DK161339B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotisk kompleks, omfattende erythromycin d og estere deraf, eller dets enkelte komponenter og mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 161339B

*

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk kompleks, omfattende erythromycin D, 3",4"-di-0-acetylerythromycin D, 3"-0-acetyl-4"-0-propionylerythromycin D og 4"-O-acetylerythromycin 5 D, eller deres enkelte komponenter eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Opfindelsen angår også en kultur af mikror-ganismen Nocardia sp. ATCC 39043 til anvendelse ved 10 fremgangsmåden.

En kultur af mikroorganismen Nocardia sp. ATCC 39043 producerer direkte erythromycin D sammen med estere omfattende 4"-0-acetylerythromycin D, 3"-4,,-di-0-ace-tylerythromycin D og 3"-0-acetyl-4"-0-propionylerythro-15 mycin D ved gæring. Den mest værdifulde af disse estere, 3",4"-diacetate,t,er hovedkomponenten i det ved gæringen opnåede kompleks. Hvis erythromycin D selv er det ønskede produkt, foretages eventuelt hydrolyse af esterne i dyrkningsvæsken før isoleringen af erythromycin D.

20 Erythromycin D er et af en gruppe macrolid-antibiotica med fælles strukturegenskaber som følger: •N(CH0)0 * CH- CH, . JV 3'2 ΗΟ'ΐ'ίΐ η , J JR3 II I CH U 5*1 J&C 0 η01\ΙοΛοΛη.

ch3 /1 9h3 Ί "»1 I 3 \ OL CH_ ji” * 5**Y^ 0 CH3 ORb 2

DK 161339 B

Erythromycin A OH CH^

Erythromycin B H CH^

Erythromycin C OH H

Erythromycin D Η H

5 Majer et al., J. Am. Chem. Soc., 99, side 1620-1622, (1977), isolerede og identificerede erythromycin D j som en sporkomponent fra en industriel erythromycin

A rensningssidestrøm. Den foreliggende opfindelse J

tilvejebringer en praktisk fremstilling af erythromycin I

10 D ved direkte gæring.

Tidligere rapporterede estere i erythromycin-rækken blev fremstillet ved kemiske metoder, ikke som gærings- produkter. Disse estere inkluderer 21-acetaterne, 2'- i propionaterne, 4"-acetaterne og 4"-propionaterne af ! 15 både erythromycin A og erythromycin B; se Jones et al., J. Med. Chem. 15, side 631-634 (1972); Martin et al.) J. Med. Chem., 15, side 635-637 (1972).

Strukturelt beslægtede estere er tidligere blevet rapporteret som del af megalomicin-komplekset af antibioti-20 ca. Megalomicin A, som har en tredje sukkerdel tilknyttet ved C-6, svarer iøvrigt i struktur til erythromycin C. Andre medlemmer af denne række er estere af megalomicin A, som følger:

DK 161339 B

3 CH, CEL f*CH3*2

ho/vS hyS

^ίΓτ^ ί 1Γ3 Y°yH3 CH^ORe ... °νγ RO'j n(ch3)2 ' Rd Re

Megalomicin. AH H

Megalomicin B COCH^ H

Megalomicin COCH3 COCH3

Megalomicin C2 COC2H5 COCH3

Se Bartner et al., J. Chem. Soc., Perkin I, side 1600-1624 (1979).

Når en kultur af Nocardia sp. ATCC 39043 dyrkes under aerobe betingelser i vandige medier, producerer den et 5 kompleks af macrolid-antibiotica omfattende erythromycin D og hidtil ukendte mono- og diestere deraf, nemlig 3",4"-diacetatet, 3"-acetat-4"-propionatet og 4"-acetatet som systematisk navngivet ovenfor ifølge carbonhydrat-nomenklaturens regler.

10 Selv om den kultur af Nocardia sp., der anvendes ved den foreliggende gæring, almindeligvis vil være biologisk

DK 161339 B

4 ren (dvs. fri for andre forurenende mikroorganismer), er dette ikke et nødvendigt træk ved opfindelsen.

Det nødvendige træk er, at kulturen er i stand til at producere det ønskede antibiotiske kompleks.

5 Som forklaret detaljeret nedenfor bestemmes den anti-bakterielle aktivitet af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser let ved metoder, som er velkendte inden for faget. Denne aktivitet afspejler deres anvendelighed til systemisk eller to-10 pisk behandling af reflektioner af uantagelige bakterier hos dyr eller mennesker, som vækstfremmende midler i dyrefodere, til konservering af stoffer, som er biologisk nedbrydelige af modtagelige bakterier, eller som industrielle desinfektionsmidler.

15 Foretrukne blandt de her omhandlede estere er 3",4”-diacetatet på grund af dets høje absorptionsgrad ad den orale vej. Endvidere er dette diacetat hovedkomponenten ved gæringen.

Opfindelsen angår også en kultur af Nocardia sp.

20 ATCC 39043, som er i stand til at producere det omhandlede antibiotiske kompleks i udvindelige mængder, når den dyrkes under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder til carbon og nitrogen, og den frysetørrede form deraf, 25 som er egnet til opbevaring og bevarelse af mikroorganismen .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter også fremstillingen af farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af erythromycin D og de omhandlede.estere deraf. Farmaceutisk 30 acceptable syreadditionssalte inkluderer, men er ikkre begrænset til sådanne med saltsyre, svovlsyre, salpetersyre, phosphorsyre, citronsyre, maleinsyre, ravsyre, benzen- 5

DK 161339 B

f sulfonsyre, p-toluensulfonsyre, 2-naphthalensulfonsyre og methansulfonsyre.

Kulturen, som er i stand til at producere det antibiotiske kompleks af erythromycin D og estere deraf, be-5 tegnes med Nocardia sp. og er blevet deponeret i The

American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. som typekultur under accessionsnummeret ATCC 39043. Den permanente deponering af denne kultur ved The American Type Culture Collection og offentlig ad-10 gang dertil garanteres under dette patents effektive levetid.

Denne hidtil ukendte kultur blev afledt fra en jordprøve opsamlet i Gose City, Nara Prefecture, Japan, og identificeret i kultursamlingen hos Pfizer Inc.

.15 som N464-21. Dens beskrivelse og klassifikation blev udført af Dr. L.H. Huang. Den er Gram-positiv, delvis syrefast og har et hvidt luftmycelium og et ikke let fragmenteret substratmycelium, hvis farve varierer fra farveløs, flødefarvet, bleggul til gullig. Celle-20 væganalysen for sukkerstoffer, aminosyrer og myco- later fastslår yderligere dens tilhørsforhold til slægten Nocardia.

Et podemedium fremstilles ved udpladning fra et fryse-25 tørret præparat i ATCC nr. 172 væske og dyrkning i 4 dage ved 28 °C på en ryster. Det centrifugeres derpå i 20 minutter, vaskes tre gange med sterilt destilleret vand og udplantes på medier, der almindeligvis anvendes til identifikation af medlemmer af Actiono- 30 mycetalerne.

DK 161339B

6

Incubation udføres ved 28 °C, og resultaterne kan aflæses ved varierede tider, men tages mest almindeligt ved 14 dage. Farverne beskrives i almindelig terminologi, men eksakte farver bestemmes ved sammenligninger 5 med farvemærkater fra Color Harmony Manual, 4th edition. Metoderne til hel-celle- og sukkeranalyser er dem, der er beskrevet i Becker et al., Appl. Micorbiol. 12: 421-423, 1964; og i Lechevalier et al., J. Lab. Clin. Med.

71: 934-944, 1968. Cirka 30 g autoklaveres, og våt 10 mycelium blev anvendt til mycolatanalyser under anvendelse af den metode, der er beskrevet af Lechevalier et al., J. Bacteriol. 105: 313-318, 1971.

Kulturen blev identificeret som følger: Gærextrakt-maltextrakt-agar (ISP nr. 2 medium, Difco) 15 - vækst god, mørk gullig (nær 2ic), moderat hævet, ryn ket, luftmycelium hvidt; underside samme som overside: intet opløseligt pigment.

Havremel-aqar (ISP nr. 3 medium, Difco) - vækst ringe til moderat, hvid, tynd, glat, luftmycelium sparsomt, 20 hvidt; underside farveløs, intet opløseligt pigment.

Uorganiske salte-stivelse-aqar (ISP nr. 4 medium, Difco) - ingen vækst.

Glycerol-asparaqin-aqar (ISP nr. 5 medium, Difco) -vækst god, gullig (1 l/2ga, 1 l/2ia, 2is), moderat 25 hævet, rynket, luftmycelium hvidt; underside gullig (1 l/2ia); intet opløseligt pigment.

Glucose-asparaqin-aqar (Waksman, "The Actinomycetes", v. 2, medium nr. 2, side 328, 1961) - vækst god, hvid til flødefarvet (1 l/2ca), svagt hævet, glat til svagt 7

DK 161339B

rynket, luftmycelium hvidt; underside blegt gulligt (1 l/2e'a) intet opløseligt pigment.

Czapek-saccharose-agar (ibid.., medium nr. 1, side 328) - vækst ringe til moderat, hvid, tynd, glat, luft-5 mycelium sparsomt, iagttages kun under mikroskopet; underside farveløs; intet opløseligt pigment.

Glucoe-gærextrakt-agar (ibid., medium nr. 29, side 331) - vækst moderat, flødefarvet (1 l/2ca), tynd, glat til svagt ru, intet luftmycelium; underside 10 flødefarvet; intet opløseligt pigment.

Emersons agar (ibid., medium nr. 28, side 331) -vækst moderat, flødefarvet (2ca), tynd, glat til svagt ru, intet luftmycelium; underside flødefarvet til svagt gulligt (2ca, 2ea); intet opløseligt pigment.

15 Nærinqsaqar (ibid., medium nr. 14, side 330) - vækst moderat, flødefarvet (1 l/2ca), tynd til svagt hævet, glat, intet luftmycelium; underside flødefarvet; intet opløseligt pigment.

Bennets agar (ibid., medium nr. 30, side 331) - vækst 20 god, hvid, flødefarvet til blegt gullig (2ca, 2ea), hævet, rynket, luftmycelium hvidt; underside blegt gullig (2ea); intet opløseligt pigment.

Gordon og Smiths tyrosin-aqar (Gordon og Smith, J.

Bact,. 69: 147-150, 1955) - vækst moderat, flødefarvet 25 (1 l/2ca), tynd, glat, luftmycelium sparsomt, iagtta ges kun under mikroskopet; underside farveløs til flødefarvet; intet opløseligt pigment.

Calciummalat-aqar (Waksman, Bact. Rev. 21, 1-29, 1957) - vækst moderat, flødefarvet til blegt gullig 8

DK 161339 B

(lca, mellem lca og lea), tynd, glat, med nogle få hvide prikker, luftmycelium hvidt til flødefarvet; underside blegt gullig (lea); intet opløseligt pigment.

5 Casein-aqar (Gordon and Smith, ibid.) - vækst moderat, hvid, tynd, glat, luftmycelium hvidt; underside farveløs; intet opløseligt pigment.

Gelatine-agar (Gordon and Mihm, J. Bact. 73, 15-27, 1957) - vækst moderat, hvid, tynd, glat, kan være 10 svagt rynket nær ved kanten, luftmycelium hvidt; underside farveløs til flødefarvet (1 l/2ca); intet opløseligt pigment.

Stivelse-agar (ibid.) - vækst moderat, hvid, tynd, glat eller svagt rynket nær ved kanten, luftmycelium hvidt; 15 underside flødefarvet (1 l/2ca); intet opløseligt pigment .

Karto ff el-qulerods-aqar (Lechevalier, Lab. Clin. Med.·, 71, 934-944, 1968, men der anvedtes kun 30 g kartofler, 2,5 g gulerødder og 20 g agar) - vækst moderat, 20 hvid, tynd, glat, luftmycelium hvidt; underside farve løs; intet opløseligt pigment.

Vandværksvand-agar (2%) - vækst sparsom til ringe, hvid, tynd, glat, submers, luftmycelium sparsomt, iagttages kun under mikroskop; underside farveløs; intet opløse-· 25 ligt pigment.

Morfologiske egenskaber: fragmenteringsundersøgelsen blev foretaget en gang om dagen op til 5 dage på glucose-asparagin-agar. Fragmentering af myceliet skete 5 dage efter podning. De følgende morfologiske iagttagelser 30 blev gjort på glucose-asparagin-agar efter 16 dages podning: luftmycelium hvidt, bugtet, bølget eller zig-zagget

DK 161339B

9 0,5-0,9 jum i diameter, kan indeholde opsvulmninger og fragmenter; opsvulmningerne, terminale, laterale eller indskudte, enkelte eller fortløbende, kugleformede, ovale til elliptiske, 0,8-1,6 pm i diameter, 5 eller 1,2-3 x 0,7-1,8 pm; fragmenterne 1,8-6 (eller længere x 0,7-0,9 jjm, glatte som afsløret ved skanderings-elektronmikroskopi; både opsvulmningerne og fragmenterne indeholder ofte refraktive oliekugler.

Biokemiske egenskaber : Gram-positiv; delvis syrefast; 10 melaninproduktion negativ; produktion af hydrogensulfid negativ; nitratreduktion positiv; gelatinesmeltning negativ; hydrolyse af esculin, hippurat og stivelse (Gordon et al., Int. J. Syst. Bact., 24, 54-63, 1974) positiv; nedbrydning af adenin, hypoxanthin og xan-15 tin (ibid.) positiv; nedbrydning af calciummalat, casein, cellulose, tyrosin og urinstof (ibid.) negativ; resistens over for lysozym (ibid.) positiv; ingen vækst i Jensens (Proc. Linn, Soc. N.S.W. 55: 231-248, 1930) eller Levine og Schoenleins (A Compilation of 20 Culture Media, medium nr. 2511, 1930) væske; ingen koagulation og ingen peptonisering på skummetmælk (Difco).

Udnyttelse af organiske syrer (Gordon et al., loc. cit.): acetat, malat, propionat og pyruvat udnyttelse; benzoat, citrat, dextrin, lactat, mucat, oxalat, phenol, 25 succinat og tartrat udnyttes ikke.

Syreproduktion ud fra carbonhydrater (ibid.): Syre produceres ud fra fructose, galactose, glucose, glycerol, inositol, mannitol, mannose, raffinose, ribose, salicin, stivelse og saccharose; syre produceres ikke ud fra 30 adonitol, arabinose, cellobiose, dulcitol, erythritol, lactose, maltose, melezitose, melibiose, rhamnose, sorbitol, sorbose, trehalose, xylose og α-methyl-d-gly-cosid.

DK 161339 B

10

Carbonhydrat-udnyttelse (ibid.): Arabinose, fructose, galactose, glucose, glycerol, inositol, maltose, mannitol, mannose, melezitose, raffinose, ribose, salicin, sorbitol, stivelse, saccharose, trehalose 5 og xylose udnyttes; cellobiose, sorbose og a-methyl-d-glycosid udnyttes tvivlsomt; adonitol, dulcitol, erythritol, lactose, melibiose og rhamnose udnyttes ikke.

Temperatur-forhold (ATCC medium nr. 196 i "ATCC Cul-10 ture Collection Catalog" 14th ed., side 519, 1980):

Kulturen viser god til udmærket vækst ved 28 °C, god vækst ved 21 og 37 °C, og ingen vækst ved 10 og 45 °C. Den overlever ved 50 °C i 8 timer.

Cellevæg-analyse: Cellevæggen indeholder mesodiamino-15 pimelinsyre, arabinose og galactose.

Mycolat-analyse: Cellevæggen indeholder nocardo- mycolater.

De morfologiske egenskaber, nocardomycolinsyrerne, og en type II/ cellevæg (meso-diaminopimelinsyre, arabi-20 nose og galactose) angiver placeringen af den foreliggende kultur i slægten Nocardia. Kulturen er beslægtet med Nocardia paraffinae (Jensen) Waksman & Henrici og N. otitidis-caviarum Snijders m.h.t. nogle morpholo-giske og biokemiske egenskaber. Den adskiller sig fra 25 N. paraffinae ved ikke at producere syre ud fra maltose, ikke at udnytte benzoat og succinat og ikke at hydrolysere urinstof. Fem forskelle adskiller den fra N; otitidis-caviarum: at den ikke producerer syre ud fra maltose og trehalose, manglende evne til at hydro-30 lysere urinstof, ingen koagulation på mælk og ingen vækst ved 45 °C.

DK 161339 B

11

For at producere det antibiotiske kompleks omfattende erythromycin D og estere deraf (3",4M-diacetatet, 3"-acetat-4"-propionatet og 4"-acetatet), gæres den foreliggende Nocardia sp. ATCC 39043 i 3-13 dage, passende 5 ved 24-36 °C under submerse betingelser med omrøring og beluftning på medier bestående af carbonhydratkilder, såsom sukkerstoffer, stivelser, glycerol; organiske nitrogenkilder, såsom so jabønnemel', casaminosyrer, gærekstrakt; vækststoffer, såsom grain solubles, fiske-10 mel, bomuldsfrømel; mineralsalte indeholdende sporelementer, såsom jern, cobalt', kobber, zink osv. og calciumcarbonat eller phosphater som puffermidler.

DK 161339 B

12

Det nødvendige podemateriale til gæringen fremstilles ved skrabning af vegetative celler fra skråsubstrater eller Roux-flasker inkuberet med Nocardia-kulturen. Et fast medium, som er egnet til begyn-5 delsesvækst på skråsubstrater og Roux-flasker, er ATCC-medium nr. 172: q/liter

Glucose 10

Opløselig stivelse 20 10 Gærekstrakt 5 NZ Amin A ... .5

Calciumcarbonat 1

Destilleret vand til 1000 ml; pH til 7,0 med Κ0Η 15 Tilsat agar 20

Vegetative celler fra skråsubstrater anvendes til at pode enten rystekolber eller podematerialetankej eller alternativt podes podematerialetankene fra ryste-kolber. I rystekolber vil væksten almindeligvis have 20 nået sit maksimum på 4-6 dage, medens væksten i podematerialetankene sædvanligvis vil være i den mest favorable periode 3-5 dage efter podning. En fermentor kan podes med vegetativ væske fra podematerialekolberne eller -tankene under fuldstændigt aseptiske betingelser 25 og gæres i et tidsrum på 4-6 dage. Beluftning opretholdes i rystekolben ved omrøring på en ryster eller i tanke ved udblæsning af steril luft igennem en fordeler med en hastighed på 1/2-2 voluminer luft pr. volumen væske pr. minut. Omrøringshastigheden afhænger af den 30 anvendte type omrører; en rystekolbe køres sædvanligvis med 150-200 slag pr. minut, og en fermentor med 300-1700 omdr./min. Sterilitet opretholdes hele tiden. Temperaturen reguleres mellem 26 og 34 °C. Skumning under gæringen kan kontrolleres med sterilt antiskumningsmiddel, 13

DK 161339 B

såsom raffineret soyabønneolie eller andre egnede an-tiskumningsmidler, i sammensætningen og efter behov aseptisk efter podningen.

Typiske gæringsmedier (med Pfizer Inc. ‘s kodebogstav-5 betegnelser) er som følger: JD JL JLZ-M-1

Cerelose 10 g/1 10 2

Majsstivelse 5 10 10

Majsstøbevand 5 _

Soyamel - 10 15

Forgærbare opløselige stoffer fra majs 5

Casein 5-- BYF 300 gær 5 NZ Amin Ytt - 5 10

Natriumchlorid - 2,5

Calciumcarbonat 3-2

Cobaltchlorid 0,002 0,01 0,01

Kaliumdihydrogen- phosphat - - 1

Magnesiumsulfat - - 0,5

Eddikesyre - - 1,05 (1 ml) pH 7,2-7,3 7,1-7,2

DK 161339 B

14 JCL-3 JLC-3 * JLC-6 JLC-61

Glucose 20 g/1 20 20 20 "NZ Amine"-type A 10-10 "Casamino acid" 10 10

Blodmel 10 10 10 10 DL-valin - 5 5 DL-leucin 10 10

NaCl 4 4 4 4

CaCOj 4 4 4 4

MgCl2.6H20 5 555

Isoamylalkohol 0,82 0,82 0,82 0,82 (1 ml) (1 ml) (1 ml) (1 ml)

Phosphatpuffer (M/50) tilsat tilsat tilsat tilsat

De antibiotiske stoffer kan udvindes ved ekstraktion af hele væsken ved alkalisk pH med et egnet, med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, ethylacetat eller methylisobutylketon. Opløs-5 ningsmidlet skilles fra og tilbageekstraheres i surt vand. Til forskel fra erythromycin A er erythromycin D og dens estere temmelig stabile ved sur pH-værdi (2,5-5,0). Det vandige lag skilles fra, indstilles til pH 8,0-9,0 og genekstraheres med det samme eller et an-10 det med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel. Det antibiotiske kompleks udvindes ved afdampning af opløsningsmidlet og chromatografi af remanensen. Komponenterne i det antibiotiske kompleks isoleres ved yderligere chromatografi.

15 De ovenfor definerede farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser fremstilles let ved standardmetoder. F.eks. kombineres et ækvivalent af syren med den frie aminform af forbindelsen i et organisk eller vandigt organisk op-20 løsningsmiddel. Saltet isoleres ved koncentrering og/eller tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel. I nogle

DK 161339 B

15 tilfælde isoleres saltet direkte fra en reaktionsblanding uden isolering af den frie amin.

Hvis erythromycin D er det ønskede slutprodukt, foretrækkes det at hydrolysere estrene på et eller an-5 det stadium i processen før isoleringen af det rensede erythromycin D. Dette formindsker forarbejdningen og maximerer udbyttet af erythromycin D. Hydrolyse kan udføres på dyrkningsvæsken ved simpelthen at gøre væsken svagt basisk med en base, såsom mættet 10 bariumhydroxidopløsning eller fortyndet natrium- eller kaliumhydroxidopløsning eller natrium- eller kalium-carbonatopløsning. Alternativt gennemføres hydrolysen på et råt koncentrat, på det isolerede antibiotiske kompleks eller på de isolerede estere i et vandigt el-15 ler alkoholisk opløsningsmiddel under anvendelse af en base som defineret ovenfor.

Erythromycin D og estrene deraf, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, udviser in vitro aktivitet over for et middel-spektrum af Gram-positive 20 og Gram-negative bakterier. Tabel I sammenfatter resultaterne af in vitro MIC-prøvninger (MIC = minimal inhiberende koncentration). Til denne standardprøvning indpodes hver organisme i en række glas indeholdende næringsmedium og række-dobbeltfortyndede koncentrationer 25 af antibioticumet. MIC-værdien er den laveste koncentration af antibioticumet, som forhindrer vækst af mikroorganismen i løbet af 24 timers inkubationsperiode.

DK 161339 B

16

TABEL I

In vitro aktivitet af erythromycin D og estere deraf MIC t/ug/ml)_1_

Mikroorganisme a DAAC DAP^ DA6

Staph, aureus 005 0,39 1,56 0,39 3,12 052 0,39 ' 3,12’ 0,78 6,25 400 6,25 50 12,5 (f)

Staph, epid. 111 0,20 0,39 0,20 0,78

Strep, fåec. 006 0,39 1,56 0,78 3,12

Strep, pyog. 203 0,025 0,10 0,05 0,20

Strep, pneuitt. 012 0,025 0,10 0,05 0,39 E. toll 470 3,12 12,5 12,5 6,25

Past. mult. 001 6,25 25 12,.5 25

Neiss. aicca 000 6,25 25 12,5 25

Hem. influ. 036 50 (f) (f) (f) 012 25 (f) 50 50 (a) Alle forbindelser resulterede i MIC større end 50 for Staph, aureus 110; Staph, epid. 087 og 126; Strep, pyog. 054; E. coli 125, 129 og 266; Pseudomonas aerug.

104 og 663, K. Pn. 009 og 031; K. oxy. 024, Serr.

5 mare. 017; Ent. aerog. 040; Ent. cloac. 009; Prov. stua. 013; Prov. ret. 025 og Morg. morg. 001.

(b) Erythromycin D.

(c) 3",4"-diacetat.

(d) 3"-acetat-4"-propionat.

10 (e) 4"-acetat.

(f) MIC større end 50.

DK 161339 B

17

Erythromycin D og esterne deraf udviser også in vivo aktivitet over for infektioner med modtagelige bakterier som sammenfattet i tabel II. Til bestemmelse af en sådan aktivitet frembringes akutte eksperi-5 mentelle infektioner hos mus ved intraperitoneal indpodning af musene med en standardiseret kultur af prøveorganismen suspenderet i 585 svinemavemucin. Infektionsgraden standardiseres, således at musene modtager mindst en LD^gg-dosis af organismen (LD^ggj 10 den minimale podemængde af organismen, som kræves til konstant at dræbe 10085 af de inficerede, ikke-be-handlede kontrolmus). Prøveforbindelsen indgives oralt i forskellige doseringsniveauer til grupper af inficerede mus 1/2, 4 og 24 timer efter infektionen. Ued af-15 slutningen af prøvningen bedømmes blandingens aktivitet ved optælling af antallet af overlevende blandt behandlede dyr ved en given dosis. Aktiviteten udtrykkes som procentdelen af dyr, der overlever ved en given dosis, eller udregnes som en PD^g (dosis, som beskytter 20 5085 af dyrene mod infektion).

DK 161339 B

18

TABEL II

In vivo aktivitet af erythromycin D og estere deraf

Oral dosering 1/2, 4 og 24 timer efter infektion PD5Q (mg/kg)

Staph, aureus Strep, pyogenes Antibioticum 005_ 205_ erythromycin D 57 15 4"-0-acety1- erythromycin D 139 40 3",4"-di-0-acetyl- erythromycin D 27 15 erythromycin A 64 25

Til behandling af systemiske infektioner hos dyr, herunder mennesker, forårsaget af modtagelige mikroorganismer, doseres de omhandlede forbindelser i et niveau på 2,5-100 mg/kg pr. dag, fortrinsvis 5-50 mg/kg/dag, 5 sædvanligvis i opdelte doser. Variation i dosering vil foretages afhængigt af individet og af mikroorganismens modtagelighed. Disse forbindelser doseres oralt eller parenteralt, idet den foretrukne indgiv-ningsvej er oral. Modtageligheden af mikroorganismer 10 isoleret i klinikken prøves rutinemæssigt i kliniske laboratorier ved den velkendte skive-plade-metode.

Fremstilling af optimale doseringsformer vil ske ved metoder, som er velkendte inden for farmacien. Til oral indgivning sammensættes forbindelserne alene el-15 ler i kombination med farmaceutiske bærere, såsom inerte faste fortyndingsmidler, vandige opløsninger eller forskellige ikke-toxiske organiske opløsningsmidler i sådanne doseringsformer som gelatinekapsler, tabletter,

DK 161339 B

19 pulvere, pastiller, sirupper og lignende. Sådanne bærere inkluderer vand, ethanol, benzylalkohol, glycerol, propylenglycol, vegetabilske olier, lactose, stivelser, talcum, gelatiner, gummier og 'andre vel-5 kendte bærere. Til parenteral indgivning opløses eller suspenderes forbindelserne i farmaceutisk acceptable bærere, såsom vand, saltvand, sesamolie og lignende. Midler, som vil forbedre suspenderbarheden og dispersionskvaliteterne, kan også tilsættes.

10 Til topisk behandling af overfladiske infektioner hos dyr, herunder mennesker, forårsaget af modtagelige mikroorganismer sammensættes de omhandlede forbindelser ved metoder, som er velkendte inden for farmacien, til lotioner, salver, cremer, geler eller lignende 15 i koncentrationer i området 5-200 mg/cm^ afdoserings-formen, fortrinsvis i området 10-100 mg/cm . Doseringsformen påføres infektionsstedet ad libitum, almindeligvis mindst en gang om dagen.

Når de ifølge opfindelsen fremstillede antibakterielle 20 forbindelser anvendes som konserveringsmidler for biologisk nedbrydelige materialer, blandes de simpelthen med det biologisk nedbrydende materiale i en koncentration, som mindst er tilstrækkelig til at inhibere væksten af den bakterie, der forårsager biologisk nedbryd-25 ning. Rutinemæssig rækkefortyndingsteknik kan anvendes til at bestemme de koncentrationer, der er nødvendige til at opnå det ønskede formål.

Når de ifølge opfindelsen fremstillede antibakterielle forbindelser anvendes som vækstfremmende midler til 30 husdyr, tilføres de i lave niveauer (f.eks. 10-100 g forbindelse pr. ton foder). Blanding af forbindelsen med foderet gennemføres sædvanligvis i to stadier,

DK 161339 B

20 først ved fremstilling af en forblanding (f.eks.

10-100 g forbindelse blandet med 4,5-9,1 kg soya-bønne-,,mill run" eller lignende), som derpå blandes med foderet ved formalingstidspunktet.

5 Når disse forbindelser anvendes som industrielle desinfektionsmidler, påføres de almindeligvis som fortyndede opløsninger på de overflader, som skal des-inficeres.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved 10 de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1 Gæring i 2,5 liter beholdere

Der fremstilledes tyve beholdere med JL-medium, 2,5 liter medium pr. beholder. Der tilsattes 1 ml anti-15 skumningsmiddel, og beholderne blev lukket og steriliseret ved 120 °C og 103 kPa i 45 minutter. Beholderne blev podet med en (2¾) eller to (4¾) podekolber med Nocardia sp. ATCC 39043, gæret i 3-6 dage ved 30 °C (omrørt med 1700 omdr./min. og med luft blæst igennem 20 væsken med et volumen pr. volumen pr. minut). Da gæringen var fuldført (baseret på antibiotisk skiveprøvning over for Micrococcus luteus ATCC 9341 eller B. subtilis ATCC 6633), blev fermentorerne stoppet, indstillet til pH 8,0-9,0 ved 50¾ natriumhydroxidopløsning 25 og ekstraheret med 1/3 volumen methylisobutylketon. Det organiske lag blev skilt fra ved centrifugering. Efter afskumning blev de antibiotiske stoffer tilbageekstrahe-ret i surt vand ved pH 3,0, det vandige lag blev skilt fra, og det brugte opløsningsmiddel smidt væk. Det sure 30 vand blev indstillet til pH 8,0-9,0 og derpå ekstraheret tiled ethylacetat. Opløsningsmidlet blev afskummet, tørret

DK 161339 B

21 med vandfrit natriumsulfat og koncentreret. Koncentratet vejede 2,5 g.

Koncentratet blev opløst i methanol og sendt ned i-gennem en søjle af hydroxypropyleret tværbundet dex-5 trangel ("Sephadex® LH-20", forhandlet af Pharmacia Fine Chemicals), med methanol som elueringsmiddel.

De aktive snit blev kombineret og koncentreret til en sirup, vægt omkring 1,7 g. Dette koncentrat var parat til chromatografering på silicagel for at isolere 10 det rensede antibioticumkompleks som beskrevet detaljeret i eksempel 3.

Den biologiske aktivitet af væsken, ekstrakterne og søjlesnittene blev fulgt ved anvendelse af en modtagelig stamme af Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylo-15 coccus aureus ATCC 6538 eller Micrococcus luteus ATCC 9341. De individuelle komponenter i væsken, ekstrakterne eller søjlesnittene blev gjort synlige ved tyndt-lagschromatografi under anvendelse af "Analtech" silica-gel-GF-plader i de følgende systemer: chloroform/metha-20 nol i volumenforholdet 9:1 eller 3:1 eller chloroform/-acetone/ammoniumhydroxid i volumenforholdet 25:25:1 og sprøjtning af de udviklede plader med vanillin-reagens (5 g vanillin i 100 ml ethanol og 50 ml 85¾ phosphorsyre). Pladerne blev opvarmet til· 80 °C, og 25 de antibiotiske stoffer blev grå til blå/purpur på en hvid baggrund. De individuelle komponenter blev også gjort synlige ved overlejring af den udviklede plade med den førnævnte bakterie i agar, tilsætning af tetrazolium og inkubation af pladerne natten over ved 37 °C. De anti-30 biotiske stoffer viste sig som klare zoner mod en rødlig baggrund.

DK 161339 B

22 EKSEMPEL 2 Gåring af i Nocardia sp. ATCC 39043 i stor målestok

Opskalering i store fermentorer (95-3800 liter) blev udført ved fremstilling af store rystekolber inde-5 holdende 0,7 liter JD- eller JL-medium. Rystekolbernes podemateriale blev gæret i 3-6 dage ved 28 °C og anvendt til at pode en 190, 950 eller 5700 liters fermentor indeholdende 95, 380 eller 3800 liter JL- eller JL2M-l-medium. Fermentorerne blev indhøstet ef-10 ter 5-7 dage.

En 3800 liter gæring blev udvundet ved ekstraktion af hele væsken ved pH 9,2 med 760 liter methylisobutyl-keton. Ekstrakten blev adskilt fra det vandige lag og tilbageekstraheret i 95 liter surt vand, pH 3,4.

15 Det sure vand blev indstillet til pH 9,5 og ekstraheret med 38 liter methylisobutylketon. Det organiske lag blev tilbageekstraheret i 3,8 liter surt vand ved pH

2,5 og skilt fra. Det sure vand blev indstillet til 9,5 og derpå ekstraheret med 1 liter ethylacetat. Det orga-20 niske lag blev afskummet og derpå tørret med vandfrit natriumsulfat. Ethylacetatet blev afdampet til næsten tørhed, udbyttet 18 g.

Koncentratet i methanol blev derpå sendt ned igennem "Sephadex® LH20" i methanol, og de aktive snit blev 25 kombineret og koncentreret. Udbyttet af koncentrat var 12 g, og det var parat til udskillelse af renset antibiotisk kompleks på silicagel.

DK 161339 B

23 EKSEMPEL 3

Isolering af renset antibiotisk kompleks

En 190 liters gæring af Nocardia sp. ATCC 39043 blev ekstraheret med methylisobutylketon ved en pH-værdi 5 på omkring 9,0. Fjernelse af opløsningsmidlet efterlod en mørk olieagtig remanens, som blev ført igennem en syre-base-oparbejdning som beskrevet nedenfor. Olien blev opløst i 500 ml ethylacetat, og der tilsattes 500 ml vand. pH-værdien blev indstillet 10 til 9,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning under omrøring, og det vandige lag blev smidt væk. Ethyl-acetatlaget blev overlejret med 500 ml vand, og pH-værdien blev under omrøring indstillet til 3,0 med phosph-orsyre. Ethylacetatlaget blev smidt væk, og den 15 sure vandige del blev overlejret med 500 ml ethylacetat, og pH-værdien indstillet under omrøring til 9,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning. Ethylacetatlaget blev tørret over natriumsulfat og inddampet til opnåelse af 32,5 g rødbrun olie. Denne olie blev derpå chro-20 matograferet på 1200 g "Sephadex® LH-20" under anvendelse af methanol som elueringsmiddel til frembringelse af omkring 16 g viskøs gummi. Chromatografi på silicagel under anvendelse af 100?ό chloroform og stigende mængder methanol (op til 5% methanol) gav 2 g antibiotisk kom-25 pleks.

EKSEMPEL 4

Behoiderqærinq med hydrolyse af esterne i dyrkninqsvæsken

Det blev iagttaget ved tyndtlagschromatografisk analyse, at udvidelse af gæringstiden forøger indholdet af erythro-30 mycin D i forhold til esterne i væsken, ledsaget af en stigning i pH. Alkaliske hydrolysebetingelser blev derpå

DK 161339 B

24 etableret til hydrolyse af esterne til erythromycin D i væsken.

Der udførtes gæring i forskellige·medier (3 liter) i 6 liters omrørte beholdere ved 26 °C i op til 13 5 dage ifølge proceduren fra eksempel 1. Til.hydrolyse blev 0,5 ml hel væske blandet med 0,5 ml mættet vandig BaCOH^-opløsning. Efter 15 minutters rystning i vandbad ved 30 °C blev pH-værdien indstillet til 6,0-8,0 ved tilsætning af 0,2 ml 0,92N saltsyre. In-10 takte og hydrolyserede væsker blev prøvet for styrke ved en agardiffusions(plade)-prøvning under anvendelse af Staph, aureus 005 med 3",4"-diacetatet af erythromycin D som standard (dvs. aktiviteten udtrykkes som di-acetatækvivalenter).

15 De følgende prøvninger blev bestemt: _7 dage_ _8 dage

Styrke (^ug/ml) Styrke (^ug/ml)

Medium Intakt Hydrolyseret Intakt Hydrolyseret JLC-3 21,7 87,2 17,6 88,4 JLC-3' 18,9 56,3 28,9 111,0 JLC-6 21,0 96,0 22,2 122,0 JLC-6' 25,0 130,0 28,7 132,0 _10 dage 13 dage_

Styrke (^ug/ml) Styrke (^ug/ml)

Medium Intakt Hydrolyseret Intakt Hydrolyseret JLC-3 22,2 79,2 35,3 79,2 JLC-3' 28,7 120,0 37,8 143,0 JLC-6 22,2 97,5 32,9 97,5 JLC-6' 26,9 143,0 40,7 143,0

DK 161339 B

25

Efter hydrolyse isoleres det koncentrerede antibiotiske kompleks, som nu er beriget m.h.t. erythromycin D, ifølge eksempel 1 og 2. Renset erythromycin D isoleres ifølge metoder, som er beskrevet 5 detaljeret i nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 5

Erythromycin D ved hydrolyse af isoleret antibiotisk kompleks_

Antibiotisk kompleks (16 g) fremstillet ifølge de fo-10 regående eksempler blev behandlet med 20 ml koncentreret NH^OH i methanol i 120 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev inddampet til et skum og genopløst i ethylacetat. Erythromycin D (5,1 g) blev udvundet ifølge syre-base-ekstraktionsoparbejd-15 ningsproceduren i eksempel 3.

EKSEMPEL 6

Isolering af erythromycin D, 3",4"-di~0-acetylery-thromycin D, 4"-0-acetylerythromycin D og 3"-0-acetyl-4||-Q-propionylerythromycin D_ 20 Antibiotisk kompleks (49,05 g), fremstillet ifølge de foregående eksempler, blev anbragt på en præparativ-chramatografi-søjle ("Jobin-Yvon Chromatospec") pakket med 1600 g silicagel (partikelstørrelse svarende til maskevidde 37-62 ^um) opbygget i heptan. Der blev op-25 taget fraktioner på 500 ml, efterhånden som opløsningsmidlet blev ændret til chloroform og derpå chloroform indeholdende stigende mængder methanol (op til 20¾)· Fraktionerne blev kontrolleret ved tyndtlagschromatogra-fi under anvendelse af 1:1 chloroform/methanol som elue-30 ringsmiddel og vanillinsprøjtning som beskrevet i eksem-

DK 161339B

26 pel 1. Rf-værdierne for de individuelle komponenter og udbytterne af rå produkter ved afdampning af passende kombinerede fraktioner var:

Rf Udbytte af råt produkt (1) 3''-acetat-4"-propionat 0,69 9,86 g 5 (2) 3',,4,,-diacetat 0,65 8,47 g (3) 4"-acetat 0,47 24,3 g (4) erythromycin D 0,35 3,0 g

Hver af de kombinerede fraktioner (1), (2) og (4) blev søjlechromatograferet pi 25 x 1000 mm søjler af 10 silicagel under anvendelse af chloroform indeholdende stigende mængder methanol (op til 5¾) til fremstilling af analytisk rene prøver som følger: (1) 3"-aeetat-4"-propionat 80 mg (2) 3",4"-diacetat 760 mg 15 (4) erythromycin D 1,0 g

Den kombinerede fraktion (3) blev kørt igen på den præparative søjle til opnåelse af et udbytte på 2,19 g analytisk rent 4"-acetat. De følgende fysisk-kemiske egenskaber blev fundet på disse produkter: 20 3»-Q-acetyl-4>,-0-propionvlervthromycin Di smp.

122-132 °C; intet meningsfuldt UV i methanol; IR (KBr) 3500, 2980, 2960, 1470, 1380, 1240, 1180, 1020, 1010, 755 cm"1.

3",4"-di-O-acetylerythromycin D: smp. 123-130 °C; 25 UV (MeOH) 282 nm (max); IR (KBr) 3490, 2980, 2960, 1740, 1460, 1380, 1230, 1180, 1050, 1010 cm-1.

DK 161339 B

27 V-O-acetylerythromycin D: smp. 124-130 °C; intet meningsfuldt UV i methanol; IR (KBr) 3510, 2980, 2940, 1742, 1460, 1380, 1240, 1180, 1110, 1050, 1010 cm”^.

3 Erythromycin D: identisk med tidligere karakteriseret erythromycin D.

EKSEMPEL 7

Erythromycin D ved hydrolyse af 3",4",di-0-acetylerythromycin D_ 10 3”,4"-di-0-acetylerythromycin D (27 mg) blev omrørt i 16 timer med 1,0 ml 0,1 N methanolisk Κ0Η ved stuetemperatur. Inddampning til tørhed gav et hvidt fast stof, som ved ethylacetat-syre-base-ekstraktions-oparbejdning ifølge eksempel 3 gav erythromycin D.

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk kompleks, omfattende erythromycin D, 3",4"-di-0-ace-tylerythromycin D, 3,,-0-acetyl-4,,-0-propionylerythro-mycin D og 4"-0-acetylerythromycin D, eller dets en- 5 kelte komponenter eller farmaceutisk acceptable syre additionssalte deraf, kendetegnet ved, at Nocardia sp. ATCC 39043 dyrkes i et vandigt næringsmedium indeholdende en assimilerbar kilde til carbon og nitrogen, indtil der er opnået væsentlig antibiotisk 10 aktivitet, hvorefter det antibiotiske kompleks skilles fra, og, om ønsket, en eller flere af komponenterne isoleres fra det antibiotiske kompleks, idet der, hvis erythromycin D er det ønskede produkt, eventuelt foretages en hydrolyse af esterne før isoleringen af ery-15 thromycin D, hvorpå der, om ønsket, dannes farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af den/de fremstillede forbindelser.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydrolysen af esterne udføres i dyrkningsvæsken 20 før fraskillelsen af det antibiotiske kompleks.

3. Kultur af Nocardia sp. ATCC 39043 til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

4. Kultur .ifølge krav 3, kendetegnet ved ,at den er i frysetørret form.