JPS6317834B2

JPS6317834B2 -

Info

Publication number: JPS6317834B2
Application number: JP53084612A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kawaguchi; Hiroshi Tsukiura; Koji Tomita
Original assignee: BURISUTORU MAIYAAZU KENKYUSHO KK
Current assignee: BURISUTORU MAIYAAZU KENKYUSHO KK
Priority date: 1977-07-13
Filing date: 1978-07-13
Publication date: 1988-04-15
Also published as: JPS5444699A; NL7807570A; FR2397416A1; ES471709A1; CA1111792A; FR2397416B1; GB2003465B; US4169096A; CH639384A5; GB2003465A; DE2830856A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規の抗生物質化合物に関する。特に
本発明はA.T.C.C.No.31295、31296、31297又は
31298の同定特性をもつミクロポリスポラシー
シア株を水性媒質中で浸水好気性条件のもとで培
養して実質的量のBu−2313とよぶ抗生物質複合
物を生成しかつ任意に培養媒質からBu−2313を
回収することによつて生成される上記Bu−2313
とよぶ抗生物質複合物に関する。本発明はまたBu−2313複合物からクロマトグ
ラフ法により回収されるBu−2313AおよびBu−
2313AとよぶBu−2313の新規の２抗生物質成分
を提供するものである。Bu−2313およびその生
物活性成分Bu−2313AとBu−2313Bは種々の嫌
気性細菌およびある種の好気性細菌に対し抗菌活
性を示す。Bu−2313AおよびBu−2313Bは人を
含む動物の伝染病、特に嫌気性細菌によつて起る
病気の治療に価値がある。 Bu−2313およびその成分、Bu−2313AとBu−
2313Bはミクロポリスポラシーシアの新しい色
素生成性亜種の醗酵によつて生成出来る。Bu−
2313AとBu−2313Bの構造は次のとおりである。但し Bu−2313AのＲ＝CH₃ Bu−2313BのＲ＝Ｈ従つて本発明における抗生物質化合物の製造法
は広義には、ミクロポリスポラ属に属する抗生物
質Bu−2313A及びBu−2313B生産菌を培養し、
培養媒質から抗生物質Bu−2313A及びBu−
2313Bを回収することからなる。微生物抗嫌気性抗生物質の探索過程において寡少胞子
性アクチノマイセテ株No.E864−61はインドラ
ジヤスタン地方で採集した土壌試料から分離され
た。それは牛肉抽出液−ペプトン−無機塩類媒質
にジヒドロオキシメチルフラトリジン2mcg／ml
とニスタチン40mcg／mlを補給した寒天板上42℃
で分離された。株E864−61は主として種々の嫌
気性細菌に対して活性をもつ新抗生物質複合物
Bu−2313を生成すると発見されたのである。形態学株E864−61は気生菌糸および基底菌糸上に芽
胞を生成する。多くの芽胞は直接菌糸上又は短か
い芽胞柄上のいづれかに一つつく。一対の芽胞お
よび２乃至８芽胞鎖も時々見られる。気生菌糸の
色は白で、あとでにぶい青味がかつた緑又は淡い
灰色がかつた緑に変り多くの芽胞を形成する。２
種の色素、紫と暗緑色色素が寒天媒質中に生成さ
れる。芽胞は球から長楕円体の形をし大きさは
0.5−0.7×0.5−1.2μであり滑らかな表面をもつ。
気生菌糸は時として数回から10回撚れており真直
ぐな芽胞鎖の様に見える。基底菌糸の分裂は一般
に認められないが、気生菌糸のない変異株は長期
培養後分裂した細胞を生ずる。親株（Ｓ−２）は
自然変異株を生じ易くそれは緑色芽胞集合体、気
生菌糸および紫又は緑色色素を生成する能力にお
いて異なる元の株およびいくつかの変異株の性質
を次の表１に示す。【表】元の株から単芽胞分離法により生成された変異
株Ｙ−29は高い生成性株として選択された。アク
チノマイセテE864−61株Ｓ−２、Ｓ−26、Ｓ−
７、およびＹ−29の培養物はコロンビア特別地区
ワシントン市のアメリカ型培養コレクシヨン
（The American Type Culture Collection）に
委託されそれぞれA.T.C.C.No.31295、31297、
31296および31298としてその微生物永久コレクシ
ヨンに加えられているものである。また該微生物
類は昭和53年７月４日に工業技術院微生物工業技
術研究所に委託された。（微工研寄番号第4559号、
第4561号、第4560号および第4562号）細胞壁組成物株E864−61は診断的細胞壁組成分としてメゾ
−DAP、ガラクトースおよびラムノースを含ん
でいる。細胞壁組成は表２に示している。表２細胞壁のアミノ酸および炭水化物組成アミノ酸株E864−61 メゾ−DAP ＋＋＋ LL−DAP − グリシン − グルタミン酸＋＋＋アラニン＋＋＋炭水化物アラビノース − ガラクトース＋＋＋ラムノース＋マンノース痕跡培養特性株E864−61は酵母抽出液−麦芽抽出液寒天お
よびベネツトの寒天の様な栄養豊富媒質上で極め
てよく成長するが澱粉−無機質塩寒天、グルコー
ス−アスパラギン寒天、チロシン寒天およびグル
コース−アンモニウム塩類寒天の様な化学に規定
された媒質上の成長は小さい。ザペツク
（Czapek）の寒天上は成長しない。 E864−61の元の株（Ｓ−２）は豊富な芽胞と
気生菌糸を生成する。それは２種の色素：酵母抽
出液−麦芽抽出液寒天、ペプトン−酵母抽出液−
鉄寒天およびグルコース−アンモニウム塩類寒天
上で赤味がかつた紫から赤味がかつた褐色の色素
とオートミール寒天、チロシン寒天およびベネツ
ト寒天上の暗緑色色素を生成する。変体Ｓ−26は
よく芽胞を形成しまた気生菌糸を生成するが色素
形成能力がない。変体Ｓ−７は白色気生菌糸を生
成するが緑色芽胞集合体がない。また赤味がかつ
た紫色素を豊かに生成するが緑色色素は生成しな
い。変異体Ｙ−29は芽胞集合体および気生菌糸の
形成能力がないので細菌の様な外観をもつ。それ
は緑色色素のみを生成するが移植によつてこの性
質を容易に失なう。元の株および自然変異株の培
養特性は表３に示している。【表】
ンク
生理学的特性株E864−61は好気性の好中温性（mesophilic）
なアクチノマイセテである。この株の最適成長温
度は32乃至42℃で、20乃至48℃で適度の成長が得
られる。55℃では成長は見られない。元株および
変異株の生理学的反応および炭水化物利用度はそ
れぞれ表４と５に示している。【表】で無成長
【表】ス
【表】【表】分類学株E864−61の形態学的特性と細胞壁組成から
この微生物はバージイのManual of
Determinative Bacteriology.8版、1975に記載さ
れているミクロモノスポレイシイ科クラシルニコ
フ1938に分類されるべきである。ミクロモノスポ
レイシイの属と比較した場合株E864−61はその
気生菌糸形成およびアラビノースの代りにラムノ
ースがあるが型の細胞壁組成においてミクロモ
ノスポレイシイ属と違つている。それはまたサー
モアクチノマイセス、アクチノビフイダ、サーモ
モノスポラ、ミクロバイスポラおよびミクロテト
ラスポラ属と芽胞形態および細胞壁型（上記属は
型）において異なる。株E864−61は細胞壁型、
芽胞形態および芽胞形成様式においてミクロポリ
スポラ属に最も似ている。ミクロポリスポラ属の
もとに８種が記載されており鎖中の芽胞数におい
て各種の間にかなりの多様性がが見られる。ミク
ロポリスポラシーシアは１乃至５芽胞と３種は
鎖中５乃至20芽胞をもつと報告されている。株
E864−61はそれが殆んど単一芽胞と時に３−８
芽胞の鎖を形成する点でミクロポリスポラシー
シアに似ている。更にこの株はその気生菌糸の
色、成長温度範囲および細胞壁型においてＭ．シ
ーシアと似ているが、２種の拡散性色素生成にお
いてＭ．シーシアと違つている。故に株E864−
61はミクロポリスポラシーシアの新色素生成性
亜種であると思われる。株E864−61は自然に又は人工的に容易に突然
変異するので、本発明は元の株Ｓ−２又は変体Ｓ
−26、Ｓ−７又はＹ−29に限定されないのであ
る。明確にいえばそれはＸ線放射、紫外線照射、
窒素マスタード処理、、フエイジ（phage）露出
等の様な方法によつて上記微生物から生成出来る
すべてのBu−2313を生成する自然および人工的
突然変異株および変異株を含むものと考える。他
の抗生物質と同様に、Bu−2313の高い生成は単
一集落選択後高生産性株の選択によつて、種々の
突然変異誘発剤による処理により又は遺伝子組換
え、形質の転換又は導入の遺伝的方法によつて出
来ると予想される。抗生物質の製造抗生物質複合物Bu−2313は水性栄養媒質中浸
水好気性条件のもとでミクロポリスポラシーシ
アE864−61（および出来ればA.T.C.C.No.31295、
31296、31297又は31298）の株の培養によつて生
成される。他の放射菌属の培養に使われる一般法
がミクロポリスポラシーシアE864−61の培養
に応用出来る。栄養媒質はグリセロース、グルコ
ース、フルクトース、マンノース、澱粉、デキス
トリン、麦芽糖、糖密、油類、脂肪類等の様な同
化性炭素源の１又は２以上を精製状態又は粗状態
のいづれかで含んでいる必要がある。栄養媒質は
また例えば大豆粉、魚粉、麦芽抽出液、ペプト
ン、酵母抽出液、デイスチラーズソルブルズ、グ
ルテンミール、コーンステイープ液、棉実粉、カ
ゼイン、加水分解した蛋白質物質、硝酸塩類、ア
ンモニア塩類、尿素等の様な同化性窒素源の１又
は２以上を含んでいる必要がある。塩化ナトリウ
ム、りん酸カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カ
ルシウムの様な栄養無機塩類および少量の重金属
塩類、例えば銅、亜鉛、マンガン、鉄等の塩類、
も媒質に加えてもよい。空気吹込み浸水培養にお
いて液体パラフイン、大豆油、脂肪又はシリコー
ンの様な泡防止剤も利用出来る。醗酵温度は約20乃至約48℃が好ましく、32℃乃
至42℃の範囲が最もよい。醗酵媒質のPHは約５乃
至約10の範囲とすべきで約６乃至約８の範囲が好
ましい。普通３−７日内で最適生成が得られる。
タンク醗酵が行なわれる場合はブロス培養物を傾
斜又は土壌培養液又は有機体の凍結真空乾燥培養
物で接種して栄養ブロス中に成長性接種物を生成
するとよい。この様に活性接種物を得た後、醗酵
タンク媒質中にそれを無菌状態で移す。醗酵ブロ
ス中の抗生物質活性は嫌気性状態のもとでGAM
〔ギフアネローベ（anerobe）媒質、ニツスイ〕
上試験菌としてバクテロイデスフラギリスを用
いてペーパーデイスク−寒天板分析によつて測定
出来る。最適ブロス能力が得られた後、出来れば
過助材を使つてブロスを過する。菌糸のケー
キを水洗し液と洗液を併せてPH約８に調節しジ
アイオン（Diaion）HP−20（三菱化学工業）又
はアンバーライト（Amberlite）XAD−２（ロー
ムアンドハース社）の様な非イオン性マクロ網状
（マクロ多孔性）重合体樹脂の管をとおす。この
樹脂管を水とメタノール水溶液（例えば40％メタ
ノール）で洗い次いで約95％メタノール溶液で溶
離する。活性分別部分を併せ真空濃縮し蒸発又は
凍結真空乾燥により粗Bu−2313複合物を得る。
かくして得た固体は上記のマクロ網状樹脂上のク
ロマトグラフ法および（又は）シリカゲルクロマ
トグラフ法によりその成分、Bu−2313Aおよび
Bu−2313Bに分離出来る。ミクロポリスポラシーシアE864−61のいく
つかの株醗酵の際グリシンを醗酵媒質に加えると
（例えば１％）Bu−2313Aの生成を抑えて主生成
物としてBu−2313Bが得られることが発見され
ている。 Bu−2313AとBu−2313Bの物理化学的性質 Bu−2313AとBu−2313Bは共に淡黄色結晶と
して分離される酸性物質である。これらは低級ア
ルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムおよび
ベンゼンの様な殆んどの有機溶媒に容易にとけ、
ヘキサンおよびアルカリ性水に僅かにとけるが、
水には実際上とけない。これらは酸性液中で安定
であるが、アルカリ性液中では安定性小さくＮ／
10NaOH液中室温で一夜放置すれば不活性とな
る。両成分とも塩化第２鉄と陽性反応をするがニ
ンヒドリン、アンスロン、サカグチとトレンの反
応においては陰性である。Bu−2313AとBu−
2313Bは次のとおり2TLC系によつて区別出来る【表】 Bu−2313Aは116−118℃で溶融しまた光学活
性をもつ、〔α〕²⁶ _D＝−58゜（Ｃ、0.5、MeOH）、そ
れは50％エタノール水溶液中5.2のpKa′を示し滴
定当量519をもちまたそのマススペクトルはｍ／
e517において分子イオンピークを与える。Bu−
2313Bは融点160−162℃で光学的活性を示す：
〔α〕²⁵ _D＝−69.9゜（Ｃ0.3、MeOH）および−34.9゜
（Ｃ0.93、CHCl₃）それは46％エタノール水溶液
中pKa′4.9で滴定当量509をもちまたマススペクト
ルはｍ／e503において分子イオンピークを与え
る。種々の溶媒中のBu−2313AとBu−2313Bの紫
外線スペクトルはそれぞれ付図１および２に示し
ているがその最大吸収は次のとおりである。【表】衝液
N〓10HCl〓５％エタ 241(210)、359(656)、370(665)
ノール
Bu−2313AとBu−2313BのKBrペレツト中に
おける赤外線スペクトルはそれぞれ付図３と４に
示しているが1730、1660、1630、1580および1210
cm^-1に認められる吸収バンド特性で互によく似て
いる。1500cm^-1における鋭いバンドが成分Ａに見
られるが、成分Ｂは成分Ａにない3200−3400cm^-1
においてＮ−Ｈ吸収特性を示す。Bu−2313Aと
Bu−2313BのCDCl₃中のプロトンNMRスペクト
ルはそれぞれ付図５と６に示している。それらは
5C−メチル基、１メチルエステル基およびトラ
ンスジエノイツク酸発色団の存在を示してい
る。成分ＡのNMRスペクトルはδ3.03ppmにおい
てＮ−メチル信号を示すが、これは成分Ｂにはな
い。分子イオンピークはBu−2313A（ｍ／e517）
とBu−2313B（ｍ／e503）の両方のマス分光学に
よつて認められた。主断片イオンピークはｍ／
e221（成分Ｂの基本ピーク）、ｍ／e235（成分Ａの
基本ピーク）およびｍ／e283（両成分ＡとＢの強
度ピーク）におけるマススペクトルに見られる。 Bu−2313AとBu−2313Bは酸性物質でそれら
およびそれらの混合物は塩基と塩類を生成する。
本明細書で用いる“無毒の製薬上許容される塩”
とは金属陽イオン、例えばナトリウム、カリウ
ム、およびマグネシウムの様なアルカリ金属又は
アルカリ土金属陽イオンとの塩類を含むものとす
る。 Bu−2313AとBu−2313Bの生物学的特性抗菌性
スペクトル Bu−2313AとBu−2313Bの最小抑制濃度は
種々の好気性および嫌気性細胞に対する多数接種
用装置を用い連続２倍寒天希釈法によつて測定し
た。栄養寒天媒質（エイケン）は一般に好気性細
菌に用い、ゴノコツカス（GC）媒質（エイケン）
は連鎖状球菌、ネイセリアおよびヘモフイラス種
の様なむづかしい好気性細菌に用いまたGAM寒
天媒質（ニツスイ）は嫌気性細菌に用いた。 Bu−2313AとBu−2313Bの種々の好気性およ
び嫌気性細菌に対する試験管内活性は関聯化合物
として使われるチランダマイシンおよびクリンダ
マイシンのそれと共にそれぞれ表６および７に示
している。Bu−2313AとBu−2313Bは低濃度に
おいて種々の嫌気性細菌の成長を抑制したが、
Ｓ．アウレウス、Ｅ．コリおよびＫ．ニユーモニ
イの様な普通の好気性細菌の多くに対しては中位
から弱い活性を示した。しかしバチルス種、連鎖
状球菌、ネイセリアメニンギチジイス、N.ゴ
ノルヘーイおよびヘモフイラスインフルエンジ
イの種はBu−2313AおよびBu−2313Bに敏感で
あつた。一般にBu−2313AおよびBu−2313Bの
活性および抗菌性スペクトルはチランダマイシン
のそれと非常に似ておりBu−2313Bの本質的試
験管活性はBu−2313Aの活性より幾分高い様で
ある。接種菌量の影響２嫌気性細菌（Ｂ．フラギリスとＣ．パーフリ
ンゲンス）についてGAM培地および寒天媒質を
用いて接種菌量のMICに対する影響をしらべた。
表８に示すとおり、ブロス稀釈法で検べた処Bu
−2313AとBu−2313BのMICは接種菌量に非常に
影響された。殺菌性活性 Bu−2313AとBu−2313Bの殺菌力を嫌気性細
菌２株および好気性細菌１株について検べた。
MIC測定後の濁りのない各管からのブロス試料
0.1ml寒天平板につけて生活力ある細胞数をしら
べた。GAM寒天板をＢ．フラギリスおよびＣ．
パーフリンゲンスの生活力細胞数を数えるに用い
また５％馬血清を含む栄養寒天をＳ．パイオジエ
ネス用に用い、平板は37℃で18時間培養した。集
落成長が平板当り100以下の抗生物質濃度を殺菌
性があるとした。（元の接種菌量10⁵−10⁶細胞／
ml）表９に示すとおり、Bu−2313AとBu−
2313Bの殺菌作用は殺菌性よりもむしろ細菌静止
的であると思われる。【表】【表】【表】【表】【表】【表】はつかねずみ血液濃度 Bu−2313（Na塩）、クリンダマイシンおよびフ
ラギル（Flagyl）を段階的薬量（100、50、25お
よび12.5mg／Kg）で皮下又は経口投与した後のね
ずみの血液濃度を測定した。血液試料を眼窩静脈
洞から採取し試験菌体としてB.フラギリス
A20926を用いペーパーデイスク−寒天板法によ
つて分析した。結果を表10に示す。Bu−2313B
を用いて得た最大血液濃度は非経口および経口投
与いづれもクリンダマイシンのそれより約３−４
倍高かつたが、フラギルはBu−2313Bよりよい
吸収を示した。【表】生体内活性 Bu−2313AとBu−2313Bの生体内効果をＢ．
フラギリス A20926（部分的）、Ｃ．パーフリン
ゲンスA9635およびＳ．パイオゲネスA20201（全
身的）に感染したはつかねずみで試験した。はつかねずみの首背面に細胞２−５×10⁶と微
結晶性セルロース10mgを含む細菌懸濁液0.5mlを
皮下注射してＢ．フラギリスの部分的感染をさせ
た。注射30分後に初めて５日間毎日１回皮下又は
経口投与して治療を行なつた。ねずみ５匹の群を
各薬量に対して用い動物は６日目に解剖切開して
皮下膿瘍の大きさを測定した。各動物の応答を傷
の大きさによつて０−５に採点し点数の合計を群
中のねずみ数で除して各治療群と対照群の平均点
を得た。対照群の平均点を感染度100％ととり各
治療群の相対感染度を計算しまたPD₅₀値をロツ
グプロビツトプロツト（log−probit plot）
によつて推定した。Bu−2313Bを用いて得た結
果をクリンダマイシンおよびフラギルの結果と共
に表11に示している。この感染試験ではクリンダ
ーマイシンはBu−2313A又はフラギルより活性
であつた。豚胃ムチンの５％懸濁液（アメリカンラボラト
リーズ）中の病原体の致命的量をねずみの腹腔内
に投与して全身的にＣ．パーフリンゲンス又は
Ｓ．パイオゲネスに感染させた。細菌を投与する
直前に抗生物質を皮下又は経口投与した。５日後
にPD₅₀を測定した。表12でわかるとおりBu−
2313Bは皮下および経口投与いづれによつても全
身的伝染に対してかなりよい防禦を示したが、
Bu−2313Aの経口投与は不活性であつた。クリ
ンダマイシンはこの生体実験において最も活性で
あつた。【表】【表】ン
クリンダマイシ 0.08 0.22 0.3 21
ン
フラギル 31 60 NT NT
NA＝活性なし
NT＝試験せず
急性毒性 Bu−2313AおよびＢの急性LD₅₀を皮下、腹腔
内および経口投与によつて検べた。Bu−2313の
遊離酸およびナトリウム塩型の両方について試験
し結果を表13に示している。Bu−2313BはBu−
2313Aより著しく低い毒性を示したが、これは２
成分の間の僅かな構造差から考えて（Ｎ−メチル
基の有無）興味あることである。【表】本発明の１形態は式：（式中ＲはＨ又はCH₃を表わす。）で示される抗生物質化合物又はその混合物又はそ
の製薬上許容される無毒塩（ナトリウム塩が好ま
しい）に関する。本発明の他の形態はBu−2313Aと呼ぶ抗生物
質化合物又はその製薬上許容される無毒塩（成る
可くナトリウム塩）に関する。その化合物は低級
アルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムおよ
びベンゼンに溶解し、ヘキサンおよびアルカリ性
水には僅かにとけるが水には実際上不溶の酸性物
質であり、それは塩化第２鉄とは陽性反応をする
がニンヒドリン、アンスロン、サカグチおよびト
レンの試薬とは陰性反応をし、その精製形は約
116−118℃で溶融し、光学的活性で〔α〕²⁶ _D＝約
−58゜（Ｃ0.5、メタノール）であり、50％エタノ
ール水溶液中約5.2のpKa′を示し滴定当量519をも
ち、そのマススペクトルにおいてｍ／e517に分子
イオンピークをもち、実験式C₂₇H₃₅NO₉をもち
かつその紫外線、赤外線および核磁気共鳴スペク
トルがそれぞれ実質的に付図１，３および５に示
す様なものである化合物である。本発明の他の形態はBu−2313Bと呼ぶ抗生物
質化合物又はその製薬上許容される無毒塩（成る
可くはナトリウム塩）に関する。その化合物は低
級アルコール類、酢酸エチル、クロロフオルムお
よびベンゼンに溶解し、ヘキサンおよびアルカリ
性水には僅かにとけるが水には実際上不溶である
酸性物質であり、それは塩化第２鉄と陽性反応を
するがニンヒドリン、アンスロン、サカグチおよ
びトレンの試薬とは陰性反応をし、その精製形は
約160乃至162℃で溶融し、光学的活性で〔α〕²⁵ _D
＝約−69.9゜（Ｃ0.3、メタノール）および−34.9゜
（Ｃ0.93、CHCl₃）をもち、46％エタノール水溶
液中約4.9のpKa′を示し滴定量509をもち、そのマ
ススペクトルにおいてｍ／e503に分子イオンピー
クをもち、実験式C₂₆H₃₃NO₉をもちかつその紫
外線、赤外線および核磁気共鳴スペクトルがそれ
ぞれ実質的に付図２，４および６に示す様なもの
である化合物である。本発明の他の形態はA.T.C.C.31295、31296、
31297又は31298の同定特性をもつミクロポリスポ
ラシーシアの株を炭素と窒素の同化性源を含む
水性培養媒質中で浸水好気性条件のもとで培養し
上記微生物により上記培養媒質中に実質的量の抗
生物質混合物を生成することにより成る抗生物質
Bu−2313AとBu−2313Bの混合物製造用微生物
学的方法に関する。好ましい実施態様ではこの方
法は更に培養媒質から抗生物質混合物を回収する
工程を含む。より好ましい実施態様の微生物はミ
クロポリスポラシーシアA.T.C.C.31298であ
る。本発明の他の形態は抗生物質Bu−2313Bの製
造用微生物学的方法に関するもので、その方法は
(a)A.T.C.C.31295、31296、31297又は31298の同
定特性をもつミクロポリスポラシーシアの株を
炭素と窒素の同化性源を含む水性培養媒質中で浸
水好気性条件のもとで培養して上記培養媒質中で
上記微生物により実質的量の抗生物質混合物を生
成し、(b)工程(a)で生成した抗生物質混合物を回収
しかつ(c)マクロ網状重合体樹脂上のクロマトグラ
フ法により上記抗生物質混合物からBu−2313B
を分離することより成るのである。好ましい実施
態様における微生物はミクロポリスポラシーシ
アA.T.C.C.31298である。本発明の他の形態は抗生物質Bu−2313A製造
用微生物学的方法に関するもので、その方法は(a)
A.T.C.C.31295、31296、31297又は31298の同定
特性をもつミクロポリスポラシーシアの株を炭
素と窒素の同化性源を含む水性培養媒質中で浸水
好気性条件のもとで培養して上記培養媒質中に上
記微生物により実質的量の抗生物質混合物を生成
し、(b)工程(a)で生成した抗生物質混合物を培養媒
質から回収し、(c)上記抗生物質混合物からマクロ
網状重合体樹脂上のクロマトグラフ法によりBu
−2313Bの大部分を分離しかつ(d)Bu−2313Aをシ
リカゲル上クロマトグラフ法により残留Bu−
2313Bから分離することより成るのである。好ま
しい実施態様における微生物はミクロポリスポラ
シーシアA.T.C.C.31298である。本発明の抗生物質化合物にはBu−2313複合物、
その成分Bu−2313AおよびBu−2313Bおよびそ
の塩類および混合物がある。本発明はその範囲内
に上記抗生物質の少なくも１種と適当な製薬上許
容される担体を含む調剤組成物を包含する。組成
物は必要な投与法に適した調剤形に形成出来る。
この組成物の例は錠剤、カプセル、ピル、粉末お
よび小粒の様な経口投与用固体組成物、溶液懸濁
液、シロツプおよびエリキシール剤の様な経口投
与用液体組成物および無菌溶液、懸濁液又は乳化
液の様な非経口投与用処方がある。他の抗生物質と同様にBu−2313AおよびＢの
服用量は患者の体重、年令および一般健康状態お
よび病気の性質によるもので医師の判断範囲内で
ある。一般に経口薬量はBu−2313A又はBu−
2313B（又はそれらの混合物）50−750mgの範囲内
で１日３−４回与える。本発明を次の実施例によつて例証するが、それ
によつて本発明を限定するものではない。実施例１種培養物の製造および小規模シエークフラスコ
醗酵グルコース３％、大豆粉１％、コーンステイー
プ液１％およびCaCO₃0.5％を含む500mlエルレン
マイヤーフラスコ中の生長性液体媒質100mlを接
種するにBu−2313生成性微生物、株E864−61No.
Ｙ−29のよく成長した寒天傾斜培養物を用いた。
媒質PHを殺菌前7.0に調整した。種培養物を回転
振とう機上（250rpm）34℃で３日培養し培養液
２−３mlをしよ糖３％、リンシードミール３％
（NH₄）₂SO₄0.3％、ZnSO₄・7H₂O0.003％および
CaCO₃0.5％より成る醗酵媒質100mlを入れた500
mlエルレンマイヤーフラスコに移した。28℃で４
−７日振とう後抗生物質生成は最高に達した。醗
酵の進行と共にブロスPHは段々と高くなり抗生物
質効力150mcg／mlとなつた時PHは8.1−8.8に達し
た。抗生物質の醗酵ブロス内活性は試験菌体とし
て嫌気性条件でGAM寒天板上で生長したバクテ
ロイデスフラギリスを用いてペーパージスク寒
天板法によつて測定した。実施例２大規模タンク醗酵株E864−61No.Ｙ−29のよく成長した寒天傾斜
培養から製造した種培養液110を2500タンク
中のグルコース３％、大豆粉３％、コーンステイ
ープ液１％およびCaCO₃0.5％を含む醗酵媒質
1500に接種した。醗酵は31℃で200rpm撹拌、
空気吹込速度1000／分で行なつた。72時間後醗
酵ブロスPH8.2となり抗生物質培養力価265mcg／
mlとなつた。実施例３分離および精製醗酵ブロス（1500、分析200mcg／ml）を
過助材を用いて過し菌糸ケーキを水洗した。
液と洗液を併せPH8.3としマクロ網状樹脂（ジア
イオン、、HP−20、100）管に入れた。管を水
400と次いで40％メタノール水溶液40で洗い
95％メタノール水溶液400で展開した。活性分
別部分を併せ真空濃縮して水性濃厚液とした。上
に得た湿菌糸ケーキ360Kgをメタノール300に懸
濁させ撹拌抽出した。これを２回反復し併せたメ
タノール抽出液700を真空濃縮した。HP−20
溶離液から得た２水性濃縮液と菌糸ケーキ抽出液
を併せ更に真空濃縮して70とし濃厚液中の活性
物を酢酸エチルで２回（２×35）抽出した。抽
出液を真空濃縮乾固して油状固体（1.03Kg、
220mcg／mg）を得た。これを酢酸エチルとメタ
ノール（20：１、2.2）の混合物にとかし活性
炭管（５容量）にとおした。管を同じ溶媒混合
物で展開し活性溶離液を併せ真空濃縮して暗褐色
固体を得て、それを熱メタノールから晶出させて
黄褐色結晶性粉末を得た。（279ｇ、650mcg／mg）かく得た結晶性物質は成分ＡとＢの混合物でそ
の分離はジジアイオンHP−20クロマトグラフ法
によつて行なつた。混合物の一部100ｇを90％メ
タノール水溶液にとかし液をHP−20樹脂管（５
）に入れた。管を80％メタノール水溶液で展開
し２活性分別部分を得た。第１活性分別部分24
の濃縮液から淡黄色針状結晶Bu−2313B45ｇを
得た。それをメタノールから２回再結晶させて分
析的純物質32ｇを得た。第２活性溶離液23を真
空濃縮して成分ＡとＢの混合物20ｇを得てそれを
シリカゲル管クロマトグラフ法によりクロロホル
ムで展開して分離した。速く動く分別部分から得
て再晶出させて成分Ａの純結晶４ｇを得た。更に
成分B7.5ｇは後部溶離液から回収した。純結晶生成物の分析結果次のとおり： Bu−2313A−C₂₇H₃₅NO₉に対する分析：計算値：Ｃ、62.65；Ｈ、6.82；Ｎ、2.71；Ｏ、27.82 測定値：Ｃ、62.57；Ｈ、6.64；Ｎ、2.60；Ｏ、28.20（差から） Bu−2313B−C₂₆H₃₃NO₉に対する分析：計算値：Ｃ、62.03；Ｈ、6.56；Ｎ、2.78；
Ｏ、28.63 測定値：Ｃ、61.77；Ｈ、6.80；Ｎ、2.65；
Ｏ、28.78（差から）実施例４ Bu−2313Bのブロモベンゼン溶媒和物の製造 Bu−2313B100mgを熱ブロモベンゼン４mlにと
かしそれに石油エーテルを僅かに液がにごり初め
る迄滴加した。この液を室温で一夜放置して結晶
を完了させた。 Bu−2313Bのブロモベンゼン溶媒和物が黄色
針状結晶として得られた（80mg）〔α〕²¹ _D＝−51.2゜
（Ｃ0.88、メタノール）。λ_nax（エタノール中）：
225、295（sh）、352および369nｍ。 NMRスペクトルδ7.1ppm（5H）（ブロモベンゼン
に対し）分析：C₃₂H₄₀NO₁₀Br（C₂₆H₃₃NO₉・
C₆H₅Br・H₂O）に対して計算値：Ｃ、56.64；
Ｈ、5.90；Ｎ、2.06；Br、11.80；Ｏ、23.60：測
定値：Ｃ、56.87；Ｈ、5.84；Ｎ、2.19；Br、
12.10；Ｏ、23.00（差から）実施例５ Bu−2313Bのナトリウム塩製造塩化メチレン10ml中にBu−2313B200mgを含む
液に水30mlを加えた。この液を撹拌しながらこれ
に1N NaOHを滴加してPH11.5とした。30分間撹
拌後溶媒層を分離し水層をｎ−ブタノール30mlづ
つで２回抽出した。抽出液を併せ真空濃縮し得た
固体を少量のアセトンにとかしｎ−ヘキサンを加
えて沈澱させてBu−2313Bナトリウム塩176mgを
得た。この物質の一部45mgをベンゼン−メタノー
ル混合液から晶出させて淡黄色結晶36mgを得た。
融点236−241℃（分解）〔α〕²³ _D＝−7.4（Ｃ0.94、
メタノール）C₂₆H₃₂NO₉Na・H₂Oに対する分析
計算値：Ｃ、57.46；Ｈ、6.26；Ｎ、2.58；
Na4.24；Ｏ、29.46；測定値：Ｃ、57.57；Ｈ、
6.29；Ｎ、2.39；Na、4.21；Ｏ、29.54（差から）。実施例６ Bu−2313Aナトリウム塩製造実施例５において用いたBu−2313Bの代りに
等量のBu−2313Aを用い実施例５の一般法を反
復してBu−2313Aのナトリウム塩を生成した。

【図面の簡単な説明】

付図１は本発明のBu−2313Aのエタノール中
（図中−線）Ｎ／10NaOH−５％エタノール中
（図中………線）、PH7.0りん酸塩緩衝液中（図中
―‐‐―線）、Ｎ／10HCl−５％エタノール中（図
中―‐‐―線）、における紫外線線吸収スペクトル
図で縦軸にＥ１％ 1cmをとり横軸に波長（ｎｍ）をと
つている。付図２は本発明のBu−2313Bのエタ
ノール中（図中−線）、Ｎ／10NaOH−５％エタ
ノール中（図中………線）、PH7.0りん酸塩緩衝液
中（図中―‐‐―線）、Ｎ／10HCl−５％エタノー
ル中（図中―‐‐―線）における紫外吸収スペク
トル図で縦軸にＥ１％ 1cmをとり横軸に波長（ｎｍ）
をとつている。付図３は本発明のBu−2313Aの
臭化カリウム中にペレツトとした時の赤外線吸収
スペクトル図で縦軸に透過率％をとり横軸に波長
（ミクロン）および波数（cm^-1）をとつている。
付図４は本発明のBu−2313Bの臭化カリウム中
にペレツトとした時の赤外線吸収スペクトル図で
縦軸に透過率１％をとり横軸に波長（ミクロン）
および波数（cm^-1）をとつている。付図５は本発
明のBu−2313AのCDCl₃中のNMRスペクトル
（60MHz）図で横軸にδppmをとつている。付図６
は本発明のBu−2313BのCDCl₃中のNMRスペク
トル（60MHz）図で横軸にδppmをとつている。

Claims

【特許請求の範囲】１式：（式中ＲはＨ又はCH₃を表わす）で示されること
を特徴とする抗生物質化合物又はその混合物又は
その製薬上許容される無毒塩。２ＲがＨである特許請求の範囲第１項記載の化
合物。３特許請求の範囲第２項に記載の化合物のナト
リウム塩。４ＲがCH₃である特許請求の範囲第１項記載の
化合物。５特許請求の範囲第４項に記載の化合物のナト
リウム塩。６ミクロポリスポラ属に属する抗生物質Bu−
2313A及びBu−2313B生産菌を培養し、培養媒質
から抗生物質Bu−2313A即ち式で示される化合物及び抗生物質Bu−2313B即ち
式で示される化合物を回収することを特徴とする式（但しＲはCH₃又はＨを示す）で示される抗生物
質化合物の製造法。７微生物がA.T.C.C.31925、31926、31927又は
31928の同定特性をもつミクロポリスポラシー
シアである特許請求の範囲第６項記載の方法。８微生物がミクロポリスポラシーシアA.T.
C.C.31928である特許請求の範囲第７項記載の方
法。９培養媒質から直接回収した抗生物質混合物か
らのBu−2313Bの分離をマクロ網状重合体樹脂
クロマトグラフ法によつて行う特許請求の範囲第
６項記載の方法。１０培養媒質から直接回収した抗生物質混合物
からのBu−2313AとBu−2313Bの分離をマクロ
網状重合体樹脂上クロマトグラフ法によつてBu
−2313Bの大部分を分離し次いで残留Bu−2313B
からシリカゲル上クロマトグラフ法によつてBu
−2313Aを分離する特許請求の範囲第６項記載の
方法。１１微生物の培養をPH5.0乃至10.0および温度
20乃至48℃の浸水好気性条件のもとで行う特許請
求の範囲第６項〜第１０項のいずれか１項に記載
の方法。１２培養をPH6.0乃至8.0で温度32乃至42℃にお
いて行う特許請求の範囲第１１項記載の方法。１３培養媒質が炭素と窒素の同化性源を含む水
性培養媒質からなる特許請求の範囲第６項〜第１
２項記載の方法。１４培養媒質が更にグリシンを含む特許請求の
範囲第１３項記載の方法。