JPS6317834B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規の抗生物質化合物に関する。特に
本発明はA.T.C.C.No.31295、31296、31297又は
31298の同定特性をもつミクロポリスポラ シー
シア株を水性媒質中で浸水好気性条件のもとで培
養して実質的量のBu−2313とよぶ抗生物質複合
物を生成しかつ任意に培養媒質からBu−2313を
回収することによつて生成される上記Bu−2313
とよぶ抗生物質複合物に関する。 本発明はまたBu−2313複合物からクロマトグ
ラフ法により回収されるBu−2313AおよびBu−
2313AとよぶBu−2313の新規の2抗生物質成分
を提供するものである。Bu−2313およびその生
物活性成分Bu−2313AとBu−2313Bは種々の嫌
気性細菌およびある種の好気性細菌に対し抗菌活
性を示す。Bu−2313AおよびBu−2313Bは人を
含む動物の伝染病、特に嫌気性細菌によつて起る
病気の治療に価値がある。 Bu−2313およびその成分、Bu−2313AとBu−
2313Bはミクロポリスポラ シーシアの新しい色
素生成性亜種の醗酵によつて生成出来る。Bu−
2313AとBu−2313Bの構造は次のとおりである。 但し Bu−2313AのR=CH3 Bu−2313BのR=H 従つて本発明における抗生物質化合物の製造法
は広義には、ミクロポリスポラ属に属する抗生物
質Bu−2313A及びBu−2313B生産菌を培養し、
培養媒質から抗生物質Bu−2313A及びBu−
2313Bを回収することからなる。 微生物 抗嫌気性抗生物質の探索過程において寡少胞子
性アクチノマイセテ株No.E864−61はインド ラ
ジヤスタン地方で採集した土壌試料から分離され
た。それは牛肉抽出液−ペプトン−無機塩類媒質
にジヒドロオキシメチルフラトリジン2mcg/ml
とニスタチン40mcg/mlを補給した寒天板上42℃
で分離された。株E864−61は主として種々の嫌
気性細菌に対して活性をもつ新抗生物質複合物
Bu−2313を生成すると発見されたのである。 形態学 株E864−61は気生菌糸および基底菌糸上に芽
胞を生成する。多くの芽胞は直接菌糸上又は短か
い芽胞柄上のいづれかに一つつく。一対の芽胞お
よび2乃至8芽胞鎖も時々見られる。気生菌糸の
色は白で、あとでにぶい青味がかつた緑又は淡い
灰色がかつた緑に変り多くの芽胞を形成する。2
種の色素、紫と暗緑色色素が寒天媒質中に生成さ
れる。芽胞は球から長楕円体の形をし大きさは
0.5−0.7×0.5−1.2μであり滑らかな表面をもつ。
気生菌糸は時として数回から10回撚れており真直
ぐな芽胞鎖の様に見える。基底菌糸の分裂は一般
に認められないが、気生菌糸のない変異株は長期
培養後分裂した細胞を生ずる。親株(S−2)は
自然変異株を生じ易くそれは緑色芽胞集合体、気
生菌糸および紫又は緑色色素を生成する能力にお
いて異なる元の株およびいくつかの変異株の性質
を次の表1に示す。 【表】 元の株から単芽胞分離法により生成された変異
株Y−29は高い生成性株として選択された。アク
チノマイセテE864−61株S−2、S−26、S−
7、およびY−29の培養物はコロンビア特別地区
ワシントン市のアメリカ型培養コレクシヨン
(The American Type Culture Collection)に
委託されそれぞれA.T.C.C.No.31295、31297、
31296および31298としてその微生物永久コレクシ
ヨンに加えられているものである。また該微生物
類は昭和53年7月4日に工業技術院微生物工業技
術研究所に委託された。(微工研寄番号第4559号、
第4561号、第4560号および第4562号) 細胞壁組成物 株E864−61は診断的細胞壁組成分としてメゾ
−DAP、ガラクトースおよびラムノースを含ん
でいる。細胞壁組成は表2に示している。 表 2 細胞壁のアミノ酸および炭水化物組成 アミノ酸 株E864−61 メゾ−DAP +++ LL−DAP − グリシン − グルタミン酸 +++ アラニン +++ 炭水化物 アラビノース − ガラクトース +++ ラムノース + マンノース 痕跡 培養特性 株E864−61は酵母抽出液−麦芽抽出液寒天お
よびベネツトの寒天の様な栄養豊富媒質上で極め
てよく成長するが澱粉−無機質塩寒天、グルコー
ス−アスパラギン寒天、チロシン寒天およびグル
コース−アンモニウム塩類寒天の様な化学に規定
された媒質上の成長は小さい。ザペツク
(Czapek)の寒天上は成長しない。 E864−61の元の株(S−2)は豊富な芽胞と
気生菌糸を生成する。それは2種の色素:酵母抽
出液−麦芽抽出液寒天、ペプトン−酵母抽出液−
鉄寒天およびグルコース−アンモニウム塩類寒天
上で赤味がかつた紫から赤味がかつた褐色の色素
とオートミール寒天、チロシン寒天およびベネツ
ト寒天上の暗緑色色素を生成する。変体S−26は
よく芽胞を形成しまた気生菌糸を生成するが色素
形成能力がない。変体S−7は白色気生菌糸を生
成するが緑色芽胞集合体がない。また赤味がかつ
た紫色素を豊かに生成するが緑色色素は生成しな
い。変異体Y−29は芽胞集合体および気生菌糸の
形成能力がないので細菌の様な外観をもつ。それ
は緑色色素のみを生成するが移植によつてこの性
質を容易に失なう。元の株および自然変異株の培
養特性は表3に示している。 【表】
ンク
生理学的特性 株E864−61は好気性の好中温性(mesophilic)
なアクチノマイセテである。この株の最適成長温
度は32乃至42℃で、20乃至48℃で適度の成長が得
られる。55℃では成長は見られない。元株および
変異株の生理学的反応および炭水化物利用度はそ
れぞれ表4と5に示している。 【表】 で無成長
【表】 ス
【表】 【表】 分類学 株E864−61の形態学的特性と細胞壁組成から
この微生物はバージイのManual of
Determinative Bacteriology.8版、1975に記載さ
れているミクロモノスポレイシイ科クラシルニコ
フ1938に分類されるべきである。ミクロモノスポ
レイシイの属と比較した場合株E864−61はその
気生菌糸形成およびアラビノースの代りにラムノ
ースがあるが型の細胞壁組成においてミクロモ
ノスポレイシイ属と違つている。それはまたサー
モアクチノマイセス、アクチノビフイダ、サーモ
モノスポラ、ミクロバイスポラおよびミクロテト
ラスポラ属と芽胞形態および細胞壁型(上記属は
型)において異なる。株E864−61は細胞壁型、
芽胞形態および芽胞形成様式においてミクロポリ
スポラ属に最も似ている。ミクロポリスポラ属の
もとに8種が記載されており鎖中の芽胞数におい
て各種の間にかなりの多様性がが見られる。ミク
ロポリスポラ シーシアは1乃至5芽胞と3種は
鎖中5乃至20芽胞をもつと報告されている。株
E864−61はそれが殆んど単一芽胞と時に3−8
芽胞の鎖を形成する点でミクロポリスポラ シー
シアに似ている。更にこの株はその気生菌糸の
色、成長温度範囲および細胞壁型においてM.シ
ーシアと似ているが、2種の拡散性色素生成にお
いてM.シーシアと違つている。故に株E864−
61はミクロポリスポラ シーシアの新色素生成性
亜種であると思われる。 株E864−61は自然に又は人工的に容易に突然
変異するので、本発明は元の株S−2又は変体S
−26、S−7又はY−29に限定されないのであ
る。明確にいえばそれはX線放射、紫外線照射、
窒素マスタード処理、、フエイジ(phage)露出
等の様な方法によつて上記微生物から生成出来る
すべてのBu−2313を生成する自然および人工的
突然変異株および変異株を含むものと考える。他
の抗生物質と同様に、Bu−2313の高い生成は単
一集落選択後高生産性株の選択によつて、種々の
突然変異誘発剤による処理により又は遺伝子組換
え、形質の転換又は導入の遺伝的方法によつて出
来ると予想される。 抗生物質の製造 抗生物質複合物Bu−2313は水性栄養媒質中浸
水好気性条件のもとでミクロポリスポラ シーシ
アE864−61(および出来ればA.T.C.C.No.31295、
31296、31297又は31298)の株の培養によつて生
成される。他の放射菌属の培養に使われる一般法
がミクロポリスポラ シーシアE864−61の培養
に応用出来る。栄養媒質はグリセロース、グルコ
ース、フルクトース、マンノース、澱粉、デキス
トリン、麦芽糖、糖密、油類、脂肪類等の様な同
化性炭素源の1又は2以上を精製状態又は粗状態
のいづれかで含んでいる必要がある。栄養媒質は
また例えば大豆粉、魚粉、麦芽抽出液、ペプト
ン、酵母抽出液、デイスチラーズソルブルズ、グ
ルテンミール、コーンステイープ液、棉実粉、カ
ゼイン、加水分解した蛋白質物質、硝酸塩類、ア
ンモニア塩類、尿素等の様な同化性窒素源の1又
は2以上を含んでいる必要がある。塩化ナトリウ
ム、りん酸カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カ
ルシウムの様な栄養無機塩類および少量の重金属
塩類、例えば銅、亜鉛、マンガン、鉄等の塩類、
も媒質に加えてもよい。空気吹込み浸水培養にお
いて液体パラフイン、大豆油、脂肪又はシリコー
ンの様な泡防止剤も利用出来る。 醗酵温度は約20乃至約48℃が好ましく、32℃乃
至42℃の範囲が最もよい。醗酵媒質のPHは約5乃
至約10の範囲とすべきで約6乃至約8の範囲が好
ましい。普通3−7日内で最適生成が得られる。
タンク醗酵が行なわれる場合はブロス培養物を傾
斜又は土壌培養液又は有機体の凍結真空乾燥培養
物で接種して栄養ブロス中に成長性接種物を生成
するとよい。この様に活性接種物を得た後、醗酵
タンク媒質中にそれを無菌状態で移す。醗酵ブロ
ス中の抗生物質活性は嫌気性状態のもとでGAM
〔ギフ アネローベ(anerobe)媒質、ニツスイ〕
上試験菌としてバクテロイデス フラギリスを用
いてペーパーデイスク−寒天板分析によつて測定
出来る。最適ブロス能力が得られた後、出来れば
過助材を使つてブロスを過する。菌糸のケー
キを水洗し液と洗液を併せてPH約8に調節しジ
アイオン(Diaion)HP−20(三菱化学工業)又
はアンバーライト(Amberlite)XAD−2(ロー
ムアンドハース社)の様な非イオン性マクロ網状
(マクロ多孔性)重合体樹脂の管をとおす。この
樹脂管を水とメタノール水溶液(例えば40%メタ
ノール)で洗い次いで約95%メタノール溶液で溶
離する。活性分別部分を併せ真空濃縮し蒸発又は
凍結真空乾燥により粗Bu−2313複合物を得る。
かくして得た固体は上記のマクロ網状樹脂上のク
ロマトグラフ法および(又は)シリカゲルクロマ
トグラフ法によりその成分、Bu−2313Aおよび
Bu−2313Bに分離出来る。 ミクロポリスポラ シーシアE864−61のいく
つかの株醗酵の際グリシンを醗酵媒質に加えると
(例えば1%)Bu−2313Aの生成を抑えて主生成
物としてBu−2313Bが得られることが発見され
ている。 Bu−2313AとBu−2313Bの物理化学的性質 Bu−2313AとBu−2313Bは共に淡黄色結晶と
して分離される酸性物質である。これらは低級ア
ルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムおよび
ベンゼンの様な殆んどの有機溶媒に容易にとけ、
ヘキサンおよびアルカリ性水に僅かにとけるが、
水には実際上とけない。これらは酸性液中で安定
であるが、アルカリ性液中では安定性小さくN/
10NaOH液中室温で一夜放置すれば不活性とな
る。両成分とも塩化第2鉄と陽性反応をするがニ
ンヒドリン、アンスロン、サカグチとトレンの反
応においては陰性である。Bu−2313AとBu−
2313Bは次のとおり2TLC系によつて区別出来る 【表】 Bu−2313Aは116−118℃で溶融しまた光学活
性をもつ、〔α〕26 D=−58゜(C、0.5、MeOH)、そ
れは50%エタノール水溶液中5.2のpKa′を示し滴
定当量519をもちまたそのマススペクトルはm/
e517において分子イオンピークを与える。Bu−
2313Bは融点160−162℃で光学的活性を示す:
〔α〕25 D=−69.9゜(C0.3、MeOH)および−34.9゜
(C0.93、CHCl3)それは46%エタノール水溶液
中pKa′4.9で滴定当量509をもちまたマススペクト
ルはm/e503において分子イオンピークを与え
る。 種々の溶媒中のBu−2313AとBu−2313Bの紫
外線スペクトルはそれぞれ付図1および2に示し
ているがその最大吸収は次のとおりである。 【表】 衝液
N〓10HCl〓5%エタ 241(210)、359(656)、370(665)
ノール
Bu−2313AとBu−2313BのKBrペレツト中に
おける赤外線スペクトルはそれぞれ付図3と4に
示しているが1730、1660、1630、1580および1210
cm-1に認められる吸収バンド特性で互によく似て
いる。1500cm-1における鋭いバンドが成分Aに見
られるが、成分Bは成分Aにない3200−3400cm-1
においてN−H吸収特性を示す。Bu−2313Aと
Bu−2313BのCDCl3中のプロトンNMRスペクト
ルはそれぞれ付図5と6に示している。それらは
5C−メチル基、1メチルエステル基およびトラ
ンス ジエノイツク酸発色団の存在を示してい
る。成分AのNMRスペクトルはδ3.03ppmにおい
てN−メチル信号を示すが、これは成分Bにはな
い。分子イオンピークはBu−2313A(m/e517)
とBu−2313B(m/e503)の両方のマス分光学に
よつて認められた。主断片イオンピークはm/
e221(成分Bの基本ピーク)、m/e235(成分Aの
基本ピーク)およびm/e283(両成分AとBの強
度ピーク)におけるマススペクトルに見られる。 Bu−2313AとBu−2313Bは酸性物質でそれら
およびそれらの混合物は塩基と塩類を生成する。
本明細書で用いる“無毒の製薬上許容される塩”
とは金属陽イオン、例えばナトリウム、カリウ
ム、およびマグネシウムの様なアルカリ金属又は
アルカリ土金属陽イオンとの塩類を含むものとす
る。 Bu−2313AとBu−2313Bの生物学的特性抗菌性
スペクトル Bu−2313AとBu−2313Bの最小抑制濃度は
種々の好気性および嫌気性細胞に対する多数接種
用装置を用い連続2倍寒天希釈法によつて測定し
た。栄養寒天媒質(エイケン)は一般に好気性細
菌に用い、ゴノコツカス(GC)媒質(エイケン)
は連鎖状球菌、ネイセリアおよびヘモフイラス種
の様なむづかしい好気性細菌に用いまたGAM寒
天媒質(ニツスイ)は嫌気性細菌に用いた。 Bu−2313AとBu−2313Bの種々の好気性およ
び嫌気性細菌に対する試験管内活性は関聯化合物
として使われるチランダマイシンおよびクリンダ
マイシンのそれと共にそれぞれ表6および7に示
している。Bu−2313AとBu−2313Bは低濃度に
おいて種々の嫌気性細菌の成長を抑制したが、
S.アウレウス、E.コリおよびK.ニユーモニ
イの様な普通の好気性細菌の多くに対しては中位
から弱い活性を示した。しかしバチルス種、連鎖
状球菌、ネイセリア メニンギチジイス、N.ゴ
ノルヘーイおよびヘモフイラス インフルエンジ
イの種はBu−2313AおよびBu−2313Bに敏感で
あつた。一般にBu−2313AおよびBu−2313Bの
活性および抗菌性スペクトルはチランダマイシン
のそれと非常に似ておりBu−2313Bの本質的試
験管活性はBu−2313Aの活性より幾分高い様で
ある。 接種菌量の影響 2嫌気性細菌(B.フラギリスとC.パーフリ
ンゲンス)についてGAM培地および寒天媒質を
用いて接種菌量のMICに対する影響をしらべた。
表8に示すとおり、ブロス稀釈法で検べた処Bu
−2313AとBu−2313BのMICは接種菌量に非常に
影響された。 殺菌性活性 Bu−2313AとBu−2313Bの殺菌力を嫌気性細
菌2株および好気性細菌1株について検べた。
MIC測定後の濁りのない各管からのブロス試料
0.1ml寒天平板につけて生活力ある細胞数をしら
べた。GAM寒天板をB.フラギリスおよびC.
パーフリンゲンスの生活力細胞数を数えるに用い
また5%馬血清を含む栄養寒天をS.パイオジエ
ネス用に用い、平板は37℃で18時間培養した。集
落成長が平板当り100以下の抗生物質濃度を殺菌
性があるとした。(元の接種菌量105−106細胞/
ml)表9に示すとおり、Bu−2313AとBu−
2313Bの殺菌作用は殺菌性よりもむしろ細菌静止
的であると思われる。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 はつかねずみ血液濃度 Bu−2313(Na塩)、クリンダマイシンおよびフ
ラギル(Flagyl)を段階的薬量(100、50、25お
よび12.5mg/Kg)で皮下又は経口投与した後のね
ずみの血液濃度を測定した。血液試料を眼窩静脈
洞から採取し試験菌体としてB.フラギリス
A20926を用いペーパーデイスク−寒天板法によ
つて分析した。結果を表10に示す。Bu−2313B
を用いて得た最大血液濃度は非経口および経口投
与いづれもクリンダマイシンのそれより約3−4
倍高かつたが、フラギルはBu−2313Bよりよい
吸収を示した。 【表】 生体内活性 Bu−2313AとBu−2313Bの生体内効果をB.
フラギリス A20926(部分的)、C.パーフリン
ゲンスA9635およびS.パイオゲネスA20201(全
身的)に感染したはつかねずみで試験した。 はつかねずみの首背面に細胞2−5×106と微
結晶性セルロース10mgを含む細菌懸濁液0.5mlを
皮下注射してB.フラギリスの部分的感染をさせ
た。注射30分後に初めて5日間毎日1回皮下又は
経口投与して治療を行なつた。ねずみ5匹の群を
各薬量に対して用い動物は6日目に解剖切開して
皮下膿瘍の大きさを測定した。各動物の応答を傷
の大きさによつて0−5に採点し点数の合計を群
中のねずみ数で除して各治療群と対照群の平均点
を得た。対照群の平均点を感染度100%ととり各
治療群の相対感染度を計算しまたPD50値をロツ
グ プロビツト プロツト(log−probit plot)
によつて推定した。Bu−2313Bを用いて得た結
果をクリンダマイシンおよびフラギルの結果と共
に表11に示している。この感染試験ではクリンダ
ーマイシンはBu−2313A又はフラギルより活性
であつた。 豚胃ムチンの5%懸濁液(アメリカンラボラト
リーズ)中の病原体の致命的量をねずみの腹腔内
に投与して全身的にC.パーフリンゲンス又は
S.パイオゲネスに感染させた。細菌を投与する
直前に抗生物質を皮下又は経口投与した。5日後
にPD50を測定した。表12でわかるとおりBu−
2313Bは皮下および経口投与いづれによつても全
身的伝染に対してかなりよい防禦を示したが、
Bu−2313Aの経口投与は不活性であつた。クリ
ンダマイシンはこの生体実験において最も活性で
あつた。 【表】 【表】 ン
クリンダマイシ 0.08 0.22 0.3 21
ン
フラギル 31 60 NT NT
NA=活性なし
NT=試験せず
急性毒性 Bu−2313AおよびBの急性LD50を皮下、腹腔
内および経口投与によつて検べた。Bu−2313の
遊離酸およびナトリウム塩型の両方について試験
し結果を表13に示している。Bu−2313BはBu−
2313Aより著しく低い毒性を示したが、これは2
成分の間の僅かな構造差から考えて(N−メチル
基の有無)興味あることである。 【表】 本発明の1形態は式: (式中RはH又はCH3を表わす。) で示される抗生物質化合物又はその混合物又はそ
の製薬上許容される無毒塩(ナトリウム塩が好ま
しい)に関する。 本発明の他の形態はBu−2313Aと呼ぶ抗生物
質化合物又はその製薬上許容される無毒塩(成る
可くナトリウム塩)に関する。その化合物は低級
アルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムおよ
びベンゼンに溶解し、ヘキサンおよびアルカリ性
水には僅かにとけるが水には実際上不溶の酸性物
質であり、それは塩化第2鉄とは陽性反応をする
がニンヒドリン、アンスロン、サカグチおよびト
レンの試薬とは陰性反応をし、その精製形は約
116−118℃で溶融し、光学的活性で〔α〕26 D=約
−58゜(C0.5、メタノール)であり、50%エタノ
ール水溶液中約5.2のpKa′を示し滴定当量519をも
ち、そのマススペクトルにおいてm/e517に分子
イオンピークをもち、実験式C27H35NO9をもち
かつその紫外線、赤外線および核磁気共鳴スペク
トルがそれぞれ実質的に付図1,3および5に示
す様なものである化合物である。 本発明の他の形態はBu−2313Bと呼ぶ抗生物
質化合物又はその製薬上許容される無毒塩(成る
可くはナトリウム塩)に関する。その化合物は低
級アルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムお
よびベンゼンに溶解し、ヘキサンおよびアルカリ
性水には僅かにとけるが水には実際上不溶である
酸性物質であり、それは塩化第2鉄と陽性反応を
するがニンヒドリン、アンスロン、サカグチおよ
びトレンの試薬とは陰性反応をし、その精製形は
約160乃至162℃で溶融し、光学的活性で〔α〕25 D
=約−69.9゜(C0.3、メタノール)および−34.9゜
(C0.93、CHCl3)をもち、46%エタノール水溶
液中約4.9のpKa′を示し滴定量509をもち、そのマ
ススペクトルにおいてm/e503に分子イオンピー
クをもち、実験式C26H33NO9をもちかつその紫
外線、赤外線および核磁気共鳴スペクトルがそれ
ぞれ実質的に付図2,4および6に示す様なもの
である化合物である。 本発明の他の形態はA.T.C.C.31295、31296、
31297又は31298の同定特性をもつミクロポリスポ
ラ シーシアの株を炭素と窒素の同化性源を含む
水性培養媒質中で浸水好気性条件のもとで培養し
上記微生物により上記培養媒質中に実質的量の抗
生物質混合物を生成することにより成る抗生物質
Bu−2313AとBu−2313Bの混合物製造用微生物
学的方法に関する。好ましい実施態様ではこの方
法は更に培養媒質から抗生物質混合物を回収する
工程を含む。より好ましい実施態様の微生物はミ
クロポリスポラ シーシアA.T.C.C.31298であ
る。 本発明の他の形態は抗生物質Bu−2313Bの製
造用微生物学的方法に関するもので、その方法は
(a)A.T.C.C.31295、31296、31297又は31298の同
定特性をもつミクロポリスポラ シーシアの株を
炭素と窒素の同化性源を含む水性培養媒質中で浸
水好気性条件のもとで培養して上記培養媒質中で
上記微生物により実質的量の抗生物質混合物を生
成し、(b)工程(a)で生成した抗生物質混合物を回収
しかつ(c)マクロ網状重合体樹脂上のクロマトグラ
フ法により上記抗生物質混合物からBu−2313B
を分離することより成るのである。好ましい実施
態様における微生物はミクロポリスポラ シーシ
アA.T.C.C.31298である。 本発明の他の形態は抗生物質Bu−2313A製造
用微生物学的方法に関するもので、その方法は(a)
A.T.C.C.31295、31296、31297又は31298の同定
特性をもつミクロポリスポラ シーシアの株を炭
素と窒素の同化性源を含む水性培養媒質中で浸水
好気性条件のもとで培養して上記培養媒質中に上
記微生物により実質的量の抗生物質混合物を生成
し、(b)工程(a)で生成した抗生物質混合物を培養媒
質から回収し、(c)上記抗生物質混合物からマクロ
網状重合体樹脂上のクロマトグラフ法によりBu
−2313Bの大部分を分離しかつ(d)Bu−2313Aをシ
リカゲル上クロマトグラフ法により残留Bu−
2313Bから分離することより成るのである。好ま
しい実施態様における微生物はミクロポリスポラ
シーシアA.T.C.C.31298である。 本発明の抗生物質化合物にはBu−2313複合物、
その成分Bu−2313AおよびBu−2313Bおよびそ
の塩類および混合物がある。本発明はその範囲内
に上記抗生物質の少なくも1種と適当な製薬上許
容される担体を含む調剤組成物を包含する。組成
物は必要な投与法に適した調剤形に形成出来る。
この組成物の例は錠剤、カプセル、ピル、粉末お
よび小粒の様な経口投与用固体組成物、溶液懸濁
液、シロツプおよびエリキシール剤の様な経口投
与用液体組成物および無菌溶液、懸濁液又は乳化
液の様な非経口投与用処方がある。 他の抗生物質と同様にBu−2313AおよびBの
服用量は患者の体重、年令および一般健康状態お
よび病気の性質によるもので医師の判断範囲内で
ある。一般に経口薬量はBu−2313A又はBu−
2313B(又はそれらの混合物)50−750mgの範囲内
で1日3−4回与える。 本発明を次の実施例によつて例証するが、それ
によつて本発明を限定するものではない。 実施例 1 種培養物の製造および小規模シエークフラスコ
醗酵 グルコース3%、大豆粉1%、コーンステイー
プ液1%およびCaCO30.5%を含む500mlエルレン
マイヤーフラスコ中の生長性液体媒質100mlを接
種するにBu−2313生成性微生物、株E864−61No.
Y−29のよく成長した寒天傾斜培養物を用いた。
媒質PHを殺菌前7.0に調整した。種培養物を回転
振とう機上(250rpm)34℃で3日培養し培養液
2−3mlをしよ糖3%、リンシードミール3%
(NH4)2SO40.3%、ZnSO4・7H2O0.003%および
CaCO30.5%より成る醗酵媒質100mlを入れた500
mlエルレンマイヤーフラスコに移した。28℃で4
−7日振とう後抗生物質生成は最高に達した。醗
酵の進行と共にブロスPHは段々と高くなり抗生物
質効力150mcg/mlとなつた時PHは8.1−8.8に達し
た。抗生物質の醗酵ブロス内活性は試験菌体とし
て嫌気性条件でGAM寒天板上で生長したバクテ
ロイデス フラギリスを用いてペーパージスク寒
天板法によつて測定した。 実施例 2 大規模タンク醗酵 株E864−61No.Y−29のよく成長した寒天傾斜
培養から製造した種培養液110を2500タンク
中のグルコース3%、大豆粉3%、コーンステイ
ープ液1%およびCaCO30.5%を含む醗酵媒質
1500に接種した。醗酵は31℃で200rpm撹拌、
空気吹込速度1000/分で行なつた。72時間後醗
酵ブロスPH8.2となり抗生物質培養力価265mcg/
mlとなつた。 実施例 3 分離および精製 醗酵ブロス(1500、分析200mcg/ml)を
過助材を用いて過し菌糸ケーキを水洗した。
液と洗液を併せPH8.3としマクロ網状樹脂(ジア
イオン、、HP−20、100)管に入れた。管を水
400と次いで40%メタノール水溶液40で洗い
95%メタノール水溶液400で展開した。活性分
別部分を併せ真空濃縮して水性濃厚液とした。上
に得た湿菌糸ケーキ360Kgをメタノール300に懸
濁させ撹拌抽出した。これを2回反復し併せたメ
タノール抽出液700を真空濃縮した。HP−20
溶離液から得た2水性濃縮液と菌糸ケーキ抽出液
を併せ更に真空濃縮して70とし濃厚液中の活性
物を酢酸エチルで2回(2×35)抽出した。抽
出液を真空濃縮乾固して油状固体(1.03Kg、
220mcg/mg)を得た。これを酢酸エチルとメタ
ノール(20:1、2.2)の混合物にとかし活性
炭管(5容量)にとおした。管を同じ溶媒混合
物で展開し活性溶離液を併せ真空濃縮して暗褐色
固体を得て、それを熱メタノールから晶出させて
黄褐色結晶性粉末を得た。(279g、650mcg/mg) かく得た結晶性物質は成分AとBの混合物でそ
の分離はジジアイオンHP−20クロマトグラフ法
によつて行なつた。混合物の一部100gを90%メ
タノール水溶液にとかし液をHP−20樹脂管(5
)に入れた。管を80%メタノール水溶液で展開
し2活性分別部分を得た。第1活性分別部分24
の濃縮液から淡黄色針状結晶Bu−2313B45gを
得た。それをメタノールから2回再結晶させて分
析的純物質32gを得た。第2活性溶離液23を真
空濃縮して成分AとBの混合物20gを得てそれを
シリカゲル管クロマトグラフ法によりクロロホル
ムで展開して分離した。速く動く分別部分から得
て再晶出させて成分Aの純結晶4gを得た。更に
成分B7.5gは後部溶離液から回収した。 純結晶生成物の分析結果次のとおり: Bu−2313A−C27H35NO9に対する分析: 計算値:C、62.65;H、6.82;N、2.71; O、27.82 測定値:C、62.57;H、6.64;N、2.60; O、28.20(差から) Bu−2313B−C26H33NO9に対する分析: 計算値:C、62.03;H、6.56;N、2.78;
O、28.63 測定値:C、61.77;H、6.80;N、2.65;
O、28.78(差から) 実施例 4 Bu−2313Bのブロモベンゼン溶媒和物の製造 Bu−2313B100mgを熱ブロモベンゼン4mlにと
かしそれに石油エーテルを僅かに液がにごり初め
る迄滴加した。この液を室温で一夜放置して結晶
を完了させた。 Bu−2313Bのブロモベンゼン溶媒和物が黄色
針状結晶として得られた(80mg)〔α〕21 D=−51.2゜
(C0.88、メタノール)。λnax(エタノール中):
225、295(sh)、352および369nm。 NMRスペクトルδ7.1ppm(5H)(ブロモベンゼン
に対し)分析:C32H40NO10Br(C26H33NO9・
C6H5Br・H2O)に対して計算値:C、56.64;
H、5.90;N、2.06;Br、11.80;O、23.60:測
定値:C、56.87;H、5.84;N、2.19;Br、
12.10;O、23.00(差から) 実施例 5 Bu−2313Bのナトリウム塩製造 塩化メチレン10ml中にBu−2313B200mgを含む
液に水30mlを加えた。この液を撹拌しながらこれ
に1N NaOHを滴加してPH11.5とした。30分間撹
拌後溶媒層を分離し水層をn−ブタノール30mlづ
つで2回抽出した。抽出液を併せ真空濃縮し得た
固体を少量のアセトンにとかしn−ヘキサンを加
えて沈澱させてBu−2313Bナトリウム塩176mgを
得た。この物質の一部45mgをベンゼン−メタノー
ル混合液から晶出させて淡黄色結晶36mgを得た。
融点236−241℃(分解)〔α〕23 D=−7.4(C0.94、
メタノール)C26H32NO9Na・H2Oに対する分析
計算値:C、57.46;H、6.26;N、2.58;
Na4.24;O、29.46;測定値:C、57.57;H、
6.29;N、2.39;Na、4.21;O、29.54(差から)。 実施例 6 Bu−2313Aナトリウム塩製造 実施例5において用いたBu−2313Bの代りに
等量のBu−2313Aを用い実施例5の一般法を反
復してBu−2313Aのナトリウム塩を生成した。
本発明はA.T.C.C.No.31295、31296、31297又は
31298の同定特性をもつミクロポリスポラ シー
シア株を水性媒質中で浸水好気性条件のもとで培
養して実質的量のBu−2313とよぶ抗生物質複合
物を生成しかつ任意に培養媒質からBu−2313を
回収することによつて生成される上記Bu−2313
とよぶ抗生物質複合物に関する。 本発明はまたBu−2313複合物からクロマトグ
ラフ法により回収されるBu−2313AおよびBu−
2313AとよぶBu−2313の新規の2抗生物質成分
を提供するものである。Bu−2313およびその生
物活性成分Bu−2313AとBu−2313Bは種々の嫌
気性細菌およびある種の好気性細菌に対し抗菌活
性を示す。Bu−2313AおよびBu−2313Bは人を
含む動物の伝染病、特に嫌気性細菌によつて起る
病気の治療に価値がある。 Bu−2313およびその成分、Bu−2313AとBu−
2313Bはミクロポリスポラ シーシアの新しい色
素生成性亜種の醗酵によつて生成出来る。Bu−
2313AとBu−2313Bの構造は次のとおりである。 但し Bu−2313AのR=CH3 Bu−2313BのR=H 従つて本発明における抗生物質化合物の製造法
は広義には、ミクロポリスポラ属に属する抗生物
質Bu−2313A及びBu−2313B生産菌を培養し、
培養媒質から抗生物質Bu−2313A及びBu−
2313Bを回収することからなる。 微生物 抗嫌気性抗生物質の探索過程において寡少胞子
性アクチノマイセテ株No.E864−61はインド ラ
ジヤスタン地方で採集した土壌試料から分離され
た。それは牛肉抽出液−ペプトン−無機塩類媒質
にジヒドロオキシメチルフラトリジン2mcg/ml
とニスタチン40mcg/mlを補給した寒天板上42℃
で分離された。株E864−61は主として種々の嫌
気性細菌に対して活性をもつ新抗生物質複合物
Bu−2313を生成すると発見されたのである。 形態学 株E864−61は気生菌糸および基底菌糸上に芽
胞を生成する。多くの芽胞は直接菌糸上又は短か
い芽胞柄上のいづれかに一つつく。一対の芽胞お
よび2乃至8芽胞鎖も時々見られる。気生菌糸の
色は白で、あとでにぶい青味がかつた緑又は淡い
灰色がかつた緑に変り多くの芽胞を形成する。2
種の色素、紫と暗緑色色素が寒天媒質中に生成さ
れる。芽胞は球から長楕円体の形をし大きさは
0.5−0.7×0.5−1.2μであり滑らかな表面をもつ。
気生菌糸は時として数回から10回撚れており真直
ぐな芽胞鎖の様に見える。基底菌糸の分裂は一般
に認められないが、気生菌糸のない変異株は長期
培養後分裂した細胞を生ずる。親株(S−2)は
自然変異株を生じ易くそれは緑色芽胞集合体、気
生菌糸および紫又は緑色色素を生成する能力にお
いて異なる元の株およびいくつかの変異株の性質
を次の表1に示す。 【表】 元の株から単芽胞分離法により生成された変異
株Y−29は高い生成性株として選択された。アク
チノマイセテE864−61株S−2、S−26、S−
7、およびY−29の培養物はコロンビア特別地区
ワシントン市のアメリカ型培養コレクシヨン
(The American Type Culture Collection)に
委託されそれぞれA.T.C.C.No.31295、31297、
31296および31298としてその微生物永久コレクシ
ヨンに加えられているものである。また該微生物
類は昭和53年7月4日に工業技術院微生物工業技
術研究所に委託された。(微工研寄番号第4559号、
第4561号、第4560号および第4562号) 細胞壁組成物 株E864−61は診断的細胞壁組成分としてメゾ
−DAP、ガラクトースおよびラムノースを含ん
でいる。細胞壁組成は表2に示している。 表 2 細胞壁のアミノ酸および炭水化物組成 アミノ酸 株E864−61 メゾ−DAP +++ LL−DAP − グリシン − グルタミン酸 +++ アラニン +++ 炭水化物 アラビノース − ガラクトース +++ ラムノース + マンノース 痕跡 培養特性 株E864−61は酵母抽出液−麦芽抽出液寒天お
よびベネツトの寒天の様な栄養豊富媒質上で極め
てよく成長するが澱粉−無機質塩寒天、グルコー
ス−アスパラギン寒天、チロシン寒天およびグル
コース−アンモニウム塩類寒天の様な化学に規定
された媒質上の成長は小さい。ザペツク
(Czapek)の寒天上は成長しない。 E864−61の元の株(S−2)は豊富な芽胞と
気生菌糸を生成する。それは2種の色素:酵母抽
出液−麦芽抽出液寒天、ペプトン−酵母抽出液−
鉄寒天およびグルコース−アンモニウム塩類寒天
上で赤味がかつた紫から赤味がかつた褐色の色素
とオートミール寒天、チロシン寒天およびベネツ
ト寒天上の暗緑色色素を生成する。変体S−26は
よく芽胞を形成しまた気生菌糸を生成するが色素
形成能力がない。変体S−7は白色気生菌糸を生
成するが緑色芽胞集合体がない。また赤味がかつ
た紫色素を豊かに生成するが緑色色素は生成しな
い。変異体Y−29は芽胞集合体および気生菌糸の
形成能力がないので細菌の様な外観をもつ。それ
は緑色色素のみを生成するが移植によつてこの性
質を容易に失なう。元の株および自然変異株の培
養特性は表3に示している。 【表】
ンク
生理学的特性 株E864−61は好気性の好中温性(mesophilic)
なアクチノマイセテである。この株の最適成長温
度は32乃至42℃で、20乃至48℃で適度の成長が得
られる。55℃では成長は見られない。元株および
変異株の生理学的反応および炭水化物利用度はそ
れぞれ表4と5に示している。 【表】 で無成長
【表】 ス
【表】 【表】 分類学 株E864−61の形態学的特性と細胞壁組成から
この微生物はバージイのManual of
Determinative Bacteriology.8版、1975に記載さ
れているミクロモノスポレイシイ科クラシルニコ
フ1938に分類されるべきである。ミクロモノスポ
レイシイの属と比較した場合株E864−61はその
気生菌糸形成およびアラビノースの代りにラムノ
ースがあるが型の細胞壁組成においてミクロモ
ノスポレイシイ属と違つている。それはまたサー
モアクチノマイセス、アクチノビフイダ、サーモ
モノスポラ、ミクロバイスポラおよびミクロテト
ラスポラ属と芽胞形態および細胞壁型(上記属は
型)において異なる。株E864−61は細胞壁型、
芽胞形態および芽胞形成様式においてミクロポリ
スポラ属に最も似ている。ミクロポリスポラ属の
もとに8種が記載されており鎖中の芽胞数におい
て各種の間にかなりの多様性がが見られる。ミク
ロポリスポラ シーシアは1乃至5芽胞と3種は
鎖中5乃至20芽胞をもつと報告されている。株
E864−61はそれが殆んど単一芽胞と時に3−8
芽胞の鎖を形成する点でミクロポリスポラ シー
シアに似ている。更にこの株はその気生菌糸の
色、成長温度範囲および細胞壁型においてM.シ
ーシアと似ているが、2種の拡散性色素生成にお
いてM.シーシアと違つている。故に株E864−
61はミクロポリスポラ シーシアの新色素生成性
亜種であると思われる。 株E864−61は自然に又は人工的に容易に突然
変異するので、本発明は元の株S−2又は変体S
−26、S−7又はY−29に限定されないのであ
る。明確にいえばそれはX線放射、紫外線照射、
窒素マスタード処理、、フエイジ(phage)露出
等の様な方法によつて上記微生物から生成出来る
すべてのBu−2313を生成する自然および人工的
突然変異株および変異株を含むものと考える。他
の抗生物質と同様に、Bu−2313の高い生成は単
一集落選択後高生産性株の選択によつて、種々の
突然変異誘発剤による処理により又は遺伝子組換
え、形質の転換又は導入の遺伝的方法によつて出
来ると予想される。 抗生物質の製造 抗生物質複合物Bu−2313は水性栄養媒質中浸
水好気性条件のもとでミクロポリスポラ シーシ
アE864−61(および出来ればA.T.C.C.No.31295、
31296、31297又は31298)の株の培養によつて生
成される。他の放射菌属の培養に使われる一般法
がミクロポリスポラ シーシアE864−61の培養
に応用出来る。栄養媒質はグリセロース、グルコ
ース、フルクトース、マンノース、澱粉、デキス
トリン、麦芽糖、糖密、油類、脂肪類等の様な同
化性炭素源の1又は2以上を精製状態又は粗状態
のいづれかで含んでいる必要がある。栄養媒質は
また例えば大豆粉、魚粉、麦芽抽出液、ペプト
ン、酵母抽出液、デイスチラーズソルブルズ、グ
ルテンミール、コーンステイープ液、棉実粉、カ
ゼイン、加水分解した蛋白質物質、硝酸塩類、ア
ンモニア塩類、尿素等の様な同化性窒素源の1又
は2以上を含んでいる必要がある。塩化ナトリウ
ム、りん酸カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カ
ルシウムの様な栄養無機塩類および少量の重金属
塩類、例えば銅、亜鉛、マンガン、鉄等の塩類、
も媒質に加えてもよい。空気吹込み浸水培養にお
いて液体パラフイン、大豆油、脂肪又はシリコー
ンの様な泡防止剤も利用出来る。 醗酵温度は約20乃至約48℃が好ましく、32℃乃
至42℃の範囲が最もよい。醗酵媒質のPHは約5乃
至約10の範囲とすべきで約6乃至約8の範囲が好
ましい。普通3−7日内で最適生成が得られる。
タンク醗酵が行なわれる場合はブロス培養物を傾
斜又は土壌培養液又は有機体の凍結真空乾燥培養
物で接種して栄養ブロス中に成長性接種物を生成
するとよい。この様に活性接種物を得た後、醗酵
タンク媒質中にそれを無菌状態で移す。醗酵ブロ
ス中の抗生物質活性は嫌気性状態のもとでGAM
〔ギフ アネローベ(anerobe)媒質、ニツスイ〕
上試験菌としてバクテロイデス フラギリスを用
いてペーパーデイスク−寒天板分析によつて測定
出来る。最適ブロス能力が得られた後、出来れば
過助材を使つてブロスを過する。菌糸のケー
キを水洗し液と洗液を併せてPH約8に調節しジ
アイオン(Diaion)HP−20(三菱化学工業)又
はアンバーライト(Amberlite)XAD−2(ロー
ムアンドハース社)の様な非イオン性マクロ網状
(マクロ多孔性)重合体樹脂の管をとおす。この
樹脂管を水とメタノール水溶液(例えば40%メタ
ノール)で洗い次いで約95%メタノール溶液で溶
離する。活性分別部分を併せ真空濃縮し蒸発又は
凍結真空乾燥により粗Bu−2313複合物を得る。
かくして得た固体は上記のマクロ網状樹脂上のク
ロマトグラフ法および(又は)シリカゲルクロマ
トグラフ法によりその成分、Bu−2313Aおよび
Bu−2313Bに分離出来る。 ミクロポリスポラ シーシアE864−61のいく
つかの株醗酵の際グリシンを醗酵媒質に加えると
(例えば1%)Bu−2313Aの生成を抑えて主生成
物としてBu−2313Bが得られることが発見され
ている。 Bu−2313AとBu−2313Bの物理化学的性質 Bu−2313AとBu−2313Bは共に淡黄色結晶と
して分離される酸性物質である。これらは低級ア
ルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムおよび
ベンゼンの様な殆んどの有機溶媒に容易にとけ、
ヘキサンおよびアルカリ性水に僅かにとけるが、
水には実際上とけない。これらは酸性液中で安定
であるが、アルカリ性液中では安定性小さくN/
10NaOH液中室温で一夜放置すれば不活性とな
る。両成分とも塩化第2鉄と陽性反応をするがニ
ンヒドリン、アンスロン、サカグチとトレンの反
応においては陰性である。Bu−2313AとBu−
2313Bは次のとおり2TLC系によつて区別出来る 【表】 Bu−2313Aは116−118℃で溶融しまた光学活
性をもつ、〔α〕26 D=−58゜(C、0.5、MeOH)、そ
れは50%エタノール水溶液中5.2のpKa′を示し滴
定当量519をもちまたそのマススペクトルはm/
e517において分子イオンピークを与える。Bu−
2313Bは融点160−162℃で光学的活性を示す:
〔α〕25 D=−69.9゜(C0.3、MeOH)および−34.9゜
(C0.93、CHCl3)それは46%エタノール水溶液
中pKa′4.9で滴定当量509をもちまたマススペクト
ルはm/e503において分子イオンピークを与え
る。 種々の溶媒中のBu−2313AとBu−2313Bの紫
外線スペクトルはそれぞれ付図1および2に示し
ているがその最大吸収は次のとおりである。 【表】 衝液
N〓10HCl〓5%エタ 241(210)、359(656)、370(665)
ノール
Bu−2313AとBu−2313BのKBrペレツト中に
おける赤外線スペクトルはそれぞれ付図3と4に
示しているが1730、1660、1630、1580および1210
cm-1に認められる吸収バンド特性で互によく似て
いる。1500cm-1における鋭いバンドが成分Aに見
られるが、成分Bは成分Aにない3200−3400cm-1
においてN−H吸収特性を示す。Bu−2313Aと
Bu−2313BのCDCl3中のプロトンNMRスペクト
ルはそれぞれ付図5と6に示している。それらは
5C−メチル基、1メチルエステル基およびトラ
ンス ジエノイツク酸発色団の存在を示してい
る。成分AのNMRスペクトルはδ3.03ppmにおい
てN−メチル信号を示すが、これは成分Bにはな
い。分子イオンピークはBu−2313A(m/e517)
とBu−2313B(m/e503)の両方のマス分光学に
よつて認められた。主断片イオンピークはm/
e221(成分Bの基本ピーク)、m/e235(成分Aの
基本ピーク)およびm/e283(両成分AとBの強
度ピーク)におけるマススペクトルに見られる。 Bu−2313AとBu−2313Bは酸性物質でそれら
およびそれらの混合物は塩基と塩類を生成する。
本明細書で用いる“無毒の製薬上許容される塩”
とは金属陽イオン、例えばナトリウム、カリウ
ム、およびマグネシウムの様なアルカリ金属又は
アルカリ土金属陽イオンとの塩類を含むものとす
る。 Bu−2313AとBu−2313Bの生物学的特性抗菌性
スペクトル Bu−2313AとBu−2313Bの最小抑制濃度は
種々の好気性および嫌気性細胞に対する多数接種
用装置を用い連続2倍寒天希釈法によつて測定し
た。栄養寒天媒質(エイケン)は一般に好気性細
菌に用い、ゴノコツカス(GC)媒質(エイケン)
は連鎖状球菌、ネイセリアおよびヘモフイラス種
の様なむづかしい好気性細菌に用いまたGAM寒
天媒質(ニツスイ)は嫌気性細菌に用いた。 Bu−2313AとBu−2313Bの種々の好気性およ
び嫌気性細菌に対する試験管内活性は関聯化合物
として使われるチランダマイシンおよびクリンダ
マイシンのそれと共にそれぞれ表6および7に示
している。Bu−2313AとBu−2313Bは低濃度に
おいて種々の嫌気性細菌の成長を抑制したが、
S.アウレウス、E.コリおよびK.ニユーモニ
イの様な普通の好気性細菌の多くに対しては中位
から弱い活性を示した。しかしバチルス種、連鎖
状球菌、ネイセリア メニンギチジイス、N.ゴ
ノルヘーイおよびヘモフイラス インフルエンジ
イの種はBu−2313AおよびBu−2313Bに敏感で
あつた。一般にBu−2313AおよびBu−2313Bの
活性および抗菌性スペクトルはチランダマイシン
のそれと非常に似ておりBu−2313Bの本質的試
験管活性はBu−2313Aの活性より幾分高い様で
ある。 接種菌量の影響 2嫌気性細菌(B.フラギリスとC.パーフリ
ンゲンス)についてGAM培地および寒天媒質を
用いて接種菌量のMICに対する影響をしらべた。
表8に示すとおり、ブロス稀釈法で検べた処Bu
−2313AとBu−2313BのMICは接種菌量に非常に
影響された。 殺菌性活性 Bu−2313AとBu−2313Bの殺菌力を嫌気性細
菌2株および好気性細菌1株について検べた。
MIC測定後の濁りのない各管からのブロス試料
0.1ml寒天平板につけて生活力ある細胞数をしら
べた。GAM寒天板をB.フラギリスおよびC.
パーフリンゲンスの生活力細胞数を数えるに用い
また5%馬血清を含む栄養寒天をS.パイオジエ
ネス用に用い、平板は37℃で18時間培養した。集
落成長が平板当り100以下の抗生物質濃度を殺菌
性があるとした。(元の接種菌量105−106細胞/
ml)表9に示すとおり、Bu−2313AとBu−
2313Bの殺菌作用は殺菌性よりもむしろ細菌静止
的であると思われる。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 はつかねずみ血液濃度 Bu−2313(Na塩)、クリンダマイシンおよびフ
ラギル(Flagyl)を段階的薬量(100、50、25お
よび12.5mg/Kg)で皮下又は経口投与した後のね
ずみの血液濃度を測定した。血液試料を眼窩静脈
洞から採取し試験菌体としてB.フラギリス
A20926を用いペーパーデイスク−寒天板法によ
つて分析した。結果を表10に示す。Bu−2313B
を用いて得た最大血液濃度は非経口および経口投
与いづれもクリンダマイシンのそれより約3−4
倍高かつたが、フラギルはBu−2313Bよりよい
吸収を示した。 【表】 生体内活性 Bu−2313AとBu−2313Bの生体内効果をB.
フラギリス A20926(部分的)、C.パーフリン
ゲンスA9635およびS.パイオゲネスA20201(全
身的)に感染したはつかねずみで試験した。 はつかねずみの首背面に細胞2−5×106と微
結晶性セルロース10mgを含む細菌懸濁液0.5mlを
皮下注射してB.フラギリスの部分的感染をさせ
た。注射30分後に初めて5日間毎日1回皮下又は
経口投与して治療を行なつた。ねずみ5匹の群を
各薬量に対して用い動物は6日目に解剖切開して
皮下膿瘍の大きさを測定した。各動物の応答を傷
の大きさによつて0−5に採点し点数の合計を群
中のねずみ数で除して各治療群と対照群の平均点
を得た。対照群の平均点を感染度100%ととり各
治療群の相対感染度を計算しまたPD50値をロツ
グ プロビツト プロツト(log−probit plot)
によつて推定した。Bu−2313Bを用いて得た結
果をクリンダマイシンおよびフラギルの結果と共
に表11に示している。この感染試験ではクリンダ
ーマイシンはBu−2313A又はフラギルより活性
であつた。 豚胃ムチンの5%懸濁液(アメリカンラボラト
リーズ)中の病原体の致命的量をねずみの腹腔内
に投与して全身的にC.パーフリンゲンス又は
S.パイオゲネスに感染させた。細菌を投与する
直前に抗生物質を皮下又は経口投与した。5日後
にPD50を測定した。表12でわかるとおりBu−
2313Bは皮下および経口投与いづれによつても全
身的伝染に対してかなりよい防禦を示したが、
Bu−2313Aの経口投与は不活性であつた。クリ
ンダマイシンはこの生体実験において最も活性で
あつた。 【表】 【表】 ン
クリンダマイシ 0.08 0.22 0.3 21
ン
フラギル 31 60 NT NT
NA=活性なし
NT=試験せず
急性毒性 Bu−2313AおよびBの急性LD50を皮下、腹腔
内および経口投与によつて検べた。Bu−2313の
遊離酸およびナトリウム塩型の両方について試験
し結果を表13に示している。Bu−2313BはBu−
2313Aより著しく低い毒性を示したが、これは2
成分の間の僅かな構造差から考えて(N−メチル
基の有無)興味あることである。 【表】 本発明の1形態は式: (式中RはH又はCH3を表わす。) で示される抗生物質化合物又はその混合物又はそ
の製薬上許容される無毒塩(ナトリウム塩が好ま
しい)に関する。 本発明の他の形態はBu−2313Aと呼ぶ抗生物
質化合物又はその製薬上許容される無毒塩(成る
可くナトリウム塩)に関する。その化合物は低級
アルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムおよ
びベンゼンに溶解し、ヘキサンおよびアルカリ性
水には僅かにとけるが水には実際上不溶の酸性物
質であり、それは塩化第2鉄とは陽性反応をする
がニンヒドリン、アンスロン、サカグチおよびト
レンの試薬とは陰性反応をし、その精製形は約
116−118℃で溶融し、光学的活性で〔α〕26 D=約
−58゜(C0.5、メタノール)であり、50%エタノ
ール水溶液中約5.2のpKa′を示し滴定当量519をも
ち、そのマススペクトルにおいてm/e517に分子
イオンピークをもち、実験式C27H35NO9をもち
かつその紫外線、赤外線および核磁気共鳴スペク
トルがそれぞれ実質的に付図1,3および5に示
す様なものである化合物である。 本発明の他の形態はBu−2313Bと呼ぶ抗生物
質化合物又はその製薬上許容される無毒塩(成る
可くはナトリウム塩)に関する。その化合物は低
級アルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムお
よびベンゼンに溶解し、ヘキサンおよびアルカリ
性水には僅かにとけるが水には実際上不溶である
酸性物質であり、それは塩化第2鉄と陽性反応を
するがニンヒドリン、アンスロン、サカグチおよ
びトレンの試薬とは陰性反応をし、その精製形は
約160乃至162℃で溶融し、光学的活性で〔α〕25 D
=約−69.9゜(C0.3、メタノール)および−34.9゜
(C0.93、CHCl3)をもち、46%エタノール水溶
液中約4.9のpKa′を示し滴定量509をもち、そのマ
ススペクトルにおいてm/e503に分子イオンピー
クをもち、実験式C26H33NO9をもちかつその紫
外線、赤外線および核磁気共鳴スペクトルがそれ
ぞれ実質的に付図2,4および6に示す様なもの
である化合物である。 本発明の他の形態はA.T.C.C.31295、31296、
31297又は31298の同定特性をもつミクロポリスポ
ラ シーシアの株を炭素と窒素の同化性源を含む
水性培養媒質中で浸水好気性条件のもとで培養し
上記微生物により上記培養媒質中に実質的量の抗
生物質混合物を生成することにより成る抗生物質
Bu−2313AとBu−2313Bの混合物製造用微生物
学的方法に関する。好ましい実施態様ではこの方
法は更に培養媒質から抗生物質混合物を回収する
工程を含む。より好ましい実施態様の微生物はミ
クロポリスポラ シーシアA.T.C.C.31298であ
る。 本発明の他の形態は抗生物質Bu−2313Bの製
造用微生物学的方法に関するもので、その方法は
(a)A.T.C.C.31295、31296、31297又は31298の同
定特性をもつミクロポリスポラ シーシアの株を
炭素と窒素の同化性源を含む水性培養媒質中で浸
水好気性条件のもとで培養して上記培養媒質中で
上記微生物により実質的量の抗生物質混合物を生
成し、(b)工程(a)で生成した抗生物質混合物を回収
しかつ(c)マクロ網状重合体樹脂上のクロマトグラ
フ法により上記抗生物質混合物からBu−2313B
を分離することより成るのである。好ましい実施
態様における微生物はミクロポリスポラ シーシ
アA.T.C.C.31298である。 本発明の他の形態は抗生物質Bu−2313A製造
用微生物学的方法に関するもので、その方法は(a)
A.T.C.C.31295、31296、31297又は31298の同定
特性をもつミクロポリスポラ シーシアの株を炭
素と窒素の同化性源を含む水性培養媒質中で浸水
好気性条件のもとで培養して上記培養媒質中に上
記微生物により実質的量の抗生物質混合物を生成
し、(b)工程(a)で生成した抗生物質混合物を培養媒
質から回収し、(c)上記抗生物質混合物からマクロ
網状重合体樹脂上のクロマトグラフ法によりBu
−2313Bの大部分を分離しかつ(d)Bu−2313Aをシ
リカゲル上クロマトグラフ法により残留Bu−
2313Bから分離することより成るのである。好ま
しい実施態様における微生物はミクロポリスポラ
シーシアA.T.C.C.31298である。 本発明の抗生物質化合物にはBu−2313複合物、
その成分Bu−2313AおよびBu−2313Bおよびそ
の塩類および混合物がある。本発明はその範囲内
に上記抗生物質の少なくも1種と適当な製薬上許
容される担体を含む調剤組成物を包含する。組成
物は必要な投与法に適した調剤形に形成出来る。
この組成物の例は錠剤、カプセル、ピル、粉末お
よび小粒の様な経口投与用固体組成物、溶液懸濁
液、シロツプおよびエリキシール剤の様な経口投
与用液体組成物および無菌溶液、懸濁液又は乳化
液の様な非経口投与用処方がある。 他の抗生物質と同様にBu−2313AおよびBの
服用量は患者の体重、年令および一般健康状態お
よび病気の性質によるもので医師の判断範囲内で
ある。一般に経口薬量はBu−2313A又はBu−
2313B(又はそれらの混合物)50−750mgの範囲内
で1日3−4回与える。 本発明を次の実施例によつて例証するが、それ
によつて本発明を限定するものではない。 実施例 1 種培養物の製造および小規模シエークフラスコ
醗酵 グルコース3%、大豆粉1%、コーンステイー
プ液1%およびCaCO30.5%を含む500mlエルレン
マイヤーフラスコ中の生長性液体媒質100mlを接
種するにBu−2313生成性微生物、株E864−61No.
Y−29のよく成長した寒天傾斜培養物を用いた。
媒質PHを殺菌前7.0に調整した。種培養物を回転
振とう機上(250rpm)34℃で3日培養し培養液
2−3mlをしよ糖3%、リンシードミール3%
(NH4)2SO40.3%、ZnSO4・7H2O0.003%および
CaCO30.5%より成る醗酵媒質100mlを入れた500
mlエルレンマイヤーフラスコに移した。28℃で4
−7日振とう後抗生物質生成は最高に達した。醗
酵の進行と共にブロスPHは段々と高くなり抗生物
質効力150mcg/mlとなつた時PHは8.1−8.8に達し
た。抗生物質の醗酵ブロス内活性は試験菌体とし
て嫌気性条件でGAM寒天板上で生長したバクテ
ロイデス フラギリスを用いてペーパージスク寒
天板法によつて測定した。 実施例 2 大規模タンク醗酵 株E864−61No.Y−29のよく成長した寒天傾斜
培養から製造した種培養液110を2500タンク
中のグルコース3%、大豆粉3%、コーンステイ
ープ液1%およびCaCO30.5%を含む醗酵媒質
1500に接種した。醗酵は31℃で200rpm撹拌、
空気吹込速度1000/分で行なつた。72時間後醗
酵ブロスPH8.2となり抗生物質培養力価265mcg/
mlとなつた。 実施例 3 分離および精製 醗酵ブロス(1500、分析200mcg/ml)を
過助材を用いて過し菌糸ケーキを水洗した。
液と洗液を併せPH8.3としマクロ網状樹脂(ジア
イオン、、HP−20、100)管に入れた。管を水
400と次いで40%メタノール水溶液40で洗い
95%メタノール水溶液400で展開した。活性分
別部分を併せ真空濃縮して水性濃厚液とした。上
に得た湿菌糸ケーキ360Kgをメタノール300に懸
濁させ撹拌抽出した。これを2回反復し併せたメ
タノール抽出液700を真空濃縮した。HP−20
溶離液から得た2水性濃縮液と菌糸ケーキ抽出液
を併せ更に真空濃縮して70とし濃厚液中の活性
物を酢酸エチルで2回(2×35)抽出した。抽
出液を真空濃縮乾固して油状固体(1.03Kg、
220mcg/mg)を得た。これを酢酸エチルとメタ
ノール(20:1、2.2)の混合物にとかし活性
炭管(5容量)にとおした。管を同じ溶媒混合
物で展開し活性溶離液を併せ真空濃縮して暗褐色
固体を得て、それを熱メタノールから晶出させて
黄褐色結晶性粉末を得た。(279g、650mcg/mg) かく得た結晶性物質は成分AとBの混合物でそ
の分離はジジアイオンHP−20クロマトグラフ法
によつて行なつた。混合物の一部100gを90%メ
タノール水溶液にとかし液をHP−20樹脂管(5
)に入れた。管を80%メタノール水溶液で展開
し2活性分別部分を得た。第1活性分別部分24
の濃縮液から淡黄色針状結晶Bu−2313B45gを
得た。それをメタノールから2回再結晶させて分
析的純物質32gを得た。第2活性溶離液23を真
空濃縮して成分AとBの混合物20gを得てそれを
シリカゲル管クロマトグラフ法によりクロロホル
ムで展開して分離した。速く動く分別部分から得
て再晶出させて成分Aの純結晶4gを得た。更に
成分B7.5gは後部溶離液から回収した。 純結晶生成物の分析結果次のとおり: Bu−2313A−C27H35NO9に対する分析: 計算値:C、62.65;H、6.82;N、2.71; O、27.82 測定値:C、62.57;H、6.64;N、2.60; O、28.20(差から) Bu−2313B−C26H33NO9に対する分析: 計算値:C、62.03;H、6.56;N、2.78;
O、28.63 測定値:C、61.77;H、6.80;N、2.65;
O、28.78(差から) 実施例 4 Bu−2313Bのブロモベンゼン溶媒和物の製造 Bu−2313B100mgを熱ブロモベンゼン4mlにと
かしそれに石油エーテルを僅かに液がにごり初め
る迄滴加した。この液を室温で一夜放置して結晶
を完了させた。 Bu−2313Bのブロモベンゼン溶媒和物が黄色
針状結晶として得られた(80mg)〔α〕21 D=−51.2゜
(C0.88、メタノール)。λnax(エタノール中):
225、295(sh)、352および369nm。 NMRスペクトルδ7.1ppm(5H)(ブロモベンゼン
に対し)分析:C32H40NO10Br(C26H33NO9・
C6H5Br・H2O)に対して計算値:C、56.64;
H、5.90;N、2.06;Br、11.80;O、23.60:測
定値:C、56.87;H、5.84;N、2.19;Br、
12.10;O、23.00(差から) 実施例 5 Bu−2313Bのナトリウム塩製造 塩化メチレン10ml中にBu−2313B200mgを含む
液に水30mlを加えた。この液を撹拌しながらこれ
に1N NaOHを滴加してPH11.5とした。30分間撹
拌後溶媒層を分離し水層をn−ブタノール30mlづ
つで2回抽出した。抽出液を併せ真空濃縮し得た
固体を少量のアセトンにとかしn−ヘキサンを加
えて沈澱させてBu−2313Bナトリウム塩176mgを
得た。この物質の一部45mgをベンゼン−メタノー
ル混合液から晶出させて淡黄色結晶36mgを得た。
融点236−241℃(分解)〔α〕23 D=−7.4(C0.94、
メタノール)C26H32NO9Na・H2Oに対する分析
計算値:C、57.46;H、6.26;N、2.58;
Na4.24;O、29.46;測定値:C、57.57;H、
6.29;N、2.39;Na、4.21;O、29.54(差から)。 実施例 6 Bu−2313Aナトリウム塩製造 実施例5において用いたBu−2313Bの代りに
等量のBu−2313Aを用い実施例5の一般法を反
復してBu−2313Aのナトリウム塩を生成した。
付図1は本発明のBu−2313Aのエタノール中
(図中−線)N/10NaOH−5%エタノール中
(図中………線)、PH7.0りん酸塩緩衝液中(図中
―‐‐―線)、N/10HCl−5%エタノール中(図
中―‐‐―線)、における紫外線線吸収スペクトル
図で縦軸にE1% 1cmをとり横軸に波長(nm)をと
つている。付図2は本発明のBu−2313Bのエタ
ノール中(図中−線)、N/10NaOH−5%エタ
ノール中(図中………線)、PH7.0りん酸塩緩衝液
中(図中―‐‐―線)、N/10HCl−5%エタノー
ル中(図中―‐‐―線)における紫外吸収スペク
トル図で縦軸にE1% 1cmをとり横軸に波長(nm)
をとつている。付図3は本発明のBu−2313Aの
臭化カリウム中にペレツトとした時の赤外線吸収
スペクトル図で縦軸に透過率%をとり横軸に波長
(ミクロン)および波数(cm-1)をとつている。
付図4は本発明のBu−2313Bの臭化カリウム中
にペレツトとした時の赤外線吸収スペクトル図で
縦軸に透過率1%をとり横軸に波長(ミクロン)
および波数(cm-1)をとつている。付図5は本発
明のBu−2313AのCDCl3中のNMRスペクトル
(60MHz)図で横軸にδppmをとつている。付図6
は本発明のBu−2313BのCDCl3中のNMRスペク
トル(60MHz)図で横軸にδppmをとつている。
(図中−線)N/10NaOH−5%エタノール中
(図中………線)、PH7.0りん酸塩緩衝液中(図中
―‐‐―線)、N/10HCl−5%エタノール中(図
中―‐‐―線)、における紫外線線吸収スペクトル
図で縦軸にE1% 1cmをとり横軸に波長(nm)をと
つている。付図2は本発明のBu−2313Bのエタ
ノール中(図中−線)、N/10NaOH−5%エタ
ノール中(図中………線)、PH7.0りん酸塩緩衝液
中(図中―‐‐―線)、N/10HCl−5%エタノー
ル中(図中―‐‐―線)における紫外吸収スペク
トル図で縦軸にE1% 1cmをとり横軸に波長(nm)
をとつている。付図3は本発明のBu−2313Aの
臭化カリウム中にペレツトとした時の赤外線吸収
スペクトル図で縦軸に透過率%をとり横軸に波長
(ミクロン)および波数(cm-1)をとつている。
付図4は本発明のBu−2313Bの臭化カリウム中
にペレツトとした時の赤外線吸収スペクトル図で
縦軸に透過率1%をとり横軸に波長(ミクロン)
および波数(cm-1)をとつている。付図5は本発
明のBu−2313AのCDCl3中のNMRスペクトル
(60MHz)図で横軸にδppmをとつている。付図6
は本発明のBu−2313BのCDCl3中のNMRスペク
トル(60MHz)図で横軸にδppmをとつている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 式: (式中RはH又はCH3を表わす)で示されること
を特徴とする抗生物質化合物又はその混合物又は
その製薬上許容される無毒塩。 2 RがHである特許請求の範囲第1項記載の化
合物。 3 特許請求の範囲第2項に記載の化合物のナト
リウム塩。 4 RがCH3である特許請求の範囲第1項記載の
化合物。 5 特許請求の範囲第4項に記載の化合物のナト
リウム塩。 6 ミクロポリスポラ属に属する抗生物質Bu−
2313A及びBu−2313B生産菌を培養し、培養媒質
から抗生物質Bu−2313A即ち式 で示される化合物及び抗生物質Bu−2313B即ち
式 で示される化合物を回収することを特徴とする式 (但しRはCH3又はHを示す)で示される抗生物
質化合物の製造法。 7 微生物がA.T.C.C.31925、31926、31927又は
31928の同定特性をもつミクロポリスポラ シー
シアである特許請求の範囲第6項記載の方法。 8 微生物がミクロポリスポラ シーシアA.T.
C.C.31928である特許請求の範囲第7項記載の方
法。 9 培養媒質から直接回収した抗生物質混合物か
らのBu−2313Bの分離をマクロ網状重合体樹脂
クロマトグラフ法によつて行う特許請求の範囲第
6項記載の方法。 10 培養媒質から直接回収した抗生物質混合物
からのBu−2313AとBu−2313Bの分離をマクロ
網状重合体樹脂上クロマトグラフ法によつてBu
−2313Bの大部分を分離し次いで残留Bu−2313B
からシリカゲル上クロマトグラフ法によつてBu
−2313Aを分離する特許請求の範囲第6項記載の
方法。 11 微生物の培養をPH5.0乃至10.0および温度
20乃至48℃の浸水好気性条件のもとで行う特許請
求の範囲第6項〜第10項のいずれか1項に記載
の方法。 12 培養をPH6.0乃至8.0で温度32乃至42℃にお
いて行う特許請求の範囲第11項記載の方法。 13 培養媒質が炭素と窒素の同化性源を含む水
性培養媒質からなる特許請求の範囲第6項〜第1
2項記載の方法。 14 培養媒質が更にグリシンを含む特許請求の
範囲第13項記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US81532977A | 1977-07-13 | 1977-07-13 | |
US05/841,242 US4169096A (en) | 1977-07-13 | 1977-10-11 | Antibiotic compounds |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5444699A JPS5444699A (en) | 1979-04-09 |
JPS6317834B2 true JPS6317834B2 (ja) | 1988-04-15 |
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---|---|---|---|
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JP (1) | JPS5444699A (ja) |
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CH (1) | CH639384A5 (ja) |
DE (1) | DE2830856A1 (ja) |
ES (1) | ES471709A1 (ja) |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH0440125U (ja) * | 1990-08-03 | 1992-04-06 |
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CA3152541A1 (en) * | 2019-08-27 | 2021-03-04 | SeLux Diagnostics, Inc. | Systems and methods for performing antimicrobial susceptibility testing |
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- 1977-10-11 US US05/841,242 patent/US4169096A/en not_active Expired - Lifetime
-
1978
- 1978-07-12 FR FR7820849A patent/FR2397416B1/fr not_active Expired
- 1978-07-13 DE DE19782830856 patent/DE2830856A1/de not_active Ceased
- 1978-07-13 ES ES471709A patent/ES471709A1/es not_active Expired
- 1978-07-13 CH CH763478A patent/CH639384A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-07-13 NL NL7807570A patent/NL7807570A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-07-13 JP JP8461278A patent/JPS5444699A/ja active Granted
- 1978-07-13 CA CA307,307A patent/CA1111792A/en not_active Expired
- 1978-07-13 GB GB7829691A patent/GB2003465B/en not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0440125U (ja) * | 1990-08-03 | 1992-04-06 |
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Publication number | Publication date |
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NL7807570A (nl) | 1979-01-16 |
FR2397416A1 (ja) | 1979-02-09 |
ES471709A1 (es) | 1979-10-01 |
CA1111792A (en) | 1981-11-03 |
FR2397416B1 (ja) | 1980-10-24 |
GB2003465B (en) | 1982-04-21 |
US4169096A (en) | 1979-09-25 |
CH639384A5 (de) | 1983-11-15 |
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DE2830856A1 (de) | 1979-02-01 |
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