JPH0665675B2 - 新規なブリオスタチン４〜８ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規合成物を提供する。特に本発明は新規な非
常に活性の大環状ラクトン抗腫よう抗生物質ブリオスタ
チン４、ブリオスタチン５、ブリオスタチン６、ブリオ
スタチン７、およびブリオスタチン８を提供し、これら
は海洋性の苔虫類（bryozoan）であるブグラネリチナ
（Bugula neritina）及びアマチアコンボルタ（Amathia
convoluta）から単離される。

経済的な援助が契約NO1-CM-97262によってディビジョン
オブカンサートリートメント、NCl、ナショナルインス
チチュートオブヘルス、DWH、グラントNo.CA16049-01〜
07、（ナショナルカンサーインスチチュート、DHWマリ
ー デル プリッツラフ夫人、ザオリンファウンデーシ
ョン（スペンサーティー及びアンダブリュ）、ファニー
イー．リッペルファンデーション、エレナールダブリュ
リビー夫人、ザデービッドウエアーウオーデルファン
デーション、パールスペアー夫人、及びロバート ビー
ダルトン氏によって与えられた）が提供された。我々
が感謝する他の非常に助けとなった援助はジェー．ディ
ー、ドーロス博士、ジェー．ジェー、アインク博士、デ
ィー．ガスト博士、アール．アール．インナース博士、
エル．ダブリュ．クナップ博士、ピー．ロハヴァニジャ
ヤ博士、エム．アイ、スフネス博士、ジェー．エム．シ
ュミット博士、ジェー．ウィッチェルジュニア博士、エ
ム．エー．カールソン氏、ビー．エル．ノルフリート
嬢、ケイ．エム．ウェルチ嬢、ザスミソニアンインステ
ィチューションオーシャノグラフィックソーティングセ
ンター、及びサウスカロライナ大学ナショナルサイエン
スファンデーションリージョナルファクルティ（CH78-1
8723）から得られた。又NlH CA24487（JC）及びナショ
ナルサイエンスファンデーションによっても援助が与え
られた。

［先行技術］ 苔虫類のただひとつの先行化学調査は、 （１）ある種の苔虫類、例えば、ブグラネリチナ（Bugu
la neritina）（フサコケムシ）が抗癌成分を浮遊して
いるという我々の最初の報告（ペティト ジー．アー
ル、ジェイ．エフ．デイ、ジェイ．エル．ハートウエ
ル、エッチ．ビー．ウッド、Nature,1970,227巻、962-9
63） （２）同じ種に於けるアドレノクローム様色素の予備研
究（ウィレラ ジー．ジー． Proc.Soc.Exptl.Biol M
ed.1948,68:531-553）及び （３）フルストラ フォリアケア（Flustra foliacea）
からのインドールフルストラミン類Ａ及びＢの単離（カ
ルレ ジェー．エス．、クリストファーソン ディー、
J.Org.Chem.1980,45:1586-1589:カルレ ジェー．エ
ス．、クリストファーソン シー、J.Org.Chem.1981,4
6:3440−3448）のみである。現在知られている環状のイ
オン透過担体（ionophore）のうち、ストレプトマイセ
スグリセウス成分のアプラスモマイシンが遠い関係なが
らブリオスタチンに関係しているようである。（オカミ
ワイ、オカザキ ティー、キタハラ ティー、ウメザ
ワ エッチ、J. Antibiot.1976,29:1019及びナカムラ
エッチ、イタカ ワイ、キタハラ ティー、オカザキ
ティー、オカミ ワイ、J. Antibiot.1977,3.0:714）ブ
リオスタチン類１、２、及び３はヨーロッパ特許出願01
09811,1984年５月30日公告に記載されている。

［発明の構成］ 本発明は特に式Ｉの化合物又はそのアシレートを提供す
る。

式中Ｒは （ａ）−COCH₂CH₂CH₃、又は （ｂ）−COCH₃であり、 R₁は （ａ）−COCH₂CH（CH₃）_２、 （ｂ）−COCH₂CH₂CH₃、又は （ｃ）−COCH₃である これらの化合物はここで式Ｃに示されるようにブリオス
タチン４〜８と命名される。

［生物の記載］ 外こう動物門（Ectoprocta）（一般にグリオゾア（Bryo
zoa）又はポリゾア（Polyzoa）と呼ばれている）の海洋
動物は群体のフィルターフィーダー（食物をフィルター
でこして得る）であって、各メンバー（個虫：ポリバイ
ド）は別々の単位（虫室）の中に包まれている。それら
の表面的な外観の為にブリオゾアは一般的にシーマット
又は偽珊瑚として知られている。

ブグラネリチナ（Bugula neritina）（Linnaeus）は広
く分布する苔状のブリオゾア（苔虫類）であって、船腹
に取りつく能力が良く知られている。ブグラネリチナ個
虫（鳥頭体）の一つの形は鳥のくちばしに似ており、一
方の顎を他方の顎に対し閉じることによって招かれざる
侵入からコロニーを保護することが出来る。そのような
鳥頭体はブグラネリチナの一般的な成分である。

ブグラネリチナ及び他の海洋苔虫類はジェイ．エッチ．
デイによって「南アフリカの海岸に於ける海洋生物のガ
イド」、バルケマン エー．エー．ケープタウン1974
123頁及びピー．エッチ．ベンソン及びアール．ダブリ
ュ．モンクレイフによって「良く知られた船底に付着す
る生物ブグラネリチナの幼虫の付着に対する亜鉛及びpH
の効果」（Compt.Rend.du Contres.International de l
a Corrosion Marine et de Selissures）第４回アンテ
ィベス アンド ジュアン−レーピンズ フランス７月
14〜18、1976に記載されている。

ブグラネリチナ標本はカルフォルニアのオンテレイベイ
から採集した（北緯36゜西経122゜）。これらは０〜５
フィートの低い潮位で採集された。これらの生物を採集
した他の場所は東京湾（北緯35゜東経140゜）及びメキ
シコのシナロアの近くやフロリダ州アリゲーターハーバ
ーの近くの場所が含まれる。別々の３つの採集物からの
ブグラネリチナの抽出物は全て抗新生物活性を含有して
いた。アマチアコンボルタは低木様の集合体として１〜
3cmの高さとなりここで各々の灰褐色のコロニーの個々
の動物は大きさが0.1mmである。ウールコット等、バイ
オロジーオブブリオソアンズ（Biology of Bryosoans）
（アカデミックプレス、ニューヨーク1981）及びジェ
イ．エス．ライアンズ Bryosoan（ハッチンソンアンド
カンパニーリミテッド、ロンドン 1970年）を参照。一
般にアマチアコンボルタは苔虫類ブグラネリチナＬに類
似し、両方とも北東メキシコ湾のある部分に生じる。

ブリオスタチンの単離精製 ブグラネリチナ及びアマチアコンボルタの試料からブリ
オスタチンを単離精製するのに溶媒抽出、分配クロマト
グラフィ、シリカゲルクロマトグラフィ、クレイグ装置
中での液−液分配、樹脂上への吸収、及び溶媒からの結
晶化を含め多くの方法を使用することが出来る。これら
の手順はまた継続中の出願1983年６月12日出願のS.N.51
3148にも記載されておりここに参照する。

クロマトグラフィに用いた全ての溶媒は再蒸留した。カ
ラムクロマトグラフィはセファデックスLH20、ファーマ
シアファインケミカルAB、アップサール、スエーデン又
はシリカゲル（70-730メッシュ）、イー．メルク、ダル
ムシュタットのいずれかを用いて行なった。用いたHPLC
カラム（9.4×500nm）はニュージャージー州クリフトン
のファットマインインコーポレーテッドからのパーチシ
ル10、M-9-ODS-2（C-18逆相）及びパーチシル‐10 M-9
カラムであった。最終分離はアルテックスHPLCでシステ
ムコントローラーモデル420及びモデル110Aポンプをも
って行なった。分離用及び逆相（KC-18）LTCプレートは
ワットマンにより提供され、シリカゲルGFユニプレート
はアナルテックインコーポレーテッド、ニューアーク、
デラウエア州から供給された。プレートはUV光線によっ
て可視化されるか及び／又はアニスアルデヒド、酢酸、
硫酸スプレー（プレートを約150゜で５〜10分加熱）に
よって検出した。フラクションはガソリンFC-80（マイ
クロフラクショネータ）又はFC 220（レーストラックフ
ラクショネータ）装置を用いて集め、クロマトグラフ分
画に対し、ガソリンUVモニターモデルHMを使用した。融
点は未補正でコフラー型の融点装置を用いて観察した。
紫外線スペクトルはヒューレットパッカード8450 UV／V
ISスペクトロメータを用いて記録した。施光度はパーン
エルマーモデル210施光計を用いて記録した。マススペ
クトロメーターで記録し、赤外スペクトルはニコレット
FTIRモデルMX-1スペクトロメーターを用いて記録した。
NMRスペクトルはブルーカーWH-90.WH-400及びバリアンX
L100装置で得た。テトラメチルシランを内部標準とし
て、溶媒として重水素クロロホルムを使用した。

500kg湿潤重量のブグラネリチナを採集直後2-プロパノ
ール中に浸漬し、その状態で処理場所に送った。シッピ
ング（運搬）溶液（150ガロン）を動物から抜き出し50
℃でブチ（Buchi）R-150E蒸発器を用いて水性スラリー
に濃縮した。この濃縮物を多くの部分に分割し、繰り返
し塩化メチレンで抽出した（５〜６回）。シッピング溶
液からの乾燥した塩化メチレン抽出物を一緒にしたもの
は511.0gの重さであり、3.75mg／kgの注射投与に於いて
マウスに対し毒性であった。

シッピング溶液を抜き出し後、海洋動物を切り刻み、更
に塩化メチレンとメタノール（1:1）の混合物で２週間
環境温度で抽出した。生じる溶液を動物から抜き出し、
４部の溶液に対し１部の水を層分離をさせるために加え
た。下層（多くは塩化メチレン）を除き、40〜45℃で減
圧を用いて蒸発乾固した。残存する上層に十分な塩化メ
チレン及びメタノールを加えて単一層とし（夫々上層、
塩化メチレン、メタノール4:2:1の比）、そしてこの溶
液を環境温度で12日間の第二の抽出の為に動物材料に戻
した。第二の抽出から生じる溶液を動物から排出し、水
を再度層分離するために加えた。下層を分離し、蒸発乾
固した。乾燥塩化メチレン抽出物全部で366.1gを動物を
２回塩化メチレン−メタノール抽出をすることにより得
た。

乾燥塩化メチレン抽出物（シッピング溶液に由来するも
の及び切り刻んだ動物の抽出物からのもの）を更に少量
とって各々をメタノール：水（9:1）／ヘキサン（４
回）で始める溶媒分配にかけることによって更に分離し
た。乾燥したヘキサン抽出物はP388マウス腫よう試験に
於いて不活性であった。水性のメタノール層は更に水で
希釈し、8;2とし、四塩化炭素で繰り返し（９回）抽出
した。四塩化炭素抽出物を乾燥し、抗腫よう活性を検定
した。シッピング溶液に由来する149.6gの部分は1.5mg
／kgの投与量に於いてマウスに毒性であったが、一方6
4.3g量の切り刻んだ動物の塩化メチレン／メタノール抽
出に由来するものはPSマウス腫よう試験系に於いて活性
であり、10mg／kgの投与量に於いて寿命を46％増加し
た。

上記の全抽出及び溶媒分配工程は式Ａに於ける図解で示
される。

アマチアコンボルタに対して同様の手順を使用した。斯
くして245kgのアマチアコンボルタ湿潤重量を、最初
に、式Ｂ第一部に於いて概略を示したように、61g四塩
化炭素PS活性フラクションに減少させた。2:3塩化メチ
レン／メタノールを溶媒として使用するセファデックス
HL-20を用いるゲル透過分配型クロマトグラフィ分離は
主要な抗新生物成分のフラクションＤの急速濃縮を更に
生じた。有用なそれ以上の分離濃縮をこの段階を式Ｂの
第二部に示されるように繰り返すことによって達成し
た。フラクションＨは最も強力な抗新生物成分を含有す
るようであり、更にシリカゲル上で注意深く分画するこ
とによって分離し、活性のフラクションＭを生成した。
溶媒を変化させてシリカゲルクロマトグラフィ分離を更
に延長し、活性フラクションＮを生成した。調製用層ク
ロマトグラフィによって比較的小重量のＮ（37.5ng）は
部分的な分離を可能とし、活性なフラクションＯを生成
した。245kgの動物からの18.2mgのフラクションＯでさ
え、最終分離の為には、徹底的な逆相及び通常相のHPLC
手順を要する更に挑戦をさせられる混合物であった。こ
のことはブリオスタチン４（1a）及び６（1b）が夫々1.
6mg及び0.6mg収率で単離されたことを意味する。

一方有望なセファデックスLH-20フラクションのＧ及び
Ｉを式Ｂ第三部に概略を示すように一緒にし、ブリオス
タチン４及び６を得るのにすぐ上にまとめたような同じ
形式の分画にかけた。しかし前の分離のフラクションＭ
に対応する活性フラクションＰはかなりもっとこみいっ
ており、LH-20ゲルを用いる非常に注意深い分配クロマ
トグラフィ段階の導入を要した。生じるPSインビボ（生
体内）で非常に活性なフラクションＱはフラクションＭ
〜Ｏを分離するのに開発した技術を用いてアマチアコン
ボルタの主要な活性抗新生物成分に分離可能であった。
追加の量のブリオスタチン４（1a,6.0mg）及び６（1b,
5.7mg）を単離し、ブリオスタチン５（1c,3.1mg）及び
新規なブリオスタチン命名８（2,4.2mg）を伴った。ブ
リオスタチン４及び６の一緒にした合計収率は2.1×10
^-6％及び2.6×10^-6％、ブリオスタチン５の1.3×10^-6％
及びブリオスタチン８の1.7×10^-6％であった。ブリオ
スタチン４〜６の現在のPS生体内（インビボ）抗新生物
評価（分離式第三部を参照）はブリオスタチン８が同様
な注目すべき高水準を示すことが最終的に見いだされた
ことを示唆する。

ブグラネリチナ抗新生物成分の平行研究はブリオスタチ
ン４及び６に対しここで示した構造の指定を導いた。こ
の独特の大環状ラクトンの系列のメンバーとしてのブリ
オスタチン８の認知はアニスアルデヒド試薬でスプレー
した物質の薄層クロマトグラフフを加熱すると特徴的な
赤みがかった白亜色が生じることが観察されることから
生じた。400MHz 1H NHR（表１）及び13C NMR（表
２）の詳細な解釈は、ブリオスタチン８が基本的なブリ
オピラン環系及びブリオスタチン１の置換パターンを保
持していることを示している。主要な差異はC-7及びC-2
0のようであり、ここでアセテート及び（E,E）オクタ‐
2,4-ジエノエートエステルが存在しないようにみえる。
分子イオンのきまった検出の為に我々が開発したブリオ
スタチン８に対する溶液相第二イオンマススペクトルメ
トリック技術の適用はむくわれるものであることがわか
った。ヨウ化ナトリウムを含有するスルホラン溶液は分
子イオンコンプレックスを903［Ｍ＋Na］^＋に、そして
重要な断片イオンを815［Ｍ＋Na-88］^＋に与えた。88質
量単位のみがなくなることはブリオスタチン８がブチレ
ート置換基でC-7及びC-20に於いてエステル化したとい
う推測に導いた。

ブリオスタチン２の構造解明の一部としてブリオスタチ
ン１が水性メタノール中で１％塩酸を用いて選択的に加
水分解され得ることが見いだされた。この反応は主要生
成物としてブリオスタチン２を導き、この非常に役に立
つ選択性の理由となるのが、C-20の周りにおける立体障
害であることを示唆している。ブリオスタチン８を１％
塩酸と水性メタノール中で１日間室温で反応させると主
要な生成物はマススペクトル及びプロトン磁気共鳴研究
に基づいて異性体形を1gを伴うとしてもC-20ブチレート
エステルであると推定された。加水分解生成物の溶液相
第二イオンマススペクトルは833［Ｍ＋Na］^＋に於いて
分子イオンコンプレックスを示し、非常にはっきり表わ
れる断片イオンを754［Ｍ＋Na-88］^＋に於いて示す。こ
のように選択的な加水分解による一つのブチルエステル
のなくなることを及びマススペクトルで促進された開裂
による第二のもののなくなることはブリオスタチン８に
対するC-7、C-20ジブチレート構造２に対する支持をす
ることに追いやるものとなった。ブチル基の非分枝状で
あることはブリオスタチン４、６、および８のNMR研究
によって確証された。

アマチアコンボルタの主要な抗新生物成分に対する構造
が確立された時にこの動物及び関連するブグラネリチナ
の間の可能な関係が調べられることとなった。全ての以
前の収集したものからの動物標本証拠物件並びにこれと
ともに1981年からより最近（1982年）までの再収集から
入手し得る100プラスのキログラム量のアマチアコンボ
ルタを厳密に調べた。＜0.2％〜凡そ３％乾燥重量のブ
グラネリチナの範囲の量が寄生又は着生の方法によって
アマチアコンボルタから生育しているものと分かった。
ここに記載した1981年の再収集は凡そ2.5重量％の付着
したブグラネリチナを有することが分かった。全体的に
アマチアコンボルタと同じ区域に於いて収集したブグラ
ネリチナからブリオスタチン４〜６を単離特性化する我
々の経験から、これらのブリオスタチン収率は2.5％の
ブグラネリチナを含有するアマチアコンボルタから期待
されるよりも２〜４倍大きなものであるようである。し
かしこの比率はこれらがアマチアコンボルタによって造
られたと安全に結論づけるには余りにも近かった。一方
ブリオスタチン８は同伴者のブグラネリチナから期待さ
れるよりも50倍大きな量でアマチアコンボルタから単離
された。したっがってブリオスタチン８はアマチアコン
ボルタの真正の成分であるようであり、及び／又は両方
の動物はブリオスタチンが送られてアマチアコンボルタ
によって濃縮されるかもしれない関係を有するかであ
る。又はもしも本当のブリオスタチンの源が双鞭毛藻類
のような一般的な食物源中に存在するのであればこれら
の関係は更によりこみいったものである。

選ばれた単離および精製方法は各段階に於いてインビト
ロおよび／又はインビボ抗腫よう試験であってアール．
アイ、ゲラン、エヌ．エッチ．グリーンバーグ、エム．
エム．マクドナルド．エイ．エム．シュマヒャーおよび
ビー．エス．アボットらによってCancer Chemother.Re
p.第３部３巻（２）:1-103（1972）及びシュミット ジ
ェイ．エム．、ペティット ジー．アール．によってEx
perientia 34巻659-660（1978）に記載されるように行
なうことによってモニターすることが出来る。そのよう
な試験は培養基中の腫よう細胞の生育を阻止するのに要
求される活性物質の濃度の測定（例えば50％生育を阻止
するのに要する濃度又はED₅₀）及び移植された腫ようを
有するマウスの寿命を長引かせるのに要求される活性物
質の投与量の測定が含まれる。

従ってブリオスタチン４はED₅₀10^-3〜10^-4μｇ／KgでPS
細胞ラインを阻止し、46μｇ／Kgに於いて寿命延長を62
％増加することが示されている。同様にブリオスタチン
８はマウスT388リンパ白血病検定（PS細胞ライン）に於
いて1.3×10^-3のED₅₀を有する。ここに特許請求した他
のブリオスタチンも効果的な抗新生物剤として示されブ
リオスタチン５はPSセルライン中のED₅₀1.3×10^-3〜2.6
×10^-4μｇ／ml、そして生体内の寿命延長185μｇ／Kg
で88％を有し、そしてブリオスタチン６は3.0×10^-3μ
ｇ／mlのED₅₀及び185μｇ／Kgに於ける82％の生体内寿
命延長を有し、ブリオスタチン７はPSセルライン中に於
けるED₅₀2.6×10^-5μｇ／ml及び92μｇ／Kgに於ける生
体内寿命延長77％を有する。

投与される量は新生物病が何であるか、関与する宿主の
種類、その年齢、健康、体重、もしあるとすれば同時処
置の種類、頻度及び治療比率に依存するであろう。

投与される活性成分の投与水準は例示的には静脈内で0.
1〜約200 mg／kg、腹腔内で１〜約500mg／kg、皮下で約
１〜約500mg／kg、筋肉内で１〜約500mg／kg、径口で５
〜約1000mg／kg、鼻内点滴注入が５〜約1000mg／kg、エ
ロゾル５〜約1000mg／Kg動物体重である。

濃度で表現すると活性成分は本発明の組成物中で皮膚の
周りの局所使用のため、鼻内、咽喉内、気管支内（bron
chially）、ブロンコリアリ（broncholially）、ちつ
内、こう門内又は、目内に組成物の約0.01〜約50重量／
重量％、好ましくは約１〜約20重量／重要％で存在で
き、非径口使用には組成物の約0.05〜約50重量／容量
％、好ましくは約５〜約20重量／容量％の濃度で存在し
得る。

本発明の組成物は好ましくは人および動物に投与の為に
単位投与形、例えば錠剤、カプセル、丸薬、粉剤、か
粒、座薬、滅菌非径口溶液又は懸濁液、滅菌非径口でな
い溶液又は懸濁液、及び径口溶液又は懸濁液などであっ
て適当な量の活性成分を有するものとして提供されるの
が好ましい。

径口投与の為には、固体又は流体単位投与形が調製でき
る。

粉末は極めて単純に活性成分を適当な細かい寸法に粉砕
し、同様に粉砕した希釈剤と混合することによって調製
される。希釈剤は乳糖又は澱粉などの可食炭水化物物質
であり得る。甘味剤又は砂糖並びに香味油が存在するの
が有利である。

カプセルは前に述べた様な粉末混合物を造って形成され
たゼラチンの鞘に満たすことによって造られる。有利に
は充填操作の助剤として潤滑剤、例えば滑石、ステアリ
ン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムが充填操作
の前に粉末混合物に加えられる。

軟質ゼラチンカプセルは活性成分の受け入れられる植物
油、軽質液体ペトロラタム又は他の不活性油又はトリグ
リセリドとのスラリーの機械カプセル封入によって造ら
れる。

錠剤は粉末混合物を調製し、か粒化又はスラグ化し、滑
剤を加え、錠剤に圧縮することによって造られる。粉末
混合物は活性成分、好ましくは粉末にしたものを希釈剤
又は基剤、例えば澱粉、乳糖、カオリン、燐酸ジカルシ
ウムなどと混合することによって造られる。粉末混合物
はコーンシロップ、ゼラチン溶液、メチルセルロース溶
液又はアラビアゴム粘液などの結合剤で湿潤化させふる
いを通すことによってか粒化することが出来る。か粒化
の外粉末混合物はスラグ化出来、即ち錠剤機を通し、生
じる不完全に形成された錠剤を粉々に砕く（スラグ）。
スラグはステアリン酸、ステアリン酸塩、滑石又は鉱油
の添加によって錠剤形成ダイに粘着することを防止する
ために潤滑することが出来る。潤滑化された混合物を次
に錠剤に圧縮する。

有利には錠剤はシェラックの密封コート又は腸溶皮コー
トからなる保護コーティング、糖の被覆、メチルセルロ
ース及びカルバナ蝋の光沢被覆をすることが出来る。

シロップ、エルキジル、及び懸濁液などの径口投与の為
の流体単位投与形は各茶さじの一杯の組成物が予め決め
られた量の活性成分を投与の為に含有しているように造
られる。水溶液形は砂糖、香味剤及び防腐剤とともに水
性賦形薬中に水溶液に溶解しシロップを形成する。エル
キシルは香料と共に適当な甘味料と共にヒドロアルコー
ル賦形薬を用いて造ることが出来る。懸濁液はアラビア
ゴム、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁剤の
助けを受けて適当な賦形薬との不溶形態として造られ
る。

非径口投与の為には流体単位投与形は活性成分及び滅菌
賦形薬を用いて造られるが水が好ましい。活性成分は使
用される形態及び濃度の依存し、賦形薬中に懸濁される
か溶解されるかのいずれかである。溶液を調製するにあ
たって、水溶性活性成分を注射用水に溶解し適当な小瓶
又はアンプル中に満たす前にフィルター殺菌し、密封さ
れる。有利には助剤例えば局所麻酔剤、防腐剤、および
緩衝剤が賦形薬中に溶解される。非径口懸濁液は実質的
に同じ方法で造られるが但し活性成分は賦形薬中に溶解
されるのでなくて懸濁され、滅菌がろ過によって行なわ
れない。活性成分は滅菌賦形薬中に懸濁される前にエチ
レンオキシドに晒されることによって滅菌される。有利
には表面活性剤又は湿潤剤が組成物中に含められ、活性
成分の均一な分配を容易にする。

径口および非径口投与に加えて、こう門内およびちつ内
経路を使用できる。活性成分は座薬によって投与され得
る。凡そ体温の融点を有する賦形薬又は容易に溶解され
る賦形薬を使用できる。例えばココアバター、及び種々
のポリエチレングリコール類（カーボワックス）は賦形
薬として役立つ。

鼻内点滴注入には流体単位投与形は活性成分及び適当な
製薬上の賦形薬を使用し、水が好ましく、又は通気方の
為の乾燥粉末による。

エロゾルとしての使用の為には、活性成分は、加圧エロ
ゾル容器中にガス状又は液化されたほう射薬、例えばジ
クロロジフルオロメタン、二酸化炭素、窒素、プロパン
などと共に、必要に応じて又は望ましい場合に通常の助
剤、例えば共溶媒及び湿潤剤などと共に充填することが
出来る。

明細書及び特許請求の範囲中で使用する単位投与形とい
う用語は人及び動物患者への単一の投与に適した物理的
に別の単位をさし、各単位は要求される製薬希釈剤又は
担体又は賦形薬と組み合わせて所望の治療効果を生じる
ように計算された予め決めた量の活性化合物を含んでい
る。本発明の新規な単位投与形の為の仕様明細は、 （ａ）活性物質の独特の性質及び達成される特定の治療
効果、 （ｂ）本明細書に詳細に記載されるように人に於いての
治療目的の為のそのような活性物質の配合技術に於ける
固有の制限、 に支配され直接依存しており、これらは本発明の特徴で
ある。本発明に従う適当な単位投与形の例は錠剤、カプ
セル、トローチ、座薬、粉末パケット、ウエハー、カシ
ュー、茶さじ一杯、大さじ一杯、滴下物、アンプル、小
瓶、これらの任意のものの分離した複数のもの、及びこ
こに記載した他の形式である。

抗ビールス又は抗新生物剤として使用される活性成分
は、それら自体この技術で入手でき確立された手順で調
製することのできる製薬物質の使用により単位投与形に
容易に造ることが出来る。

ブリオスタチンの投与は新生物病、例えば急性骨髄球性
白血病、急性リンパ球性白血病、悪性黒腫、肺の腺癌、
神経芽細胞腫、肺の小細胞癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、
ぼうこう癌を有する動物又は人を治療するのに有用であ
る。

本発明は以下に与えられる実施例によってよりよく理解
される。

実施例１ ブリオスタチン４の単離および精製 ブグラネリチナ（109g湿潤重量メキシコ湾）の塩化メチ
レン−メタノール−水抽出物の塩化メチレン相を連続し
てヘキサンおよび四塩化炭素の間で9:1〜4:1メタノール
−水中に分配した。全体の分離をバイオアッセイ（PSシ
ステム）でガイドし、四塩化炭素フラクションを、ゲル
透過（セファデックスLH-20,2:3塩化メチレン−メタノ
ール）、シリカゲル（塩化メチレン−メタノール）、分
配（セファデックスLH-20、ヘキサン−塩化メチレン−
メタノール10:10:1）、Prep.TL（ヘキサン−酢酸エチ
ル）、逆相（C-18メタノール−水）及びノーマルフェー
ズ（パルチシル10,酢酸エチル−ヘプタン−メタノール
−水）、HPLクロマトグラフィ手順という一続きに徹底
的にかけた。塩化メチレン−メタノールからの再結晶は
44.5mg（4.1×10^-5収率）のブリオスタチン４を無定形
の粉末、融点198-200℃を与えた。FAB⁴MS m／ｚ 894
（C46H70O17に対するM⁺）：▲［α］²⁷ _D▼＋93.6゜：
（ｃ＝0.032 CH₃ OH）;UV（CH₃ OH）λmax（ε,36,50
0）;IR（KBr）3470,2980-2945,1740,1725,1660-1645,14
40,1390,1370,1290,1240,1170,1100,1080,1050,及び100
0cm^-1;及び13C NMR式Ｉ〜４上に書入れた通り（試みと
しての指定）。

ブリオスタチン４の400 MHzのNMRスペクトルの詳細な解
釈はブリオスタチン類13a及び2.3bのブリオピラン環系
にたいする高解像プロトン同定に非常に緊密に対応する
一連の信号を明らかにした。さらにブリオスタチン１〜
３の特徴であるC-7及びC-20のエステルの側鎖プロトン
は存在しなかった。しかし、δ172.03及びδ172.22に於
ける13C NMR信号はC-7及C-20に於ける新しいエステル
置換の存在を示唆する。そのような結論はδ72.46に於
けるC-7炭素共鳴及びδ79.13に於けるC-20炭素共鳴によ
って更に強められる。同様にブリオスタチン１の1H NM
Rスペクトルに於いて鋭い一重線としてC-7プロトンがδ
5.10（ｍ）に表われ、C-20プロトンがδ5.167に表われ
た。両方の信号とも非常にブリオスタチン１分子構造に
非常に特徴的であった。

種々の方法に於けるブリオスタチンのマススペクトルに
於ける分子イオンの認識の実質的困難性の為に溶液相第
二イオンマススペクトルに基づく新しい一連の技術を開
発した。これらのアルカリ金属ヨウ化物、銀テトラフル
オロボレート又はタリウムテトラフルオロボレートのス
ルホラン中のものを用いる新規な手順はブリオスタチン
類を含む多様な物質につき容易く得られる、決まり切っ
たやり方での分子イオンの検出を与えた。これらの新規
なマススペクトル方法をブリオスタチン４の構造を更に
決定することに適用することは決定的と証明された。ス
ルホラン中のヨウ化ナトリウムでブリオスタチン４はｍ
／ｚ 917 ［Ｍ＋Na］^＋を示し、親ピークが899［Ｍ＋
Na-18］⁺,829［Ｍ＋Na-88］^＋及び815［Ｍ＋Na-102］^＋
であった。銀テトラフルオロボレートではｍ／ｚ 1001
及び1003［Ｍ＋Ag107及びAg109］⁺,983及び985［Ｍ＋Ag
-18］⁺,913及び915［Ｍ＋Ag-88］^＋及び899及び901［Ｍ
＋Ag-102］^＋が見いだされた。88分子量単位が存在しな
いことはブチレートエステル及び水の除去を示唆し、一
方102が存在しないことはバレリエート基及び水の除去
を示す。これらの仮定の確認は残った¹Hと¹³C NMR信号
の指定によって得られた。ブチレート基はノルマルであ
ってバレリエートエステルがイソであることが見いださ
れた。

塩酸によるブリオスタチン１（1a）からブリオスタチン
２（1b）への選択的酸触媒加水分解の研究はブチレート
及びイソバレリエートエステルに対する位置を指定する
基本として使用した。C-7と比べてC-20の相対的な立体
圧縮は障害のより少ない位置（C-7）に於ける加水分解
が起こりやすくしているようであり、ブリオスタチン１
はもっともな収率でブリオスタチン２へ変換可能である
ことが見いだされた。塩酸（水性メタノール中１％室温
で24時間）でのブリオスタチン４（1mg）の選択的加水
分解はブリオスタチン4a（0.72mg）（FAB MS m／ｚ 83
3［Ｍ＋Na］^＋、C41H62O 16に対する）及び少量生成物
として（100μｇ）ブリオスタチン4b（FAB MS m／ｚ 8
47 ［Ｍ＋Na］⁺C42H64O 16に対する）を生成した。こ
れらの結果からブチレートエステルはC-20に指定され、
イソバレリエートエステルはC-7に指定された。

実施例２ ブリオスタチン類４、５、６及び７及びアシ
ル化誘導体類 収集及び抽出：メキシコ湾東部（フロリダ州フランクリ
ンカンティ、アリゲーターハーバー）からのブグラネリ
チナの再収集（1982年７月）は50kgの湿潤重量の海洋動
物を与え、これは2-プロパノール中に保存した。

上記の溶媒分配順序で37.6gのブリオスタチンに富んだ
塩化メチレン抽出物（PS ED₅₀ 0.058μｇ／ml）を与え
た。抽出物を一連のカラムクロマトグラフィ分離にか
け、ブリオスタチン４及びその後ブリオスタチン類５〜
７を与えた。

ブリオスタチン５ シリカゲルカラムクロマトグラフィ及びゲル透過（セフ
ァデックスLH-20）クロマトグラフィの一連から活性フ
ラクション（0.38g）を白色の無定形粉末として単離
し、これはPS ED₅₀1.6×10^-3μｇ／mlを有し、これはTL
C（7:3 n-ヘキサン：アセトン及び2:3 n-ヘキサン：
酢酸エチル）によってブリオスタチン類４〜７を含有し
ていた。n-ヘキサン：アセトン（5:1→1:1）及びn-ヘキ
サン：酢酸エチル（2:1→1:2）を用いる乾燥カラム（２
×60 cm）のシリカゲルクロマトグラフィ方法を用いる
ことによって更に精製の為に６個のフラクションを選ん
だ。最初のフラクションはブリオスタチン４を含有して
いた。第二、第三及び第五のフラクションは1:1→9:1メ
タノール：水勾配（流速2ml／分）を用いるパーチシル
（Partisil）‐10-M-9-ODS-2（C-18逆相）を用いるHPLC
にかけた。第二のフラクション（15mg）は純粋なブリオ
スタチン５（14.1mg）を生成し、融点は169〜172℃であ
った。（CH₂Cl₂−CH₃HOから針状）:FAB MS m／ｚ 866
（C44H66O17に対する）： ▲［α］²⁷ _D▼＋106.92゜：（ｃ＝0.028CH₃OH）;UV（CH
₃OH）λmax 266 nm（ε,36,300）;IR（KBr） 3465,2
980-2935,1740,1725,1660-1640,1440,1385,1370,1290,1
230,1165,1100,1080,1060,及び1000cm^-1 ブリオスタチン６ 第三のフラクション（65mg）を同じHPLC最終精製にか
け、ブリオスタチン６、61.9mg、融点172-175℃を得
た。（CH₂Cl₂−CH₃OHから針状）:FAB MS m／ｚ 827（C
41H60O17に対する）： ▲［α］²⁷ _D▼＋39.92゜：（ｃ＝0.05 CH₃OH）;UV（CH
₃OH）λmax 228 nm（ε,35,350）:IR（KBr）3460,2980-
2950,1740,1720,1660-1650,1440,1380,1370,1280,1240,
1160,1100,1080,1060,及び100cm^-1 ブリオスタチン５の酸触媒加水分解 ブリオスタチン５（3b,1mg）の標本を0.5mlの１％塩酸
中で室温で24時間加水分解にかけた。塩化メチレンでの
抽出、水での洗浄及び乾燥によって得た生成物をHPLC逆
相（C-18）カラムクロマトグラフィによりメタノール：
水（1:1から9:1）を用いて分離し、Ｃ−20アセテート3e
（300μｇ）及びC-7イソバレリエート3f（100μｇ）を
得た。

C-20アセテートは水性メタノールから無定形粉末として
得た。融点153〜156℃。FAB MS m／ｚ 805［Ｍ＋Na］^＋（C39H58O16に対する）787［Ｍ＋Na-1
8］⁺:IR（KBr）:3475,2980-2950,1740,1720,1660-1638,
1435,1380-1370,1290,1240,1160,1100,1090,1075,1048,
1005及び870cm^-1 C-7イソバレリエートは水性メタノールから無定形固体
として得た。融点147〜152℃。FAB MS :m／ｚ 847［Ｍ
＋Na］^＋（C42H64O16に対する） 829［Ｍ＋Na-18］^＋及び745［Ｍ＋Na-102゜］⁺:IR（KB
r）:3470,3435,2975-2950,1738,1720,1660-1635,1440,1
390-1370,1290,1240,1160,1100,1075,1050,1000及び870
cm^-1 生成物は同様の酸加水分解によってブリオスタチン４か
らの化合物と同じものであることが分かった。

ブリオスタチン６の酸触媒加水分解 ブリオスタチン６（1mg）の標本をブリオスタチン５に
対する上記の同じ方法を用いて加水分解した。同じ方法
に於ける粗生成物に対する上記HPLCはブリオスタチン５
から得たものと同じC-20アセテート（350μｇ）及びC-7
ブチレート（150μｇ）を与えた。

C-7ブチレートは融点66-170℃の無定形固体として得ら
れた。FAB MS: m／ｚ 833［Ｍ＋Na⁺（C41H62O16に対す
る）815［Ｍ＋Na-18］^＋及び745［Ｍ＋Na-88］⁺:IR（KB
r）:3475,3430,2975-2945,1736,1720,1640,1620,1440,1
390,1095,1080,1040,及び870cm^-1 ブリオスタチン７の酸触媒加水分解 ブリオスタチン７（1mg）の資料を加水分解し、ブリオ
スタチン５に対し概略を示したLPLCによって粗生成物を
生成した。主要な生成物は20-アセテート（370μｇ）
で、ブリオスタチン５から得られた生成物と同じ生成物
であることが分かった。

ブリオスタチン４のアセチル化 ブリオスタチン４（9.0mg）の試料の無水酢酸（0.14m
l）及びピリジン（0.2ml）で室温で４時間処理した。混
合物を氷水中に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。抽出物
は希塩酸と水でで洗って濃縮し、減圧で乾燥した。粗生
成物（9.5mg）を上のブリオスタチン５に対して記載し
たのと同じ手順を用いてHPLCで精製した。純粋なブリオ
スタチン４アセテート3h（8.0mg 88.9％収率）をCH₂Cl
₂−CH₃OHから無色針状物として得た。融点159-162℃：
▲［α］²⁷ _D▼＋58.71（ｃ＝0.034、CH₃OH）:UV（CH₃O
H） λmax 227nm（ε,36,600）:IR（KBr）3460,2985-
2935,1745,1730,1660-1640,1440,1380,1370,1290,1240,
1165,1100,1050,及び1000cm^-1 表Ｉ〜IVはブリオスタチン５〜７の1H NMR及び13C NM
Rを示す。

実施例３ ゲル透過フラクションＧ及びＩを分離することはもっと
さらにたいへんな仕事であった。両方のフラクションを
一緒にし、27.56gの一緒にしたフラクション（式Ｂ第３
部）を先ずフラクションＨ→Ｍに対しまとめたように分
離し、PS活性のフラクションＰ（979mg）を生成した。
この段階でセファデックスLH-20及び溶媒系n-ヘキサン
−塩化メチレン−メタノール（10:10:1）を用いて分配
クロマトグラフィ手順を用いるのが最もよいことが分か
った。3cm×120cmの寸法のカラムを用い、12mlのフラク
ション合計240mlを集めた。生じる最も活性のフラクシ
ョン（Q,266mg）を更にフラクションＭ→Ｎに対し上で
述べたように更に分画した。のこりの分離段階はフラク
ションＯで用いた一般手順と同じ手順で達成した（式Ｂ
第２部）。HPLCシリカゲルからの溶離出現の順でプリオ
スタチン４（6.0mg）、ブリオスタチン５（3.1mg）、ブ
リオスタチン６（5.7mg）、及びブリオスタチン８（4.2
mg）を得た。恐らくこれらの物質はアマチアコンボルタ
のブグラネリチナとの連合に由来する。しかしブリオス
タチン８はアマチアコンボルタの真正の成分であるよう
であり、以下の用に特徴付けられた。

ブリオスタチン８ ブリオスタチン８を分析純度に最初の4.2mgをHPLC逆相C
-18カラムでメタノール−水（50:50から90:10）を溶離
剤として用いる再クロマトグラフィによって分析純度に
した。生じる2.8mgのブリオスタチン８を無色の無定形
粉末として得た。融点177〜173℃▲［α］²⁷ _D▼＋49.9
（ｃ＝0.04、CH₃OH）:UV λ（CH₃OH）max 266（ε,3
7,500）;IR ν（KBr）max 3551,3475,3415,2975-295
0,1742,1721,1640,1616,1449,1380,1245,1225,1165,109
5,1075,1050,及び870cm^-1、MS:903［Ｍ＋Na］^＋。400 M
Hzのブロトン、カーボン13、及び炭素磁気共鳴データは
表Ｖ及びVIにブリオスタチン１と比較して示されてい
る。

ブリオスタチン８のモノブチレートエステルへの酸触媒
加水分解 ブリオスタチン８の0.8mgの標本を0.2mlのメタノール中
の１％酸塩中で加水分解した（24時間、室温）。生成物
（0.5mg）をHPLC逆相カラム（C-18）クロマトグラフィ
によりメタノール−水（50:50から90:10）で単離した。
加水分解生成物の溶液相第二イオンマス及び高解像 1H
NMR（400 MHz）スペクトル研究の結果は議論の部分に
記録した。

実施例４ ブリオスタチンの誘導体類 ブリオスタチン類は遊離ヒドロキシルおよび置換可能な
アシル基を有する。従ってこれらの化合物の種々のアシ
ルエステルはこの技術で当業者によく知られた方法で調
整することが出来る。ブリオスタチンのアシル誘導体に
は （ａ）飽和又は不飽和直鎖又は分枝鎖脂肪酸カルボン
酸、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、第三
ブチル酢酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、カプリ
ル酸、デカン酸、ドデカン酸、ラウリン酸、トリドデカ
ン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、
マーガリン酸、ステアリン酸、アクリル酸、クロトン
酸、ウンデシレン酸、オレイン酸、ヘキシン酸、ヘプチ
ン酸、オクチン酸など、 （ｂ）飽和又は不飽和脂環式炭素環状酸、例えばシクロ
ブタンカルボン酸、シクロペタンカルボン酸、シクロペ
ンテンカルボン酸、メチルシクロペンテンカルボン酸、
シクロヘキサンカルボン酸、ジメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸、ジプロピルシクロヘキサンカルボン酸など、 （ｃ）飽和又は不飽和脂環式脂肪族カルボン酸、例えば
シクロペンタン酢酸、シクロペンタンプロピオン酸、シ
クロヘキサン酢酸、シクロヘキサン酪酸、メチルシクロ
ヘキサン酢酸など、 （ｄ）芳香族カルボン酸、例えば安息香酸、トルイル
酸、ナフトエ酸、エチル安息香酸、イソブチル安息香
酸、メチルブチル安息香酸など、および （ｅ）芳香族、脂肪族カルボン酸、例えばフェニル酢
酸、フェニルプロピオン酸、フェニル吉草酸、桂皮酸、
フェニルプロピオン酸、及びナフチル酢酸などである。
適当なハロ、ニトロ、ヒドロキシ、ケト、アミノ、シア
ノ、チオシアノ、及び低級アルコキ炭化水素カルボン酸
は上に与えられた炭化水素カルボン酸であって１又はそ
れ以上のハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、ケト、アミ
ノ、シアノ、又はチアシアノ又は低級アルコキシ、有利
には低級アルコキシの６個を越えない炭素原子のもの、
例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ア
ミロキシ、ヘキシロキシ、及びそれらの異性体形で置換
されたものを含む。そのような置換炭化水素カルボン酸
はモノ、ジ及びトリクロロ酢酸、α及びβ−クロロプロ
ピオン酸、α及びγ−ブロモ酪酸、α及びδ−ヨード吉
草酸、メバロン酸、２−及び４−クロロシクロヘキサン
カルボン酸、シキミ酸、２−ニトロ−１−メチルシクロ
ブタンカルボン酸、1,2,3,4,5,6−ヘキサクロロシクロ
ヘキサンカルボン酸、３−ブロモ−２−メチルシクロヘ
キサンカルボン酸、４−及び−５−ブロモ−２−メチル
シクロヘキサンカルボン酸、５−及び６−ブロモ−２−
メチルシクロヘキサンカルボン酸、2,3−ジブロモ−２
−メチルシクロヘキサンカルボン酸、2,5−ジブロモ−
２−メチルシクロヘキサンカルボン酸、4,5−ジブロモ
−２−メチルシクロヘキサンカルボン酸、5,6−ジブロ
モ−２−メチルシクロヘキサンカルボン酸、３−ブロモ
−３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、６−ブロモ−
３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、1,6−ジブロモ
−３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、２−ブロモ−
４−メチルシクロヘキサンカルボン酸、1,2−ジブロモ
−４−メチルシクロヘキサンカルボン酸、３−ブロモ−
2,2,3−トリメチルシクロペンタンカルボン酸、１−ブ
ロモ−3,5−ジメチルシクロヘキサンカルボン酸、ホモ
ゲンチジン酸、ｏ−,m−及びｐ−安息香酸、アニス酸、
サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、β−レゾルシル
酸、没食子酸、ベラトリン酸、トリメトキシ安息香酸、
トリメトキシ桂皮酸、4,4′−ジクロロベンジル酸、ｏ
−,m−及びｐ−ニトロ安息香酸、シアノ酢酸、3,4−及
び3.5−ジニトロ安息香酸、2,4,6−トリニトロ安息香
酸、トリシアノ酢酸、シアノプロピオン酸、酪酸、エト
キシ蟻酸（炭酸水素エチル）、リンゴ酸、クエン酸、イ
ソクエン酸、６−メチルサリチル酸、マンデル酸、レブ
リン酸、ピルビン酸、グリシン、アラニン、バリン、イ
ソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、
セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシプロリン、
オルニチン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ヒドロ
キシリジン、フェニルグリシン、ｐ−アミノ安息香酸、
ｍ−アミノ安息香酸、アントラニル酸、アスパラギン
酸、グルタミン酸、アミノアジピン酸、グルタミン、ア
スパラギンなどである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式Ｉの化合物又はその低級脂肪酸エステル ［式中Ｒは （ａ）−COCH₂CH₂CH₃、又は （ｂ）−COCH₃であり、 R₁は （ａ）−COCH₂CH（CH₃）_２、 （ｂ）−COCH₂CH₂CH₃、又は （ｃ）−COCH₃である］。
2. 【請求項２】Ｒが−COCH₂CH₂CH₃であり、R₁が−COCH₂CH
   （CH₃）_２であるブリオスタチン４である特許請求の範
   囲第１項に記載の化合物。
3. 【請求項３】Ｒが−COCH₃であり、R₁が−COCH₂CH（C
   H₃）_２であるブリオスタチン５である特許請求の範囲第
   １項に記載の化合物。
4. 【請求項４】Ｒが−COCH₃であり、R₁が−COCH₂CH₂CH₃で
   あるブリオスタチン６である特許請求の範囲第１項記載
   の化合物。
5. 【請求項５】Ｒ及びR₁が−COCH₃であるブリオスタチン
   ７である特許請求の範囲第１項に記載の化合物。
6. 【請求項６】Ｒが−COCH₂CH₂CH₃であり、R₁が−COCH₂CH
   ₂CH₃であるブリオスタチン８である特許請求の範囲第１
   項に記載の化合物。