PT95881B - Processo para a preparacao de derivados de pradimicina com accao anti-fungica e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

1. Campo da Invenção

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A presente invenção diz respeito a compostos semi-sintéticos anti-fúngicos, ao seu uso terapêutico e ãs composições far macêuticas que os contêm. Mais particularmente, estes compostos anti-fúngicos são derivados das pradimicinas.

2. Informação do Relatório da Descoberta

As pradimicinas também conhecidas como antibióticos BU-3608, são um grupo de antibióticos anti-fúngicos produzidos por Actinomadura hibisca sp. nov. Várias pradimicnas que se isolaram a partir da fermentação de caldos de Actinomadura hibisca ou de suas variantes ou de seus mutantes e suas estruturas, estão descritas adiante:

a)	Pradimicina A:	R^=CHg; R2=CHg; R3 =	v-D-xilosilo
b)	Pradimicina B:	R1=CH3; R2=CH3; R3=í	I
c)	Pradimicina C:	R1=CH3; R2=H; R3=^-	-D-xilosilo
d)	Pradimicina D:	R^H,· R2-ch3 ? ^3=^-	-D-xilosilo
e)	Pradimicina E:	R1=H; R2 =H; R3=P“d-	-xilosilo
f)	Pradimicina FA-1:	R1=CH2OH? R2=CH3; R3=^-D-xilosilo
g)	Pradimicina Fa-2:	R1=CH2OH; R2=H; R3='	á-D-xilosilo

A pradimicina A foi referida como BMY-28567 no Extracto n° 984 da 27â Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, em 4 a 7 de Outubro de 1987, New York, New York. As pradimicinas A, B e C estão publicadas no pedido de patente de invenção europeia ns 277,621. As pradimicinas D, E e seus respectivos derivados desxilosilos estão referidos no nosso co-pendente pedido de invenção norte-americana da série n2 203,776, depositado em 7 de Junho de 1988.

Os análogos N-alquilados das pradimicinas A, B. C, D, E e seus derivados desxilosilos estão publicados no nosso co-pendente pedido de patente de invenção norte-americana da série nQ 221,144, depositado em 19 de Julho de 1988.

As pradimicinas FA-1, Fa-2, seus respectivos derivados desxilosilos e seus análogos N-alquilados estão publicados no nosso co-pendente pedido de patente de invenção norte-americana da série No 269,821, depositado em 10 de novembro de 1988.

Dois compostos, conhecidos como benanomicinas A e B, foram referidos em J. Antibiot., 1988, 41(6): 807-811, e ibid, 41(8): 1019-1028. A benanomicina B parece ser idêntica à pradi micina C, ao passo que a benanomicina A possui um grupo hidroxji lo no lugar do grupo amino açucarado da benanomicina B.

-3RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um composto de fórmula geral (II) :

na qual, o símbolo R^ é escolhido entre o grupo que consiste em um átomo de hidrogénio, um grupo metilo e um grpo hidr£ ximetilo, e quando o símbolo R^ representa um grupo metilo ou hidroximetilo, o aminoácido resultante possui a configuração D?

o símbolo R₂ representa um átomo de hidrogénio ou um gru po ^-D-xilosilo;

o símbolo R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo; e o símbolo R^ é escolhido entre o grupo que consiste em: grupo alcenilo C₂_₅; ^C2-5^{? a}l^£J^uii° ^ci-5^{; a}l^ce”

nilo C₂-5 ^substitui3°' θπι que o substituinte para os grupos alquilo e alcenilo é um grupo escolhido entre o grupo que consiste em: grupo carboxi; alcoxi (C^^)-car bonilo; carbamilo; alquil (C^__₃)-carbamilo; di-alquil (C^_^)-carbamilo ou sulfonilo; alcanoílo substituí do por um grupo escolhido entre o grupo que consiste em: grupo amino; alquil (C-^) -amino e di-alquil (C₁_₅)-amino; L-glutamilo; formilo; benzilo; e p-tolilsulfonilcarbami lo;

ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. '

Um aspecto adicional da presente invenção diz respeito a um método para o tratamento de infecçÕes fúngicas em hospedeiros mamíferos com necessidade de tal tratamento que compreende a admi nistração, aos citados hospedeiros, de uma dose eficaz anti-fúngica de um composto de fórmula geral (II).

Ainda outro aspecto adicional da presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula geral (II) e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos da presente invenção mostram maior solubilidade na água do que os compostos originais, as pradimicinas

A el B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção prepara, sob um aspecto preferido, compostos de fórmula geral (II), em que o símbolo R^ representa ura grupo alcanoílo C_1-5 substituído por um grupo escolhido entre o grupo que consiste em: grupo amino, alquil (0^.-5)-amino e dialquil (C-^_₅)-amino.

Um aspecto mais preferido é o da preparação de compostos de fôr mula geral (II), em que o símbolo R^ representa um grupo alcanoílo ^C2-3 ^sukstituíâo por um grupo escolhido entre o grupo que consiste em: grupo amino, alquil(C^_^)-amino e di-alquil(C^_^)amino, sendo o grupo amino, o substituinte mais preferido.

Um aspecto adicional preferido diz respeito a compostos de fórmula geral (II), em que o símbolo R₄ representa o grupo al quilo substituído por um grupo escolhido entre o grupo que consiste em: grupo carboxi, carbamilo, alcoxi(C^_^)-carbonilo e sulfonilo; alceniio alcinilo ou alceniio C₃_₅ substituído por um grupo escolhido entre o grupo carboxi e o gru po alcoxi(C^_^)-carbonilo.

Utilizado na memória descritiva e nas reivindicações, a menos que se indique o contrário, o termo alquilo inclui cadeias de carbono simples e ramificadas Sal aceitável sob o pon to de vista farmacêutico pode ser um sal interno; um sal de uma base inorgânica ou.orgânicatal ccmo um sal de sódio, potássio,lítio, amónio, e trialquilamónio; ou um sal de adição de ãcido, tal como um ãci do inorgânico ou orgânico, por exemplo, sal cloridrato, sulfato, sulfato hidrogenado, fosfato, formiato e acetato. Um grupo alca noílo (C-£_g) -amino substituído inclui o radical carbonilo; demodo semelhante, um mono- ou di-alquilamino (C^_^)-alcanoilo substituído inclui o radical carbamilo, correspondentemente, subs tituido. Pradimicina refere-se a um membro de pradimicinas, ocorrendo naturalmente, aos seus derivados desxilosilos e aos seus respectivos sais.

Os materiais iniciais de pradimicina e métodos para a sua produção estão referidos nos nossos co-pendentes, pedidos de patentes de invenção norte-americanas das séries nQ 115,273, depositado em 2 de Novembro de 1987; nQ 203,776, depositado em

de Junho de 1988; nQ 221,144, depositado em 19 de Julho de 1988 e nQ 269,821, depositado em 10 de Novembro de 1988 . As des. cobertas contidas nestes pedidos de patentes de invenção estão incorporadas, aqui, como referências. As pradimicinas podem utilizar-se como uma base livre, sais de adição de ácidos ou bases, o zwitterion ou ésteres do grupo carboxílico, dependendo as condições particulares das reacções. Sais básicos podem ser, por exemplo, sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio , amónio e trialquilamõnio; sais de adição de ácidos podem, ser, por exemplo, cloridrato, sulfato, nitrato e similares. Ester do- ãci. do carboxílico pode ser um éster alquílico inferior, tal como éster metílico, etílico e isopropilico; fenílico, benzílico ou um éster cicloalquilíco, por exemplo, éster ciclo-hexílico.

Os compostos da presente invenção podem preparar-se por meio de métodos bem conhecidos na matéria. Assim, os grupos alqui lo ou alcenilo substituídos podem ser introduzidos por meio de deslocação nucleofílica directa ou por meio de alquilação reduto ra envolvendo o grupo amino do açúcar; os derivados N-acílicos podem preparar-se por meio da reacção do grupo amino do açúcar com o ácido desejado ou um seu equivalente acilante. Cada uma das reacções mencionadas antes será, agora, discutida com deta lhe, mais adiante.

Os derivados N-alquilados substituídos das pradimicinas podem preparar-se por meio da reacção de uma pradimicina com um composto geralmente apresentado por L-A, em que o símbolo L representa um grupo eliminãvel, tal como cloreto, brometo ou iodeto, e o símbolo A representa um grupo alquilo C₁_₅, ou alcenilo C₂_₅, substituí dos, em que os substituintes estão previamente definidos sob a fórmula geral (II) . Exemplos de L-A incluem, mas não são limi tados a, ácido iodoacético, ãcido iodopropiónico, iodoacetami-7-

da, iodoacetato de etilo e bromocrotonato de metilo. A reacçao efectua-se no seio de um dissolvente orgânico, inerte, tal como cloreto de metileno ou em água ou uma sua mistura. A escolha do dissolvente depende da natureza dos reagentes. A tempe ratura da reacção não é crítica e pode ser qualquer uma que fa cilite a formação do composto dentro de um tempo razoável. A temperatura pode situar-se -. uma escala situada entre a temperatura ambiente a temperatura de refluxo da solução reaccíonal, e o tempo de reacção pode ser de cerca de 30 minutos a cerca de 15 horas, dependéndo dos.;reagentess e do meio reaccíonal. Ao efectuar-se a reacção de alquilação, deve ser vantajoso bloquear os grupos hidroxilico e fenôlico da pradimicina. Apesar de não ser particularmente limitado, o grupo bloqueador é, de preferên cia, o grupo trimetilsililo (TMS) que pode ser introduzido utilizando-se a Ν,Ο-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA). A quantidade molar de BSA utilizada é, pelo menos, equivalente ao número de grupos OH a serem bloqueados, mas de preferência, utiliza-se em excesso em cerca de 1,2 a cerca de 3 vezes esse número. Após a terminação da reacção de alquilação, o grupo TMS pode ser eliminado por meio de hidrólise ácida ou por meio da utilização de um reagente, tal como fluoreto de tetrabutilamónio.

Como alternativa, os derivados N-alquilados substituídos da pradimicina podem preparar-se por meio de alquilação redutora que compreende, em primeiro lugar, a condensação do mate rial inicial da pradimicina com um composto apropriado contendo um aldeído ou uma cetona, funcionalmente seguida do tratamento do composto, assim formado, com um agente redutor. O aldeído ou a cetona podem ser, por exemplo, ácido glioxílico, ácido pirúvico, ácido acetoacético e acetoacetato de etilo. O agente redutor pode ser, por exemplo, um hidrato metálico, tal como borohi.

dreto de sódio, cianoboro-hidreto de sódio e hidreto de alumínio e lítio; o reagente preferido é o cianoboro-hidreto de sódio. A reacção de condensação efectua-se no seio de um dissol vente orgânico, inerte, tal como acetonitrilo, alcanol inferior, dimetilsulfóxido ou uma mistura ou uma sua solução aquosa. A temperatura de reacção não é, particularmente, limitada e pode situar-se entre a temperatura ambiente e a temperatura de reflu xo da mistura reaccional. O tempo da reacção pode situar-se na escala de alguns minutos a algumas horas. 0 composto de conden sação formado pode ser reduzidp depois, no mesmo vaso da reacção. A redução pode efectuar-se à temperatura ambiente até se obter o composto desejado. Na nossa experiência, a alquilação redutora â temperatura ambiente da pradimicina B com ácido gli oxílico e utilizando-se o cianoboro-hidreto de sódio, como agente_redutor, está completa dentro de algumas horas. As condi^ ções óptimas da reacção deverão depender, naturalmente, da natureza e reactividade dos reagentes particulares utilizados.

As pradimicinas N-aciladas da presente invenção podem preparar-se por meio da reacção de uma pradimicina com um amino ãcido, um aminoácido N-alquilado ou Ν,Ν-dialquilado ou um seu equivalente acilante. 0 aminoácido pode ser, por exemplo, gli cina, ^-aminoalanina, Ν,Ν-dimetilglicina e similares. Equivalentes acilantes derivados do ácido podem ser, por exemplo, um halogeneto ãcido tal como cloreto ãcido, um éster activo derivado da N-hidroxi-succinimida ou de 1-hidroxibenzotriazol e anidridos simétricos ou mistos. Quando se utiliza o ãcido carbo xilico como espécie acilante'¹, é preferível utilizá-lo em conjun ção com um agente de condensação, por exemplo, uma carbodiimida tal como diciclo-hexilcarbodiimida (DCC). 0 grupo amino no áci do reagente está protegido, de preferência. 0 grupo protector para o grupo amino não é, particularmente, limitado e pode ser

qualquer um, vulgarmente, utilizado na matéria das sínteses pejo tídicas. A escolha dos grupos protectores, assim como os métodos para protecção e desprotecção estão tratados no, por exemplo, capítulo 4 de Peptide Synthesis, 2â Ed:..; por Bodansky et al.. Consideramos o grupo t-butoxicarbonilo (t-BOC), que é eliminável sob condições ácidas, por exemplo, utilizando-se áci. do trifluoroacético, satisfatório para a presente invenção. A reacção de acilação pode efectuar-se no seio de um dissolvente orgânico, inerte, tal como dimetilformamida, cloreto de metileno e dicloroetano. A mistura reaccional pode incluir, eventual, mente, um receptor ácido quando se espera que o ácido seja um produto acessório, receptores ácidos apropriados são, por exemplo, bases aminas terciárias, tal como piridina, trietilamina, diisopropiletilamina e similares ou bases inorgânicas, tal como carbonatos de sódio e de potássio. A temperatura da reacção po de situar-se entre a temperatura ambiente e a temperatura de re fluxo da mistura reaccional e a reacção pode ser de cerca de 30 minutos a alguns dias; estes parâmetros não são críticos e podem ajustar-se, dependendo da natureza dos reagentes, para va lorizar o rendimento do composto. Os grupos hidroxílico e feno lico do material incial da pradimicina podem estar, quer despro tegidos, quer bloqueados. Um grupo bloqueador preferido para os grupos OH é o TMS, como previamente se considerou. Quando se utiliza a pradimicina desprotegida, os grupos OH podem, tam bém, tornar-se acilados para formar ésteres. Os ésteres, assim formados, podem ser hidrolisados sob condições básicas sem clivagem da ligação amida, novamente formada.

Os derivados N-carbamílicos da pradimicina podem obter-se por meio da reacção de uma pradimicina com um isocianato apropriado. A reacção efectua-se no seio de um dissolvente or-10-

gânico, inerte, tal como acetonitrilo e à temperatura ambiente. O tempo da reacção deve situar-se na escala de 1 hora a vários dias.

Como previamente se mencionou, as pradimicinas podem utilizar-se sob a forma de base livre, um sal básico, um sal de adição de ácido ou um éster do ácido carboxílico. Se se uti lizar um éster, o grupo pode ser eliminado por meio de hidrólise alcalina para gerar o composto final.

Compreende-se que a síntese de compostos da presente in venção não é limitada aos processos e aos reagentes referidos antes, mas pode incluir outros métodos capazes de alquilar ou acilar o grupo amino da porção açúcar das pradimicinas. As con dições reaccionais poderão, naturalmente, variar com a escolha dos materiais iniciais, mas podem ser confirmadas, prontamente, pelos entendidos na matéria sem excessivas experimentações.

ACTIVIDADE BIOLÕGICA

A actividade anti-fúngica, in vitro, dos compostos representativos da presente invenção foi determinada contra dife rentes fungos por meio do método da diluição sucessiva em agar.

A dimensão do inoculado foi ajustada a 10 células/ml e um volume de, aproximadamente, 0,003 ml de suspensão fúngica foi aplicado à superfície do antibiótico contendo placas de agar com um multi-inoculador. Após a incubação, a concentração mais baixa do antibiótico que causou, virtualmente, a inibição completa do crescimento fúngico foi determinada como a concentração mínima inibidora (CMI). Os resultados estão reunidos nos Quadros leia.

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Alguns compostos foram avaliados, também, numa infecção intravenosa de Candida albicans ^:A95040 em exemplares de murganhos. Suspendeu-se o organismo a testar numa concentra ção salina, aproximadamente 10 vezes a dose média letal do fun go (10 células/murganho) que se utilizou para infectar, por via intravenosa, murganhos machos ICR pesando 20 a 24 g. A cada grupo de cinco murganhos, em cada nível de dosagem, os compostos do teste foram administrados por via intravenosa ou por via intramuscular. Os 50% da dose protectora (ϋΡ^θ) foram calculados a partir das médias de sobrevivência registadas 20 õu 21 dias após o repto fúngico. Os animais de controlo morreram entre 7 a 15 dias. Os resultados do teste in vivo estão reuni dos no Quadro 2.

Quadro 2. Actividade Anti-fúngica- In Vivo contra Candida Albi-

	cans	A9540 nos Murganhos
A. Composto	DPrQ *(mg/kg,IV)	B.	Composto	DP50*(mg/kg)	Via
Ex.	1	45		Ex.	4	>50**	IV
Ex.	2	29		Ex.	5	>50**	IV
Ex.	3	18		Ex.	21	>50	IV
Ex.	7	7,2		Ex.	23	>50	IV
Ex.	9	>50		PradimicinaA3 0	IV
Pradimicina	A 7,9		PradimicinaB3 2	IV

Ex. 10	30	Ex. 4	>50**	IM
Ex. 11	36	Pradimicina	A 8,2	IM
Pradimicina A	11	Pradimicina	B >50	IM

* Determinação 20 dias após o repto fúngico, de acordo com o método de Litchfield e Wilcoxon.

1) Os organismos do teste em cultura à temperatura de 28OC durante

-1618 horas em meio YGP (extracto de levedura, glucose, peptona, K2HPO4, AgSO₄? pH=6,6)

2) Medicamento administrado, uma vez, i. v. justamente após a infecção * Determinação 21 dias após o repto fúngico, de acordo com o método de Spearman-Karber.

** Observada morte retardada.

1) Organismos do teste incubados durante 18 horas em dextrose agar Sabouraud.

2) Medicamentos administrados i. m. ou i. v. a 1 e 3,5 horas após a infecção e, duas vezes, no dia seguinte.

Solubilidade na Agua

A solubilidade na água dos compostos representativos da presente invenção foi determinada, utilizando-se um dos pro tocolos seguintes:

I. Suspendeu-se a amostra (1,0 mg ou 2,5 mg) em 250 ^il. de uma concentração salina do tampão de fosfato de Dulbecco (PBS, sem CaCl2 e MgC^· 6^0) , sonicada ã temperatura ambiente durante 10 minutos e centrifugou-se durante 10 minutos. Analisou-se o sobrenadante (2 jil) por meio de cromatografia liquida de alta pressão (HPLC) utilizando-se as condições especificadas para ca da composto na Secção Experimental. Quando visivelmente solúvel, determinou-se a solubilidade como ^4 mg/ml (ou j?10 mg/ml para a amostra de 2,5 mg utilizada). Quando não solúvel, adicio nou-se uma quantidade adicional de PBS (x jil, sonicada) e centrifugou-se. Quando visivelmente solúvel, injectou-se a solução de 2 jil para HPLC e utilizou-se a ãrea do pico para a concentração conhecida da amostra.

Comparando a área do pico obtida no sobrenadante prévio, calculou-se a solubilidade do seguinte modo:

-17solubilidade =- x

Ao mg/ml em que A representa a área do da amostra em 250 pl de PBS e da solução completa de 1,0 mg pico do sobrenadante de 1,0 mg Ao representa a área do pico da amostra em x ju.1 de PBS.

II. Suspendeu-se a amostra (3^ 3,5 mg) em 1 ml de PBS (-) ou de PBS (+), sonicada à temperatura de 30°C durante 10 minutos e conservou-se; à temperatura ambiente durante 2 horas . Centrifugou-se a solução ou a suspensão resultantes em 12,000 rpm durante 10 minutos. 0 sobrenadante (ρΗ=6,7Λ>' 7,2) foi diluídd~ (5x ou 50x ) com NaOH (pH ca. 11,5) 0,0lN e mediu-se a sua absorção UV em 500 nm. Taxou-se a solubilidade por meio do valor do coeficiente de absorção em. relação, ao·valor Standard. Valor.. Standard: pradimicina A pura = ^Eic_m ^{180 em 500 nirjein solu}5^° alcalina. Utilizou-se a forma de ião complexo da amostra para o teste da solubilidade, como ele é. Dissolveu-se a amostra (3 mg) do sal cloridrato em 3 ml de ãgua destilada e neutralizou-se com NaOH 0,0IN e, depois, liofilizou-se a solução para se obter uma amostra do teste.

As soluções PBS(-) e PBS{+) utilizadas no protocolo II foram preparadas do seguinte modo:

Utilizou-se uma solução salina (PBS) tamponada de fosfa to de Dulbecco. Preparação da solução PBS {-): dissolveu-se um comprimido PBS (-) (Flow Laboratories, Cat. n° 28-103-05), em 100 ml de ãgua destilada e autoclavou-se durante 10 minutos à temperatura de 115°C. Esta solução contêm 0,2 g/1 de KC1,

0,2 g/1 de KH₂PO₄, 8g/l de NaCl e 1,15 g/1 de Na₂HP0₄· Prepara ção da solução (PBS) (+): dissolveu-se um comprimido PBS (-) em

ml de água destilada? dissolveram-se 10 mg de CaCl₂ em 10 ml de água destilada; dissolveram-se 10 mg de MgCl₂, 6HO em 10 ml de água destilada. Estas soluções foram autoclavadas, como se descreveu antes, e misturaram-se após o arrefecimento.

A solubilidade na água dos compostos representativos está apresentada no Quadro 3.

QUADRO 3 . Solubilidade na Ãgua

Composto

Método Solubilidade Qig/ml)

Ex. 1	II	(-)*	>30,000
	II	(+)	>31,000
Ex. 2	II	(-)	11,000
Ex. 3	II	(-)	11,000
Ex. 7**	II	(-)	3
Pradimicina A	II	(-)	17
Ex. 9	II	(+)	>32,000
Ex. 10	II	(+)	1,000
Ex. 11	II	(+)	250
Pradimicina A	II	(+)	81
Ex. 4	I		>10,000
Ex. 5	I		>4,000
Ex. 6	I		>4,000
Ex. 15	I		2,000
Ex. 18	I		4,000
Ex. 21	I		2,000
Ex. 22	I		5,000
Ex. 23	I		500
Pradimicina A	I		17
Pradimicina B	I		70
* (-): PBS(-);	(+): PBS(+)	•
** Muito solúvel	em ãgua destilada	a um pH= 9 para se obter

uma solução clara, mas decomposta para originar a pradimicina C a um pH=7,0 .

Os compostos da presente invenção mostram possuir acti vidade contra vários fungos. Além disso, são mais solúveis na água do que as pradimicinas donde derivam.

Para tratamento de infecções fúngicas nos animais e nos seres humanos, os antibióticos da presente invenção podem admi nistrar-se numa quantidade eficaz, sob o ponto de vista anti-fúngico, por meio de qualquer das vias de administração aceites; estas incluem, mas não se limitam, a via intravenosa, in tramuscular, oral, intranasal e para as infecções superficiais a administração tópica.

As preparações para administração parentérica incluem so luções aquosas ou não-aquosas, esterilizadas, suspensões ou emulsões. Também se podem preparar sob a forma de composições sólidas, esterilizadas, que se podem dissolver em ãgua esterilizada, soro fisiológico, ou em algum outro meio injectável , esterilizado, imediatamente antes da utilização. A formulação oral pode apresentar-se sob a forma de comprimidos, cápsulas de gelatina, pós, pastilhas, xaropes e similares. Para a administração tópica, o composto pode ser incorporado em loções, po madas, geles, cremes, unguentos, tinturas e similares. As formas de dosagem unitária podem preparar-se, utilizando-se métodos geralmente conhecidos dos entendidos na matéria de formulações farmacêuticas.

Será de considerar que, quando se trata de um hospedeiro infectado com um fungo susceptível aos antibióticos da presente invenção, a via de administração preferida e a dose actuante, utilizadas, deverão ser do arbítrio do clínico assistente, entendido no tratamento de infecções fúngicas e variarão de acordo com o organismo causativo, a sua sensibilidade ao antibiótico, gravidade e local da infecção e de acordo com as ca-20racterísticas do doente, tais como idade, peso corporal, veloci dade de excreção, medicação concorrente e condição física geral.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção sem limitarem o seu âmbito que é definido por meio das reivindicações anexas a esta memória descritiva.

Exemplo 1: Preparação de N-(carboximetil)pradimicina A (II; R^=CHg; R₂=ô-D-xilosil; R^CH^; R^C^CX^H)

Adicionaram-se 75 mg (0,4 mmoles) de ãcido iodoacético a uma mistura de 50 mg (0,057 mmoles) de pradimicina A HC1 e

0,25 ml (1 mmole) de BSA em 1 ml de cloreto de metileno e aqueceu-se a mistura ã temperatura de refluxo, durante a noite. Depois, adicionaram-se 5 ml de metanol e 1 ml de HC1 IN. Concentrou-se a mistura reaccional sob pressão reduzida e cromatografou-se o resíduo oleoso sobre uma coluna de gel de sílica (prePAK cartucho (waters), 20 mm x 250 mm) eluindo-se com ãgua e, depois, acetonitrilo a 30% - ãgua. Reuniram-se as fracções contendo o composto desejado, concentraram-se e secaram-se por congelação para se obter o composto em título (43 mg; 84%), sob a forma de um pó amorfo.

^X’^V-V> (KBr) cm¹: 1725 (fraco), 1628-1607, 1388, 1334,

IuclX

1296, 1257, 1050.

Uvl (1/100N NaOH) nm (£): 232 ^max (32400), 318 (15000),

497 (14400).

MS (SIMS): m/z 899 (M+H)t

RMN ¹H (DMSO—dg) £ : 1,18 (3H, d, J=6,4 Hz, 5'-CH₃), 1,32 (3H, d, J=7,3, alanil-CH ), 2,28 (3H, s, 3-CHg), 2,61 (3H, s,

-21N-CH ), 3,69 (1H, dd, J=5,3 & 11 Hz, 5-H), 3,95 (3H, s, OCH₃), 4,39 (1H, qui, J=7.3 Hz, alanil-CH), 4,43 (1H, d, J=8 Hz, 1-H), 4,43 (1H, d, J=12 Hz, 5-H), 4,56 (1H, br-d, J=12 Hz, 6-H), 4,60 (1H, d,J=8 Hz, l'-H), 4,99 (2H, br)*, 5,59 (1H, br)*, 6,02 (1H, br)*, 6,93 (1H, d, J=2 Hz) , 10H) , .tlH,. 5.;4-H) , 7,28(1H, d,J=2Hz, 12-H), 8,04 (1H, s, 7-H), 8,58 (1H, d, J=7 Hz, CONH)*, 12,0 (1H, br)*, 12,90 (1H, s)*, 13,80 (1H, br)*.

* Desaparecido por meio da adição de D₉0.

O

Exemplo 2: Preparação de N-(carbamoilmetil)pradimicina A (II; R_X=CH₃; R₂=S-D-xilosil; R₃=CH₃; R₄=CH₂CONH₂

Adicionaram-se 150 mg (0,81 mmoles) de iodoacetamida a uma mistura de 100 mg (0,11 mmoles) de pradimicina A HCl e 0,56 ml (2,2 mmoles) de BSA em 4 ml de cloreto de metileno e aqueceu-se a mistura ã temperatura de refluxo, durante a noite. Depois, adicionaram-se 0,56 ml de BSA e 150 mg de iodoacetamida à mistu ra reaccional e aqueceu-se a mistura ã temperatura de refluxo durante um adicional de 5 horas. Tratou-se a mistura reaccional com 3 ml de HCl IN e 10 ml de metanol e concentrou-se sob pressão reduzida. Cromatografou-se o residuo sobre uma coluna de gel de sílica Ο_χθ (20 mm x 200 mm) eluíndo-se com água e, depois, acetonitrilo a 30%-ãgua. Reuniram-se as fracções contendo o com posto desejado, concentraram-se e secaram-se por congelação para se obterem 81 mg (rendimento: 82%) do composto em título, sob a forma de um põ amorfo, vermelho intenso. P.f.: 225°C (dec.) max (KBr) cm : 1607, 1296, 1063.

IV

-22UV X _ (1/100N NaOH) nm ( f.) : 319 (15200), 497 ΙΠαΧ (14600) .

MS (SIMS): m/z 898 (M+H)⁺.

RMN ¹H (DMSO-dg) & : 1,20 (3H, d, J=6 Hz, 5'-CH₃), 1,32 (3H, d, J=7,3, alanÍl-CH₃), 2,29 (3H, s, 3-CH₃), 2,56 (3H, s , N-CH₃), 3,71 (ÍH, dd, J=5 & 12 Hz, 5-H), 3,95 (3H, s, OCH₃) ,

4,38	(ÍH, qui, J=6 Hz, alan	il-CH), 4,45 (ÍH, d,	J=8	Hz, 1	-H) ,
4,46	(ÍH, d, J=12 Hz, 5-H),	4,54 (ÍH, br-d, J=12	Hz	, 6-H)	, 4,61
(ÍH,	d, J=8 Hz, l’-H), 5,20	(2H, br)*, 5,63 (ÍH,	br	)*, 6,	05
(ÍH,	br)*, 6,93 (ÍH, d, J=2	Hz, 10-H), 7,05 (ÍH,	s,	4-H) ,	7~20
(2H,	br, CONH2)*, 7,29 (ÍH,	d, J=2 Hz, 12-H), 8,	05	(1H, s	r
7-H)	, 8,58 (1H, d, J=7 Hz,	CONH)*, 12,55 (1H, br	)*,	12,90	(1H,
s)*,	13,80 (ÍH, br)*.

Desaparecido por meio da adição de D^O.

Exemplo 3; Preparação de N-(etoxicarbonilmetil)pradimicina A (II; R₁=CH₃; R₂=Ô-D-XÍlosÍl; R₃=CH₃; R₄=-CH₂CO₂C₂H₅)

Repetiu-se o processo do Exemplo 1, utilizando-se 50 mg (0,05 mmoles) de pradimicina HCl, 0,28 ml (1,1 mmole) de BSA e 0,20 ml (1,7 mmoles) de iodoacetato de etilo, para se obterem 39 mg (rendimento; 74%) do composto em título, sob a forma de um pó amorfo, vermelho intenso. P.f.: 225°C (dec.)

I.V. Ç (KBr) cm¹: 1737, 1607, 1296, 1066.

UV (1/100N NaOH) nm (£ ) : 320 (15600), 498 (15100)

MS (SIMS): m/z 927 (M+H)⁺.

-23RMN H¹ (DMSO-a_g) 6 : 1,17 (3H, d, J=7 Hz, 5'-CH₃),

1,18 (3H, t	, J=7	Hz, CH2CH3	), 1,	33 (3H, d, J=7 Hz, alanil-
-CHg), 2,28	(3H,	s, 3-CH3),	2,61	(3H, s, N-CH3), 3,95	(3H, s,
OCH3), 4,06	(2H,	m, CH2CH3)	, 4,39 (ÍH, qui, J=7 Hz, alanil-
-CH), 4,52	(1H,	br-d, J=12	Hz, 6	-Η), 4,59 (1H, d, J=8	Hz ,
l'-H), 5,00	(3H,	br)*, 5,58	(ÍH,	br)*, 5,99 (1H, br)*,	6,91
(ÍH, d, J=2	Hz,	10-H), 7,04	(1H,	s, 4-H), 7,28 (1H, d,	J=2 Hz
12-H), 8,03	(1H,	s, 7-H), 8	,59 (1H, d, J=7 Hz, CONH)*,	12,55
(ÍH, br)*,	12,92	(ÍH, s)*,	13,90	(ÍH, br)*.

O * Desaparecido por meio da adição de D₂0.

Exemplo 4: Preparação de N-(carboximetil)pradimicina B (II; R^CHg; R₂=H; ^R3^=CH3^? R₄=-CH₂CO₂H)

A uma solução de 1,00 g (1,41 mmoles) de pradimicina B e 2,13 g (23,1 mmoles) de mono-hidrato do ãcido glioxílico em 40 ml de água adicionaram-se 20 ml (20 mmoles) de NaOH IN para a sua dissolução. Diluíu-se esta solução com 40 ml de ace tonitrilo e agitou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. A essa solução adicionaram-se 0,353 g (5,6 mmoles) de cianoboro-hidreto de sódio e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora. Eliminou-se o acetonitrilo in vácuo e diluíu-se a mistura com 20 ml de água e acidificou-se a um pH=3 por meio da adição de 20 ml de HCl IN. Centrifugou-se o precipitado formado, lavou-se com água (2 x 20 ml), suspendeu-se numa pequena quantidade de água (2 ml) e liofilizou-se para se obterem 960 mg do composto em título, impuro, sob a for ma de um põ vermelho. Dissolveu-se este em 5 ml de agua contendo 1,8 ml de NaOH IN por meio de sonicação e purificou-se por meio de uma coluna cromatogrãfica (cromatografia sobre gel

-24de sílica, de fase inversa, Lichroprep RP-18,40-63 jim, EM Sei ence) eluíndo-se com água. Reuniram-se as fracções apropriadas, concentraram-se e acidificaram-se a um pH=3 por meio da adição de HC1 IN. Recolheu-se o precipitado formado por meio de centrifugação (ver original) para se obterem 139 mg do com posto em título. A purificação por coluna, repetida, das frac ções contaminadas originaram um total de 669 mg (0,833 mmoles; rendimento: 59,1%) do composto em título.

Rt 1,90 minutos (pureza 93%; HPLC, coluna: Microsorb Short One Ο^θ, eluente: 50% tampão (0,15% KH^O^, pH 3,5)/ace

tonitrilo-H20 (4:1), média da corrente: 1,2 ml/minuto.
I.V. (KBr) V max:	3420, 1735,	1630	-1 cm
UV (MeOH:H2O; 1:1)	X max: 234	(f	27,000), 290 (f
22,300), 466 nm ( £ 9,	640) .

MS (FAB): m/z 767 (M+H)⁺ ; HRMS: calcd. para C_3?H₃₉N₂O₁₆ (M+H)⁺ 767,2300, encontrado 767,2283.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) 6 (ppm): 1,17 (3H, d, J=6,3 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me), 2,67 (3H, s, N-Me), 3,2-4,0 (6H, m, 4'-H, 2'-H, 3'-H, 5'-H,

CH₂), 3,93 (3H, s, 11-OMe), 4,3-4,6 (4H, m, 17-H, 5-H, 6-H, l'-H), 5,54 (br s, trocado com D₂O), 6,14 (s, trocado com D₂O), 6,93 (ÍH, s, 10-H), 7,06 (1H, s, 4-H), 7,27 (1H, d, J=2,3 Hz, 12-H), 8,05 (ÍH, s, 7-H), 8,55 (1H, d, J=7,2 Hz, CONH, trocado com D₂O), 12,85 (ÍH, s, trocado com D₂O).

RMN C¹³ (300 MHz, DMSO-d6/CDCl₃) á (ppm): 17,1, 17,3 (5’-Me), 19,4 (3-Me), 42,6 (N-Me), 47,8 (C-17), 56,5 (11-OMe),

57,8 (NCH₂), 65,3 (C-5'), 71,4 (C-2’), 71,8 (C-6), 72,7, 73,6

-25(C-4', C-3’), 8,08 (C-5), 105,3 (C-l'), 106,7 (C-10), 107,7 (C-12), 110,1 (C-8a), 114,1 (C-7), 115,8 (C-4), 126,4 (C-2), 127,3 (C- ), 131,5 (C-14a), 134,6 (C-7a), 137,3 (C-4a), 138,5 (C-12a), 148,0 (C-6a), 151,6 (C- ), 157,8 (C-l), 164,8 (C-9), 166,0 (C-ll), 167,2 (C- ) , 173,3 (C- ), 174,2 (C- ), 185,2 (C-13),186,9 (C-8).

Exemplo 5: Preparação de N-(carbamoílmetil)pradimicina B (II; R₁=CH₃; R₂=H; R₃=CH₃; R₄=-CH₂CONH₂)

Em uma suspensão de 100 mg (0,14 mmoles; 85% pura por meio de HPLC) de pradimicina B em 5 ml de 1,2-dicloroetano injectaram-se 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA e agitou-se a mistura à temperatura de 70°C durante 1,5 horas, sob um atmosfera de azo to anidro. A esta solução escura adicionaram-se 189 mg (0,99 mmoles) de iodoacetamida e agitou-se a mistura à temperatura de 100°C durante 6 horas. Concentrou-se a mistura in vacuo e dissolveu-se o resíduo em 10 ml de acetonitrilo e tratou-se a solução com 1,5 ml dê^HGLlNdurante 10 minutos. Recolheu-se o precipitado formado e purificou-se por meio de coluna cromatogrãfica (gel de sílica, fase inversa, Lichroprep, RP-18 EM Scien ce) eluindo-se com acetonitrilo a 35%/H₂O para se obterem 51 mg (0,067 mmoles; rendimento 48%) do composto em título, sob a for ma de um pó cor de laranja escura. Rt 3,29 minutos (pureza: :87,5%; HPLC, eluente: A/B=l/1 em que A=50% de acetonitrilo/ /0,15% de um tampão de fosfato de potássio; pH=3,5; B= 80% de acetonitrilo/H₂0 outras condições: as mesmas observadas no Exem pio 4).

I.V. (KBr) v* max: 3423, 1697, 1625 cm“i

-26UV (MeOH:H₂O; 1:1) X max: 234 (f 29,300), 290 (£

24,000), 470 nm ( £ 10,100).

MS (FAB): m/z 766 (M+H)⁺.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-dg)^ (ppm): 1,19 (3H, d, J=7,2 Hz, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=6,8 MHz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me) 2,63 (3H, brs, N-Me), 3,2-3,8 (m) , 3,93 (3H, s, U-OMe) , 4,3-4,6 (4H, m) , 5,5 (ÍH, br, D₂O permutável), 6,0 (1H, br, D₂O permutável), 6,89 (ÍH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,03 (ÍH, s, 4-H) , 7,25 (2H, br, 12-H e um de CONH₂, parcialmente D₂O permutável),

7,6 (ÍH, brs, um de CONH₂, D₂O permutável), 8,0 (1H, s, 7-H), 8,62 (ÍH, d, J=7 Hz, CONH, D₂O permutável), 12,92 (ÍH, s, D₂O permutável).

Exemplo 6: Preparação de N-(etoxicarbonilmetil)pradimicina B (II; R-pCH·^ R₂ ^{=H; R}3^=CH3'· ^R4⁼“^CH2^C°2^C2^H5^J

Repetiu-se o processo do Exemplo 5, utilizando-se 100 mg (0,14 mmoles; 85% de pureza por HPLC) de pradimicina B, 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA e 0,12 ml (1,01 mmoles) de iodoacetato de etilo; e como eluente para a coluna de ãgua cromatografica, 20% de acetonitrilo/H₂0 e 40% de acetonitrilo/H₂0 para se obterem 32 mg (rendimento: 29%) do composto em título, sob a forma de um pó cor de laranja; Rt 5,63 minutos (pureza ^95%; HPLC, eluente: 50% de acetonitrilo/0,15% de tampão de fosfato de potãs sio; pH= 3,5; outras condições: as mesmas observadas no Exemplo 4) .

I.V. (KBr) V max: 3426, 1731, 1635, 1608 cm^-1.

-27UV (MeOH:H₂O; 1:1) λ max: 234 ( 6 32,000), 290 ( £_ 26,000), 468 nm ( £. 11,000).

MS (FAB): m/z 795 (M+H)⁺; HRMS: calcd. para ^C39^H43^N2°16 ^{(m+h) +} 795,2613, encontrado 795,2594.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-dg) ξ (ppm): 1,22 (3H, t, J=7Hz, CH₃CH₂ -), 1,29 (3H, d, J=7,3 Hz, 5’-Me), 1,37 (3H, d, J=6,6 Hz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me), 3,12 (3H s, N-Me), 3,85 (ÍH, m) , 3,92 (3H, s, 11-OMe), 3,93-3,98 (2H, m), 4,08-4,6 (5H, m), 4,7 (ÍH, d, J=6,7 Hz, l'-H), 6,9 (ÍH, d, J=2 Hz, 10-H),

7,03 (ÍH, s, 4-H), 7,26 (ÍH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,06 (1H, s,

7-H), 8,54 (ÍH, d, J=7 Hz, CONH, D₂O permutável, 12,8 (1H, s,

D₂O permutável).

Exemplo 7: Preparação de N-(sulfometilo de sódio) pradimicina C (II; R₁=CH₃; R^-D-xilosil; R₃=H; R₄=CH₂SO₂Na)

A uma solução de 50 mg (0,058 mmoles) de pradimicina C em 10 ml de ãgua adicionaram-se 14,6 mg (0,174 mmoles) de bicarbonato de sódio e 11,7 mg (0,087 mmoles) do sal sódico do ácido hidroximetanossulfónico. Agitou-se a mistura total durante 30 minutos, à temperatura ambiente, e liofilizou-se para se obterem 80 mg de um sólido. P. f. ^100°C (grad. dec.)

I.V. U (KBr) cm¹: 1618, 1623.

UV 1 (1/100N NaOH) nm (E*^% ): 319 (115), 498 (112).

' max lcm '

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-dg) & · 1,20 (3H, d, J=6,5 Hz),

5’-CH₃), 1,30 (3H, d, J=6,9 Hz, CH-CH₃), 2,23 (3H, s, 3-CH₃), 3,90 (3H, s, 11-OCH₃), 4,59 (ÍH, d, J=7,7 Hz, l’-H), 6,71 (ÍH, d, J=2,0 Hz, 10-H), 6,93 (1H, s, 4-H), 7,13 (ÍH, d, J=2,0 Hz, 12-H), 7,71 (ÍH, s, 7-H).

-28Exemplo 8. Preparação de N-(sulfometilo de sódio)pradimici na A (II; R-^CH^; -D-xilosil; R-^CH^;

R₄=CH₂SO₃Na)

A uma suspensão de 50 mg (0,057 mmoles) de pradimicina a HCL em 5 ml de H₂0 adicionaram-se 9,6 mg (0,114 mmoles) de bicarbonato de sódio e 8,7 mg (0,057 mmoles) do sal de sódio mo no-hidratado do ácido hidroximetanossulfónico e agitou-se a mis tura total à temperatura ambiente durante 2 horas e, depois, liofilizou-se para se obter uma amostra (63 mg; teoricamente = = 59 mg) que, por intermédio da RMN protónica, se verificou cons tituir uma mistura do composto em titulo e pradimicina A, uma proporção de, aproximadamente, 1:3. A separação completa dos dois componentes não foi bem sucedida. P. F.> 220°C.

I.V. _max (KBr) cm¹: 3413, 1618, 1603, 1442, 1384, 1355, 1290, 1256.

^DVi max ^(H2°> ™ ^(E/m’ ^{; 222 (241}>' ²⁴⁶ <¹⁹⁷> ·

RMN H¹ (DMSO-d_g+D₂O) 3 : 1,14 e 1,23 [total 3H (ca.

3:1), cada d, J^, _Μθ=6,4 Hz, 5’-Me], 1,31 (3H, d, J-^ _Μθ=6,8 ^HZ/ 17-Me), 2,22 e 2,24 [total 3H (ca. 1:3), cada S, 4’-NMe], 2,40 (3H, s, 3-Me), 3,0-3,2 (3H, m, 2-H, 5-Hax, e 3-H), ca. 3,6 (2H, m, 2’-H e 3’-H), 3,70 (ÍH, dd, J5«ax,5«eq⁼¹¹·² Hz, ^J4-<,5<teq⁼⁵'⁴ Hz, 5”-Heq), 3,90 (3H, s, 11-OMe) , 4,10 (1H, q, 17-H) , 4,36 (ÍH, d, Jp, 2⁼⁷'^{3 Hz}' ^1_H) ' 4,39 UH, ^J56⁼¹⁰'⁸ Hz, 5-H), 4,44 (ÍH, d, J1Q 12=2,4 Hz, ^10_H)' ⁶'⁹³ (^1H, ^s' ⁴-H)> 7,14 (ÍH, d, 12-H), 7,69 (1H, s, 7-H).

-29Exemplo 9: Preparação de N-formil pradimicina A (II; R₁=CH₃; R₂= β-D-xilosil; R₃=CH₃; R₄=-COH)

A uma mistura de 100 mg (0,11 mmoles) de pradimicina HCl e 0,50 ml (2 mmoles) de BSA em 2 ml de cloreto de metileno adi cionaram-se 0,1 ml de anidrido fórmico acético e agitou-se a mistura, durante a noite, à temperatura ambiente. Ã mistura adicionaram-se 1 ml de HCl IN e 3 ml de MeOH e concentrou-se a mistura sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo numa pequena quantidade de NaHCO₃ aquoso e cromatografou-se sobre uma coluna de gel de sílica (20 mm x 150 mm) utilizando-se água e, depois, acetonitrilo a 10%-ãgua, como eluente. Verificaram-se as fracções de acetonitrilo por meio de HPLC e reuniram-se as fracções desejadas, concentraram-se e secaram-se por congelação para se obterem 78 mg (rendimento: 82%) do composto em ti tulo, sob a forma de um pó amorfo, vermelho intenso. P. f.:250°C (dec).

I.V. V (KBr) cm¹: 1653-1607, 1445, 1162.

^K max '

UVl (1/lOONNaOH) nm (£) : 319 (14300), 497 (13900).

MS (SIMS): m/z 891 (M+Na)⁺.

RMN H¹ (DMSO-dg) è : 1,04 (3H, d, J=6,4 Hz, 6’-H)**,

1,33 (3H, d, J=7,2 Hz, alanil-CH₃), 2,26 (3H, s, 3-CH.p , 2,97 (3H, s, N-CH₃), 3,68 (ÍH, dd, J=5 & 12 Hz, 5-H), 3,90 (3H, s, OCH₃), 4,34 (1H, qui, J=7,2 Hz, alanil-CH) , 4,40 (ÍH, d, J=8 Hz, 1-H), 4,44 (2H, m, 5,6-H), 4,74 (ÍH, d, J=8 Hz, l'-H),

6,71 (ÍH, d, J=2,l Hz, 10-H), 6,85 (ÍH, s, 4-H), 7,11 (ÍH, d,

J=2,1 Hz, 12-H), 7,75 (ÍH, s, 7-H), 7,92 (s, CHO)**, 8,65 (ÍH, br, CONH)*, 13,20 (1H, br)*, 15,15 (ÍH, br)*.

* Desaparecido por meio da adição D₃O.

** Acompanhado de um sinal devido ao maior rotâmero.

30Exemplo 10. Preparação de N-glicil pradimicina A (II; R₁=CH₃; R_£= ft-D-xilosil; R₃=CH₃; R₄=COCH₂NH₂)

A uma solução de 105 mg (0,12 mmoles) de pradimicina A HC1 e 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA em 3 ml de cloreto de metile no anidro adicionaram-se 350 mg (1,2 mmoles) do éster 1-benzo triazolilico de N-t-BOC-glicina. Aqueceu-se a mistura à tempe ratura de refluxo, durante a noite, e depois, arrefeceu-se ã temperatura ambiente. Adicionou-se uma solução 1M de fluoreto de tetrabutilamónio em 2,5 ml de tetra-hidrofurano e agitou-se a mistura durante 30 minutos ã temperatura ambiente e, depois , concentrou-se a pressão reduzida. Diluíu-se o resíduo com H₂O, acidificou-se com HC1 IN a um pH=5 e recolheu-se o sólido formado por meio de filtração. Extraiu-se o filtrado com acetato de etilo, evaporou-se o dissolvente e reuniu-se o resíduo com o sólido, previamente, obtido. Cromatografou-se a mistura sobre uma coluna C^_g utilizando-se um tampão de acetonitrilo a 40% a um pH=3,5. Reuniram-se as fracções contendo o composto desejado e, evaporaram-se sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se com ãgua. Secou-se a camada orgânica com Na₂SO₄ e evaporou-se para se obterem 52 mg (46%) do derivado N-t-BOC-glicílico de pradimicina A .

	RMN	H1 (400 MHz	, DMSO-dg) £:1,03 (3H,-	d,J=6,	,0 Hz, 6’-H)	** /
1,33	(3H,	d, J=7,3 Hz,	17-CH3), 1,37 e 1,38	(9H,	s, terc-Bu-
til)	, 2,29	(3H, s, 3-C	H3), 3,0-3,2 (5H, m,	4'-H,	2-5-H),
3,71	(IH,	dd, J=5,4 e	11 Hz, 5-H), 3,95 (3	H, s,	11-OCH3), 4	,39
(IH,	qui,	J=7,3 Hz, 17	-Η), 4,4-4,6 (3H, m,	5-H, (	5-H, 1-H),
4,71	(IH,	d, J=6,8 Hz,	l'-H), 4,9-5,1 (3H,	br-s,	OH)*f 5,6-5	,8
(IH,	br-s,	OH)*, 5,99	(IH, br-s, OH)*, 6,91	(IH,	s, 10-H), 7	,02

-31(1Η, s, 4-H), 7,27 (ÍH, s, 12-H), 8,00 (ÍH, s, 7-H), 8,62 (ÍH, s, 16-NH)*, 12,57 (ÍH, br-s, OH)*, 12,94 (1H, s, OH)*.

* **

Desaparecido por meio de adição de D₂O.

Acompanhado de um sinal devido ao menor rotâmero.

Agitou-se uma solução de 52 mg (0,055 mmoles) de Ν-(N-t-BOC-glicil)-pradimicina A em 1 ml de ácido trifluoroacético (TFA), durante 30 minutos e â temperatura ambiente. Após a evaporação de TFA, adicionou-se éter isopropílico ao resíduo e recolheu-se o precipitado formado por meio de filtração. Purificou-se a mistura por meio de HPLC preparatória (Nihon seimitsu, coluna NS-20250, dissolvente tampão de MeCN a 30% a um pH=3,5), seguida de cromatografia sobre gel de sílica C^g, utilizando-se 25 a 30% de acetonitrilo-H₂0, comoeluente, para se obterem 23,0 mg (rendimento: 46%) do composto em título, após liofilização do eluido. P. f.: ^> 220°C (dec.).

I.V. γ) (KBr) cm^-1: 3413, 2390, 1620, 1380, 1332,

Ϊΐ1ά>2£

1054.

UV % (0,0lN NaOH) nm {£): 320 (12,300), 497 (12,000)

MS (FAB): m/z 900 (M+3H)'t.

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-dg) & : 1,08 (3H, d, J=6,4 Hz,

6’-H)**, 1,33 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-CH₃), 2,26 (3H, s), 3,69 (ÍH, dd, J=5,6 & 11,1 Hz, 5-H)**, 3,91 (3H, s, ll-OCHg), 4,25 (ÍH, br-m, 17-H), 4,4-4,5 (2H, 5-H, 6-H), 4,48 (ÍH, d, J=7,7 Hz, 1-H), 4,73 (ÍH, d, J=7,3 Hz, l'-H)**, 5,0-5,15 (3H, brs, OH)*, 5,72 (ÍH, br-s, OH)*, 5,72 (ÍH, br-s, OH)*, 5,80 (ÍH, br-s, OH)*, 6,71 (ÍH, d, J=2,6 Hz, 10-H), 6,83 (1H, s, 4H),

7,13 (ÍH, d, J=2,6 Hz, 12-H), 7,74 (1H, s, 7-H), 8,6 (1H, br,

16-NH) *

-32* Desaparecido por meio da adição de D₂0.

** Acompanhado de um sinal devido ao menor rotâmero.

Exemplo 11. Preparação de N-(β-alanil)pradimicina A (II; Rt=CH₀; R_o=-D-xilosil; R_Q=CH_O;

r₄=-co(ch₂) ₂nh₂)

A uma solução de 100 mg (0,11 mmoles de pradimicina A HC1 e 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA em 5 ml de cloreto de metileno ani. dro adicionaram-se 349 mg (1,1 mmoles) do éster 1-benzotriazolí lico de N-t-BOC--alanina. Aqueceu-se a mistura à temperatura de refluxo durante 2 dias e, depois, arrefeceu-se ã temperatura ambiente. Adicionou-se uma solução 1M de fluoreto de tetrabutilamónio em 3 ml de tetra-hidrofurano e agitou-se a mistura cor de púrpura durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após o dissolvente se ter evaporado sob pressão reduzida, adicionaram-se acetato de etilo e ãcido cítricoo a 10% ao resíduo. Agi. tou-se a mistura e, depois, filtrou-se para se recolher o sólido insolúvel, separou-se a camada orgânica e lavou-se com ãgua e uma solução concentrada de cloreto de sódio. Adicionou-se o sólido insolúvel à camada orgânica e concentrou-se a mistura. Cromatografou-se o resíduo sobre uma coluna de gel de sílica eluíndo-se com 35% a 40% de acetonitrilo-^O· Recolheram-se as fracções contendo o composto desejado, evaporaram-se e extraíram-se com acetato de'etilo. Concentraram-se os extractos e secaram-se por congelação com 1,4-dioxano para se obterem 100 mg (87%) do derivado N-t-BOC- β-alanil.

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-dg) £ : 1,3-1,4 (terc-butil) ,

2,28 (3H, s, 3-CH₃), 3,71 (ÍH, dd, J=5,4 e 11 Hz, 5-H)** ,

-333,93 (3Η, s, 11-OMe), 4,38 (ÍH, qui, J=7,3 Hz, 17-H), 4,4-4,7 (3H, m, 5-H, 6-H, 1-H), 4,70 (ÍH, d, J=7,3 Hz, l'-H)**, 4,9-5,1 (3H, OH)* 5,7-5,9 (2H, OH)*, 6,83 (ÍH, d, J=2,2 Hz, 10-H), 6,95 (1H, s, 4-H), 7,20 (lH,<à, J=2,2 Hz, 12-H), 7,90 (ÍH, s,

7-H), 8,69 (ÍH, br, 16-NH)*, 13,03 (1H, s, OH)*.

Desaparecido por meio da adição de D₂O.

Acompanhado de um sinal devido ao menor rotâmero.

Agitou-se uma solução de 90 mg {0,089 mmoles) de N-(N-t-BQC-^3-alanil)pradimicina A em TFA durante 15 minutos à tem peratura ambiente. Após a evaporação de TFA, cromatografou-se o resíduo sobre uma coluna de gel de sílica eluindo-se com

20% a 40% de acetonitrilo-^O. Reuniram-se as fracções conten do o composto desejado e concentraram-se. Dissolveu-se o resí duo em uma pequena quantidade de ãgua e liofilizou-se para se obterem 20 mg (25%) de N-(¢3-alanil) pradimicina A , sob a for ma de um põ amorfo. P. f.: > 230°C (dec.).

I.V. J (KBr) cm^-1: 3390, 1620, 1445, 1386, 1260.

^v ItlcLX

U.V. 1 _ (0,0lN NaOH) nm ( : 318 (13,000), 498

IUâX (12,700) .

MS (FAB): m/z 912 (M+H)⁺.

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-dg) 6 : θ/95 (3H, br, 5'-CH₃),

1,33 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-CH₃), 2,23 (3H, s, 3-CH₃)**, 3,74 (1H, dd, J=4,7 e 11 Hz, 5-H)**, 3,91 (3H, s, 11-OMe), 4,2 (1H, br, 17-CH), 4,3-4,5 (3H, m, 5-H, 6-H, 1-H), 4,61 (ÍH, d, J= «7,8HZ, l'-H)**, 4,9-5,2 (2-3H, OH)*, 5,6-5,9 (2H, OH)*, 6,71 (ÍH, d, J=2,l Hz, 10-H), 6,82 (ÍH, s, 4-H)**, 7,13 (ÍH, br,

12-H), 7,73 (ÍH, s, 7-H), 8,22 (ÍH, br, 16-NH)*, 8,30 (1H,

-34s, OH)*.

* Desaparecido por meio da adição de D₂0.

** Acompanhado de um sinal devido ao menor rotâmero.

Exemplo 12. - Preparação de N-(trans-3-metoxicarbonil-2-propenil)pradimicina A (II; R^=CH₃; R₂=^-D-xilo sil; R₃=CH₃; R₄=CH₂CH=CHCO₂CH₃)

A uma solução de 78 mg (0,089 mmoles) de pradimicina A HC1 e 0,44 ml (1,8 mmoles) de BSA em 3 ml de diclorometano ani, dro adicionaram-se 80 mg (0,445 mmoles) de 4-bromocrotonato de metilo e aqueceu-se a mistura ã temperatura de refluxo durante 4 dias. Evaporou-se o dissolvente e dissolveu-se o resíduo numa mistura de 3 ml de metanol e 3 ml de HC1 IN. Evaporou-se o metanol e cromatografou-se o concentrado aquoso sobre uma co luna de gel de sílica C^g. Lavou-se a coluna com ãgua e, depois, eluíu-se com acetonitrilo aquoso a 70%. Reuniram-se as desejadas fracções monitorizadas por meio de HPLC, concentraram-se e liofilizaram-se para se obterem 55 mg (rendimento;66%) do composto em título. P. f.: >180°C

I.V. V (KBr) cm^-1 ; 1720, 1610, 1440.

ΙΠ3.Χ

UV 1 „ (1/100N NaOH) nm (E,^% ) : 300 (220), 500 (223) max lcm '

MS (FAB): m/z 939 (M+H)⁺.

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-d_g) £ (ppm): 1,13 (3H, d, J=6 Hz, 5’-Me), 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me),

3,95 (3H, s, OCH₃), 4,39 (ÍH, qui, J=7,3 Hz, alanil-CH), 6,00 (ÍH, d, J=15,8 Hz, =CH-COOMe), 6,83 (ÍH, dt, J=15,8 e 5,5 Hz, CH₂-CH=CH-COOMe), 6,90 (ÍH, br-s, 10-H), 7,02 (ÍH, s, 4-H), 7,27

-35(1Η, d, J=2,2 Hz, 12-H), 8,00 (lH, s, .7-H).

Exemplo 13. Preparação de N-(trans-3-carboxi-2-propenil)pradi micina A (II; R-^CH,; R₉= p>-D-xilosil; R₀=CH,;

r₄=-ch₂ch=chco₂h)

Agitou-se ã temperatura ambiente, durante a noite, uma solução de N-(trans-3-metoxicarbonil-2-propenil)pradimicina A numa mistura de metanol e NaOH IN. Evaporou-se o metanol e aci. dificou-se o resíduo aquoso com HCl IN e, depois, cromatografou-se com uma coluna de gel de sílica Ο_χθ. Lavou-se a coluna com ãgua e eluíu-se com acetonitrilo aquoso a 40%. Reuniram-se as desejadas fracções monitorizadas por meio de HPLC, concentraram-se e liofilizaram-se para se obterem 34 mg (rendimento: 85%) do composto em título. P. f.: ^>180°C.

I.V. v) _v (KBr) cm^-1: 1610, 1450, 1390.

,1% _ (1/100N NaOH) nm (E7^o ) : 320 (235), 500 (235)

IUclX x CIH

MS (FAB): m/z 927 (M+3H)⁺, 949 (M+Na+2H)⁺.

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-dg) & (ppm) : 1,13 (3H, d, J=6,4

Hz, 5’-Me), 1,33 (3H, d, J=7,2 Hz, 17-Me), 2,25 (3H, s, 3-Me), 2,56 (3H, s, N-Me), 3,91 (3H, s, OMe), 4,3-4,5 (3H, m, 5,6-H e 17-H), 4,60 (1H, d, J=7,7 Hz, l’-H), 5,90 (1H, d, J=15,8 Hz, =CH-COOH), 6,72 (1H, d, J=2,l Hz, 10-H), 6,73 (1H, dt, J=15,8 e 5,5 Hz, CH=CH-COOH), 6,86 (1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=2,1 Hz, 12-H), 7,76 (1H, s, 7-H).

-36Exemplo 14. Preparação do sal formiato de N-(glicil)pradimi cina Β (II; R-pCH-j; R₂=H; ^R3^=CH3; R₄=COCH₂NH₂)

A uma solução agitada de 114 mg (0,15 mmoles; 80% pura por HPLC) do éster metílico de pradimicina B HCl e 20 jil (0,15 mmoles; secos sobre aparas moleculares 4A) de trietilamina em 2 ml (secos sobre aparas moleculares 3A) de dimetilformamida anidra adicionaram-se, à temperatura ambiente, 204 mg (0,75 mmo les; Sigma) do éster N-hidroxisuccinimídico de N-(t-BOC)glicina. Agitou-se a mistura à temperatura de 22°C, sob uma atmosfera de azoto anidro, durante 12 horas e, depois, concentrou-se in vácuo até próximo da secura. Triturou-se o resíduo oleoso com n-pentano, várias vezes, e cromatografou-se (SiO₂; MeOH-CH₂Cl₂/5:95 a 15:85) para se obterem 120 mg de material multi-acilado, impuro: Rt 1,84 minutos (pureza: 75%; HPLC, coluna : Microsorb

Short One- C^g, 4,6 mm I.D. x 100 mm, 3 jim, Rainin Instrument Company, eluente: A/B=l:l, A:acetonitrilo-KH₂P0₄ a 0,15 % pH=3,5=l:l, v/v; B: acetonitrilo -H₂O=4:1, velocidade da corren te: 1,2 ml/minuto, detecção: absorção UV com 254 nm).

Misturou-se este material multi-acilado, impuro (80 mg) em 6,5 ml de MeOH com 3,2 ml de NaOH 0,25N e agitou-se a mis tura à temperatura ambiente durante 6 horas. Acidificou-se a mistura, lenta e cuidadosamente, com HCl 0,1 até se obter um pH=2 (pH papel). Diluíu-se a mistura obscura com 6,5 ml de H₂0 e eliminou-se o MeOH in vácuo. Filtrou-se o precipitado resultante, lavou-se com H₂O e secou-se para se obterem 25 mg (0,029 mmoles; rendimento: 29%) do composto em título, sob a forma de um sólido impuro: Rt 2,12 minutos (pureza: 75%, HPLC, condições: as mesmas anteriores).

-37Purificou-se este material impuro com 75% de pureza (200 mg) por meio de coluna cromatográfica, utilizando-se o Michel-Miller High Performance Low Pressure Liquid Chromatography System (Ace Glass Inc.), sobre gel de sílica C_lg, fase inversa (Whatman Partisil Prep 40 ODS-3,C-18; 1,5 cm x 30 cm).

A coluna foi eluída com H₂0 e, depois, com acetonitrilo a 80%-H₂O para se obterem 20 mg de N-(t-BOC-glicil)pradimicina B, sob a forma de um pó vermelho. Rt 3,48 minutos (pureza:97% ;

HPLC, coluna: Waters Radial Pak C^_g, eluente: 50% (pH=4, tampão de fosfato de amónio 0,05M) / (80% de acetonitrilo em H₂O), velocidade da corrente: 4 ml /minuto.

P. f.: 170°-270°C (dec. lenta).

I.V. (^KBr)V_max: 3420, ^173θ, 1630, ¹⁶¹⁰ cm¹·

UV (MeOH: H„O = 1:1)3, : 232 (£32,200), 290

Z ITlclX ( £ 26,100) , 468 nm ( £ 11,000).

MS (FAB): m/z 866 (M+H)⁺, 766 (M-tBoc+2H)⁺, 433.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) 7 (ppm) : 0,97, 1,07 (3H, 2d,

J=6 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 1,36 (9H, s, tBu),

2,29 (3H, s, 3-Me), 3,02, 3,14 (3H, 2s, N-Me), 3,5-4,0 (6H, m, 2'-H, 3'-H, 3'-H, 5'-H, CH₂), 3,95 (3H, s, 11-OMe), 4,38 (1H, qi,

J=7 Hz, 17-H), 4,4-4,6 (2H, m, 5-H, 6-H), 4,71 (1H, br, l'-H),

5,13, 5,42, 6,61 (3H, br, trocado com (1H, br, s,

OH, trocado com S₂°)> 6,58 (1H, t, J=5 Hz, NH, trocado com D₂O), 6,94 (1H, J=2 Hz, 10-H), 7,08 (1H, s, 4-H), 7,29 (1H, d,

J=2 Hz, 12-H), 8,07 (1H, s, 7-H), 8,55 (1H, d, J=7 Hz, CONH, trocado com D₂O), 12,84 (1H, s, trocado com D₂O) .

Agitou-se à temperatura ambiente, durante 6 horas, uma mistura de 30 mg (0,035 mmoles; pureza z\> 86%) de N-t-BOC-gli-38cil)pradimicina B em 3 ml de ácido fórmico a 80%. Eliminou-se o material insolúvel por meio de filtração e concentrou-se o filtrado in vácuo até à secura. Triturou-se o resíduo com EtOAc e secou-se até se obterem 20 mg (0,025 mmoles; ren dimento: 70%) do composto em título, sob a forma de um pó ver melho: Rt 2,31 minutos (pureza: 80%; HPLC, 50% A/B (sistema de tampão de fosfato de amónio), velocidade da corrente: 2 ml/ /minuto; este material ficou livre da pradimicina B, Z 2%).

I.V. (KBr) N)_max: 3420, 1730, 1630, 1610 cm¹.

UV (MeOH): H„O = 1:1) 1 : 234 ( £ 17,400), 290 ( £. 14,100) , 464 nm ( £. 6,100) .

MS (FAB): m/z.,766 (M+H-HCO₂H) ⁺

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-dg/D^/DCl) £ (ppm): 1,00, 1,08 (3H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,23 (3H, s, 3-Me), 3,13 (3H, br, N-Me), 3,71 (3H, s, 11-OMe), 3,70-4,0 (4H, m, 2'-H, 3'-H, 4*-H, 5-H), 4,1-4,8 (6H, m, 17-H, 5-H,

6-H, l'-H, CH₂), 6,60 (ÍH, br s, 10-H), 7,00 (ÍH, s, 4-H),

7,09 (ÍH, br s, 12-H), 7,83 (ÍH, s, 7-H), 8,08 (ÍH, s, HCO₂).

Exemplo 15. - Preparação de N-(Ν,Ν-dimetilglicil)pradimicina B (II; R₁=CH₃; R₂=H; R₃=CH₃; R₄=-COCH₂N(CH₃)₂

A uma solução agitada do éster metílico de pradimicina B HCl (500 mg; 0,66 mmoles; 81% pura por HPLC) e trietilamina (92,4 jil; 0,66 mmoles) em dimetilformamida anidra (12 ml, secos sobre aparas moleculares 3A) adicionaram-se, à temperatura ambiente, 1,68 g (8,4 mmoles) do éster N-hidroxisuccinimida de Ν,Ν-dimetilglicina e agitou-se a mistura à temperatura de cerca de 40°C durante 24 horas. A esta mistura, adiciona-39-

ram-se 1,68 g (8,4 mmoles) de uma quantidade adicional do é_s ter N-hidroxisuccinimídico de Ν,Ν-dimetilglicina e agitou-se a mistura, continuamente à temperatura de cerca de 45°C duran te 48 horas adicionais. Eliminou-se o dissolvente in vacuo e triturou-se o resíduo, repetidamente, com pentano e, depois, éter. Dissolveu-se este material numa mistura de 30 ml de MeOH e 20 ml de ^0 e, a isto, adicionou-se uma solução fria de

1,6 g de NaOH em 15 ml de ^0 durante um período de 15 minutos. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 ho ras, neutralizou-se a um pH=7 por meio da adição de H₃PO₄ num banho gelado e eliminou-se o precipitado. Concentrou-se o fil trado e precipitou-se o resíduo por meio de coluna cromatográfica (fase inversa, gel de sílica, Whatman Partisil Prep. 40 ODS-3, C-18). Eluíu-se a coluna H₂0, em primeiro lugar, e de pois, com acetonitrilo a 50%/H₂O para se obterem 86 mg (0,10 mmoles; rendimento: 15%) do composto em titulo, sob a forma de um pó castanho avermelhado: Rt 5,36 minutos (pureza: 74%; HPLC, coluna: Waters-Radical PAK C^g, eluente: (pH=4, tampão de fosf a to de amónio a 0,05M)/(acetonitrilo a 80% em H₂0) ⁼ 3:2,veloci dade da corrente: 2 ml/minuto).

I.V. (KBr) \) : 3400, 1640, 1610 cm^-1.

fflclX

UV (MeOH: H₂0 = 1:1) % _max: 234 (£.26,200) 288 (£ 21,300), 476 nm ( £ 9,000).

MS (FAB): m/z 794 (M+H)⁺: HRMS, calcd. para ^C39^H44^N3°i5 (M+H)⁺ 799,2772, encontrado 799,2774.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) 8 (ppm): 0,99 (3/4 H, d,

J=6 Hz, 5’-Me), 1,01 (3/2 H, d, J=6 Hz, 5’-Me), 1,10 (3/4 H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,27 (3H, s, 3-Me), 2,73 (3H, s, NMe₂), 2,77 (3H, s, NMe₂), 3,10, 3,14 (3H,

2s, 4'-NMe), 3,5-4,3 (m), 3,90 (3H, s, 11-OMe), 4,3-4,5 (m, 17-H, 5-H, 6-H), 4,6-4,75 (m, l'-H), 6,72 (ÍH, s, 10-H), 6,85 (ÍH, s, 4-H), 7,12 (ÍH, s, 12-H), 7,77 (1H, s, 7-H), 8,82,

8,84 (ÍH, 2d, J=7,2 Hz, CONH, trocado com D₂O) , 13,14 (ÍH, s, trocado com D₂O).

O éster N-hidroxisuccinimídico de Ν,Ν-dimetilglicina foi preparado por meio do processo seguinte.

A uma mistura agitada de 11,5 mg (0,1 mmole) de N-hidroxisuccinimida e 10,3 g (0,1 mmoles) de Ν,Ν-dimetilglicina em 200 ml de CH₂C1₂ adicionaram-se 22,1 g (0,11 mmoles) de _N,N-diciclo-hexilcarbodiimida e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 18 horas, aqueceu-se à temperatura de refluxo durante 10 minutos e, depois, agitou-se durante 4 horas adicionais. Eliminou-se o precipitado e evaporou-se o filtrado. Triturou-se o resíduo oleoso com n-hexano e extraiu-se o sólj. do com éter anidro, eliminando-se os produtos insolúveis. A evaporação do éter in vácuo originou 13,0 g (0,065 mmoles; ren dimento: 65%) do composto em título, sob a forma de um sólido higroscõpico branco.

I.V. (KBr) J : 1780, 1710, 1650 (br) cm¹. y max ' '

MS (DCI): m/z 201 (M+H)⁺.

RMN H¹ (200 MHz, CDC1₃) <$ ppm: 2,40 (6H, s, NMe₂), 2,81 (4H, s, CH₂CH₂), 3,51 (2H, s, NCH^).

Exemplo 16. Preparação de N-(Ν,Ν-dimetilglicil)pradimicina A (II; R₁=CH₃; R₂=β-D-xilosil; R₃=CH₃; R₄=COCH₂N (ch₃)₂)

A uma mistura de 61 mg (0,07 mmoles) de pradimicina A HC1 e 0,35 ml (1,4 mmoles) de BSA em 1,2 ml de diclorometano adicio-41naram-se 55 mg (0,35 mmoles) de cloreto de N,N-dimetilglicilo HC1. Agitou-se a mistura ã temperatura ambiente durante 1 ho ra e concentrou-se in vácuo. Dissolveu-se o resíduo numa mis. tura de 2 ml de metanol e 1 ml de HC1 IN. Evaporou-se o meta nol e cromatografou-se o resíduo aquoso sobre uma coluna de gel de sílica C^g. Lavou-se a coluna com ãgua e eluíu-se com acetonitrilo aquoso a 30%, para se obterem 42 mg (rendimento:

: 65%) do composto em título. P. f.: >190°C (grad. dec.).

I.V. y) _max ^{(KBr) cm_1: 1620} (largo).

UV 1 (1/100N NaOH) nm (£ ):318 (15,200) 497 (14,600)

Z* HlclX *

MS (FAB): m/z 926 (M+H)⁺.

RMN H¹ (400 MHz, DMSO-d_g) £ (ppm): 1,00, 1,11 (total 3H, 2d, J=6,4 Hz, 5'-Me), 1,34 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,28 2,29 (total 3H, 2s, 3-Me), 2,67 (3H, s, N-Me), 2,72 (3H, s,

N-Me), 3,90 (3H, s, OMe), 6,72 (IH, d, J=2,6 Hz, 10-H), 6,83 (IH, s, 4-H), 7,12 (IH, m,12-H), 7,76 (IH, s, 7-H).

Exemplo 17. - Preparação de N-carbamil pradamicina B (II; R₁=CH₃; R₂=H; ^R3^=CH3^;

A uma suspensão agitada do éster metilico de pradimici na B HC1 (100 mg; 0,13 mmoles) em 5 ml de acetonitrilo adicio naram-se 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA e aqueceu-se a mistura ã temperatura de 50°C durante 30 minutos. A esta mistura, após arrefecimento â temperatura ambiente, adicionaram-se 18 ^1 (0,13 mmoles) de trietilamina, seguidos de 32 jal (0,26 mmoles) de isocianato de triclorometilcarbonilo. Agitou-se esta mistura ã temperatura ambiente, sob uma atmosfera de azoto anidro, durante 20 horas, ao fim de cujo tempo a HPLC indicou a formação de um novo composto com Rt 5,42 minutos (HPLC, coluna: Waters

-42Radical PAK C^g). Diluiu-se a mistura com 2 ml de MeOH e tra tou-se com 1 ml de HC1 IN; eluente: A/B=35/65 em que A=tampão de fosfato de amónio 0,5 M, p=4; B=acetonitrilo a 80% em H₂O velocidade da corrente: 3 ml/minuto. Concentrou-se a mistura rapidamente, in vácuo até ã secura. Dissolveu-se o resíduo em acetonitrilo a 5% em 10 ml de H₂O e agitou-se ã temperatura am biente durante 18 horas. Recolheu-se o sólido formado para se obterem 77 mg de uma mistura do éster metílico de N-(carbamil) - e N-(triclorometilcarbonilcarbamil)desxilosil pradimici na A: Rt 2,06 minutos (49%) e 5,42 minutos (38%) (HPLC, condições: as mesmas anteriores) .

Dissolveu-se esta mistura (77 mg) numa solução de 2 ml de acetonitrilo e 2 ml de H₂0. A esta adicionou-se uma solução de 10 mg de NaOH em 0,5 ml de H₂O e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos, ao fim de cujo tempo a HPLC indicou estar a reacção completa. Acidificou-se esta , cuidadosamente, a um pH=2,5 com HgPO^ diluído. Recolheu-se o precipitado e purificou-se por meio de coluna cromatogrãfica (fase inversa, gel de sílica, Partisil Prep 40 ODS-3, C-18) eluindo-se com (acetonitrilo a 80%/H₂O): (tampão de fosfato de amónio 0,025M, p=4) =1:4. Recolheram-se as fracções apropria das, acidificaram-se a um pH=2,5 com H^PO^ diluído e concentra ram-se para se eliminar o acetonitrilo. Recolheu-se o precipi. tado formado, lavou-se com H₂O e secou-se in vácuo para se obterem 31 mg (0,041 mmoles; rendimento: 32%) do composto em título, sob a forma de um pó vermelho escuro. P. f.: >120°C (dec.).

Rt 3,99 minutos (pureza: 75%; HPLC, coluna: a mesma de que a anterior, eluente: A/B = 55/45, em que A e B têm o significado anterior, velocidade da corrente: 2 ml/minuto).

-43I.V. (KBr) J _a : 3400, 1730 (w) , 1620 (br) cm¹.

IHclX

UV (MeOH: H₉0 = 1:1) X : 234 (£.27,700), 292 ( £ 22,900) 462 nm (£ 9,880.

MS (FAB): m/z 752 (M+H)⁺; RHMS, calcd. para ^C36^H38^N3°15(M+H)⁺ 752,2303, encontrado 752,2288.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) & (ppm): 1,01 (3H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7 Hz, 17-H), 2,28 (3H, s, 3-Me) , 3,01 (3H, s, N-Me) , 3,66 (ÍH, brs), 3,77 (ÍH, m)., 3,94 (3H, s, 11-OMe), 4,35-4,6 (5H, m, 17-H, 5-H, 6-H, l’-H), 6,93 ' (ÍH, s, 10-H), 7,09 (ÍH, s, 4-H), 7,29 (ÍH, s, 12-H), 8,06 (ÍH, s, 7-H), 8,55 (ÍH, d, J=6,5 Hz, CONH, trocado com D₂O), 12,85 (lH, trocado com D₂O).

Exemplo 18. Preparação de N-(N-metilcarbamoíl)pradimicina B (II; R₁=CH₃; R₂=H; ^R3^=CH3'· R₄=“CONHCH₃)

A uma suspensão agitada de 100 mg (0,13 mmoles) de éster metílico de pradimicina B HC1 em 5 ml de acetonitrilo adi cionaram-se 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA e aqueceu-se a mistura ã temperatura de 50°C durante 30 minutos. A esta mistura, após arrefecimento à temperatura ambiente, injectaram-se 18 pl (0,13 mmoles) de trietilamina, seguidos de 7,7 pl (0,13 mmoles) de isocianato de metilo. Agitou-se a mistura ã temperatura am biente, sob uma atmosfera de azoto anidro durante 2 horas, depois injectou-se uma quantidade adicional de 15,4 pl (0,26 mmo les) de isocianato de metilo e agitou-se, continuamente, duran te outras 4 horas. Tratou-se a mistura, diluída com 2 ml de MeOH, com 1 ml de HC1 IN e concentrou-se in vacuo para se elimi

narem os dissolventes orgânicos. Recolheu-se o precipitado resultante, lavou-se com ãgua e purificou-se por meio de co luna cromatogr-ãfica; (fase inversa, gel de sílica, Whatman Partisil Prep 40 ODS-3, C-18) eluindo-se com acetonitrilo a 20%/pH=4, tampão de fosfato de amónio 0,025M e, depois, com acetonitrilo a 100%. Concentraram-se as fracções (acetonitri lo) apropriados in vacuo para se obterem 32 mg (0,041 mmoles; rendimento 32% do composto em título, sob a forma de éster me tílico: Rt 6,00 minutos (pureza: 91%; HPLC, coluna: Waters Ra dial PAK C^g, eluente A/B=l/1 em que A=tampão de fosfato de· amónio 0,05M pH=4, B= acetonitrilo a 80%/H₂O, velocidade da corrente: 3 ml/minuto).

Dissolveram-se 27 mg (0,035 mmoles) deste éster numa mistura de 1 ml de MeOH e 1 ml de H₂O e tratou-se esta com uma solução de 12 mg de NaOH em 0,3 ml de H₂O à temperatura ambien te durante 1 hora, no fim de cujo tempo a HPLC indicou estar completa a reacção. Acidificou-se a mistura a um pH=3 por meio da adição de H^PO^ a 10% e concentrou-se in vacuo até próximo da secura. Recolheu-se o precipitado, lavou-se com H₂O (0,3 ml x x 2) e secou-se para se obterem 24 mg (0,031 mmoles; rendimento: 89%: rendimento total 28%) do composto em título, sob a forma de um pó vermelho. P. f.: > 138°C (dec.).

Rt 2,29 minutos (pureza 93%; HPLC, condições: as mes_ mas anteriores).

I.V. (KBr)J : 3400, 1730 (w) , 1620 (br) cm¹.

Iucl2£

UV (MeOH: H_o0 = 1:1)3 : 234 ( £ 32,200), 290 max ( £_ 26,100), 468 nm ( £. 11,300).

MS (FAB): m/z 766 (M+H)⁺; RHMS, calcd para

-45C₃₇H_4QN₃O₁₅ (M+H)⁺ 766,2459, encontrado 766,2441.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) è (ppm): 1,02 (3H, d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,34 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,31 (3H, s, 3-Me), 2,59 (3H, d, J=4 Hz, NHMe), 3,03 (3H, s, NMe), 3,69 (2H, br s), 3,82 (ÍH, m), 3,97 (3; s,ll^OMe), 4,35-4,6 (5H, m, 17-H, 5-H, 6-H, l'-H), 5,00 (br), 5,57 (br), 6,17 (d, trocado com D₂O), 6,95 (ÍH, d, J=2,4 Hz, 10-H), 7,11 (ÍH, s, 4-H), 7,31 (ÍH, d, J=2,4 Hz, 12-H), 8,08 (ÍH, s, 7-H), 8,57 (ÍH, d, J= = 7 Hz, CONH, trocado com D₂O), 12,87 (ÍH, s, trocado com d₂o) .

Exemplo 19. Preparação de N-(p-toluenossulfonilcarbamil) pra dimicina B (II; R₃=CH₃; R₂=H; R₃=CH₃; R₄=CONHSO₂~

-p-tolilo)

A uma suspensão agitada de 100 mg (0,13 mmoles) do és. ter metílico de pradimicina B HC1 em 5 ml de acetonitrilo adi cionaram-se 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA e aqueceu-se a mistura à temperatura de 50°C durante 30 minutos. Após arrefecimento à temperatura ambiente, adicionaram-se a esta mistura reaccio nal 18 ^1 (0,13 mmoles) de trietilamina e 25,3 mg (0,13 mmoles) de isocianato de p-toluenossulfonilo. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente, sob uma atmosfera de azoto anidro, durante 5 horas. Adicionaram-se cerca de 10 mg de isocia nato de p-toluenossulfonilo e continuou a agitar-se durante ou tras 18 horas, no fim de cujo tempo a HPLC indicou que se formaram cerca de 80% do composto. Diluíu-se a mistura com 2 ml de MeOH e adicionou-se àquela 1 ml de HC1 IN. Concentrou-se a solução, rapidamente, in vácuo até à secura. Agitou-se a suspensão do resíduo em 3 ml de H₂O durante 3 horas e recolheu-se

o sólido, triturou-se com Et₂O e secou-se para se obterem 77 mg (0,084 mmoles; rendimento: 64%) do éster metilico do composto em título, sob a forma de um sólido vermelho: Rt 3,39 minutos (pureza: 85%; HPLC, coluna: Waters Radial PAK C_1O, eluente:A/B= =35/65 em que A=tampão de fosfato de amónio 0,05M ; pH=4;

B= acetonitrilo a 80% em H^O, velocidade da corrente: 4 ml (mi nuto).

Suspenderam-se 50 mg (0,056 mmoles) do éster metilico numa mistura de 3 ml de MeOH e 3 ml de HjO. A esta mistura adi cionou-se uma solução de .22 mg (0,056 mmoles) de NaOH em 1 ml de H₂0 e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora. Acidificou-se a mistura num banho gelado com H^PO^ diluído a um pH=3 e, depois, concentrou-se in vacuo num volume de cerca de 3 ml. Recolheu-se o precipitado, lavou-se com H₂O e secou-se in vacuo para se obterem 34 mg (0,038 mmoles; rendimento: 67%, rendimento total: 43%) do composto em título, sob a forma de um pó avermelhado. P. f.: >125°C (dec.).

Rt 1,61 minutos (pureza: 83%; HPLC, eluente: A/B=35/65 em que A=tampão de fosfato de amónio 0,05M; pH=4; B=acetonitri. lo a 80% em H₂0; outras condições: as mesmas anteriores.

I.V. (KBr) : 3420, v max '	1720	(w),	1620	(sh), 1600 cm
UV (MeOH: H2O = 1:1)	max	230	(f-	35,500), 290
21,300) , 468 nm( 9,000).
MS (FAB): m/z 906 (M+H)+.
RMN H1 (300 MHz, DMSO-dg)	á	(ppm):	0,91	, 1,05 (3H, 2

br, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,30 (3H, s, 3-Me),

2,38 (3H, s, p-Me), 2,89, 3,12 (3H, 2s, NMe), 3,94 (3H, s, 11-OMe), 4,2-4,7 (m, 17-H, 5-H, 6-H, l’-H), 6,91 (1H, s, 10-H), 7,03 (1H, s, 4-H), 7,26 (1H, s, 12-H), 7,36 (2H, d, J=8 Hz,

-Μ

ArHs), 7,77 (2Η, d, J=8 Hz, ArHs, 8,02 (IH, s, 7-H), 8,59 (IH, d, J=6,5 Hz, CONH, trocado com D₂O) , 12,89 (IH, s, tro cado com D₂O) *

Exemplo 20. - Preparação do sal-formiato de N-(L-glutamil) pradimicina Β (II; R-^CH^; R₂=H; ^R3^=CH3' r₄=-coch(nh₂)(ch₂)₂co₂h)

A uma suspensão agitada do éster metílico de pradimicina B HCl (760 mg, 1,0 mmoles; 80% puro por HPLC) em DMF (5 ml secos sobre aparas moleculares 3A) adicionaram-se 0,14 ml (1,0 mmole) de trietilamina, seguidos de 2,60 g,(6,Q mmoles; pre parados a partir do éster -benzilico do ácido N-t-BOC-(L)-glu tâmico) do éster -benzil-0(-N-hidroxi-succinimídico do ãcido N-t-BOC-(L)-glutâmico.' Agitou-se a mistura vermelha escura, resultante, à temperatura de 3,5°C durante 24 horas e concentrou-se in vácuo até próximo da secura. Triturou-se o resíduo, vãrias vezes, com n-pentano e cromatografou-se sobre gel de sí^ lica (MeOH-CH₂Cl₂/5:95 a 20:80, para se obter 1,0 g de material multi-acilado semi-puro. Misturou-se este material semi-puro (1,0 g) em 10 ml de MeOH e 5ml de H₂© com uma solução de 280 mg de NaOH em 5 ml de H₂0. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 6 horas. Acidificou-se esta a um pH= /v3 com H^PO^ a 5% e filtrou-se o produto precipitado formado e secou-se para se obterem 258 mg de um sólido impuro. Purificou-se este por meio de coluna cromatogrãfica, como se descreveu antes (coluna C^; A:B=70:30 a 50:50; A e B definidos como anteriormente) . Reuniram-se as fracçoes apropriadas, acidificaram-se a um pH=cerca de 3 e filtrou-se o precipitado e secou-se para se obterem 27 mg (0,029 mmoles; rendimento: 2,9%) do composto

em título, sob a forma de um pó vermelho: Rt 7,00 minutos (pu reza: 95%; HPLC; 50% A/B, velocidade da corrente: 2 ml/minuto) .

I.V. (KBr) 9 : 3420, 1730, 1630, 1610 cm'¹, max

UV (MeOH: H_oO = 1:1) 1 : 234 (£ 35,700), 296

Z ΙΠ3Χ ( £ 29,000), 464 nm (è- 12,200).

MS (FAB): m/z 938 (M+H)⁺, 838 (M-t-Boc+2H), 443.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-dg) & (ppm): 0,95, 1,12 (3H, 2d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,33 (3H, d, 17-Me), 1,34 , 1,37 (9H, 2s, tBu), 1,65, 1,83, 2,20 (2H, m, CH₂), 2,30 (3H, s, 3-Me), 3,02 (s, Me) 3,3, 3,73, 3,85 (6H, m, 2'-H, 3'-H, 4'-H, 5'-H, CH₂CO), 3,94 (3H, s, 11-OMe), 4,2-4,75 (5H, m, 17-H, CHCO, 5-H, 6-H, l’-H), 5,27, 5,65, 6,16 (3H, br, trocado com D₂O), 6,94 (1H, d, J=2,5 Hz, 10-H), 7,09 (ÍH, s, 4-H), 7,29 (ÍH, d, J=2,5 Hz, 12-H),

8,07 (ÍH, s, 7-H), 8,56 (ÍH, d, J=7 Hz, 16-NH, trocado com D₂O) , 12,31 (br, trocado com D₂O), 12,85 (1H, s, trocado com D₂O), 13,78 (br, trocado com D₂O).

Agitou-se ã temperatura de cerca de 30°C durante 5 horas, uma mistura de 29 mg (0,031 mmoles; 95% pura por HPLC) de N-t-BOC-Glu-pradimicina B em HCO₂H a 75%/H₂O (4 ml) (v/v). Con centrou-se a mistura in vacuo até ã secura e triturou-se o re síduo com EtOAc para se obterem 22 mg (0,025 mmoles; rendimento: 80%) do composto em título, sob a forma de um sólido verme lho escuro: Rt 6,8 minutos (HPLC, eluente A/B = 40160; veloci. dade da corrente: 0,5 ml/minuto).

I.V. (KBr) 0 _max: 3420

UV (MeOH: H₂O = 1:1)% 17,200) , 470 nm ( 7,700) .

1740, 1640, 1610cm^-1.

: 234 ( £ 23,000), 290 max

-49MS (FAB): m/z 838 (M+H - HCO₂H)⁺; espectro da massa de alta resolução, calcd. para C^qH^N^O^ (M+H) ⁺ 838,2671, encon trado 838,2659.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) à (ppm): 0,91, 1,15 (3H, 2d, J=6 Hz, 5'-Me), 1,34 (3H, d, J=7 Hz, 17-Me), 2,28, 2,29 (3H , 2s, 3-Me), 3,11, 3,21 (3H, 2s, NMe), 3,0-4,0 (m), 3,91 (3H, s, 11-OMe), 4,3-4,7 (5H, m, 17-H, CHCO, 5-H, 6-H, l'-H), 5,7 (3 br), 6,72 (ÍH, s, 10-H), 6,84 (ÍH, s, 4-H), 7,13 (ÍH, d,

J-2,2 Hz, 12-H), 7,75 (ÍH, s, 7-H), 8,13 (ÍH, s, HCO₂), 8,78, 8,85 (2H, d, J=7 Hz, 16-NH), 13,17 (br) .

Preparou-se o éster tf -benzil <X-N-hidroxissuccinimíd_i co do ácido N-t-Boc-(L)-glutâmico de acordo com o processo seguinte .

A uma mistura agitada de 10,12 g (30 mmoles; Vega Chemi cal) do éster Y -benzílico do ácido N-t-Boc-(L)-glutâmico e 4,30 g (33 mmoles; Aldrich) de N-hidroxissuccinimida em 200 ml de CH₂C1₂ adicionaram-se 6,81 g (33 mmoles, E. Merck) de N,N’-diciclo-hexilcarbodiimida. Aqueceu-se a mistura à temperatura de refluxo durante 10 minutos e, depois, agitou-se ã temperatura ambiente durante 5 horas. Eliminou-se o precipitado e lavou-se com CH₂C1₂. Reuniram-se o filtrado e o produto de la vagem e evaporou-se in vácuo até ã secura. Triturou-se o óleo residual com hexano e, depois, com n-pentano. Dissolveu-se o semi-sólido em 300 ml de Et₂O, eliminando-se os produtos insolúveis por meio de filtração. Concentrou-se o filtrado in vacuo até ã secura, obtendo-se 11,8 g (27,2 mmoles; rendimento:

: 90,6%) do composto em título, sob a forma de uma espuma esbran quiçada.

-50RMN Η¹ (300 MHz, DMSO-dg) 8 (ppm): 1,44 (9H, s, t-Bu), 2,05 (ÍH, m, 3-H), 2,17 (1H, m, 3-H), 2,64 (2H, s, succ-CH₂) , 2,65 (ÍH, m, 4-H), 2,86 (3H, brs, succ-CH₂, 4-H), 4,50 (ÍH, dd, J=8 Hz, 13 Hz, 2-H), 5,16 (2H, s, CH₂Ar),, 7,41 (5H, s, ArHs), 7,73 (ÍH, d, J=8 Hz, NH).

Exemplo 21. - Preparação de N-(alil)pradimicina B (II; R.]=CH₃; R₂=H; ^R3^=CH3' R₄=CH₂CH=CH₂)

Numa suspensão de 100 mg (0,15 mmoles; 85% pura por HPLC de pradimicina B em 4 ml de 1,2-dicloroetano injectaram-se 0,60 ml (2,42 mmoles) de BSA e agitou-se a mistura ã temperatu ra de 70°C durante 2 horas, sob uma atmosfera de azoto anidro.

Na solução castanha escura, resultante, injectaram-se 0,088 ml (0,94 mmoles) de iodeto de alilo e agitou-se a mistura à tempe ratura de 100°C, sob uma atmosfera de azoto anidro, durante

2,5 horas, no fim de cujo tempo a HPLC indicou estar a reação completa. Após arrefecimento, concentrou-se a mistura in vacuo, dissolveu-se o resíduo em 10 ml de metanol e tratou-se com 2 ml de HCl IN e 'concentrou-se, rapidamente, in vacuo, para eliminar o metanol. O resíduo, diluido com H₂O, foi purificado por meio de coluna cromatogrãfica (fase inversa, gel de sílica, Líchroprep RP-18, EM Science) eluindo-se com H₂O e, depois, com CH₃CN a 40%/H₂O para se obterem 37 mg (0,05 mmoles; rendimento:

: 35%) do composto em título, sob a forma de um pó cor de laran ja escura: Rt 4,95 minutos (pureza: 96%; HPLC, coluna: Microsorb Short One C^g eluente: CH₃CN a 50%/tampão de fosfato de potássio a 0,15% pH=3,5; velocidade da corrente: 1,2 ml/minuto.

I.V. (KBr) Q max

3390, 2927, 1731, 1606 cm¹.

-51UV (MeOH: H~O = 1:1) } _m : 234 ( £ 21,700), 286

4. iuclX ( £ 17,600), 480 nm (£ 7,600).

MS (FAB): m/z 749 (m+H)t

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d^) 6 (ppm): 1,25 (3H, d, J=7,2 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=7,3 Hz, Me), 2,27 (3H, s, 3-Me),

2,83 (3H, brs, NMe), 3,2-3,9 (m, 2’-H, 3'-H, 41H, 5' -Η) , 3,93 (3H, s, 11-OMe), 4,35-4,49 (3H, m, 5-H, 6-H, 17-H), 4,67 (1H, d, l'-H), 5,50-5,57 (2H, m, H₂C=), 5,55-5,64 (1H, m, =CH), 5,80-5,95 (2H, brs, D₂O permutável), 6,1-6,2 (2H, brs, D₂O permutável), 6,89 (ÍH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,02 (ÍH, s, 4-H),

7,25 (ÍH, d, J=2 Hz, 12-H), 8,01 (ÍH, s, 7-H), 8,58 (ÍH, d,

J=6,9 Hz, CONH, D₂O permutável), 12,88 (ÍH, s, D₂O permutável).

Exemplo 22. - Preparação de N-(alil)pradimicna A (II; R^CH^· R₂=p-D-xilosil; R₃=CH₃; R₄=CH₂CH=CH₂)

Numa suspensão de 50 mg (0,057 mmoles) de pradimicina A HCl em 2 ml de 1,2-dicloroetano injectaram-se 0,25 ml (1,02 mmo les) de BSA e aqueceu-se a mistura ã temperatura de 40°C, sob uma atmosfera de azoto anidro, durante 1 hora, no fim de cujo tempo a maior parte da pradimicina A entrou na solução. A esta solução adicionaram-se 40 jil (0,44 mmoles) de iodeto de alilo e agitou-se a mistura à temperatura de refluxo durante 11 horas. Após arrefecimento, concentrou-se a mistura in vacuo, e o resíduo , dissolvido em 5 ml de MeOH, foi tratado com 1 ml de HCl IN. Concentrou-se a mistura in vacuo e dessalgou-se o resí. duo por meio de uma coluna HP-20, eluíndo-se, em primeiro lugar, com H₂O e depois, com acetona a 80% (v/v)/H₂O (pH=3) para se obterem 42 mg (0,048 mmoles; rendimento: 85%) do composto em título, sob a forma de um pó avermelhado: Rt 3,10 minutos (pureza:

-5293%; HPLC, coluna: Microsorb Short One C^g, jum, Rainin Instrument Co., eluente: tampão 0,15%; pH=3,5)/CH^CN, velocidade da corrente detecção: absorção UV em 254 nm).

4,6 mm I.D. x 100 mm, a 50% (KH₂PO₄ a : 1,2 ml/minuto;

I.V. (KBr) J : 3400, 1730, 1630 (sh), 1610 cm”¹.

^v max '

UV (MeOH: H„O = 1:1) X : 234 ( £ 29,000), 288 (£ £ IRclX

23,000) , 476 nm ( £ 9,850).

MS (FAB): m/z 881 (M+H)⁺ ; RHMS; calcd. para ^C43^H49^N2^O18 (M+H)⁺ 881,1980, encontrado 881,2960.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-dg) 6 (ppm): 1,32 (3H, brm, 5'-Me), 1,32 (3H, d, J=7,3 Hz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me), 2,66 (3H, br, NMe), 3,0-3,2 (3H, m, 5-H, 2-H, 3-H), 3,71 (1H, dd, J=ll Hz, 5 Hz, 5-H), 3,95 (3H, s, 11-OMe), 4,3-4,7 (5H, m, 17-H, 1-H, 5-H, 6-H, l’-H), 5,1 (2H, m, =CH₂), 5,8 (ÍH, m, CH=), 6,93 (ÍH, d, 10-H), 7,04 (1H, s, 4-H), 7,28 (ÍH, d, J=2 Hz, 12-H),

8,04 (ÍH, s, 7-H), 8,57 (1H, d, J=6,9 Hz, CONH, trocado com D₂0), 12,88 (ÍH, s, trocado com D₂O).

Exemplo 23. - Preparação de N-(propargil)pradimicina B (II; R₁=CH₃; R₂=H; R₃=CH₃; R₄=-CH₂C=CH)

Numa suspensão de 100 mg (0,14 mmoles; 85% pura por HPLC) de pradimicina B em 5 ml de 1,2-dicloroetano injectaram-se 0,6 ml (2,4 mmoles) de BSA e agitou-se a mistura à temperatura de 70°C, durante 1,5 horas, sob uma atmosfera de azoto. Na mis. tura injectaram-se 0,11 ml (0,98 mmoles; 80 wt% solução em tolueno) brometo de propargilo e agitou-se a mistura ã temperatu ra de 90°C durante 6 horas. Concentrou-se a mistura reaccional

-53in vacuo e misturou-se o resíduo, dissolvido em 10 ml de metanol , com NaOH IN . Recolheu-se o precipitado formado e pu rificou-se por meio de coluna cromatográfica {fase inversa , gel de sílica, Lichroprep RP-18 , EM Science) eluíndo-se com MeOH a 70%/H₂O para se obterem 31 mg (0,033 mmoles; rendimen to: 23%) do composto em título, sob a forma de um pó cor de la ranja: Rt 4,05 minutos (pureza: 83%; HPLC, condições: as mesmas observadas no Exemplo 21).

I.V. (KBr)J : 3851, 3417, 2921, 2132, 1728, 1608

ΙΠαΧ cm . UV (MeOH: H_O = 1:1) 1 : 232 (£ 26,200), 288 (£

21,600) , 474 nm ( £ 9,050) .

MS (FAB): m/z 747 (m+H)⁺.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-dg) S (ppm): 1,10 (3H, d, J=6,2 Hz, 5'-Me), 1,31 (3H, d, J=6,l Hz, 17-Me), 2,28 (3H, s, 3-Me), 2,67 (3H, s, NMe), 2,88 (ÍH, br, HCC-), 3,07 (ÍH, br, 4’-Η), 3,32 (s, D₂O permutável), 3,7 (4H, brs), 3,94 (3H, s, 11-OMe), 4,38-4,58 (4H, m), 6,08 (1H, br, D₂O permutável), 6,9 (ÍH, d, J=2 Hz, 10-H), 7,05 (ÍH, s, 4-H), 7,25 (ÍH, d, J=2 Hz,

12-H), 8,0 (1H, s, 7-H), 8,6 (1H, d, J=7 Hz, COHN, D₂O permutável) , ÍH, s, D₂O permutável).

Exemplo 24. - Preparação de N-(benzil)pradimicina A (II; R^=CH₃ ; R₂= p -D-xilosil; R^CH^; R₄=CH₂Ph)

Numa suspensão de 80 mg (0,095 mmoles) de pradimicina A HC1 em 6 ml de 1,2-dicloroetano injectaram-se 0,6 ml (2,42 mmoles) de BSA e aqueceu-se a mistura à temperatura de 70°C,

-54durante 1,5 horas, sob uma. .atmosfera de azoto anidro. Nesta solução, injectaram-se 83 ^il (0,70 mmoles) de brometo de benzilo e agitou-se a mistura ã temperatura de 70°C durante 17 ho ras. Após arrefecimento, concentrou-se a mistura in vacuo e tratou-se o resíduo, dissolvido em 8 ml de MeOH, com 0,8 ml de ✓

HCl IN. Concentrou-se a mistura in vacuo e purificou-se o resíduo por meio de coluna cromatográfica (fase inversa, gel de sílica, Lichroprep RP-18, EM Science) eluindo-se com H₂O,

CH^CN e, depois, MeOH. Concentraram-se as fracções MeOH in vácuo para se obterem, 37 mg (0,04 mmoles; rendimento: 42%) do compo_s to em titulo, sob a forma de um pó castanho: Rt 4,40 minutos (pureza: 91%; HPLC, eluente: tampão a 50% (K^PO^ a 0,15%; pH= =3,5)/CH_gCN, outras condições: as mesmas observadas no Exemplo 22) .

I.V. (KBr) : 3400, 1740, 1630 (sh), 1610 cm^-1.

HiaX

UV (MeOH: H„O = 1:1)1 : 232 (£26,000) , 284

IftciX ( £. 20,900) , 480 nm ( £ 9,600) .

MS (FAB): m/z 932 (M+H)⁺; HRMS; calcd. para ^C47^H51^N2^Oi8 (M+H)⁺ 931,3137, encontrado 931,3116.

RMN H¹ (300 MHz, DMSO-d_g) £ (ppm): 1,16 (3H, d, J=6,2

Hz, 5	'-Me), 1,30 (3H, d, J=7,3 Hz	, 17-Me), 2,17	(3H, s, 3-Me),
2,52	(3H, s, NMe), 2,9-3,2 (m) , 3	,71 (m), 3,92	(3H, s, 11-OMe)
4,00	(2H, s, CH2Ph), 4,3-4,5 (4H,	m, 17-H, 1-H	, 5-H, 6-H),
4,60	(1H, d, J=6 Hz, l'-H), 6,85	(1H, s, 10-H),	6,97 (1H, s,
4-H) ,	7,22 (1H, s, 12-H), 7,2-7,4	(5H, m, ArHs)	, 7,94 (1H, s,
7-H) ,	8,59 (1H, d, J=7 Hz, CONH),	12,97 (1H, s)

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de compostos de formula geral na qual representa um átomo de hidrogénio ou um grupo me tilo ou hidroximetilo;

   representa um átomo de hidrogénio ou um grupo -D-xilosilo;

   R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo .

   metilo; e

   R^ representa um grupo alcanoílo comportando •como substituinte um grupo amino, alquil(0_χ_₃)’-amino ou di-alquil-amino;·alcinilo ^2-5'

   L-glutamilo; formilo; benzilo; p-tolilsulfonilcarbamilo; ou alcenilo C₂-5 ®^v®ntualmente- substituído ou alquilo substituído em que os substituintes são grupos escolhidos entre um grupo carboxilo, alcoxi(0_χ_₅)-carbonilo, carbamilo, alquil(C_1-5)-carbamilo, di-alquil(0_χ_₅)-carbamilo ou sulfonilo;

   com a condição de o aminoacido resultante se apresentar na configuração- D quando R^ representa um grupo metilo ou -hidroximetilo, e dos seus sais aceitáveis sob o. ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto:

   (a) para-a preparação de derivados N-(alquil substituídos) ou N-(alcenil substituídos) de se introduzirem em uma pra dimicina inicial os grupos alquilo ou alcenilo substituídos por deslocação nucleofílica directa ou por alquilação redutora envolvendo o grupo amino do açúcar; ou

   -57(b) para a preparação de derivados.N-acilados de se fa zer reagir o grupo amino do -açúcar de uma pradimicina inicial com o ácido pretendido ou um agente de acilação equivalente;

   ou (c) para a preparação de derivados N-carbomílicos de se fazer reagir uma pradimicina inicial.com um isocinato apro priado.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de formula geral-II na qual R_d representa um grupo alquilo C^_g comportando como substituinte um grupo, carboxilo, alcoxi (C^g) -carbonilo, carbamilo, alquil (C^_g)-carbamilo, di-aqluil (C-^g)-carbamilo ou sulfonilo; ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêu tico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos ini ciais correspondentemente substituídos.

   J
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ repre .senta um -grupo alcenilo Cg_g comportando como substituinte um grupo carboxilo, alcoxi (C^g)-carbonilo, carbamilo, -. alquil (C-_L_g) -carbamilo ou di-alquil (C^g) -carbamilo; ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corres pondentemente substituídos.
4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na gual R_d repre.

   senta-um.grupo alcanoílo comportando como substituinte um grupo amino., alquil (C^_-)-amino, ou di-alquil(C^_₅)-amino; ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação-de compostos de fórmula geral II na qual R₄ representa um grupo L-glutamilo., formilo ou p-tolisulfonilcarbamilo; ou. dos seus sais .aceitáveis sob. o ponto de vista farmacêu tico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos ini ciais correspondentemente substiutídos.
6. 6.- Processo de acordo com a- reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ representa um grupo benzilo, alcenilo C₃__g ou alcinilo C₃__g; ou dos. seus sais aceitáveis sob-o ponto de vista farmacêutico, -caracterizado pelo facto de se.utilizarem compostos iniciais correspondentemente.substituídos.
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 3, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R_d representa um grupo alcenilo C₃_₅.comportando como substituinte um grupo carboxilo ou alcóxi(C^__g)-carbonilo; ou dos seus sais

   -59aceitãveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
8. 8.- Processo de acordo com a reivindicação 2, para a preparação -de compostos de fórmula geral II na qual R^ representa um grupo carboximetilo, carbamilmetilo, alcoxi-carbonilmetilo ou sulfonilmetilo; ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituí dos.
9. 9.- Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R^ representa um grupo. 3-carboxi-2-propenilo ou 3-alcoxi -carbonil-2-propenilo; ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos, iniciais correspondentemente substituídos.
10. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 4, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual R₄ representa, um grupo alcanoílo ^2-3 ^comP°^rtando como substituinte um grupo amino, alquil(C^_g)-amino ou di-alquil(C^_g)-amino; ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, ca racterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais cor

    -60respondentemente substituídos.
11. 11.- Processo de acordo com a reivindicação 4, para a preparação de compostos de formula geral II na qual representa um grupo glicilo, Ν,Ν-dimetilglicilo ou jâ-alanilo; ou dos seus sais sais aceitáveis, sob o ponto de vista farmaceuti co, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
12. 12,- Processo.para a preparação de composições farmacêuticas. com acção anti-fúngica, caracterizado pelo facto de se misturar uma. quantidade efectiva de um composto de formula geral II, preparado pelo processo de acordo com a reivindi cação 1, como ingrediente, activo, com um veículo aceitável pm farmácia.