H, s, 3-CH3), 3,71 (IH, dd, J=5,4 ja 11 Hz, 5"-H)*\ 3,93 (3H, s, 11-OMe), 4,38 (IH, qui, J=7,3 Hz, 17-H), 4,4 - 4,7 (3H, m, 5-H, 6-H, 1"-H), 4,70 (IH, d, J=7,3 Hz, 10 1' -H )**, 4,9 - 5,1 (3H, OH)*, 5,7 - 5,9 (2H, OH)*, 6,83 (IH, d, 3=2,2 Hz, 10-H), 6,95 (IH, s, 4-H), 7,20 (IH, d, J=2,2 Hz, 12-H), 7,90 (IH, s, 7-H), 8,69 (IH, br, 16-NH)*, 13,03 (IH, s, OH)*.

*Katosi lisSttSesså D20:ta.

15 **Yhdesså signaalin kanssa johtuen alhaisesta rotaatiosta.

Liuosta, jossa oli N-(N-t-Boc-8-alanyyliJpradimi-siini A (90 mg, 0,089 mmoolia) TFA:ssa, sekoitettiin 15 minuuttia huoneen lSmpOtilassa. TFA:n haihduttamisen jålkeen jSSnnds kromatografoitiin C18 silikageelipylvååssa 20 20 - 40-%:sella asetonitriili-H20:11a eluoiden. Jakeet, jotka sisSlsivåt haluttua yhdistettå, yhdistettiin ja vå-kevditiin. Jåånnds liuotettiin pieneen mååråSn vettå ja kylmakuivattiin antamaan 20 mg (25 %) N-(8-alanyyli)pradi-misiini A amorfisena jauheena. Sp. >230 °C (haj.).

25 IR nax (KBr) cm*1 : 3 390, 1 620, 1 445, 1 386, 1 260.

UV 'λ »«* (0,01N NaOH) nm (Σ) : 318 (13,000), 498 (12,700). MS (FAB): m/z 912 (M+H)\ XH NMR (400 MHz, DMSO-d6) 6 : 0,95 (3H, br, 5 ’ -CH3), 1,33 (3H, d, J=7,3 Hz, I7-CH3), 2,23 (3H, s, 3-CH3)**, 3,74 (1H, 30 dd, J=4,7 ja 11 Hz, 5’’-H)**, 3,91 (3H, s, 11-OMe), 4,2 (1H, br, 17-CH), 4,3 - 4,5 (3H, m, 5-H, 6-H, 1"-H), 4,61 (1H, d, 3=7,8 Hz, 1' -H )**, 4,9 - 5,2 (2-3H, OH)*, 5,6 - 5,9 (2H, OH)*, 6,71 (1H, d, 3=2,1 Hz, 10-H), 6,82 (IH, s, 4-H)**, 7,13 (1H, br, 12-H), 7,73 (IH, s, 7-H), 8,22 (1H, br, 35 16-NH)*, 8,30 (IH, S, OH)*.

92207 28 *Katosi lisåttåesså D20:ta.

**Yhdessa signaalin kanssa johtuen alhaisesta rotaatiosta. Esimerkki 12 N-(trans-3-metoksikarbonyyli-2-propenyyli)pradimi-5 siini A:n valmistus (II, R1=CH3, R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4=-CH2CH=CHCO 2CH3)

Liuokseen, jossa oli pradimisiini A HC1 (78 mg, 0,089 mmoolia) ja BSA (0,44 ml, 1,8 mmoolia) kuivassa di-kloorimetaanissa (3 ml), lisåttiin metyyli-4-bromikroto-10 naattia (80 mg, 0,445 mmoolia) ja seosta palautusjaahdy-tettiin 4 påivåå. Liuotin haihdutettiin ja jaannos liuo-tettiin seokseen, jossa oli metanolia (3 ml) ja IN HC1 (3 ml). Metanoli haihdutettiin ja vesipitoinen konsent-raatti kromatografoitiin C18 silikageelipylvååssa. Pylvas 15 pestiin vedellå ja eluoitiin sitten 70-%:sella vesipitoi-sella asetonitriililla. HPLC:llå tutkitut halutut jakeet yhdistettiin, vakevoitiin ja kylmakuivattiin antamaan 55 mg (saanto 66 %) otsikkoyhdistetta. Sp. >180 'C.

IR '^mx (KBr) cm’1 : 1 720, 1 610, 1 440.

20 UV i- max (1/100N NaOH) nra ( ) : 300 (220), 500 (223).

i cm MS (FAB): m/z 939 (M+H)\ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ (ppm) : 1,13 (3H, d, J=6 Hz, 25 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me), 3,95 (3H, s, 0CH3), 4,39 (IH, qui, J = 7,3 Hz, alanyyli-CH), 6,00 (IH, d, J-15,8 Hz, =CH-C00Me), 6,83 (IH, dt, J-15,8 ja 5,5 Hz, CH2-CH=CH-COOMe), 6,90 (IH, br-s, 10-H), 7,02 (IH, s, 4-H), 7,27 (IH, d, J=2,2 Hz, 12-H), 8,00 (IH, s, 30 7-H).

29 92207

Esimerkki 13 N-(trans-3-karboksi-2-propenyyli)pradimisiini A :n valmistus (II, R1 = CH3, R2=B-D-ksylosyyli, R3=CH3, R4 = -CH2CH-=CHC02h) 5 Liuosta, jossa oli N-(trans-3-metoksikarbonyyli-2- propenyyli)pradimisiini A seoksessa, jossa oli metanolia ja IN NaOH, sekoitettiin huoneen lampotilassa yon yli. Metanoli haihdutettiin ja vesipitoinen jaannos tehtiin happamaksi IN HC1:11S ja kromatografoitiin sitten C16 si-10 likageelipylvaassa. Pylvas pestiin vedella ja eluoitiin 40-%:sella vesipitoisella asetonitriililla. HPLCrlla tut-kitut halutut jakeet yhdistettiin, vakevoitiin ja kylma-kuivattiin antamaan 34 mg (saanto 85 %) otsikkoyhdistetta. Sp. >180 °C.

15 IR V max (KBr) cm'1 : 1 610, 1 450, 1 390.

uv ?' max (1/100N NaOH) nm ( E1% ) : 320 (235), 500 (235).

lcm MS (FAB): m/z 927 (M+3H)\ 949 (M+Na+2H) *.

20 :H NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ (ppm) : 1,13 (3H, d, J=6,4 Hz, 5'-Me), 1,33 (3H, d, J = 7,2 Hz, 17-Me), 2,25 (3H, s, 3-Me), 2,56 (3H, s, N-Me), 3,91 (3H, s, OMe), 4,3 - 4,5 (3H, m, 5,6-H ja 17-H), 4,60 (IH, d, J=7,7 Hz, 1'-H) , 5,90 (1H, d J=15,8 Hz, =CH-C00H), 6,72 (IH, d, J=2,l Hz, 10-H), 6,73 25 (1H, dt, J=15,8 ja 5,5 Hz, CH=CH-C00H), 6,86 (IH, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=2,1 Hz, 12-H), 7,76 (IH, s, 7-H).

Esimerkki 14 N-(glysyyli)pradimisiini B formiaattisuolan valmistus (II, r1 = ch3, r2 = h, r3=ch3, r4=-coch2nh2) 30 Sekoituksenalaiseen liuokseen, jossa oli pradimi siini B metyyliesteri HC1 (114 mg, 0,15 mmoolia; 80-%:ses-ti puhdas HPLC:lla) ja trietyyliamiinia (20 μΐ, 0,15 mmoolia; kuivattu 4Å molekyyliseuloilla) kuivassa dimetvyli-formamidissa (2 ml; kuivattu 3Å molekyyliseuloilla), li-25 sattiin huoneen lampotilassa N-(t-Boc)- glysiini-N-hydrok- . · 92207 30 sisukkiini-imidiesteria (204 mg, 0,75 mmoolia; Sigma). Seosta sekoitettiin 22 °C:ssa kuivassa typen atmosfaårissa 12 tuntia ja vakevOitiin sitten tyhjossa låhes kuiviin. Oljymaista jaanndstå kuivajauhettiin n-pentaanissa useita 5 kertoja ja kromatografoitiin (Si02; MeOH-CH2Cl2/5:95 -15:85) antamaan 120 mg raakaa hyvin asyloitua ainetta: Rt 1,84 minuuttia (puhtaus 75 %; HPLC, pylvds: Microsorb

Short One C18, 4,6 mm I.D. x 100 mm, 3 pm, Rainin Instrument Company, eluentti: A/B = 1:1, A, asetonitriili-O,15 % 10 KH2P04 pH 3,5 = 1:1, tilav./tilav; B, asetonitriili-HzO = 4:1, virtausnopeus 1,2 ml/minuutti, havainnot: UV absorp-tio 254 nm:ss3).

TSmS raaka hyvin asyloitu aine (80 mg) MeOH:ssa (6,5 ml) sekoitettiin 0,25N NaOH:n kanssa (3,2 ml), ja 15 seosta sekoitettiin huoneen ISmpdtilassa 6 tuntia. Tama tehtiin happamaksi hitaasti ja varovasti 0,1N HCl:lla kun-nes pH oli 2 (pH-paperi). Samea seos laimennettiin H20:lla (6,5 ml) ja MeOH poistettiin tyhjOsså. Saatu sakka suoda-tettiin, pestiin H20:lla ja kuivattiin antamaan 25 mg 20 (0,029 mmoolia, saanto 29 %) otsikkoyhdistetta raakana kiinteanS aineena: Rt 2,12 minuuttia (puhtaus 75 %, HPLC:llå, olosuhteet: kuten edelia).

TSmS 75-%:sesti puhdas raaka aine (200 mg) puhdis-tettiin pylvSskromatografisesti kMyttåen Michel- Miller 25 High Performance Low Pressure Liquid Chromatography Sys-tem:ia (Ace Glass Inc.) C-18 KåMnteisfaasi silikageelillå (Whatman Partisil Prep 40 ODS-3, C-18; 1,5 cm x 30 cm). PylvSs eluoitiin H20:lla ja sitten 80-%:sella asetonitrii-li-H20:lla antamaan 20 mg N-(t-Boc-glysyyli)pradimisiini B 30 punaisena jauheena: Rt 3,48 minuuttia (puhtaus 97 %; HPLC, pylvfls: Waters Radial Pak C18, eluentti: 50 % (pH 4, 0,05M ammoniumfosfaattipuskuria)/(80-%:nen asetonitriili H20:ssa), virtausnopeus: 4 ml/minuutti. s.p. 170 °C - 270 °C (hajoaa hitaasti).

35 IR (KBr) ^ nax : 3 420, 1 730, 1 630, 1 610 cm'1.

92207 31 UV (MeOH: H20 = 1:1) ^ max : 232 (Σ 32,200), 290 (Σ 26,100), 468 nm (Σ 11,000).

MS (FAB): m/z 866 (M+H)\ 766 (M-tBoc+2H)*, 433.

XH NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 (ppm): 0,97, 1,07 (3H, 2d, J=6 5 Hz, 5' -Me), 1,31 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 1,36 (9H, s, tBu), 2,29 (3H, s, 3-Me), 3,02, 3,14 (3H, 2s, N-Me), 3,5 - 4.0 (6H, m, 2' -H, 3’-H, 4'-H, 5'-H, CH2), 3,95 (3H, s, 11-OMe), 4,38 (IH, qi, J=7 Hz, 17-H), 4,4 - 4,6 (2H, m, 5-H, 6-H), 4,71 (IH, br, l’-H), 5,13, 5,42, 6,61, (3H, br, 10 vaihtuva, D20), 6,16 (IH, br s, OH, vaihtuva D20), 6,58 (IH, t, J=5 Hz, NH, vaihtuva D20), 5,94 (IH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,08 (IH, s, 4-H), 7,29 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,07 (IH, s, 7-H), 8,55 (IH, d, J=7 Hz, CONH, vaihtuva, D20), 12,84 (IH, s, vaihtuva, D20).

15 Seosta, jossa oli N-(t-Boc-glysyyli)pradimisiini B

(30 mg, 0,035 mmoolia, puhtaus n. 86 %) 80-%:sessa muura-haishapossa (3 ml), sekoitettiin huoneen lSmpbtilassa 6 tuntia. Liukenematon aines poistettiin suodattamalla ja suodos vSkevOitiin tyhjOssS kuiviin. JéénnQs kuivajauhet-20 tiin EtOAc:llS ja kuivattiin antamaan 20 mg (0,025 mmoolia, saanto 70 %) otsikkoyhdistetta punaisena jauheena: Rt 2,31 minuuttia (puhtaus 80 %; HPLC, 50 % A/B (ammoniumfos-faattipuskurisysteemi), virtausnopeus 2 ml/minuutti; tåmå aine oli vapaa pradimisiinista B, <2 %).

25 IR (KBr) : 3 420, 1 730, 1 630, 1 610 cm'1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) ^ Bax : 234 (Σ 17,400), 290 (Σ 14,100), 464 nm (Σ 6,100).

MS (FAB): m/z 766 (M+H-HC02H) + .

XH NMR (300 MHz, DMS0-d6/D20/DCl) δ (ppm): 1,00, 1,08 (3H, 30 2d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,23 (3H, s, 3-Me), 3,13 (3H, br, N-Me), 3,71 (3H, s, 11-OMe), 3,7 - 4.0 (4H, m, 2' -H), 3'-H, 4'-H, 5-H), 4,1 - 4,8 (6H, m, 17-H, 5-H, 6-H, l'-H, CH2), 6,60 (IH, br s, 10-H), 7,00 (IH s, 4-H), 7,09 (IH, br s, 12-H), 7,83 (IH, s, 7-H), 8,08 35 (IH, s, HC02).

32 92207

Esimerkki 15 N-(N,N-dimetyyliglysyyli)pradlmisiini B: n valmis-tus (II, R1 = CH3, R2 = H, R3 = CH3, R4 * -COCH2N(CH3)2

Sekoituksenalaiseen liuokseen, jossa oli pradimi-5 siini B metyyliesteri HC1 (500 mg, 0,66 mmoolia; 81-%:sesti puhdas HPLCrllå) ja trietyyliamiinia (92,4 μΐ, 0,66 mmoolia) kuivassa dimetyyliformamidissa (12 ml, kui-vattu 3Å molekyyliseuloilla) lisSttiin huoneen lSmpotilas-sa N,N-dimetyyliglysiini-N-hydroksisukkiini-imidiesteria 10 (1,68 g, 8,4 mmoolia), ja seosta sekoitettiin n. 40 °C:ssa 24 tuntia. TahSn seokseen lisåttiin lisaa N,N-dimetyyli-glysiini-N-hydroksisukkiini-imidiesteria (1,68 g, 8,4 mmoolia) ja seoksen sekoittamista jatkettiin n. 45 °C:ssa ylimaåråiset 48 tuntia. Liuotin poistettiin tyh-15 josså ja jåånndstå kuivajauhettiin toistuvasti pentaanilla ja sitten eetterilia. Tama aine liuotettiin seokseen, jossa oli MeOH (30 ml) ja H20 (20 ml) ja tahan lisåttiin kylma liuos, jossa oli NaOH (1,6 g) H20:ssa (15 ml) 15 minuutin aikana. Seosta sekoitettiin huoneen lampdtilassa 2 tuntia, 20 neutraloitiin pH 7:aan lisaamaiia H3P04 jaahauteessa, ja muodostunut sakka poistettiin. Suodos våkevOitiin ja jåån-nds puhdistettiin pylvaskromatografisesti (kåånteisfaasi-silikageeli, Whatman Partisil Prep 40 ODS-3, C-18). Pylvas eluoitiin ensin H20:lla ja sitten 50-%:sella asetonitrii-25 li/H20:lla antamaan 86 mg (0,10 mmoolia, saanto 15 %) ot-sikkoyhdistetta punertavan ruskeana jauheena: Rt 5,36 mi-nuuttia (puhtaus 74 %; HPLC, pylvås: Waters Radical PAK C18, eluentti: (pH 4 puskuri, 0,05M ammoniumfosfaat- ti)/(80-%:nen asetonitriili H20:ssa) = 3:2, virtausnopeus: 30 2 ml/minuutti).

IR (KBr) '/„a, : 3 400, 1 640, 1 610 cm*1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) 7)nax: 234 (Σ 26,200), 288 (Σ 21,300), 476 nm (Σ 9,000).

MS (FAB): m/z 794 (M+H) + ; HRMS, laskettu C39H44N3015( M+H) ’ 35 799,2772, havaittu 799,2774.

• 33 922 ΰ 7 ΧΗ NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0,99 (3/4 Η, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,01 (3/2 H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,10 (3/4 H, d, J=6, Hz, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me), 2,73 (3H, s, NMe2), 2,77 (3H, s, NME2), 3,10, 5 3,14 (3H, 2s, 4' -NMe), 3,5 - 4,3 (m), 3,90 (3H, s, 11- OMe), 4,3 - 4,5 (m, 17-H, 5-H, 6-H), 4,6 - 4,75 (m, l'-H), 6,72 (IH, s, 10-H), 6,85 (IH, s, 4-H), 7,12 (IH, s, 12- H), 7,77 (IH, s, 7-H), 8,82, 8,84 (IH, 2d, J=7,2 Hz, CONH, vaihtuva, D20), 13,14 (IH, s, vaihtuva, D20).

10 N, N-dimetyyliglysiini-N-hydroksisukkiini-imidies- teri valmistettiin seuraavalla menetelmalia.

Sekoituksenalaiseen seokseen, jossa oli N-hydrok-sisukkiini-imidia (11,5 g, 0,1 mmoolia) ja N,N-dimetyyli-glysiiniå (10,3 g, 0,1 mmoolia) CH2Cl2:ssa (200 ml), lisat-15 tiin N,N-disykloheksyylikarbodi-imidiS (22,1 g, 0,11 mmoolia), ja seosta sekoitettiin huoneen låmpOtilassa 18 tun-tia, kuumennettiin palautusjaahdyttaen 10 minuuttia ja annettiin sitten sekoittua ylimaaraiset 4 tuntia. Sakka poistettiin ja suodos haihdutettiin. Oljymainen jåånnos 20 kuivajauhettiin n-heksaanissa ja kiintea aine uutettiin vedettOmaiia eetterilia, poistaen liukenemattomat aineet. Eetterin haihduttaminen tyhjOssa antoi 13,0 g (0,065 mmoolia, saanto 65 %) otsikkoyhdistetta valkoisena kosteutta sitovana kiinteana aineena.

25 IR (KBr) s/ Bax : 1 780, 1 710, 1 650 (br) cm*1.

MS (DCI): m/z 201 (M+H)\ XH NMR (200 MHz, CDC13) δ ppm: 2,40 (6H, s, NMe2), 2,81 (4H, s, CH2CH2), 3,51 (2H, s, NCH2).

Esimerkki 16 30 N-(N,N-dimetyyliglysyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, R1 = CH3, R2 = β-D-ksylosyyli, R3 = CH3, R4 = C0CH2N-(CH3)2

Seokseen, jossa oli pradimisiini A HC1 (61 mg, 0,07 mmoolia) ja BSA (0,35 ml, 1,4 mmoolia) dikloorimetaa-35 nissa (1,2 ml), lisattiin N,N-dimetyyliglysyylikloridi HC1 92207 34 (55 mg, 0,35 mmoolia). Seosta sekoitettiin huoneen låmpo-tilassa yksi tunti ja vSkevOitiin tyhjOssa. Jå3nn5s liuo-tettiin seokseen, jossa oli metanolia (2 ml) ja IN HC1 (1 ml). Metanoli haihdutettiin ja vesipitoinen jåånnos 5 kromatografoitiin C18 silikageelipylvaassa. Pylvés pestiin vedelia ja eluoitiin 30-%:sella vesipitoisella asetonit-riililia antamaan 42 mg (saanto 65 %) otsikkoyhdistettå. SP. >190 “C (asteittainen hajoaminen).

IR (KBr) cm'1: 1 620 10 UV } oax (1/100N NaOH) nm (Σ): 318 (15 200), 497 (14 600). MS (FAB): m/z 926 (M+H)\

Hi NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ (ppm) : 1,00, 1,11 (kokonais-måara 3H, 2d, J=6,4 Hz, 5’-Me), 1,34 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,28, 2,29 (kokonaismaara 3H, 2s, 3-Me), 2,67 (3H, 15 s, N-Me), 2,72 (3H, s, N-Me), 3,90 (3H, s, OMe), 6,72 (IH, d, J=2,6 Hz, 10-H), 6,83 (IH, s, 4-H), 7,12 (IH, m, 12-H), 7,76 (IH, s, 7-H).

Esimerkki 17 N-karbamyylipradimisiini B:n valmistus (II, R1 = 20 CH3, R2 = H, R3 = CH3, R4 = -C0NH2)

Sekoituksenalaiseen suspensioon, jossa oli pradi-misiini B-metyyliesteri-HCl (100 mg, 0,13 mmoolia) aseto-nitriilissa (5 ml), lisattiin BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia) ja seosta kuumennettiin 50 °C:ssa 30 minuuttia. Tahan seok-25 seen, jaahdyttamisen jålkeen huoneen lampotilaan, lisattiin trietyyliamiinia (18 μΐ, 0,13 mmoolia), mita seurasi trikloorimetyylikarbonyyli-isosyanaatti (32 μΐ, 0,26 mmoolia). Tata seosta sekoitettiin huoneen lampOtilassa kuivan typen atmosfaarissa 20 tuntia, jona aikana HPLC ilmoitti 30 uuden tuotteen muodostumisesta Rt 5,42 minuutissa (HPLC, pylvås: Waters Radical PAK C18). Seos laimennettiin

MeOH:lla (2 ml) ja sita kasiteltiin IN HCl:lia (1 ml), eluentti: A/B = 35/65, jossa A = pH 4, 0,5M ammoniumfos-faattipuskuri, B = 80-%:nen asetonitriili H20:ssa, vir-35 tausnopeus: 3 ml/minuutti. Seos vakevditiin nopeasti 92207 35 tyhjOsså kuiviin. jaannOs liuotettiin 5-%:seen asetonit-riiliin H20:ssa (10 ml) ja sekoitettiin huoneen låmpotilas-sa 18 tuntia. Muodostunut kiinteS aine kerattiin antamaan 77 mg seosta, jossa oli N-(karbamyyli)- ja N-(trikloorime-5 tyylikarbonyylikarbamyyli)desksylosyylipradimisiini A-me-tyyliesteriå: Rt 2,06 minuuttia (49 %) ja 5,42 minuuttia (38 %) (HPLC, olosuhteet: samat kuin edelia).

TSma seos (77 mg) liuotettiin liuokseen, jossa oli asetonitriilia (2 ml) ja H20 (2 ml). Tåhan lisattiin liuos, 10 jossa oli NaOH (10 mg) H20:ssa (0,5 ml), ja seosta sekoitettiin huoneen lampOtilassa 30 minuuttia, johon mennessa HPLC ilmoitti taydellisesta reaktiosta. Tåmå tehtiin varo-vasti happamaksi pH-arvoon 2,5 laimealla H3P04:lia. Sakka kerattiin ja puhdistettiin pylvaskromatografisesti (kaan-15 teisfaasisilikageeli, Partisil Prep 40 ODS-3, C-18) elu- oiden (80-%:nen asetonitriili/H20): (pH 4, 0,025M ammoniumf osf aattipuskuri) = 1:4. Tarkoituksenmukaiset jakeet kerattiin, tehtiin happamaksi pH-arvoon 2,5 laimealla H3P04:lia ja vakevttitiin asetonitriilin poistamiseksi. Muo-20 dostunut sakka kerattiin, pestiin H20:lla ja kuivattiin tyhjOssa antamaan 31 mg (0,041 mmoolia, saanto 32 %) ot-sikkoyhdistetta tummanpunaisena jauheena. Sp. >120 “C (haj.).

Rt 3,99 minuuttia (puhtaus 75 %; HPLC, pylvås: sama 25 kuin edelia, eluentti: A/B = 55/45, jossa A ja B ovat kuten edelia on maaritetty, virtausnopeus: 2 ml/minuutti). IR (KBr) : 3 400, 1 730 (w), 1 620 (br) cm'1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) /|MX : 234 (Σ 27,700), 292 (Σ 22,900), 462 (Σ 9,880).

30 MS (FAB): m/z 752 (M+H)*; HRMS, laskettu C36H38N3015(M+H Γ 752,2303, havaittu 752,2288.

*H NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 1,01 (3H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7 Hz, 17-H), 2,28 (3H, s, 3-Me), 3,01 (3H, s, N-Me), 3,66 (IH, brs), 3,77 (IH, m), 3,94 35 (3H, s, 11-OMe), 4,35 - 4,6 (5H, m, 17-H), 5-H, 6-H, 92207 36 l'-H), 6,93 (IH, s, 10-H), 7,09 (IH, s, 4-H), 7,29 (IH, s, 12-H), 8,06 (IH, s, 7-H), 8,55 (IH, d, J=6,5 Hz, CONH, vaihtuva, D20), 12,85 (IH, s, vaihtuva, D20).

Esimerkki 18 5 N-(N-metyy1ikarbamoyy1i)pradimisiini B:n valmistus (II, R1 = CH3, R2 = H, R3 = CH3, R4 = -C0NHCH3)

Sekoituksenalaiseen suspensioon, jossa oli pradi-misiini B-metyyliesteri-HCl (100 mg, 0,13 mmoolia) aseto-nitriilisså (5 ml), lisåttiin BSA:ta (0,6 ml, 2,4 mmoolia) 10 ja seosta kuumennettiin 50 eC:ssa 30 minuuttia. Tåhån seokseen, jaahdyttåmisen jaikeen huoneen lampOtilaan, in-jektoitiin trietyyliamiinia (18 μΐ, 0,13 mmoolia), mitå seurasi metyyli-isosyanaatti (7,7 μΐ, 0,13 mmoolia). Seosta sekoitettiin huoneen lampOtilassa kuivan typen atmos-15 faarissa kaksi tuntia, sitten injektoitiin ylimMarainen maarS metyyli-isosyanaattia (15,4 μΐ, 0,26 mmoolia) ja sekoittamista jatkettiin toiset nelja tuntia. MeOH:lla (2 ml) laimennettua seosta késiteltiin IN HCl:lia (1 ml) ja vakevOitiin tyhjOssa orgaanisten liuottimien poistami-20 seksi. Saatu sakka kerattiin, pestiin vedellå ja puhdis-tettiin pylvåskromatografisesti (kSSnteisfaasisilikageeli, Whatman Partisil Prep 40 ODS-3, C-18) eluoiden 20-%:sella asetonitriili/pH 4, 0,025M ammoniumfosfaattipuskurilla ja sitten 100-%:sella asetonitriililia. Tarkoituksenmukaiset 25 jakeet (asetonitriili) vakevOitiin tyhjOssa antamaan 32 mg (0,041 mmoolia, saanto 32 %) otsikkoyhdistetta metyyli-esterina: Rt 6,00 minuuttia (puhtaus 91 %; HPLC, pylvas: Waters Radial PAK C18, eluentti: A/B = 1/1, jossa A = pH 4, 0,05M ammoniumfosfaattipuskuri, B = 80-%:nen asetonitrii-30 li/H20, virtausnopeus: 3 ml/minuutti).

Tama esteri (27 mg, 0,035 mmoolia) liuotettiin seokseen, jossa oli MeOH (1 ml) ja H20:ta (1 ml), ja tatå kasiteltiin liuoksella, jossa oli NaOH (12 mg) H20:ssa (0,3 ml) huoneen lampOtilassa 1 paiva, mihin mennessa HPLC 35 ilmoitti reaktion taydellisyydesta. Seos tehtiin happamak- 92207 37 si pH-arvoon 3 lisååmålia 10-%:sta H3P04 ja vakevoitiin tyhjosså låhes kuiviin. Sakka kerSttiin, pestiin H20:lla (0,3 ml x 2) ja kuivattiin antamaan 24 mg (0,031 mmoolia, saanto 89 %; kokonaissaanto 28 %) otsikkoyhdistettå punai-5 sena jauheena. Sp. >138 °C (haj.).

Rt 2,29 minuuttia (puhtaus 93 %; HPLC, olosuhteet: samat kuin edellå).

IR (KBr) x : 3 400, 1 730 (w), 1 620 (br) cm’1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) '). nax: 234 (Σ 32,200), 290 (Σ 26,100), 10 468 nm (Σ 11,300).

MS (FAB): m/z 766 (M+H)*; HRMS, laskettu C37H40N3015: sta (M+H)+ 766.2459, havaittu 766.2441.

*H NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 1,02 (3H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,34 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,31 (3H, s, 3-Me), 15 2,59 (3H, d, J=4 Hz, NHMe), 3,03 (3H, s, NMe), 3,69 (2H, br s), 3,82 (1H, m), 3,97 (3H, s, 11-OMe), 4,35 - 4,6 (5H, m, 17-H, 5-H, 6-H, l'-H), 5,00 (br), 5,57 (br), 6,17 (d, vaihtuva, D20), 6,95 (IH, d, J=2,4 Hz, 10-H), 7,11 (1H, s, 4-H), 7,31 (1H, d, 3=2,4 Hz, 12-H), 8,08 (IH, s, 7-H), 20 8,57 (1H, d, 3=7 Hz, CONH, vaihtuva D20), 12,87 (1H, s, vaihtuva, D20).

Esimerkki 19 N-(p-tolueenisulfonyylikarbamyyli)pradimisiini B:n valmistus (II, R1 = CH3, R2 = H, R3 = CH3, R4 = -C0NHS02-p-25 tolyyli)

Sekoituksenalaiseen lietteeseen, jossa oli pradi-misiini B-metyyliesteri-HCl (100 mg, 0,13 mmoolia) aseto-nitriilissS (5 ml), lis&ttiin BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia), ja seosta kuumennettiin 50 °C:ssa 30 minuuttia. Jååhdytta-30 misen j&lkeen huoneen l&mpdtilaan tåhSn reaktioseokseen lisSttiin trietyyliamiinia (18 μΐ, 0,13 mmoolia) ja p-to-lueenisulfonyyli-isosyanaattia (25,3 mg, 0,13 mmoolia). Seosta sekoitettiin huoneen lampOtilassa kuivan typen at-mosfaarisså 5 tuntia. LisSå p-tolueenisulfonyyli-isosya-35 naattia (n. 10 mg) lisSttiin, ja sekoittamista jatkettiin 92207 38 toiset 18 tuntia, mihin mennessfi HPLC ilmoitti, ettå n. 80 % tuotteesta oli muodostunut. Seos laimennettiin MeOH:11a (2 ml) ja tåh&n lisåttiin IN HC1 (1 ml). Liuos våkevOitiin nopeasti tyhjGssa kuiviin. Jåånndssuspensiota 5 H20:ssa (3 ml) sekoitettiin kolme tuntia ja kiinteå aine keråttiin, kuivajauhettiin Et20:lla ja kuivattiin antamaan 77 mg (0,084 mmoolia, saanto 64 %) otsikkoyhdisteen metyy-liesteria punaisena kiinteånå aineena: Rt 3,39 minuuttia (puhtaus 85 %; HPLC, pylvås: Waters Radial PAK Cie, eluent-10 ti: A/B = 35/65, jossa A = pH 4, 0,05M ammoniumfosfaatti-puskuri, B = 80-%:nen asetonitriili H20:ssa, virtausnopeus 4 ml/minuutti).

Metyyliesteria (50 mg, 0,056 mmoolia) suspendoitiin seokseen, jossa oli MeOH (3 ml) ja H20 (3 ml). Tåhan lisåt-15 tiin liuos, jossa oli NaOH (22 mg, 0,056 mmoolia) H20:ssa (1 ml), ja seosta sekoitettiin huoneen låmpotilas-sa 1 tunti. Tama tehtiin happamaksi jåahauteessa laimealla H3P0,:lia pH-arvoon 3 ja våkevditiin sitten tyhjossa n. 3 ml:n tilavuuteen. Sakka keråttiin, pestiin H20:lla ja kui-20 vattiin tyhjOssfi antamaan 34 mg (0,038 mmoolia, saanto 67 %; kokonaissaanto 43 %) otsikkoyhdistettå punertavana jauheena. Sp. >125 °C (haj.).

Rt 1,61 minuuttia (puhtaus 83 %; HPLC, eluentti: A/B = 35/65, jossa A = pH 4, 0,05M ammoniumfosfaattipusku-25 ri B = 80-%:nen asetonitriili H20:ssa, muut olosuhteet: samat kuin edellå).

IR (KBr) ./max : 3 420, 1 720 (w), 1 620 (sh), 1 600 cm'1. UV (MeOH: H20 = 1:1) 2: 230 (Σ 35,500), 290 (Σ 21,300), 468 nm (Σ 9,000).

30 MS (FAB): m/z 906 (M+H)\ "H NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 0,91, 1,05 (3H, 2 br, 5’-Me), 1,32 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,30 (3H, s, 3-Me), 2,38 (3H, s, p-Me), 2,89, 3,12 (3H, 2s, NMe), 3,94 (3H, s, ll-OMe), 4,2 - 4,7 (m, 17-H, 5-H, 6-H, l’-H), 6,91 (IH, s, 35 10-H), 7,03 (IH, s, 4-H), 7,26 (IH, s, 12-H), 7,36 (2H, d, 92207 39 J=8 Hz, ArHs), 7,77 (2H, d, J=8 Hz, ArHs), 8,02 (IH, s, 7-H), 8,59 (IH, d, J=6,5 Hz, CONH, vaihtuva, D20), 12,89 (IH, s, vaihtuva, D20).

Esimerkki 20 5 N-(L-glutamyyli)pradimisiini B-formiaattisuolan valmistus (II, R1 = CH3, R2 = H, R3 = CH3, R4 = -

C0CH(NH2) (CH2)2C02H

Sekoituksenalaiseen lietteeseen, jossa oli pradi-misiini B-metyyliesteri-HCl (760 mg, 1,0 mmoolia; 80-%:-10 sesti puhdas HPLCrllå) DMF:sså (5 ml, kuivattu 3Å molekyy-liseuloilla), liséttiin trietyyliamiinia (0,14 ml, 1.0 mmoolia), mita seurasi N-t-Boc-(L)-glutamiinihappo-x-bentsyyli-a-N-hydroksisukkiini-imidiesteri (2,60 g, 6.0 mmoolia; valmistettu N-t-Boc-(L)-glutamiinihappo-x- 15 bentsyyliesterista). Saatua tummanpunaista seosta sekoi- tettiin 35 eC:ssa 24 tuntia ja våkevbitiin tyhjosså låhes kuiviin. jaannOsta kuivajauhettiin useita kertoja n-pen-taanissa ja kromatografoitiin silikageelilia (MeOH-CH2Cl2/5:95 - 20:80) antamaan 1,0 g puolipuhdasta hyvin 20 asyloitua ainetta. Tata puolipuhdasta ainetta (1,0 g)

MeOHrssa (10 ml) ja H20:ssa (5 ml) sekoitettiin liuoksen kanssa, jossa oli NaOH (280 mg) H20:ssa (5 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lSmpdtilassa 6 tuntia. Tama tehtiin happamaksi pH-arvoon n. 3,5-%:sella H3P04:lia, ja muodos-25 tunut sakka suodatettiin ja kuivattiin antamaan 258 mg raakaa kiinteaa ainetta. Tama puhdistettiin pylvaskromato-grafisesti kuten edelia on kuvattu (Cie pylvas, A:B = 70:30 - 50:50; A, B kuten edelia on maaritetty). Tarkoi-tuksenmukaiset jakeet yhdistettiin, tehtiin happamaksi pH-30 arvoon n. 3 ja sakka suodatettiin ja kuivattiin antamaan 27 mg (0,029 mmoolia, saanto 2,9 %) otsikkoyhdistettå pu-naisena jauheena: Rt 7,00 minuuttia (puhtaus 95 %; HPLC, 50 % A/B, virtausnopeus: 2 ml/minuutti).

IR (KBr) ^ : 3 420, 1 730, 1 630, 1 610 cm"1.

92207 40 UV (MeOH: H20 = 1:1) }234 (Σ 35,700), 296 (Σ 29,000), 464 (Σ 12,200).

MS (FAB): m/z 938 (M+H)*, 838 (M-t-Boc+2H), 443.

XH NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 0,95, 1,12 (3H, 2d, J=6 5 Hz, 5'-Me), 1,33 (3H, d, 17-Me), 1,34, 1,37 (9H, 2s, tBu), 1,65, 1,83, 2,20 (2H, m, CH2), 2,30 (3H, s, 3-Me), 3,02 (s, NMe), 3,3, 3,73, 3,85 (6H, m, 2'-H, 3'-H, 4’-H, 5'-H, CH2CO), 3,94 (3H, s, 11-OMe), 4,2 - 4,75 (5H, m, 17-H, CHCO, 5-H, 6-H, l’-H), 5,27, 5,65, 6,16 (3H, br, vaihtuva, 10 D20), 6,94 (IH, d, J=2,5 Hz, 10-H), 7,09 (IH, s, 4-H), 7,29 (1H, d, J=2,5 Hz, 12-H), 8,07 (IH, s, 7-H), 8,56 (1H, d, J=7 Hz, 16-NH, vaihtuva, D20), 12,31 (br, vaihtuva, D20), 12,85 (1H, s, vaihtuva, D20), 13,78 (br, vaihtuva, D20).

Seosta, jossa oli N-t-Boc-Glu-pradimisiini B 15 (29 mg, 0,031 mmoolia; 95-%:sesti puhdas HPLC:lla) 75-%:sessa (tilav./tilav.) HC02H/H20:ssa (4 ml), sekoitet-tiin n. 30 °C:ssa 5 tuntia. Tåmå vSkevbitiin tyhjossa kui-viin ja jSSnnds kuivajauhettiin Et0Ac:llS antamaan 22 mg (0,025 mmoolia, saanto 80 %) otsikkoyhdistettå tummanpu-20 naisena kiinteanå aineena: Rt 6,8 minuuttia (HPLC, eluent-ti A/B = 40:60, virtausnopeus: 0,5 ml/minuutti).

IR (KBr) /B(Ut : 3 420, 1 740, 1 640, 1 610 cm'1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) ^ max: 234 (Σ 23,000), 290 (Σ 17,200), 470 nm (Σ 7,700).

25 MS (FAB): m/z 838 (M+H - HC02H)*; korkean erotuskyvyn mas-sadektrometria laskettu C40H44N3O17: sta (M+H)* 838.2671 ha-vaittu 838.2659.

*H NMR (300 MHz, DMS0-d6) 6 (ppm): 0,91, 1,15 (3H, 2d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,34 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,28, 2,29 (3H, 30 2s, 3-Me), 3,11, 3,21 (3H, 2s, NMe), 3,0 - 4,0 (m), 3,91 (3H, s, 11-OMe), 4,3 - 4,7 (5H, m, 17-H, CHCO, 5-H, 6-H, l’-H), 5,7 (3 br), 6,72 (1H, s, 10-H), 6,84 (IH, s, 4-H), 7,13 (1H, d, J=2,2 Hz, 12-H), 7,75 (IH, s, 7-H), 8,13 (1H, s, HC02), 8,78, 8,85 (2H, d, J=7 Hz, 16-NH), 13,17 (br).

Λ1 92207 41 N-t-Boc-( L)-glutamiinihappo-x-bentsyyli-a-N-hydrok-sisukkiini-imidiesteri valmistettiin seuraavan menetelmån mukalsestl.

Sekoituksenalaiseen seokseen, jossa oli N-t-Boc-5 (L)-glutamiinihappo-x-bentsyyliesteria (10,12 g, 30 mmoo- lia; Vega Chemical) ja N-hydroksisukkiini-imidia (4,30 g, 33 mmoolia; Aldrich) CH2Cl2:ssa (200 ml), lisattiin N, N' -disykloheksyylikarbodi-imidia (6,81 g, 33 mmoolia; E. Merck). Seosta kuumennettiin palautusjSåhdyttSen 10 mi-10 nuuttia ja sitten sita sekoitettiin huoneen låmpotilassa 5 tuntia. Sakka poistettiin ja pestiin CH2Cl2:lla. Suodos ja pesut yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjGssa kuiviin. JSannOsGljy kuivajauhettiin heksaanilla, sitten n-pentaa-nilla. Puolikiinteå aine liuotettiin Et20:iin (300 ml), 15 liukenematon aine poistettiin suodattamalla. Suodos våke-vGitiin tyhjOssM kuiviin antamaan 11,8 g (27,2 mmoolia, saanto 90,6 %) otsikkoyhdistetta valkeahkona vaahtona.

XH NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm); 1,44 (9H, s, t-Bu), 2,05 (IH, m, 3-H), 2,17 (IH, m, 3-H), 2,64 (2H, s, succ-CH2), 20 2,65 (IH, m, 4-H), 2,86 (3H, brs, succ-CH2, 4-H), 4,50 (IH, dd, J=8, 13 Hz, 2-H), 5,16 (2H, s, CH2Ar), 7,41 (5H, s, ArHs), 7,73 (IH, d, J=8 Hz, NH).

Esimerkki 21 N-(allyyli)pradimisiini B:n valmistus (II, R1 = CH3, 25 R2 = H, R3 = CH3, R* = CH2CH=CH2)

Suspensioon, jossa oli pradimisiini B (100 mg, 0,15 mmoolia; 85-%:sesti puhdas HPLC:lia) 1,2-dikloori-etaanissa (4 ml), injektoitiin BSA (0,60 ml, 2,42 mmoolia), ja seosta sekoitettiin 70 °C:ssa kuivan typen atmos-30 faarissa kaksi tuntia. Saatuun tummanruskeaan liuokseen injektoitiin allyylijodidia (0,088 ml, 0,94 mmoolia) ja seosta sekoitettiin 100 °C:ssa kuivan typen atmosfåårissa 2,5 tuntia, mihin mennessa HPLC ilmoitti tåydellisesta reaktiosta. Jåahdytyksen jaikeen seos våkevGitiin tyhjos-35 sa, jaannOs liuotettiin metanoliin (10 ml) ja kasiteltiin 92207 42 IN HClillå (2 ml), ja vSkevOitiin nopeasti tyhjOssa meta-nolin poistamiseksi. Jåånnbs, laimennettuna H20:lla, puh-distettiin pylvåskromatografisesti (kSånteisfaasisilika-geeli, Lichroprep RP-18, EM Science) eluoiden H20:lla ja 5 sitten 40-%:sella CH3CN/H20:11a antamaan 37 mg (0,05 mmoo-lia, saanto 35 %) otsikkoyhdistettå tummanoranssisena jau-heena: Rt 4,95 minuuttia (puhtaus 96 %; HPLC, pylvås:

Microsorb Short One C18, eluentti: 50-%:nen CH3CN/0,15-%:nen kaliumfosfaattipuskuri, pH 3,5, virtausnopeus: 1,2 ml/mi-10 nuutti).

IR (KBr) / max : 3 390, 2 927, 1 731, 1 606 cm'1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) max: 234 (Σ 21,700), 286 (Σ 17,600), 480 (Σ 7,600).

MS (FAB): m/z 749 (M+H)\ 15 *H NMR (300 MHz, DMS0-d6) 6 (ppm): 1,25 (3H, d, J=7,2 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me), 2,83 (3H, brs, NMe), 3,2 - 3,9 (m, 2'-H, 3Ή, 4Ή, 5'-H), 3,93 (3H, s, ll-0Me), 4,35 - 4,49 (3H, m, 5-H, 6-H, 17-H), 4,67 (1H, d, l'-H), 5,50 - 5,57 (2H, m, H2C=), 5,55 - 5,64 20 (1H, m, =CH), 5,80 - 5,95 (2H, brs, D20, vaihtuva), 6,1 - 6.2 (2H, brs, D20, vaihtuva), 6,89 (IH, d, J=2 Hz, 10-H), 7.02 (IH, s, 4-H), 7,25 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,01 (1H, s, 7-H), 8,58 (1H, d, J=6,9 Hz, CONH, D20, vaihtuva), 12,88 (1H, s, D20, vaihtuva).

25 Esimerkki 22 N-(allyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, R1 = CH3, R2 = β-D-ksylosyyli, R3 = CH3, R4 = -CH2CH=CH2

Lietteeseen, jossa oli pradimisiini A-HC1 (50 mg, 0,057 mmoolia) 1,2-dikloorietaanissa (2 ml), injektoitiin 30 BSA (0,25 ml, 1,01 mmoolia) ja seosta kuumennettiin 40 eC:ssa kuivan typen atmosfåårisså yksi tunti, jona aikana suurin osa pradimisiini A:sta meni liuokseen. Tahan liuokseen lisattiin allyylijodidia (40 μΐ, 0,44 mmoolia), ja seosta sekoitettiin palautusjååhdytyslampotilassa 11 35 tuntia. Jaåhdytyksen jSlkeen seos våkevbitiin tyhjossa ja 92207 43 jaannOs liuotettiin MeOH:iin (5 ml), kasiteltiin IN HCl:lia (1 ml). Seos vakevditiin tyhjossa ja jaannoksesta poistettiin suola HP-20 pylvaassa eluoiden ensin H20:lla ja sitten 80-%:sella (tilav./tilav. ) asetoni/H20:11a (pH 3) 5 antamaan 42 mg (0,048 mmoolia, saanto 85 %) otsikkoyhdis-tetta punertavana jauheena: Rt 3,10 minuuttia (puhtaus 93 %; HPLC, pylvas: Microsorb Short One C18, 4,6 mm I.D. x 100 mm, 3 pm, Rainin Instrument Co., eluentti: 50-%:nen puskuri/0,15-% KH2P04, pH 3,5)/CH3CN, virtausnopeus: 10 1,2 ml/minuutti, havainnot: UV-absorptio 254 nm:ssa).

IR (KBr) f max : 3 400, 1 730, 1 630 (sh), 1 610 cm1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) 7 m&x : 234 (Σ 29,000), 288 (Σ 23,000), 476 (Σ 9,850).

MS (FAB): m/z 881 (M+H)*; HRMS; laskettu C43H49N2018: sta 15 (Μ+ΗΓ 881.1980, havaittu 881.2960.

XH NMR (300 HMz, DMS0-d6) δ 1,32 (3H, brm, 5’-Me), 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me), 2,66 (3H, br, NMe), 3,0 - 3,2 (3H, m, 5"-H, 2"-H, 3"-H), 3,71 (1H, dd, J=ll Hz, 5 Hz, 5"-H), 3,95 (3H, s, 11-OMe), 4,3 - 4,7 20 (5H, m, 17-H, 1"-H, 5-H, 6-H, l'-H), 5,1 (2H, m, =CH2), 5,8 (1H, m, CH=), 6,93 (IH, d, 10-H), 7,04 (IH, s, 4-H), 7,28 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,04 (IH, s, 7-H), 8,57 (1H, d, J=6,9 Hz, C0NH, vaihtuva, D20), 12,88 (1H, s, vaihtuva, D20).

25 Esimerkki 23 N-(propargyy1i)pradimisiini B:n valmistus (II, R1 = CH3, R2 = H, R3 = CH3, R4 = -CH2C=CH)

Suspensioon, jossa oli pradimisiini B (100 mg, 0,14 mmoolia; 85-%:sesti puhdas HPLC:lia) 1,2-dikloori-30 etaanissa (5 ml), injektoitiin BSA (0,6 ml, 2,4 mmoolia), ja seosta sekoitettiin 70 °C:ssa typen atmosfaarissa 1,5 tuntia. Tahan injektoitiin propargyylibromidia (0,11 ml, 0,98 mmoolia, 80 paino-%:inen liuos tolueenis-sa), ja seosta sekoitettiin 90 °C:ssa 6 tuntia. Reaktio-35 seos vakevditiin tyhjGsså ja jaannds, liuotettuna metano- 92207 44 liin (10 ml), sekoitettiin IN NaOH:hon. Muodostunut sakka keråttiin ja puhdistettiin pylvåskromatografisesti (kåån-teisfaasisilikageeli, Lichroprep RP-18, EM Science) eluoi-den 70-%:sella Me0H/H20:lla antamaan 31 mg (0,033 mmoolia, 5 saanto 23 %) otsikkoyhdistetta oranssisena jauheena: Rt 4,05 minuuttia (puhtaus 83 %; HPLC, olosuhteet: samat kuin esimerkissa 21 annetut).

IR (KBr) ^nax : 3 851, 3 417, 2 921, 2 132, 1 728, 1 608 cm"1.

10 UV (MeOH: H20 = 1:1) 2 max : 232 (Σ 26,200), 288 (Σ 21,600), 474 (nm (Σ 9,050).

MS (FAB): m/z 747 (M+H)+.

XH NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 1,10 (3H, d, J=6,2 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=6,l Hz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me) 15 2,67 (3H, s, NMe), 2,88 (IH, br, HCC-), 3,07 (IH, br, 4'-H), 3,32 (s, D20, vaihtuva), 3,7 (4H, brs), 3,94 (3H, s, 11-OMe), 4,38 - 4,58 (4H, m), 6,08 (IH, br, D20, vaihtuva), 6,9 (IH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,05 (IH, s, 4-H) 7,25 (IH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,0 (IH, s, 7-H), 8,6 (IH, d, J=7 Hz, COHN, 20 D20, vaihtuva), 12,91 (IH, s, D20, vaihtuva).

Esimerkki 24 N-(bentsyyli)pradimisiini A:n valmistus (II, R1 = CH3, R2 = β-D-ksylosyyli, R3 = CH3, R4 = -CH2Ph)

Suspensioon, jossa oli pradimisiini A-HC1 (80 mg, 25 0,095 mmoolia; 1,2-dikloorietaanissa (6 ml), injektoitiin BSA (0,6 ml, 2,42 mmoolia), ja seosta kuumennettiin 70 °C:ssa typen atmosfåårisså 1,5 tuntia. TShån liuokseen injektoitiin bentsyylibromidia (83 μΐ, 0,70 mmoolia), ja seosta sekoitettiin 70 °C:ssa 17 tuntia. Jååhdyttåmisen 30 jålkeen seos våkevditiin tyhjdsså ja jaannOsta, liuotettu-na MeOH:hon (8 ml), kåsiteltiin IN HCl:llå (0,8 ml). Seos våkevGitiin tyhjGssa ja jaannOs puhdistettiin pylvåskroma-tografisesti (kaånteisfaasisilikageeli, Lichroprep RP-18, EM Science) eluoiden H20:lla, CH3CN:lla ja sitten MeOH:lla. 35 MeOH-jakeet våkevoitiin tyhjGsså antamaan 37 mg 92207 45 (0,04 nunoolia, saanto 42 %) otsikkoyhdistetta ruskeana jauheena: Rt 4,40 minuuttia (puhtaus 91 %; HPLC, eluentti: 50-%:nen puskuri (0,15 % CH2P04, pH 3,5)/CH3CN, muut olosuh-teet: samat kuin esimerkissfl 22 annetut.

5 IR (KBr) /eax : 3 400, 1 740, 1 630 (sh), 1 610 cm'1.

UV (MeOH: H20 = 1:1) m : 232 (Σ 26,000), 284 (Σ 20,900), 480 (Σ 9,860).

MS (FAB): m/z 932 (M+2H)\* HRMS; laskettu C47H51N2018: sta (M+H) + 931.3137, havaittu 931.3116.

10 XH NMR (300 MHz, DMS0-d6) δ (ppm): 1,16 (3H, d, J=6,2 Hz, 5'-Me), 1,30 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,17 (3H, s, 3-Me), 2,52 (3H, s, NMe), 2,9 - 3,2 (m), 3,71 (m), 3,92 (3H, s, 11-OMe), 4,00 (2H, s, CH2Ph), 4,3 - 4,5 (4H, m, 17-H, 1"-H, 5-H, 6-H), 4,60 (1H, d, J=6 Hz, l'-H), 6,85 (IH, s, 10-H), 15 6,97 (IH, s, 4-H), 7,22 (IH, s, 12-H), 7,2 - 7,4 (5H, m,

ArHs), 7,94 (IH, s, 7-H), 8,59 (1H, d, J=7 Hz, CONH), 12,97 (1H, s, ).

Claims (11)

46 92207

1. Menetelmå terapeuttisesti kåyttdkelpoisen pradi-misiinijohdannaisen tai sen farmaseuttisesti hyvåksyttå-5 van suolan valmistamiseksi, jolla on kaava R1 CONHCHCOgH HCL JL XH,

0 H0 TY m (II)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå R4 on (Cx_5)-alkyyli, joka on II 92207 47 substituoitu ryhmaiia, joka valitaan ryhmasta karboksi, (Cj^J-alkoksikarbonyyli, karbamyyli, (C1.5)-alkyylikarba-myyli, di(C1_5)-alkyylikarbamyyli ja sulfonyyli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 5 tunnettu siita, etta R4 on (C3_5)-alkenyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka valitaan ryhmasta karboksi, (C1.5)-alkoksikarbonyyli, karbamyyli, (C^J-alkyylikarba-myyli ja diiCj^J-alkyylikarbamyyli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 10 tunnettu siita, etta R4 on (C1.5)-alkanoyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka on valittu ryhmasta amino, (C1.5)-alkyyliamino ja diiC^)-alkyyliamino.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå R4 valitaan ryhmasta L-gluta- 15 myyli, formyyli ja p-tolyylisulfinyylikarbamyyli.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R4 valitaan ryhmasta bentsyy-li, (C3_5)-alkenyyli ja (C3.5 )-alkynyyli.

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelma, 20 tunnettu siita, etta R4 on (C3_5)-alkenyyli, joka on substituoitu ryhmaiia karboksi tax (C^J-alkoksikarbo-nyyli.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R4 valitaan ryhmasta karbok- 25 simetyyli, karbamyylimetyyli, (C1.5)-alkoksikarbonyylimetyy- li ja sulfonyylimetyyli.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R4 valitaan ryhmasta 3-karbok-si-2-propenyyli ja 3-(C1.5)-alkoksikarbonyyli-2-propenyy- 30 li.

10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R4 on (C2_3)-alkanoyyli, joka on substituoitu ryhmaiia, joka valitaan ryhmasta amino, (¢^.5)-alkyyliamino ja di(C^)-alkyyliamino.

10. II Tl T T 11 i 15 jossa R1 valitaan ryhmåstå H, metyyli ja hydroksime- tyyli, ja kun R1 on metyyli tai hydroksimetyyli, saadulla aminohapolla on D-konfiguraatio; R2 on H tai B-D-ksylosyyli; R3 on H tai metyyli; ja

20 R4 valitaan ryhmasta (C2.5)-alkenyyli; (C2_5)-alky- nyyli; substituoitu (C^)-alkyyli; substituoitu (C2_5)-alkenyyli; jossa substituentti seka alkyylille etta alke-nyylille on ryhma, joka valitaan ryhmasta karboksi, (C1.5)-alkoksikarbonyyli, karbamyyli, (C^J-alkyylikarbamyyli, 25 diiCj.jJalkyylikarbamyyli ja sulfonyyli; ( )-alkanoyyli, joka on substituoitu ryhmålia, joka on valittu ryhmasta amino, (C1.5)-alkyyliamino ja di(C1.5)-alkyyliamino; L-gluta-myyli; formyyli; bentsyyli; ja p-tolyylisulfonyylikarba-myyli; tunnettu siitå, ettå substituoitu alkyyli 30 tai alkenyyliryhmå lisåtåån pradimisiiniin suoralla nuk-leofiilisella korvauksella tai pelkiståvailå alkyloinnil-la, jossa sokeriryhma on mukana; tai N-asyylijohdannaiset valmistetaan saattamalla sokeriaminoryhma reagoimaan halu-tun hapon tai sen vastaavan asyloivan aineen kanssa.

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta R4 valitaan ryhmasta glysyy-li, N,N-dimetyyliglysyyli ja B-alanyyli. 48