JPS61192298A - エリスロマイシンｄの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエリスロマイシンＤおよびそのエステル類から
なる抗生物質複合体の製法に関する。

ノカルディアＣＮｏｃａｒｄｉａ）種（ＡＴＣＣ３９０
４３）（微工研菌寄第　ｇ４’ｔ５’号）の培養物は発
酵によりエリスロマイシンＤｆ、４“−〇−アセチルエ
リスロマイシ７１）、　３″，４″−ジ−Ｏ−アセチル
エリスロマイシンＤおよび３“−Ｏ−アセチル−４“−
〇−プロピオニルエリスロマイシンＤからなるエステル
ととも（こ直接産生ずる。これらのエステルのうちもつ
とも価値があるのは、３“、４“−ジアセテートであっ
て、これは発酵の主成分である。もしエリスロマイシン
Ｄ自体が所望の生成物なら、エリスロマイシンＤの単離
前に該エステルの加水分解をブロス中で行うこともでき
る。

エリスロマイシンＤは下記一般式全有するマクロライド
抗生物質群の１つである： Ｒ（Ｌ　　　　　Ｒｂ エリスロマイシンＡ　　　　　　ＯＨＣＨ。

エリスロマイシンＢ　　　　　　ＨＣＨ。

エリスロマイシンＣ０１１Ｈ エリスロマイシンＤ　　　　　　ＨＨ Ｍａｊａｒ　ａｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ、＋　　９９、ｐｐ　　１６２０−１６２２
（１９７７）は工業規模のエリスロマイシ高精製におけ
る側流からの微量成分としてエリスロマイシンＤを単離
し同定シた。本発明はエリスロマイシンＤｆ直接発酵に
より製造する方法全提供するものである。

エリスロマイシン系のすで（こ報告済のエステル（り は発酵生産物としてではなく、化学的方法によってつく
られてきた。これらのエステルはエリスロマイシンＡと
エリスロマイシンＢの両方の２′−アセテート、τ−プ
ロピオネート、４“−アセテートおよび４“−プロピオ
ネートエステルである。

Ｊｏｎｓａ　ａｔ、　ａｌ、ｖ　Ｊ、　Ｍａｄ、　Ｃｈ
ａｔＤ、　１５、ｐｐ６３１−６３４　（１９７２）　
；Ｍａｒｔｅｎ　ｇｔ　ａｌ、ｒＪ。

Ｍｇｄ−’Ｃｈｕｍ−＋　１５、ｐｐ　６３５−６３７
（１９７２）参照。

構造的に関連のあるエステル類は抗生物質のメガロミシ
ン複合体の１部としてずで番こ報告されている。メガロ
ミシンＡはＣ−６位に付加した第三の糖部分を有してお
り、構造上エリスロマイシンＣｌこ一致する。この系列
の他のものは下記メガロミシンＡのエステルである： （リ メガロミシン、４　　　　　　Ｈ１１ メガロミシンＢ　　　　　Ｃ０ＣＨ５ＨメガロミシンＣ
，Ｃ０ＣＨ，ＣＯＣＨ３メガロミシン（１”２　　　　
　ＣＱＣ２Ｈｓ　　　　ＣＣ）Ｃ１１ｓＢａｒｔｎｓｒ
　ａｔ　ａｔ、　ｌＪ、　Ｃｈｕｍ、　ＳｏＣ，ｒ　Ｐ
ｅｒｋｉ？Ｌ１、　ｐｐ、１６００−１６２４（１９７
９）参照。

ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種Ａｒｃｃ３９０４
３の培養物は水性媒体中で好気条件下Ｏこ発酵させると
エリスロマイシンＤおよびその新規モノ−およびジエス
テル類、すなわちγ、４″−ジアセテート、３“−アセ
テート−４“−プロピオネートおよび４“−アセテート
からなるマクロライド抗生物質の複合体を産生する。上
記系統的命名は炭水化物命名法の原則による。

下記のとおり、本発明の化合物の抗菌活性は当分野で周
卸の方法ｌこよって容易に測定される。この活性によっ
て感受性細菌に帰因する動物またはヒト感染症の全身的
または局部的治療、生長促進剤としての動物飼料、感受
性細菌番こよって生物学的減成を受ける物質の防腐剤あ
るいは工業用殺菌剤として利用できる。

本発明のエステルのうち、「、４“−ジアセテートは経
口投与番こより高度に吸収されるので好ましい。さらに
、このジアセテートは発酵の主成分である。

エリスロマイシンＤおよびそのエステル類の抗生物質複
合体を産生できる微生物はノカルディア（Ｎｏａａデｄ
ｉａ）釉であり、メリーランド州ロックビ（′７） ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ＡＴＣＣ３９０４３（微工研菌寄第ｇｂｒ’１号）とし
て寄託されている。特許がなされ７’Ｃ場合、特許権の
存続期間全通してアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションでのこの微生物の寄託の永続性は保たれ、容
易に一般に分譲される。３７ＣＦＲ１，１４および３５
ＵＳＣ１１２にもとづいて田願が係属している限り寄託
された微生物全入手できる。寄託された培養物の一般へ
の分譲についてのすべての制限は特許された時点で先金
ｌこ取り除かれよう。

この新規な微生物は日本の奈良県五所市で集められた土
壌試料から得られ、ファイザー・インコーホレーテッド
のカルチャー・コレクション　Ｎ４６４−２１とした。

この微生物はダラム陽性で、部分的に抗酸性で、白色気
中菌糸体および容易には切断しない基質菌糸体を有し、
その色は無色、クリーム色、淡黄色ないし黄色がかった
色を呈している。細胞壁を糖、アミノ酸およびミコレー
トについて分析した結果、この微生物がノカルデイア（
Ｎｏｃａｒｄｉａ）属ζこ属することがわかった。

接徨物は凍結乾燥標本をプレートに塗り、ＡＴＣＣす１
７２ブロス中で４時間２８℃で娠とう培養することによ
って調製した。次いでこれを２０分間埋６分離し、滅菌
蒸留水で３回洗い、アクチノマイセタレスＣＡａｔｉｎ
ｏｔｎｙｅａｔａｌａａ　）目の微生物の確認醗こ通常
使用されている培地上に接種した。

インキュベーションは２８℃で行なわれ、結果は経時的
に測定されるが、１４日口の測定値をとるのがもつとも
ふつうである。色は通常の用語で記載されるが、正確な
色はザ・カラーハーモニー・マニュアル（Ｔｈｅ　Ｃｏ
１ｏｒ　Ｈａｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｓａｌ　）第４版から
の色片との比較で決定される。全細胞および糖の分析方
法はＢｕｃｋｅｔ等のＡｐｐｌ　、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉ
ｏｌ、１２　：　４２１−４２３　；およびＬｇｃｈｍ
ｒａ−１ｉｇｒ等のＪ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１Ｄ、　Ｍａ
ｄ、　　７１　：　９３４−９４４．１９６８に記載さ
れている。オートクレーブで滅菌した湿った菌糸体約３
０．９全使用してＬａｃｈａｒａｌｉａｒ等のＪ、　Ｂ
ａｃｔａｒｉｏｌｌｌ　０５　：　３１３−３１８，１
９７１の方法によりミコレートを分析した。

この微生物の％性は次の如くである： 酵母エキスー麦芽エキス寒天（ＩＳＰ＋２培地、ディフ
コ） 生育良好、暗黄色（２：ｃｌこ近似）、中位盛り上がり
、しわあり、白色気中菌糸体、表義同−１可溶性色素な
し。

生育乏しいか中位、白色、薄くなめらか、気中菌糸体ま
はら、白色、裏面無色、可溶性色素なし。

コ） 生育なし。

ディフコ） １゜ 生育良好、黄色がかった色（１−ｇα、１−Ｈｚａ、２
　ｔａ）、中位の盛り上がり、しわ、白色の気菌糸ｌ　
。

体、裏面黄色がかった色（１−ＨｓｃＬ）、可溶性色素
なし。

クルコース−アスパラギン寒天（ワックスマン著”　Ｔ
ｈｅ　Ａｃｔｔｎｏｍｙｃｍｔｅａ”Ｖ、　　２、ｐ３
２８．１９６１の培地す２） 生育良好、白色ないしクリーム色（１−ｃα）、わずか
ζこ盛り上がり、裏面淡黄色（１１＃α）、可溶性色素
なし。

ツアペック−蔗糖寒天（ワックスマンの上記文献ｐ３２
８の培地≠１） 生育良好ないし中位、白色、薄く、なめらか、気中菌糸
体まばらで顕微鏡下にのみ観察され、裏面無色、可溶性
色素なし。

記文献ｐ３３１の培地≠２９） 生育中位、クリーム色（１７Ｃａ）、薄い、なめらかな
いし少し粗い、気中菌糸体なし、裏面クリーム色、可溶
性色素なし。

エマーソンの寒天（ワックスマンの上記文献ｐ３３１の
培地す２８） 生育中位、クリーム色（２’ｅ　ａ　）、薄い、なめら
かないしわずかに粗い、気中菌糸体なし、裏面クリーム
色ないし淡黄色（２ｃα、２６α）、可溶性色素なし。

栄養寒天（ワックスマンの上記文献ｐ３３０の培地≠１
４） 生育中位、クリーム色（ｌＨｃα）、薄いないし中位の
盛り上がり、なめらか、気中菌糸体なし、裏面クリーム
色、可溶性色素なし。

ゴートンおよびスミスのチロシン寒天（Ｇｏｒｄｏｎａ
ｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ＋　Ｊ、　Ｅａｃｔ、＋　６９　：　
１４７　１５０．生育中位、クリーム色＜１−Ｈｅａ）
、薄い、なめらか、気中菌糸体まばら、顕微鏡下でのみ
観察される、裏面無色ないしクリーム色、可溶性色素な
し。

Ｒｅｖ、２１、■−２９，１９５７） 生育中位、クリーム色ないし淡黄色（１６α、ＩＣαと
１ｅａとの中間）、薄い、なめらか、いくつかの白い斑
点を伴う、気中菌糸体白色ないしクリーム色、裏面淡黄
色（１６α）、可溶性色素なし。

カゼイン外大（Ｇｏｒｄｔｒｎ　ａｎｄ　Ｓｍｉ　ｔｈ
の上記文献）生育中位、白色、薄い、なめらか、白色の
気中菌糸体、裏面無色、可溶性色素なし。

ゼラチン寒天（Ｇｏｒｄｏ％ａｆＬｄ　Ｍｉｈｍ＋　Ｊ
、　Ｅａｃｔ。

７３．１５−２７．１９５７） 生育中位、白色、薄い、なめらか、縁ｌこ近い部分がわ
ずかにしわになっていることもある、気中菌糸体白色、
裏面無色ないしクリーム色（１２Ｃα）、可溶性色素な
し。

でんぷん寒天（上記文献） 生育中位、白色、薄い、なめらか、あるいは近縁部がわ
すかζこしわになっており、気中菌糸体白色、裏面クリ
ーム色（”　２　”　）　ｓ可溶性色素なし。

はれいしよ　にんじん寒天（Ｌｇｅｈａｒａｌｉｇｒ＋
Ｌａｂ。

Ｃ１１Ｄ、Ｍａｄ、　７１．９３４−９４４．１９６８
．３０ｇのはれいしよ、２．５ｐのにんしんおよび２０
ｇの寒天のみ使用） 生育中位、白色、薄い、なめらか、気中菌糸体白色、裏
面無色、可溶性色素なし。

水道水寒天（２％） 生育乏しく、白色、薄い、なめらか、深部、気中菌糸体
まばら、顕微鏡下でのみ観察され、裏面無色、可溶性色
素なし。

形態学的特性 グルコース−アスパラギン寒天上で５日目迄毎日１度無
糸分裂番こ関して研究した。気菌糸体の前糸分裂は接種
後５日して生じた。クルコース−アスパラギン寒天上で
１６日間接種培養した結果、次のような形態学的観察が
なされた：気中菌糸体は白色、屈曲性、波状またはジグ
ザグ、直径０．５−０．９μ情であり、ふくらみと断片
を含み、ふくらみは末端部、側部あるいは他層間をこお
り、単独あるいは接種しており、球状、卵型ないし楕円
形であって、直径帆８−１．６μ餌、あるいは１．２−
３　Ｘ　Ｏ，７−１，８μ常であり：断片は１．８−６
（あるいはこれより長＜）Ｘｏ、７−０．９μ毒、走査
電子顕微鏡で検鏡できる程なめらかであり；ふくらみと
断片は両名゛ともしはしは屈曲性の油滴を含んでいる。

生化学的特性 グラム陽性；部分的に抗酸性；メラニン生産０；硫化水
素生産（−）；硝酸塩生産（＋）：ゼラチン液化（−）
：エスクリン、馬尿酸塩およびでんぷんの加水分解（＋
）　＜Ｇｏｒｄｏ％ａｔ　ａｌｌｌｓｔ、　Ｊ、　５ｙ
ｓｔ。

Ｂａａｔ、＋　２４．５４−６３．１９７４）ｓアデニ
ン、ヒボキサンチンおよびキサンチンの分解（上記文献
）（＋）；マレイン酸カルシウム、カゼイン、セルロー
ス、チロシンおよび尿素の分解（上記文献）　（−）　
；　ＩＪゾチームに対する耐性（上記文献）（±）：　
Ｊａｎｓｅｎ　（Ｐｒｏｃ、ＩＡｎｎ＋　ＳｏＣ，Ｎ、
Ｓ、Ｗ。

５５：２３１−２４８．１９３０）あるいはＬｍＩＩｉ
ｎ−およびＳｃｈｏｍｎＬｍｉｎ　（Ａ　Ｃｏｍｐｉｌ
ａｔｉｏｎｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉａ、培地＋
２５１１．１９３０）のブロス中での生育なし：スキム
ミルク（ディフコ社製）上での凝集およびペプトン化な
し。

有機酸の資化（Ｇｏｒｄｏｓ　ａｔ　ａｌ、＋上記文献
）アセテート、マレート、プロピオネート、ビルヘート
ヲ資化し、ベンゾエート、シトレート、テキストリン、
ラクテート、ムケート、オキザレート、フェノール、サ
クシネートおよびタル）Ｌ／−トは資化せず。

フラクトース、ガラクトース、グルコース、クリセリン
、イノシトール、マンニトール、マンノース、ラフィノ
ース、リボース、サリシン、でんぷんおよび蔗糖から酸
を生産し；アドニトール、アラビノース、セロビオース
、ズルシトール、エリスリトール、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、メリビオース、ラムノース、ソル
ビトール、ソルボース、トレハロース、キシロースおよ
びα−メチル−ｄ−グリコシドからＩＸＩ生産せず。

アラビノース、フラクトース、ガラクトース、グルコー
ス、グリセリン、イノシトール、マルトース、マンニト
ール、マンノース、フラクトース、ラフィノース、リボ
ース、サリシン、ソルビトール、でんぷん、蔗糖、トレ
ハロース、およびキシロースハ資化され；セロビオース
、ソルボースオよびα−メチル−ｄ−グリコシドは資化
されるかどうか疑わしく；アドニトール、ズルシトール
、エリスリトール、ラクトース、メリビオースおよびラ
ムノースは資化されない。

温度との関係（ＡＴＣＣＣｕ１ｔｕｒｅ　ＣＣｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎＣａｔａｌｏ″１４ｔｈｇｄ、、ｐ５１９．
１９８０のＡＴＣＣ培地≠１９６） ２８℃で良好ないしすぐれた生育全示し、２１℃と３７
℃で良好な生育全示し、１０’Ｃと４５℃で生育せず、
５０℃で８時間生存する。

細胞壁はメン−ジアミノピメリン酸、アラビノースおよ
びガラスドースを含んでいる。

細胞壁は放線菌のミコレートを含有する。

形態学的特性、ノカルドミコール酸、およびＩＶ型細胞
壁（メソージアミノピメリン醗、アラビノースおよびガ
ラクトース）は本発明の培養物がノカルジア属に位置す
ることを示す。この培養物は、いくつかの形態学的およ
び生物化学的特性において、ノカルジア・バラフイナエ
（Ｎｏｃａｒｄｉαｐａｒａｆｆｉ％ａｇ　）　（イエ
ンセン（ＪｇｔＬｓａｎ　）　〕ワクスマン（Ｗａｋａ
ｍａｎ　）およびヘンリッチ（Ｈｅｎｒｉｃｉ　）およ
びノカルジア・オチチテイス・力ヴイアラム（Ｎ、　０
ｔｔｔｉｄｉｓ　−Ｃａｖｉａｒｒｂｍ　）スニーダー
ス（ＳｎｉＳｎｌｊｄ　）　４こ関連している。それは
、マルトースから酸を生成できないこと、安息香酸塩お
よびこはく酸塩を利用できないことおよび尿素を加水分
解できないことで、ノカルジア・パラフイナｘ　（Ｎ、
　ｐａｒａｆｆｉｎａｅ　）とは異なっている。５つの
相違点番こより、それはノヵルジア・オチチテイスーカ
ヴイアラム（＃、　Ｏｔｉｔｉｄｉｓ−Ｃａｖｉａｒｗ
ｍ）と識別される：すなわち、マルトースおよびトレハ
ロースからｆｆｆｉ＝生成できす、尿素の加水分解する
ことができず、ミルク上で凝固せず、そして４５℃で生
育しない。

エリスロマイシンＤおよびそのエステル類（３“、４“
−’）　酢酸−ｒ−、＜　ｆル、３″−酢酸エステル−
４“−プロピオン酸エステルおよび４“−酢酸エステル
）より成る、抗生物質複合物音生成するためには、本発
明のノカルジア種を、３ないし１３日間、液内条件下適
当には２４−３６℃で、かくはんと（１日） 通気を行ないながら、砂糖、でんぷん、グリセロールの
ような炭水化物源；大豆ミール、カサミノ酸、酵母エキ
スのような有機窒素物質；穀物可溶物、無粉末、綿実粉
末のような生長物質；鉄、コバルト、銅、亜鉛等のよう
な微量元素を含有する鉱酸塩および緩衝剤としての炭酸
または燐酸−カルシウム、より成る培地上で発酵させる
。

この発酵に必要な接種物はノカルジア培養物を培養され
た斜面またはルーびんから栄養細胞を掻き取ることによ
って製造された。斜面およびルーびん上の初期生長に適
する固体培地は、アメリカ模式菌培養蒐集（ＡＴＣＣ）
培地す１７２であるニゲラム／リットル 蔗糖　　　　　　　　　　　　　　　１０可溶性でんぷ
ん　　　　　　　　　　２０酵母エキス　　　　　　　
　　　　　　　５ＮＺアミンＡ５ 炭酸カルシウム　　　　　　　　　　　　１蒸留水を加
えて１０００−とする；　ＫＯＨでｐＨ７，０とする 加える寒天　　　　　　　　　　　　　２０斜面からの
栄養細胞が、ｗＲ盪フラスコまたは接種物槽のどちらが
に接種するために用いられる：または別法として、接洩
物槽は振盪フラスコから接種される。振盪フラスコ中で
は、生育は、一般に、４ないし６日でその最高に達する
であろうが、一方接種物槽内では、生長は、通常接Ｆｌ
＆３ｆｒいし５日のうちに最も好ましい期間となるであ
ろう。

発酵器は光音に前回の条件下で、接種物フラスコまたは
槽からの栄養液体培地を接種されて、４ないし６日間発
酵させられることができる。通気は、振盪フラスコ内で
は振盪器上でかくはんすることにより、あるいは、槽内
では毎分、液体培地１容積あたり空気％ないし２容積の
速度で、散韮器を通じて無菌の空気を送りこむことによ
り保持される。かくはんの速度は、用いるかくはん機の
型により；振盪フラスコは通常毎分１５０から２００サ
イクルで作動され、発酵器は毎分３００から１７００回
転で作動させられる。無菌性はいつも保持される。温度
は２６℃と３４℃の間に調節される。発酵中の発泡は、
製造中および接種後無菌的に必要とされるとき、精製し
た大豆油のような無菌の消泡剤、またはその他の適当な
消泡剤を用いて抑制することができる。

典型的な発酵培地（ファイザー社（ＰｆｉｔｇｒＩｎｃ
）のコード文字表示による〕は、次の通りである： ＪＤ　　　　ＪＬ　　　ＪＬＺ−Ｍ−１ブドウ糖　　　
　　　　１０１１／ｌ　　１０　　　　２コーンスター
チ　　　　５　　　１０　　　１０とうもろこし浸漬液
　　　５　　　−　　　−大豆粉　　　　　　　　−１
０１５ カゼイン　　　　　　　　５　　　−　　　−ＢＹＦ３
００イースト　　　　−−５ ＮＺアミンＹｔｔ　　　　　　−５１０塩化ナトリウＪ
Ａ−２，５− 炭酸カルシウム　　　　　３２ 塩化コバルト　　　　　０．００２　０．０１　　０．
０１第ニリン酸カリウム　　　　−−１ 硫酸マグネシウム　　　−−０，５ ＪＬＣ−３ＪＬＣ−３’　　ＪＬＣ−６ＪＬＣ−６’ブ
ドウ糖　　　　　２０１７／ｌ　　２０　　　２０　　
２ＯＮＺアミン−Ａ型　　−１０−１０ カサミノ酸　　　１０　　　−　　１０　　　−血液粉
末　　　　１０　　１０　　１０　　１０Ｉ）Ｌ−バリ
ン　　　−−５５ ＤＬ−ロイシン　　　１０　　　１０　　　　−　　　
−ＮａＣ１４４４４ ＣａｃＯＢ　　　　　　　４　　　４　　　４　　　４
ｕｇｃｔ、・６１１２０　　　５　　　５　　　５　　
　５抗生物質は、クロロホルム、酢酸エチルｌｃはメチ
ルイソブチルケトンのような、適当な、水と混相しない
有機溶媒を用いて、アルカリ性ｐＨで全液体培地を抽出
することによって回収することができる。この溶媒は、
分離され、酸性水中に逆抽出される。異なったエリスロ
マイシンＡ１エリスロマイシンＤおよびそのエステル類
は、酸性ｐＨ（２，５から５．０）でかなり安定である
。水性層を分離し、ｐＨ８，０−９，０に調整して、同
一または異なる、水と混和しない有機溶媒で再抽出する
。抗生物質複合物を、溶媒の蒸発および残留物のクロマ
トグラフィーによって回収する。この抗生物質複合物の
各成分を、さらにクロマトグラフにかけることにより分
離する。

上に限定した、本発明の薬学的Ｇこ計容し得る酸付加塩
は、標準的な方法によって容易にＤｉされる。例えは、
当量の酸を、有機または水性有機溶媒中で、遊離アミン
の形のこの化合物と化合させる。この塩を、濃縮および
／または非溶媒の添加ｌこよって単離する。ある場合ｌ
こは、この塩は、遊離アミンを単離することなく、反応
混合物から直接単離される。

エリスロマイシンＤが所望の最終生成物であるならば、
精製されたエリスロマイシンＤの単離の前（こ、この方
法のどこかの段階で、エステル類ヲ加水分解するのが好
適である。このこと番こより、操作工程は最小となり、
エリスロマイシンＤの収率は最大となる。加水分解は、
液体培地を、飽和水酸化バリウムまたは水酸化ナトリウ
ムまたは炭酸ナトリウムまたはカリウムの希水溶液のよ
うな塩基で弱塩基性にするだけで、液体培地上で実施さ
れることができる。別法として、加水分解は、粗製濃縮
物単離された抗生物質複合物、または、単離されたエス
テル類について、水性またはアルコール性溶媒中で上に
限定した塩基を用いて実施される。

本発明のエリスロマイシンＤおよびエステル類は、ダラ
ム陽性菌およびダラム陰性菌の培地スペクトルＩこ対し
試験管内活性を示す。第１表は試験管内ＭＩＣＣ最／Ｊ
％抑制濃度）試験の結果を要約したものである。この標
準試験のために、各細菌を、栄養培地を官有し％連続的
に希釈した濃度の抗生物質を含有する一連の管内に接種
する。ＭＩＣは、２４時間という培地試験期間にわたっ
て微生物の生長を妨げるその抗生物質の最低濃度である
。

本発明のエリスロマイシンＤおよびエステル類は、また
、第■表に要約されたように、敏感な細菌による感染に
対して生体内活性を示す。そのような活性の決定には、
５パーセントの豚の冑粘累中ｌこ懸濁させた試験細菌の
標準化培養物をマウスに腹腔内接種することをこより、
マウス（こ急性の実験的な感染を起こさせる。感染の重
さは、マウスが少なくとも細菌のＩＬＤ、ｏＯ投与量（
Ｌ　Ｄ　＋ｏｏ　：感染させられ処理されていない対照
マウスの１００パーセント全−貫して殺すのｌこ必要と
される最少細菌接種物）、を受けるよ５ｔこ標準化され
る。

（（り　　すべての化合物は、黄色ブドウ球菌（５ｔａ
ｐｈ、　ａｘｒａｗａ　）　１１０　；表皮ブドウ球菌
（５ｔａｐｈ、　ａｐｉｄ−）　０．８７および１２６
；化膿連鎖球菌（５ｔｒａｐ−ｐｖｏｃｔ−）　０−５
４　；大腸菌（Ａ’、　ｃｏｌｔ）１２５．１２９およ
び２６６：緑膿菌（Ｐｓａｓｄｏ−ｍｏｎａｓ　ａａｒ
ｓｂｇ−）　　１０４および６６３；肺炎桿菌ＣＫ、ｐ
％、）００９および０３１；タレブシエラ・オキシ（Ｋ
−ｏｚｙ−）　　０２４　；霊菌（５ａｒｒ、　ｍａｒ
ｃ、）０１７；エンテロコツカス・エアロシナ；ｘ、　
（ｈｔ　−ａａｒｗｇ、）０４０　ｐエンテロコツカス
・クロアカニ（Ｅｎｔ、　ａｌｏａｃ、　）　００９　
；プロビデンシア・スツア（Ｐｒｏｖ、　ａｔｕａ、）
　０１３　；ブログイデンシア・レット（Ｐｒｏｖ、　
ｒａｔ、）　　Ｏ２５；およびモルガン変形菌（Ｍｏｒ
ｇ、　ｔｎｏｒｇ、）　００１　ｐに関し、５０より大
きなＭＩＣを結果的に示した。

（６）　　エリスロマイシンＤ （ｃ）３“、４“−ジ酢酸エステル （ｄ）　　３“−酢酸エステル−４“−プロピオン酸エ
ステル （＃）４“−酢酸エステル （２日） （／１５０より大きなＭＩＣ 第■表 エリスロマイシンＤおよびエステル類の生体内１Ｍ１１
エリスロマイシンＤ　　　　　５７　　　　　　１５４
′−Ｏ−アセチルエ　　　１３９　　　　　　４０リス
ロマイシンＤ イシンＤ エリスロマイシンＡ　　　　　５４　　　　　　２５試
験化合物は、感染後％、４および２４時間で、種々の投
与量水準で各感染マウス群ｌこ経口的蕃こ投与される。

試験の終りに、与えられた投与量での処理動物の中の生
存者の数を数えることにより、この混合物の活性を評価
する。活性は、与えられた投与量で生き残る動物の百分
率として表わされるか、またはＦ７）ｎｏ（感染から５
０％の動物を保護する投与ｉ−）として計算される。

敏感な微生物憂こよりひき起こされた、人′に宮む動物
における全身感染の治療番こけ、本発明の化合物は、通
常は分割用量で、１日に２．５−１００１１＋９／ｋｙ
、好適Ｊコは５−５０　ｒｖ／ｋｇ／日、の水準で投与
される。投与量の変動は、個体および微生物の感受性に
よって行なわれるであろう。これらの化合物は、経口的
または非経口的に投与されるが、好適な投薬経路は経口
にこよるものでろる。診療所で単離された微生物の感受
性は、周知のディスク−平板法によって臨床検査室で常
套的に試験される。

最適列形の製造は、薬剤師の技術分野で周知の方法によ
って行なわれるであろう。経口投薬用には、これらの化
合物は、単独でおるいは、不活性固体希釈剤、水＠液ま
たは種々の非毒性有機溶媒のよう々製薬担体と組み合わ
せて、ゼラチンカプセル、錠剤、粉末、ロゼ／ジ、シロ
ップおよびこれに類するもののような列形に処方される
。そのヨ５　す担体４こは、水、エタノール、ベンジル
アルコール；クリセリン、フロピレンゲリコール、食用
油、乳糖、でんぷん、滑石、ゼラチン、ゴムおよびその
他の周知担体が必る。非経口投薬用（こは、これらの化
合物を、水、塩水、ごま油、およびこれに類するものの
ような栗学的に許容し得る担体中に理解または懸濁させ
る。懸濁性および分散性を改良する試験全添加すること
もできる。

敏感な微生物によってひき起こされた、人間を含む動物
ｌこおける表在性感染の局部的治療のためには、本発明
の化合物は、薬剤師の技術分野で周知の方法により、５
−２００〜／剤形ω、好適番こは１０−１００〜／ＣＣ
の範囲の濃度で、外用水薬・軟膏、クリーム、軟膏、ゲ
ル、またはこれに類するものに処方される。この列形は
、感染部位（こ、任意に、通常は１日に少なくとも１回
、適用される。

本発明の抗菌化合物を生物的に分解する物質の防腐剤と
して用いる時は、それらを、少なくとも、生物的な分解
をひきおこす細菌の生長を阻害するに十分な濃度で生物
的に分解する物質と単に混ぜ会わせる。所望の目的を達
成するのに必要な濃度を決定するためには、常用の連続
希釈法を用いることができる。

本発明の抗菌化合物を、食用家畜における生長促進剤と
して用いるときは、それらは低水準（例えは、飼料１ト
ンあたり化合物ｌＯｙから１００ｇ）で与えられる。こ
の化合物と飼料との混合は、普通、二段階で竹なわれ、
最初に前混合物を調製しく例えは化合物Ｎｏ−１００ｇ
’に普通の大豆またはそれに類するもの４．５４〜９．
０８ｋｌ／　（１０−２０１ｂ）と混合する）、次いで
これを製粉のとき飼料と混合する。

これらの化合物を工業用の消毒剤として用いるとき、そ
れらは一般に希溶液として、消宿されるべき表面に適用
される。

本発明は、次の実施例により詳しく説明される。

しかしながら、本発明は、これらの実施例の特定の細部
に限定されかいことは理解されねばガらない。

実施例１゜ ＪＬ培地を用いて２０のポット全用意したが、各ポット
あたり２．５リツトルの培地を用いた。１ミリリツトル
の泡止剤を加えて、各容器ｔ［５封し、１２０℃　１５
　ｐ、ａ、ｉ、で４５分間殺菌した。各ポットに、１（
２％）または２（４％）本のノカルジアｆｉＩＡＴＣＣ
３９０４３の接種物フラスコを用いて接種し、３０℃で
３ないし６日間発酵させた〔毎分１７００回転（ＲＰＭ
）でかくはんし、毎分１容積あたり１容積で液体培地を
通して空気散布した〕。発酵が光子した時〔ミクロコツ
カス・ルテウス（Ｍｉｅｒｏｃｏｅｃｕｓ　１ａｔｅｓ
Ｌｓ　）ＡＴＣＣ９４３１または枯草菌（Ｉｌ、　ａｓ
ｂｔｉｌｔａ　）ＡＴＣＣ６６３３に対する抗生物質デ
ィスク評価に基づく〕、発酵器を停止させ、５０％の水
酸化ナトリウムを用いてｐｇ　８．ｏないし９．０に調
整しそして発の体積のメチルインブチルケトンで抽出し
た。溶媒／［：遠心分離Ｇこより分離した。泡立てた後
、この抗生物質を、ｐＨ３０の酸性水中に逆抽出］〜で
、分離し、使われた溶媒を捨てた。酸性水を、ｐＨ８，
０ないし９．０に調整した後、酢酸エチル中をこ抽出し
た。

溶媒を泡立たせ、無水硫酸す）ＩＪウムを用いて乾燥さ
せ、濃縮した。濃縮物の重量は２．５グラムであった。

　　　赤 この濃縮物全メタノールに溶解させ、溶離酸としてメタ
ノールを用いて、ヒドロキシプロピル化架橋デキストラ
ンゲル〔ファーマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａ
ｒｒｎａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から
得られるセファデクス　ＬＨ−２０）のカラムを通した
。活性なカットを合わせて濃縮し、重量約１．７グラム
のシロップとした。この濃縮物をシリカゲル上のクロマ
トグラフにかけると、実施例３に詳しく示したよ５ｔこ
精製された抗生物質複合物を単離することができた。

液体培地、抽出物およびカラムカットの生物活性は、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｘｂｔｔｌｉａ　）　ＡＴ
ＣＣ６６３３、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃＣｒｂａａｕｒｇｕｓ）ＡＴＣＣ６５３８、またはミ
クロコツカス・ルテウス（ＭｔｃｒｏｃｏＣｓｓ　１１
Ｌｔａｓｓ　）　ＡＴＣＣ９３４１の敏感な菌株を用い
ることによって追跡された。液体培地、抽出物またはカ
ラムカット中の個々の成分は、次の系、クロロホルム／
メタノール９：１または３　：　ＩＶ／Ｖ′！！：たは
クロロホルム／了七トン／水酸化アンモニウム２５　：
　２５　：１ｖ７ｖ７ｖ、中のアナルテク（Ａｎａｌｔ
ａｃｈ　）シリカゲルＧＦ板を用い、この展開した板を
バニリン試薬（エタノール１００−および８５％リン酸
５〇−中５グラムのバニリン）で噴霧する。ＴＬＣによ
って視覚化された。各板は８０℃に加熱され、抗生物質
は白の背景上で灰色ないし青／紫であった。個々の成分
はまた、展開された板を寒天中の先述のＭ’［でおおい
、テトラゾリウムを加え、この板を一夜３７℃で培養す
ること（こよっても視覚化された。抗生物質は、赤味が
かった背景に対し透明な領域としてあられれた。

０．７リツトルのＪＤまたはＪＬ培地を含有する大きな
振盪フラスコ全用意することによって、太きな発酵器（
２５ないし１０００ガロン）内での規模拡大を行なった
。振盪フラスコ接種物音、２８℃で３ないし６日間発酵
させ、そして２５．１００または１０００ガロンのＪＬ
またはＪＬ２Ｍ−１培地を含有する、５０．２５０また
は１５００ガロンの発酵器に接種するために使用した。

各発酵器は５ないし７日で収穫された。

１０００ガロン発酵は、ｐＨ９，２で、２００ガロンの
メチルインブチルケトン（ＭＩＢＫ）’に用いて、全液
体培地を抽出することによって回収された。このＭＩＢ
Ｋ抽出物を水の層から分離し、ｐＨ３，４の酸性水２５
ガロン中ζこ逆抽出した。この酸性水−ｆｐＥ９．５ζ
こ調整し、１０ガロンのＭＩＥＫで抽出した。ＭＩＢＫ
層を、ｐＨ２，５の酸性水１ガロン中に逆抽出して、分
離した。この酸性水を９．５に調整してから、１リツト
ルの酢酸エチルで抽出した。浴媒層を泡立たせた後、無
水硫酸す）　ＩＪウム上で乾燥させた。酢酸エチルを濃
縮してほぼ乾燥させて、１８グラムを得た。

その後、メタノール中のこの濃縮物をメタノール中のＬ
Ｈ２０セファデクスを降下させ、活性カラトラ合わせて
濃縮した。濃縮物の収量は１２ｐで、これからシリカゲ
ル上で精製された抗生物質複合物を分離することができ
た。

ノカルディア種ＡＴＣＣ３９０４３の５０ガロン発酵ｋ
、ｐＨ約９．０でメチルインブチルケトンを用いて抽出
した。溶媒を除去すると、黒い油状残留物が残るので、
これ全下記のように酸−塩基処理した。この油−ｉ、５
００ｍ７！の酢酸エチル（ＥｔＯＡｅ）に溶解させ、５
００−の水を加えた。

希Ｈａ　ＯＨを用い、かくはんして、ｐＨを９．０に調
整し、水性層を捨てた。ＥｔＯＡｅ層を水５００−で層
にして、かくはんしながら燐酸でｐＥ”ｆ３．０に調整
した。ＥｔＯＡｅ層を捨て、ＥｔＯＡｅ５００−音用い
て酸性の水性部を層にし、そして希Ｎａ０Ｈｋ用い、か
くはんしながらｐＨｆ９．０に調整した。酢酸エチル層
を硫酸す）　ＩＪウム上で乾燥させ、溶媒除去Ｉ、、５
ｔｒｉｐ）　して、赤かつ色の油３２．５グラム全得た
。それからこの油ｉ、１２００グラムのセファデクスＬ
Ｈ−２０上のクロマトグラフにかけ、溶離剤としてメタ
ノールを用いて、粘性のあるゴムをほぼ１６グラム得た
。１００％クロロホルムを用い、メタノールの量を増し
て行く（５％までのメタノール）、シリカゲル上のクロ
マトグラフィにより、抗生物質複合物を２ｙ得た。

！ ＴＬＣ分析により、発酵年令の拡張が、ｐＨの上昇に伴
ない、液体培地中のエステルをこ対するエリスロマイシ
ンＤの割合を増大させることが観察された。そのため、
液体培地中でのエステルのエリスロマイシンＤへの加水
分解に対し、アルカリ性の加水分解条件が確立された。

発酵は、実施例１の方法に従って、６１のかくはんされ
たポット中の種々の培地（３ｔ）中で、２６℃で１３日
までの期間、実施された。加水分解のために、０．５７
！の液体培地全体を飽和Ｂα（０７７）ｚ水溶液帆５−
と混合した。３０℃で、水浴中で１５分振盪した後、０
．９２ＮのＨＣｌ０．２−を添加することによりｐＨを
６−０−８・Ｏに調整した。そのままおよび加水分解さ
れた液体培地ζこライて、標準としてのエリスロマイシ
ンＤ（Ｄ３“。

４“−ジ酢酸エステルと共に黄色ブドウ球菌（５ｔａｐ
ｈ、　ａｓｒｍｕａ　）　ＯＯ５ｆｔ、用いる寒天拡散
（平板）検定を用いて、効力を評価した（すなわち、活
性はジ酢酸エステルを当蓋として表わされる）。

次の評価分析が決定された： 効力（Ｓσｒｔ／ｄ）　　　　　効力（想Ｃσ／−）Ｊ
ＬＣ−３２１７８７，２１７，６８８，４ＪＬＣ−３’
　　　１８．９　　　５６．３　　２＆９　　１１１．
０ＪＬＣ−６２１，０９６，０２２，２１２２，０ＪＬ
Ｃ−６’　　　２５．０　　１３０．０　　２８．７　
１３２．０１０日　　　　　１３日 効力（ｓｃｇ／ｍ／り　　　効力Ｃｍｃｇ／ｆｆ１７り
ＪＬＣ−３２２，２７９，２３５，３７９，２ＪＬＣ−
３’　　　　２８．７　　１２０．０　　　３７．８　
　１４Ｂ、０ＪＬＣ−６２２，２９７，５３２，９９７
，５ＪＬＣ−６’　　　　２６．９　　１４Ｂ、０　　
　４０．７　　１４８．０加水分解後に、今やエリスロ
マイシンＤに冨んでいる、濃縮抗生物質複合物は、実施
例１および２に従って単離される。精製されたエリスロ
マイシンＤは、以下の実施例中に詳しく述べられる方法
ζこ従って、単離される。

スロマイシンＤ 先述の各実施例に従って製造された抗生物質複合物（１
６ｇ）を、メタノール中の＠ＮＨＮＨ４０Ｈ２ＣＪで、
室温で１２０時間処理した。この反応混合物を溶媒除去
Ｃ５ｔｒ４ｐ）　して泡沫とし、酢酸エチルに再溶解さ
せた。実施例３の酸−塩基抽出処理法に従って、エリス
ロマイシンＤＣ５，１，！ｉ’）Ｔｈ回収した。

実施例６゜ エリスロマイシンＤ、３“、４″−ジーＯ−アセチルエ
リスロマイシンＤ　、　４”−０−アセチルエリスロマ
イシンＤおよび３“−Ｏ−アセチル−４“−〇−プ先の
各実施例に従って製造した抗生物質複合物（４９，０５
ｇ）　’ｋ、ヘプタン中に作製された、１６００ｇのシ
リカゲル（２３０−４００メツシユ）を詰めた分取りロ
マトグラフイーカラム〔ジョバン（Ｊｏｂ４％〕−イボ
ン（Ｙｔ＋ｏ％）クロマトグラフ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｓ
ｐｍｃ　）上に置いた。溶媒を、クロロホルムに、そし
てその後、次第に童の増えるｙｘメタノール２０％まで
）全含有するクロロホルムｌこ、変えたとき、５００ｓ
ｆ！づつの分画をとった。谷分画ｔ−１ｍ５剤としての
１：１クロロホルム：メタノールと、実施例１ζこ記載
したバニリン噴霧とを用いるＴＬＣによって検査した。

個々の成分のＲｆ価および適当に合わせた分画の蒸発（
こよる粗生成物の収量は次の通りであるニ ル （２）３“、４“−ジ酢酸エステ　　０．６５　　　８
．４７．＠ル （３）４“−酢酸エステル　　　　０．４７　　２４．
３ｇ（４）エリスロマイシンＤ　　　　Ｏ，３５８，Ｏ
７７合わせた分画（１）、（２）および（４）の各々を
、２５×１０００ｍｍのシリカゲルカラム上のカラムク
ロマトグラフにかけ、増加するメタノール（５％まで）
を含有するクロロホルム？用いて、次のような分析的に
純粋な試料を生成した： （２）３“、４“−ジ酢酸エステル　　　７６０１！ｌ
９（４）エリスロマイシンＤ　　　　　　　　１．０．
９合わせた分画（３）ヲ、分取カラム上で再操作して、
分析用４“−酢酸エステル２．１９　ｊｊ　ｆ得た。

これらの生成物ｌこ関して、次の物理化学的性質がわか
った： スロマイシンＤ＝融点１２２−１３２℃；メタノール中
で意味のあるｕｖはない；　ｔｒ（：ＫＢｒ）３５００
．２９８０．２９６０．１４７０．１３８０゜１２４０
．１１８０．１０２０．１０１０．７５５ｉ’。

融点１２３−１３０℃、”　ｓｖ　（ＭａＯＨ）　２８
２　ｎｕ（最大）；　１ｒ（ＫＢｒ）３４９０．２９８
０．２９６０．１７４０．１４６０．１３８０，１２３
０．１１８０．１０５０．１０１０　ｃＩｒＬ−’。

１２４−１３０℃；メタノール中で意味のある！！νな
し；　１ｒｃＫＢｒ）　３５１０．２９８０，２９４０
゜１７４２．１４６０．１３８０，１２４０．１１８０
．１１１０．１０３０．１０１　ｏｃｍ司。

エリスロマイシンＤ：先に特性を決定したエリスロマイ
シンＤと一１ｔ−る。

実施例７６ ３″，４″−ジ−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤの加
水分解によるエリスロマイシンＤ ３″，４″−ジ−０−アセチルエリスロマイシンＤ（２
７■）を、呈温で、０．ＩＮメタノール性ＫＯＨ１，０
ｍとともに、１６時間かくはんした。蒸発乾―すると白
色固体が得られ、このもの全実施例３に従って、酢酸エ
チル−酸−塩基抽出処理すると、エリスロマイシンＤが
得られた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種（ＡＴＣＣ
   ３９０４３）（微工研菌寄第８６４９号）を資化性の炭
   素源および窒素源を含有する水性栄養培地中で充分な抗
   生物質活性が得られるまで培養し、エリスロマイシンＤ
   、３″，４″をジ−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤ、
   ３″−Ｏ−アセチル−４″−Ｏ−プロピオニルエリスロ
   マイシンＤおよび４″−Ｏ−アセチルエリスロマイシン
   Ｄからなる抗生物質複合体を分離し、該抗生物質複合体
   から３″，４″−ジ−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤ
   を分離することからなる方法。
2. （２）ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種（ＡＴＣＣ
   ３９０４３）（微工研菌寄第８６４９号）を資化性の炭
   素源および窒素源を含有する水性栄養培地中で充分な抗
   生物質活性が得られるまで培養し、エリスロマイシンＤ
   、３″，４″−ジ−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤ、
   ３″−Ｏ−アセチル−４″−Ｏ−プロピオニルエリスロ
   マイシンＤおよび４″−Ｏ−アセチルエリスロマイシン
   Ｄからなる抗生物質複合体を分離し、上記エステル類を
   ブロス中で加水分解してから、エリスロマイシンＤに富
   んだ抗生物質複合体を単離することからなる方法。
3. （３）ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種（ＡＴＣＣ
   ３９０４３）（微工研菌寄第８６４９号）を資化性の炭
   素源および窒素源を含有する水性栄養培地中で充分な抗
   生物質活性が得られるまで培養し、エリスロマイシンＤ
   、３″，４″−ジ−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤ、
   ３″−Ｏ−アセチル−４″−Ｏ−プロピオニルエリスロ
   マイシンＤおよび４”−Ｏ−アセチルエリスロマイシン
   Ｄからなる抗生物質複合体を分離し、上記エステル類を
   ブロス中で加水分解してから、エリスロマイシンＤに富
   んだ抗生物質複合体を単離し、このエリスロマイシンＤ
   に富む抗生物質複合体からエリスロマイシンＤを分離す
   ることからなる方法。