NO172393B

NO172393B - Fremgangsmaate for fremstilling av en bu-3608 serinanalog

Info

Publication number: NO172393B
Application number: NO894417A
Authority: NO
Inventors: Yosuke Sawada; Masatoshi Kakushima; Maki Nishio; Takeo Miyaki; Toshikazu Oki
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1989-11-07
Publication date: 1993-04-05
Also published as: ATE94556T1; CA2001714A1; MY110238A; PT92263A; IL92240A0; CY1884A; KR900008049A; ZA898566B; DE68909170T2; EP0368349B1; DK561289D0; CN1044299A; PL161779B1; NO894417L; FI98147B; AU628418B2; AU4461589A; IE893617L; CA2001714C; ES2059681T3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en BU-3608 serinanalog med formelen (II)

hvori

seringruppen er D-serin,

R<1> og R<2> uavhengig er H eller C-^g-alkyl, og R<3> er jS-D-xylosyl,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. jS-D-xylosyl er fragmentet

Få eksempler på benzo(a)naftasenkinoler avledet fra mikrobielle kilder er angitt, og disse inkluderer forbindelser kalt G-2N og G-2A, og KS-619-1. Mens det ikke er angitt noen biologisk aktivitet for G-2N og G-2A, beskrives KS-619-1 som inhibitor for kalsiumionet- og calmodulinavhengig cyklisk nukleotidfosfodiesterase. I den senere tid er det i allment tilgjengelig EP-patentsøknad 277.621 beskrevet antifungale antibiotika BU-3608 (Ia), BU-3608 B (Ib) og BU-3608 C (Ic). Antibiotiske benanomisiner A og B er beskrevet i "J. Antibi-otics", 1988, 41:807-811. Benanomisin B synes å være den samme som BU-3 608 C, mens benanomisin A har en hydroksylgruppe istedenfor en sukkeraminogruppe.

I den paralleltløpende US-patentsøknad 203.776 av 7/6-88 beskrives BU-3608 (D (Id) og BU-3608 E (le).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved

a) at en stamme av Actinomadura hibisca med identifi-serende egenskaper som de stammer som i ATCC er deponert under

aksessjonsnumrene 53815, 53816, 53557 og 53762, dyrkes i et medium inneholdende assimilerbare kilder av karbon og nitrogen og D- eller DL-serin, under aerobe betingelser, b) at forbindelsen med formelen (II) isoleres fra mediet, og c) at en forbindelse med formelen (II), hvori R<1> og/ eller R<2> er hydrogen, eventuelt omdannes til en forbindelse

med formelen (II) , hvori R<1> og/eller R<2> er C-^.g-alkyl, ved omsetning i et polart løsningsmiddel og ved en temperatur i området fra romtemperatur til 100°C med et aldehyd eller et keton med 1-6 karbonatomer, til fremstilling av et imin-produkt, og iminproduktet reduseres under anvendelse av et metallhydrid som reduksjonsmiddel.

Oppfinnelsen skal illustreres nærmere under henvisning til tegningene, hvori: Fig. 1 viser et 400 MHz proton NMR-spektrum av BU-3608 FA-1 DMSO-dg. Fig. 2 viser et 400 MHz proton NMR-spektrum av BU-3608 FA-2 DMSO-dg.

Forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er antifungale midler. Som eksempler på antibiotikaproduserende stammer av "Actinomadura hibisca", kan nevnes stammen P157-2 og mutante stammer avledet derav og betegnet A2660, A2493 og B0012. Stammen, P157-2, som produserer BU-3608FA1 fortrinnsvis i et medium supplert med en kilde for D-serin, ble isolert fra en jordprøve samlet på Fiji-øyene i det Sydlige Stillehav. En biologisk ren kultur av "Actinomadura hibisca" stammen P157-2 er deponert ved ATCC i Rockville, MD og er tilføyet den perma-nente samling av mikroorganismer som ATCC 53557. En detaljert beskrivelse av dyrknings- og de fysiologiske karakteristika for stammen P157-2 er beskrevet i US-patentsøknad 115.273 av 2/11-87. Muntantstammene A2660, A2493 og B0012, som er i stand til å produsere både BU-3608 FA-1 og FA-2 i et medium inneholdende en kilde for D-serin, ble oppnådd fra opphavsstammen P157-2 ved eksponering av den for N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (1.000 /xg/ml) i en time: Stammene ble valgt på basis av deres evne til å produsere BU-3 608 antibiotisk kompleks, dvs. BU-3608 eller B-, C-, D- og E-komponentene i fravær av tilsatt kilde for D-serin. Biologisk rene kulturer av A2660, A2493 og B0012 er deponert ved ATCC og gitt aksessjonsnumrene 53762 (A2660), 53815 (A2493) og 53816 (B0012).

Dyrkingskarakteristika for de ovenfornevnte antibiotikaproduserende stammer av "Actinomadura hibisca" er gitt i tabell 1.

De produserende organismer dyrkes i et næringsmedium inneholdende en kilde for D-serin i tillegg til kjente næringskilder for actinomysetes, dvs. assimilerbare kilder for karbon og nitrogen pluss eventuelt uorganiske salter og andre kjente vekstfaktorer. Neddykkede aerobiske betingelser benyttes fortrinnsvis for fremstillingen av store mengder antibiotika, selv om overflatekulturer og kolber også kan benyttes for fremstilling av begrensede mengder. De generelle prose-dyrer som benyttes for dyrkingen av andre actinomysetes kan anvendes på foreliggende oppfinnelse.

Næringsmedier bør inneholde en egnet assimilerbar karbonkilde som ribose, glukose, sukrose, cellobiose. Som nitrogenkilde kan også ammoniumklorid, ammoniumsulfat, urea, ammoniumnitrat, natriumnitrat osv. benyttes enten alene eller i kombinasjon med andre nitrogenkilder som pepton, kjøtt-ekstrakt, gjærekstrakt, maisstøpevæske, soyabønnepulver, bomullsfrømel osv. Det kan også, hvis nødvendig, tilsettes uorganiske næringssalter for å gi kilder for natrium, kalium, kalsium, ammonium, fosfat, sulfat, klorid, bromid, karbonat, sink, magnesium, manganese, kobolt, jern o.l. Som kilde for D-serin kan man benytte enten D-serin eller DL-serin.

Fremstilling av antibiotika BU-3608 FA-1 og FA-2 kan gjennomføres ved en hvilken som helst temperatur som fører til tilfredsstillende vekst av den produserende organisme, f.eks. 25-40°C og den gjennomføres helst ved temperatur på 27-32°C. Vanligvis oppnås den optimale antibiotikumproduksjon i rystekolber etter inkuberingsperiode på 5-8 dager selv om lengre perioder kan være nødvendig i visse tilfeller. Beluftning i rystekolber oppnås ved omrøring, f.eks. rysting på en rotasjonsryster. Hvis fermenteringen skal gjennomføres i tank-fermentor, er det ønskelig å fremstille et vegetativt inoculum i en næringsbuljong ved inokulering av buljongkulturen fra en slantkultur eller en lyofilisert kultur av organismen. Etter oppnåelse av et aktivt inoculum på denne måte, blir dette aseptisk overført til fermenteringstankmediet. Antibiotisk produksjon i tankfermentorer når vanligvis optimum etter 3-6 dager inkubering. Agitering i tankfermentoren tilveiebringes ved å omrøre, og beluftningen kan oppnås ved innblåsing av luft eller oksygen i den agiterte blanding. Antibiotikumproduksjonen kan overvåkes ved bruk av kromatografiske eller spektroskopiske teknikker eller ved en hensiktsmessig biologisk analyse.

Antibiotika som fremstilles ved fremgangsmåten kan ut-vinnes fra dyrkingsbuljongen på en hvilken som helst egnet måte for slik utvinning. Et generelt skjema for en slik metode for isolering og rensing av antibiotika BU-3608 FA-1 og FA-2 fra fermenteringsbuljongen er vist nedenfor som skjema 1. For å beskrive flytdiagrammet i Skjema 1, ble hele fermenteringsbuljongen separert i mycelkake og supernatant ved vanlige metoder som sentrifugering. Supernatanten ble surgjort og presipitatet som ble dannet på denne måte ble fjernet. Filtratet ble justert til pH 5,0 for å avsette urent antibiotika som gjenoppløses i alkalisk vann og filtreres for å fjerne urenheter. Filtratet surgjøres til pH 2,0 og kromatograferes på en absorbsjonskolonne som Diaion HP-20 for derved å gi et urent BU-3608 HC1 kompleks. Dette urene antibiotikumkompleks kan omkrystalliseres f.eks. fra etylacetat, og produktet separeres i individuelle antibiotiske komponenter ved bruk av reversfase silika gel HPLC. Fraksjoner inneholdende BU-3608 FA-1 og BU-3608 FA-2 kan renses ytterligere ved Diaion HP-20 kromatografi. Hydrokloridsaltene av disse antibiotika kan så omdannes til zwitterionisk form ved justering av pH-verdien av en vandig oppløsning av HCl-salt til pH 5,5.

Antibiotika BU-3608-FA-1 og FA-2 karakteriseres ved de følgende fysiokjemiske egenskaper;

Antibiotika BU-3608 FA-1 og FA-2 kan underkastes ytterligere kjemisk modifikasjon. Oppvarming av BU-3608 FA-1, FA-2 eller en blanding derav i surt medium i et tidsrom tilstrekke-lig til å spalte xylosylgruppen gir de tilsvarende desxylosylderivater og små mengder av aglykon IV. Løsningsmidlet som benyttes kan f.eks. være dioksan, tetrahydrofuran, vann, lavere alkanol eller blandinger derav. Den sure katalysator kan f.eks. være saltsyre, svovelsyre eller trifluoreddiksyre. Temperaturen kan være 60-100°C eller løsningsmidlets tilbake-løpstemperatur. Reaksjonstiden kan være 54-10 timer og avhengig av de benyttede reaksjonsbetingelser. N,N-dimetyl BU-3608 FA-2 fremstilt ved reduktiv alkylering som beskrevet nedenfor, kan omdannes til den tilsvarende desxylosylforbindelse på tilsvarende måte. Det er iakttatt at sur hydrolyse av N,N-dimetyl BU-3608 FA-2 resulterer i et praktisk utbytte av aglykon IV.

Aminogruppen av BU-3608 FA-1, FA-2 eller deres tilsvarende desxylosylderivater kan alkyleres ved reduktiv alkylering som omfatter først å omsette antibiotikumutgangs-materiale med et aldehyd eller et keton for å danne et imin, med etterfølgende reduksjon av det således dannede imin. Kon-densasjonen og reduksjonen kan gjennomføres i samme reaksjons-beholder i ett trinn eller i to separate trinn. Den primære aminogruppe i BU-3608 FA-2 eller desxylosylderivater kan omdannes til et tertiært amin med to identiske alkylgrupper ved behandling med minst to ekvivalenter av karbonylforbindelsen i forhold til det benyttede antibiotikum, fulgt av reduksjon, eller et tertiært amin med to forskjellige alkylsubstituenter kan oppnås ved å benytte en kontrollert mengde av en første karbonylreaktant for å omdanne det primære amin til et sekun-dært amin, som deretter omsettes med en andre, forskjellig karbonylforbindelse for å gi det tertiære aminprodukt. Hvis den andre karbonylforbindelse ikke tilsettes, oppnås et sekun-dært amin.

Karbonylreaktanten kan være et aldehyd eller et keton med ett til seks karbonatomer, f.eks. formaldehyd, acet-aldehyd, propionaldehyd og aceton. Reduksjonen av iminet kan gjennomføres ved å benytte reduksjonsmidler som metall-hydrider, f.eks. natriumborhydrid, natriumcyanoborhydrid eller litiumaluminiumhydrid. Reaksjonen gjennomføres i et polart organisk løsningsmiddel eller en blanding av slike, som vann, acetonitril, lavere alkanoler og dimetylsulfoksid. Reaksjons-temperaturen er ikke spesielt begrenset og kan være fra romtemperatur til 100°C. Erfaring viser at alkyleringsreaksjoner gjennomført ved romtemperatur vanligvis er ferdig innen ca. 24 timer. Optimale reaksjonsbetingelser vil selvfølgelig avhenge av art og reaktivitet for de spesielle reaktanter. Det skal være klart at N,N-dimetyl BU-3608 FA-2 kan oppnås fra BU-3608 FA-2, FA-1 eller en blanding derav, dimetyldesxylosyl BU-3608 FA-2 oppnås fra desxylosyl BU-3608 FA-2, FA-1 eller en blanding derav.

De antifungale aktiviteter for representative forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen ble bedømt både in vitro og in vivo. De minimale inhiberende konsentrasjoner, MIC, mot forskjellige fungi, ble bestemt ved serieagarfortynnings-metoden ved bruk av Sabouraud dekstroseagar. Således ble ca. 0,003 ml fungalsuspensjon inneholdende IO<6> celler/ml påført på overflaten av agarplater inneholdende de angjeldende antibiotika. MIC-verdiene som ble registrert etter at kulturene var inkubert i 40 timer ved 28°C er angitt i tabell III.

In vivo antifungale aktiviteter ble bedømt mot intra-venøse infeksjoner med Candida albicans A9540, Cryptococcus neoformans IAM4514 og Aspergillus fumigatus IAM2034 i mus. Candida Albicans og Cryptococcus neoformans ble dyrket i 18 henholdsvis 48 timer ved 28°C i YGP medium (gjærekstrakt (0,2%), glukose (1,5%), pepton (0,5%), K2HP04 (0,05%) og MgS04 (0,05%) og suspendert i saltoppløsning. Aspergillus fumigatus ble dyrket i 7 dager ved 28°C på YGP agarslant og suspendert saltoppløsning. Sporer ble samlet ved filtrering av fungal-suspensjoner gjennom en egnet duk. ICR-hannmus med kroppsvekt fra 20 til 24 g ble infisert intravenøst ca. 10 ganger med den midlere letale dose av den angjeldende fungus.

Prøveforbindelsen ble administrert i forskjellige doser til grupper på 5 mus hver, intravenøst og enten én gang umiddelbart etter soppåvirkningen, dag 0, eller én gang daglig i 5 dager fra dag 0 til dag 4, (qd x 5). Den 50% beskyttende dose, PD50, ble beregnet fra overlevelsesgrad notert den 20. dag etter fungalsoppåvirkningen. Alle kontrolldyr døde innen 7-15 dager etter soppinfeksjonen. Resultatene av in vivo studier er angitt i tabell IV.

For behandling av fungalinfeksjoner i dyr og mennesker kan forbindelsens antibiotika gis i en antifungalt effektiv mengde på en hvilken som helst akseptert administreringsmåte, inkludert, intravenøst, intramuskulært, oralt, intranasalt, og for overflateinfeksjoner, topisk. Preparater for parenteral-administrering inkluderer sterile vandige eller ikke vandige oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner. De kan også fremstilles i form av sterile faste preparater som kan oppløses i sterilt vann, fysiologisk medium umiddelbart før bruk. Oral-preparater kan være i form av tabletter, gelatinkapsler, pulvere, pastiller, siruper og lignende. For topisk admini-strering kan forbindelsen innarbeides i lotioner, salver, kremer, tinkturer o.l. Enhetsdoseformer kan fremstilles ved bruk av de metoder fagmannen generelt bruker for farmasøytisk preparater.

Det skal være klart at når man behandler en vert, som er infisert med en fungus som er ømfintlig overfor antibiotika, vil den foretrukne administreringsvei og den benyttede doser-ing være et spørsmål for den behandlende lege og vil variere i henhold til angrepet organisme, dennes følsomhet overfor det angjeldende antibiotikum, alvor og sete for infeksjonen, samt pasientkarakteristika som alder, kroppsvekt, generell fysisk tilstand, paralleltløpende medikering o.l.

De følgende eksempler er illustrerende uten å være be-grensende for oppfinnelsens ramme.

Eksempel 1.

Fermenteringsproduksjon av BU-3608 FA-1.

(a) Agar Slant. Actinomadura hibisca P157-2 (ATCC 53557) ble dyrket på en agarslant med pH 7,0 og med sammensetningen: 0,5% oppløselig stivelse, 0,5% glukose, 0,1% fiske-kjøttekstrakt, 0,1% gjærekstrakt, 0,2% NZ-case (Scheffield Chemical Co., USA), 0,2% NaCl, 0,1% CaC03, 1,6% agar.

Kulturen ble inkubert ved 28°C i 10 dager.

(b) Podingskultur. En del av den mikrobielle vekst fra slantkulturen ble overført til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml vegetativt medium med pH 7,0 bestående av: 3% glukose, 3% soyabønnemel, 0,5% Pharmamedia, 0,1% gjærekstrakt, 0,3% CaC03.

Kulturen ble inkubert ved 32°C i 6 dager på en rotasjonsryster innstilt på 200 omdr./min. (c) Produksjonskultur. 5 ml av den mikrobielle vekst ble overført fra podingskulturen til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml sterilt produksjonsmedium bestående av: 3% glukose, 3% soyabønnemel, 0,5% Pharmamedia, 0,1% gjærekstrakt, 0,3% CaC03, 0,25% D-serin.

Kulturen ble inkubert ved 28°C i 6 dager på en rotasjonsryster satt til 200 omdr./min. Antibiotikumsproduksjonen nådde 443 /xg/ml, og 72,9% av denne var BU-3608 FA-l, 26,0% var BU-3608 og 1,1% BU-3608C. Antibiotikumsproduksjonen ble bestemt ved å måle den optiske densitet av væske fra fermenteringsbuljongen ved 500 og 600 nm. Genuin optisk densitet ble oppnådd ved å subtrahere verdien ved 600 nm fra verdien ved 500 nm. Antibiotikumskonsentrasjonen uttrykkes som ekvivalent mengde BU-3608 fri base. De forskjellige antibiotika ble identifisert ved bruk av HPLC prosedyren som beskrevet i eksempel 5.

Eksempel 2. Fermenteringsproduksjon av BU-3608 FA-1 og FA-2

ved bruk av stamme A-2493

Agarslantkultur og podingskultur av en arginin auksotrop mutant av Actinomadura hibisca P157-2 kalt stamme A-2493 (ATCC 53815), ble dyrket ved bruk av media med samme sammensetning som beskrevet i Eksempel 1 og under de i Eksempel 1 gitte betingelser.

Produksjon A. 5 ml av den mikrobielle vekst ble overført fra podingskulturen til hver 500 ml Erlenmeyer-kolber (100 kolber) inneholdende 100 ml av det samme produksjonsmedium som beskrevet i eksempel lc. Kulturen ble inkubert ved 28°C i 6 dager på en rotasjonsryster innstilt på 200 omdr./min. Antibiotikumsproduksjone nådde 200 ng|ml og besto av 29,8% BU-3608 FA-1, 28,9% BU-3608 FA-2, 19,5% BU-3608C og 21,8% BU-3608.

Produksjon B. Produksjon av antibiotika ved hjelp av stammen av A2493 ble også gjennomført i et medium (pH 7,0) bestående av: 3% glukose, 3% protein S (soyabønnemel, Ajinomoto), 0,3% CaC03, 0,5% DL-serin

Antibiotikumproduksjonen nådde 890 ug/ml etter at kulturen var inkubert i 11 dager ved 28°C. Forholdet mellom komponentene var BU-3608 FA-2 17,7%, FA-1 17,0%, BU-3608 33,5% og BU-3608 C 31,8%.

Eksempel 3. Fermenteringsproduksjon av BU-3 608 FA-1 og FA-2

ved bruk av stamme B-0 012

Produksjon A. Betingelser og kulturmedia som beskrevet i Eksempel 1 del a, b og c ble fulgt ved bruk av variantstammen kalt B-0012 (ATCC 53816) istedetfor opphavsstammen P157-2. Anti-biotikumproduks jonen nådde 1150 |ig/ml etter 6 dager og forholdet mellom komponentene var BU-3 608 FA-1 33,7%, FA-2 21,2%, BU-3 608 24,0% og BU-3608 C 21,1%.

Produksjon B. En andel av den mikrobielle vekst fra slantkulturen av stamme B-0012 ble også overført til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml av et pH 7,0 medium med følgende sammensetning: 1% oppløselig stivelse, 1% glukose, 0,5% gjærekstrakt, 0,5% pepton, 0,3% NaCl, 0,2% CaC03

Podingskulturen ble dyrket ved 32°C i 6 dager og 5 ml av den mikrobielle vekst ble overført til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml av et produksjonsmedium med pH 7,0 bestående av:

3% glukose, 3% protein S ( soyabønnemel, Ajinomoto),

0,3% CaC03, 0,25% D-serin

Kulturen ble inkubert ved 28°C i 11 dager. Den antibiotiske produksjon nådde 1,970 ug/ml og forholdet mellom komponentene var BU-3608 FA-2 20,0%, FA-1 10,0%, BU-3608 C 39,0% og BU-3608 31,0%.

Eksempel 4. Fermenteringsproduksjon av BU-3 608 FA-1 og FA-2

ved bruk av stamme A-2 660

Agarslant og podekulturer av Actinomadura hibisca stamme A-2660 (ATCC 53 762) ble produsert ved bruk av de samme betingelser og medier som er angitt under Eksempel 1, delene a og b. 5 ml av podingskulturen ble overført til en 500 ml erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml av et produksjonsmedium bestående av: 3% glukose, 3% soyabønnemel, 0,5% Pharmamedia, 0,1% gjærekstrakt, 0,3% CaC03, 0,5% DL-serin

Kulturen ble inkubert ved 28°C i 7 dager. Den antibiotiske produksjon nådde 620 ug/ml og forholdet mellom komponentene var BU-3608 FA-1 17,0%, FA-2 15,6%, BU-3608 23,9%, BU-3608 C 24,7%, D 8,3% og E 10,5%.

Eksempel 5 Isolasjon og rensing av BU-3608 FA-1 og

FA-2 fra fermenteringsbuljong.

10 liter fermenteringsbuljong oppnådd ved en prosedyre som er beskrevet i Eksempel 2, produksjon a, ble separert i myselkake og supernatant ved sentrifugering. Supernatanten ble surgjort til pH 2,0 ved bruk av 6N HC1 og det amorfe presipitat som ble avsatt ble fjernet ved filtrering. Det klare filtrat ble justert til pH 5,0 ved bruk av 6N NaOH og holdt ved 5°C i 2 timer. Det mørkerøde presipitat som ble avsatt ble samlet ved filtrering. Presipitatet ble oppløst i 4,1 liter vann justert til pH 9,0 med 6N NaOH og oppløsningen ble filtrert for å fjerne uoppløselige urenheter. Filtratet ble justert til pH 2,0 og påført på en kolonne av Diaion HP-20 (2,0 1). Kolonnen ble vasket med vann og eluert med 60% vandig aceton, ph 3,0. Konsentrasjon av det røde eluat gav et amorft faststoff av Bu-3608 kompleks hydroklorin i en mengde av 3,1 g. 3,0 g av det komplekse faststoff ble oppløst i 120 ml metanol og filtrert. Til det omrørte filtratet ble det dråpevis tilsatt 720ml etylacetat og den resulterende oppløsning ble holdt ved 5°C i 15 timer. Det avsatte presipitat ble samlet ved filtrering og tørket og man oppnådde 1,28 g.

Disse 1,28 g faststoff ble oppløst i 100 ml vann og under-kastet reversfasekromatografi på en kolonne av YMC GEL ODS A 60 (10 1, Yamamura Chemical Lab.), som var ekvilibrert med en blanding av CH3CN-0,15% KH2P04, pH 3,5 (21:79). Elueringen ble gjennomført med den samme oppløsningsmiddelblanding, og eluatet ble samlet i 1-liters-fraksjoner. Fraksjonene ble analysert ved HPLC (kolonne: YMC A-301-3, 4,6 mm I.D. x 100 mm, 3 ^m, ODS Yamamura Chemical Lab., mobilfase: CH3CN og 0,15% KH2P04, pH 3,5 (25:75), strømningshastighet: 0,8 ml/min., detektering: UV absorbsjon ved 254 nm, retensjonstid: BU-3608 FA-2, 7,65 min; BU-3608 FA-1, 8,61 min.; BU-3608A, 19,11 min.). Fraksjonene inneholdende homogent BU-3608 FA-2 eller BU-3608 FA-1, ble slått sammen og konsentrert under vakuum for å fjerne CH3CN. Hvert konsentrat ble avsaltet ved Diaion HP-20 kromatografi for derved å oppnå et så å si homogent BU-3608 FA-2 hydroklorid (75 mg) og BU-3608 FA-1 hydroklorid (50 mg) .

For å omdanne hydrokloridsaltet til den frie baseform og for å fjerne kontaminerte uorganiske salter ble en vandig oppløsning av hvert salt justert til pH 5,5 med 0,1 N NaOH for å avsette den rene zwitterioniske form av BU-3608 FA-2 (48 mg) og BU-3608 FA-1 (11 mg).

Eksempel 6. Fremstilling av N,N-dimetyl BU-3608 FA-2.

En blanding av BU-3608 FA-1 og BU-3608 FA-2 (45:55, 510 mg) ble oppløst i 50 ml vann og oppløsningen ble justert til pH 7,9 ved tilsetning av IN natriumhydroksyd og så fortynnet med 50 ml acetonitril. Til denne oppløsning ble det sekvensielt tilsatt vandig formaldehyd (>35%, 1,6 ml) og 240 mg natriumcyanoborohydrid ved romtemperatur. Oppløsningen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur, og reaksjonens forløp overvåket ved HPLC. Det organiske opp-løsningsmiddel ble fjernet under vakuum og den vandige rest ble justert til pH 10,9. 40 ml av oppløsningen ble tilsatt dråpevis til 240 ml aceton under omrøring og holdt ved 5°C i 2 timer. Det resulterende presipitat ble samlet ved filtrering ved 3000 o/min. og gjenoppløst i 40 ml vann. Etter fjerning av spor av acetoner under vakuum, ble løsningen justert til pH 5,0 og hensatt ved 5°C i 24 timer. Det avsatte presipitat ble samlet ved sentrifugering, vasket sekvensielt med vann og aceton og vakuumtørket ved 60°C, hvorved man oppnådde 80 mg switterionisk N,N-dimetyl FA-2. Smeltepunkt 214 - 218°C(dekomponering.);

U<VX>maks.°,0lN Na0Hnm(£): 232,8 (32.900),

320,0(15.500), 498,4(15.200).

Eksempel 7. Fremstilling av Desxylosyl BU-3 608 FA-1

En oppløsning av BU-3608 FA-1 (54 mg) i dioksan (5,4 ml) og IN HC1 (5,4 ml) ble kokt under tilbakeløp på et dampbad i 8 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 30 ml vann og chargert til en kort kolonne av Diaion HP-20 (Mitsubishikasei, 1,8 x 25 cm). Kolonnen ble vasket med vann og deretter eluert med 80% sur aceton (pH 3, surgjort med IN HC1). Det rødoransje eluat ble samlet og fordampet for derved å gi et dyprødt pulver. Pulveret ble oppløst i 3 5% acetonitril/fosfatbuffer av pH 3,5 og kromatografert på en ODS-kolonne (YMC-ODS, 2,1 x 25 cm, eluert med det samme opp-løsningsmiddel). Fraksjonene inneholdende den ønskede forbindelse ble kombinert og ført gjennom en HP-20 kolonne. Kolonnen ble vasket med vann og eluert med 80% aceton med pH 3. Fordamping av eluatet gav et mørkerødt pulver som ble oppløst i 8 ml vann, hvor-etter oppløsningen ble justert til pH 5,3 med 0,1 N NaOH. Det resulterende presipitat ble samlet ved sentrifugering, vasket med aceton og tørket for å gi et mørkerødt pulver (23,3 mg, 51%). Smp.

<>>180°C (dekomponering). Renhet ved HPLC: >95%.

IR: vmax (KBr) cm<-1>: 3400, 1605, 1290, 1255, 1060.

UV: xmax (1/lOONNaOH) nm U): 212(35.400), 319(15.300)

498(14.500).

<1>H NMR: (400 MHz, DMSO-dg): 1,26 (3H, d, J=6Hz, 6<1->CH3),

2,32 (3H, s, Ph-CH3, 2,65 (3H, s, NCH3), 3,75 (2H,

m, OCH2), 3,91 (3H, s, OCH3), 4,68 (1H, d, J=8Hz,

l'-H), 6,72 (1H, d, J=2Hz, 10-H), 6,87 (1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=2Hz, 12-H), 7,71 (1H, s, 7-H).

Eksempel 8. Fremstilling av Desxylosyl BU-3608 FA-2

En oppløsning av BU-3608 FA-2 (54 mg) in dioksan (5,4 ml) og IN HC1 (5,4 ml) ble kokt under tilbakeløp på et dampbad i 8 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 30 ml vann, absorbert på en kort kolonne av Diaion HP-20 (Mitsubishikasei, 1,8 x 25 cm), vasket med vann og eluert med 80% aceton av pH 3. Det sinnoberfarvede eluat ble slått sammen og konsentrert, og resten ble oppløst i 8 ml vann. Oppløsningen ble justert til pH 5,3 med 0,1 N NaOH og det resulterende presipitat ble samlet ved sentrifugering, vasket med aceton og tørket under vakuum, hvorved man oppnådde et mørkerødt pulver (37,7 mg 85%). Smeltepunkt >180°C dekomponering. Renhet ved HPLC:>9 5%.

IR: vmax (KBr) cm"<1>: 3400, 1605, 1290, 1265, 1035

UV: xmax (1/100 N NaOH)nm (e): 214(33.000), 234(32.300)

319(14.900), 498(14.100)

<1>H NMR (DMSO-dg: 1,15 (3H, d, J=7Hz, 6'-CH3), 2,32 (3H, s,

PhCH3), 3,75 (2H, m, 0CH2), 3,91 (3H, s,

OCH3), 4,67 (1H, d, J=8Hz, l'-H), 6,72

1H, d, J=3Hz, 10-H), 6,93 (1H, s, 4-H),

7,12 (1H, d, J=3Hz, 12-H), 7,71 (1H, s,

7-H).

Eksempel 9. Fremstilling av Desxylosyl N,N-dimetyl BU-3608

FA-2

Metode A

En oppløsning av N,N-dimetyl BU-3608 FA-2 (produkt fra Eksempel 6, 50 mg) i 5 ml dioksan og 5 ml IN HCl ble kokt under tilbakeløp på et dampbad i 8 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til omgivelsestemperatur og filtrert, hvorved man oppnådde 7,2 mg av et presipitat. Filtratet ble chargert på en tørr silika-gelkolonne (Merck Kieselgel 60, 4 x 30 cm) og eluert med n-BuOH:AcOH:H20(3:1:1). Eluatet ble samlet i 10 ml fraksjoner. Fraksjonene 2-14 og det tidligere oppnådde presipitat ble opparbeidet som beskrevet i Eksempel 10. Fraksjonene 21-32 ble kombinert og chargert til en HP-20 kolonne (1,8 x 25 cm). Kolonnen ble vasket med vann og eluert med 80% aceton med pH 3. Konsentrasjon av det sinoberfarvede eluat gav et faststoff som suksessivt ble renset ved ODS kolonnekromatografi (YMC-ODS, 2 x 37 cm, eluert med 20% CH3CN/pH 3,5 fosfatbuffer) og Diaion HP-20 kromatografi (1,8 x 25 cm, eluert med 80% aceton ved pH 3), hvorved man oppnådde 7,8 mg tilsvarende 17% av tittelforbindelsen som et mørkerødt pulver.

Smeltepunkt >180°C (dekomponering) Renhet ved HPLC:>95%

IR: vmax (KBr) cm"<1>: 3400, 1730, 1610, 1380, 1260, 1070

UV: Xmax (1/10ON NaOH)nm (e): 211(38.100), 318(14.200),

496(12.500).

<L>H NMR (DMSO-d6: 1,23 (3H, d, J=7Hz, 6'-CH3), 2,29 (3H, s,

PhCH3, 2,75 (6H, s, NCH3), 3,74 (2H, m,

OCH2, 3,91 (3H, s, OCH3), 4,60 (1H, d,

J=8Hz, 1<*->H), 6,73 (1H, d, J=3Hz, 10-H),

6,89(1H, s, 4-H), 7,12 (1H, d, J=3Hz,

12-H), 7,77 (1H, s, 7-H).

Metode B

En oppløsning av desxylosyl BU-3608 FA-2 (produkt fra Eksempel 8, 71 mg) i 7 ml vann og 7 ml acetonitril ble justert til pH 7 ved bruk av 0,1N NaOH. Til denne oppløsning ble det tilsatt 0,3 ml 35% vandig formaldehyd og 45 mg natriumcyanoborohydrid ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og den organiske oppløsning ble fjernet under vakuum. Den vandige rest ble justert til pH 10 med NaOH og deretter tilsatt dråpevis til 70 ml aceton. Presipitatet ble filtrert av og oppløst i vann ved pH 2,5. Oppløsningen ble chargert på en kolonne av Diaion HP-20 (1,8 x 25 cm), vasket med vann og fremkalt med sur aceton (ph 3), surgjort med IN HC1). De dyprøde eluater ble slått sammen, konsentrert til ca. 5 ml, justert til pH 5,3 med fortynnet NaOH og deretter tilsatt dråpevis til 70 ml aceton. Det resulterende presipitat ble samlet ved filtrering og represipitert fra vandig aceton, hvorved man oppnådde 66 mg tilsvarende 90% av tittelforbindelsen som et mørkerødt pulver som i alle henseende var identisk med det som ble oppnådd under metode A.

Renhet ved HPLC: >95%.

Eksempel 10. BU-3608 FA Aglykon

Fraksjonene 2-14 av eluatet fra silikagel-kolonnen i Eksempel 9 (Metode A), ble kombinert og konsentrert til tørr tilstand for å gi et pulver. Pulveret og presipitatet fra Eksempel 9, Metode A, forble oppløst i 0,01N NaOH, chargert på en kolonne av Diaion HP-20 (1,8 x 25 cm), vasket med vann og eluert med 80% aceton av pH 3. Det sinnoberrøde eluat ble slått sammen og aceton fordampet under vakuum, hvorved man oppnådde en suspensjon. Denne ble surgjort med IN HC1 til pH 3 og ekstrahert med butanol. Konsentrasjonen av butanolekstrakten ga 11,5 mg tilsvarende 33% aglykon som et mørke-rødt amorft pulver med smeltepunkt >200°C (dekomponering). Renhet ved HPLC:>95%.

IR: v max (KBr) cm"<1>: 3240, 1720, 1605, 1340, 1305, 1165

UV: x max (1/100N NaOH) nm (e): 212(34.500), 319(15.200),

498(14.000).

<1>H NMR (DMSO-dg): 2,34 (3H, s, PhCH3), 3,73 (2H, m, OCH2),

3,91 (3H, s, OCH3), 4,24 (2H, AB-q,

J=llHz, 5-H & 6-H), 4,46 (1H, m,

N-CH-COOH), 6,92 (1H, d, J=2Hz, 10-H),

7,06 (1H, s, 4-H), 7,28 (1H, d, J=2Hz,

12-H), 8,08 (1H, s, 7-H).

Eksempel 11

Den generelle prosedyre som beskrevet i Eksempel 6 følges ved bruk av de reaktanter som er angitt nedenfor for å tilveiebringe de tilsvarende alkylerte analoger av BU-3608 FA-1 og FA-2.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en BU-3608 serinanalog med formelen (II) hvori seringruppen er D-serin, R<1> og R<2> uavhengig er H eller C-^g-alkyl, og R<3> er /3-D-xylosyl, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert veda) at en stamme av Actinomadura hibisca med identifi-serende egenskaper som de stammer som i ATCC er deponert under aksessjonsnumrene 53815, 53816, 53557 og 53762, dyrkes i et medium inneholdende assimilerbare kilder av karbon og nitrogen og D- eller DL-serin, under aerobe betingelser, b) at forbindelsen med formelen (II) isoleres fra mediet, og c) at en forbindelse med formelen (II), hvori R<1> og/ eller R<2> er hydrogen, eventuelt omdannes til en forbindelse med formelen (II) , hvori R<1> og/eller R<2> er C-^g-alkyl, ved omsetning i et polart løsningsmiddel og ved en temperatur i området fra romtemperatur til 100°C med et aldehyd eller et keton med 1-6 karbonatomer, til fremstilling av et imin-produkt, og iminproduktet reduseres under anvendelse av et metallhydrid som reduksjonsmiddel.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at til fremstilling av iminproduktet anvendes formaldehyd, og at det som reduksjonsmiddel anvendes natriumcyanoborhydrid.