JPS6363554B2

JPS6363554B2 -

Info

Publication number: JPS6363554B2
Application number: JP58064395A
Authority: JP
Priority date: 1982-04-12
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1988-12-07
Also published as: IE54794B1; JPS6235755B2; DK158083D0; GR78831B; EP0092348A1; JPS61192298A; ATE20604T1; DK161339B; ES8404710A1; DE3364348D1; US4496546A; DK158083A; ES521321A0; JPH0150398B2; EP0092348B1; CA1194439A; DK161339C; JPS58198499A; JPS61181373A; IE830816L

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はエリスロマイシンＤおよびそのエステ
ル類からなる抗生物質複合物ならびにその製法に
関する。ノカルデイア（Nocardia）種（ATCC39043
（微工研菌寄第8649号））の培養物は発酵によりエ
リスロマイシンＤを、4″−Ｏ−アセチルエリスロ
マイシンＤ、3″，4″−ジ−Ｏ−アセチルエリスロ
マイシンＤおよび3″−Ｏ−アセチル−4″−Ｏ−プ
ロピオニルエリスロマイシンＤからなるエステル
とともに直接産生する。これらのエステルのうち
もつとも価値があるのは、3″，4″−ジアセテート
であつて、これは発酵の主成分である。もしエリ
スロマイシンＤ自体が所望の生成物なら、エリス
ロマイシンＤの単離前に該エステルの加水分解を
ブロス中で行うこともできる。エリスロマイシンＤは下記一般式を有するマク
ロライド抗生物質群の１つである：

【表】 Majer et al.、J.Am.Chem.Soc.、99、pp1620
−1622（1977）は工業規模のエリスロマイシンＡ
精製における側流からの微量成分としてエリスロ
マイシンＤを単離し同定した。本発明はエリスロ
マイシンＤを直接発酵により製造する方法を提供
するものである。エリスロマイシン系のすでに報告済のエステル
は発酵生産物としてではなく、化学的方法によつ
てつくられてきた。これらのエステルはエリスロ
マイシンＡとエリスロマイシンＢの両方の2′−ア
セテート、2′−プロピオネート、4″−アセテート
および4″−プロピオネートエステルである。
Jones et al.、J.Med.Chem.15、pp.631−634
（1972）；Martin et al.、J.Med.Chem.、15、
pp635−637（1972）参照。構造的に関連のあるエステル類は抗生物質のメ
ガロミシン複合体の１部としてすでに報告されて
いる。メガロミシンＡはＣ−６位に付加した第三
の糖部分を有しており、構造上エリスロマイシン
Ｃに一致する。この系列の他のものは下記メガロ
ミシンＡのエステルである：

【表】 Bartner et al.、J.Chem.Soc.、Perkin Ｉ、
pp.1600−1624（1979）参照。ノカルデイア（Nocardia）種ATCC39043の培
養物は水性媒体中で好気条件下に発酵させるとエ
リスロマイシンＤおよびその新規モノ−およびジ
エステル類、すなわち3″，4″−ジアセテート、
3″−アセテート−4″−プロピオネートおよび4″−
アセテートからなるマクロライド抗生物質の複合
体を産生する。上記系統的命名は炭水化物命名法
の原則による。下記のとおり、本発明の化合物の抗菌活性は当
分野で周知の方法によつて容易に測定される。こ
の活性によつて感受性細菌な帰因する動物または
ヒト感染症の全身的または局部的治療、生長促進
剤としての動物飼料、感受性細菌によつて生物学
的減成を受ける物質の防腐剤あるいは工業用殺菌
剤として利用できる。本発明のエステルのうち、3″，4″−ジアセテー
トは経口投与により高度に吸収されるので好まし
い。さらに、このジアセテートは発酵の主成分で
ある。医薬として適当な酸付加塩は塩酸、硫酸、硝
酸、リン酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、
ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、
２−ナフタレンスルホン酸およびメタスルホン酸
との酸付加塩である。エリスロマイシンＤおよびそのエステル類の抗
生物質複合体を産出できる微生物はノカルデイア
（Nocardia）種であり、メリーランド州ロツクビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨンのATCC39043として寄託されている。特許
がなされた場合、特許権の存続期間を通してアメ
リカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンでの
この微生物の寄託の永続性は保たれ、容易に一般
に分譲される。37CFR1.14および35USC112にも
とづいて出願が係属している限り寄託された微生
物を入手できる。寄託された培養物の一般への分
譲についてのすべての制限は特許された時点で完
全に取り除かれよう。この新規な微生物は日本の奈良県五所市で集め
られた土壌試料から得られ、フアイザー・インコ
ーポレーテツドのカルチヤー・コレクシヨン
N464−21とした。この微生物はグラム陽性で、
部分的に抗酸性で、白色気中菌糸体および容易に
は切断しない基質菌糸体を有し、その色は無色、
クリーム色、淡黄色ないし黄色がかつた色を呈し
ている。細胞壁を糖、アミノ酸およびミコレート
について分析した結果、この微生物がノカルデイ
ア（Nocardia）属に属することがわたつた。接種物は凍結乾燥標本をプレートに塗り、
ATCC＃172ブロス中で４時間28℃で振とう培養
することによつて調製した。次いでこれを20分間
遠心分離し、滅菌蒸留水で３回洗い、アクチノマ
イセタレス（Actinomycetales）目の微生物の確
認に通常使用されている培地上に接種した。インキユベーシヨンは28℃で行なわれ、結果は
経時的に測定されるが、14日目の測定値をとるの
がもつともふつうである。色は通常の用語で記載
されるが、正確な色はザ・カラーハーモニー・マ
ニユアル（The Color Harmony Manual）第４
版からの色片との比較で決定される。全細胞およ
び糖の分析方法はBecker等のAppl.Microbiol、
12：421−423；およびLecheralier等のJ.Lab.
Clin.Med.71：934−944、1968に記載されている。
オートクレーブで滅菌した湿つた菌糸体約30ｇを
使用してLecheralier等のJ.Bacteriol、105：313
−318、1971の方法によりミコレートを分析した。この微生物の特性は次の如くである：酵母エキス−麦芽エキス寒天（ISP＃２培地、デ
イフコ）生育良好、暗黄色（２：Ｃに近似）、中位盛り
上がり、しわあり、白色気中菌糸体、表裏同一、
可溶性色素なし。オートミール寒天（ISP＃３培地、デイフコ）生育乏しいか中位、白色、薄くなめらか、気中
菌糸体まばら、白色、裏面無色、可溶性色素な
し。無機塩−でんぷん寒天（ISP＃４培地、デイフ
コ）生育なし。グリセリン−アスパラギン寒天（ISP＃５培地、
デイフコ）生育良好、黄色がかつた色（１ 1/2ga、１ 1/
２ia、2ia）、中位の盛り上がり、しわ、白色の気
菌糸体、裏面黄色がかつた色（１ 1/2ia）、可溶
性色素なし。グルコース−アスパラギン寒天（ワツクスマン著
“The Actinomycetes”V.2、p328、1961の培地
＃２）生育良好、白色ないしクリーム色（１ 1/2
ca）、わずかに盛り上がり、裏面淡黄色（１ 1/2
ea）、可溶性色素なし。ツアペツク−庶糖寒天（ワツクスマンの上記文献
p328の培地＃１）生育良好ないし中位、白色、薄く、なめらか、
気中菌糸体まばらで顕微鏡下にのみ観察され、裏
面無色、可溶性色素なし。グルコース−酵母エキス寒天（ワツクスマンの上
記文献p331の培地＃29）生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄い、な
めらかないし少し粗い、気中菌糸体なし、裏面ク
リーム色、可溶性色素なし。エマーソンの寒天（ワツクスマンの上記文献
p331の培地＃28）生育中位、クリーム色（2ca）、薄い、なめら
かないしわずかに粗い、気中菌糸体なし、裏面ク
リーム色ないし淡黄色（2ca、2ea）、可溶性色素
なし。栄養寒天（ワツクスマンの上記文献p330の培地
＃14）生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄いない
し中位の盛り上がり、なめらか、気中菌糸体な
し、裏面クリーム色、可溶性色素なし。ゴードンおよびスミスのチロシン寒天（Gordon
and Smith、J.Bact.、69：147−150、1955）生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄い、な
めらか、気中菌糸体まばら、顕微鏡下でのみ観察
される、裏面無色ないしクリーム色、可溶性色素
なし。マレイン酸カルシウムの寒天（Waksman、
Bact.Rev.21、１−29、1957）生育中位、クリーム色ないし淡黄色（1ca、
1caと1eaの中間）、薄い、なめらか、いくつかの
白い斑点を伴う、気中菌糸体白色ないしクリーム
色、裏面淡黄色（1ea）、可溶性色素なし。カゼイン寒天（Gordon and Smithの上記文献）生育中位、白色、薄い、なめらか、白色の気中
菌糸体、裏面無色、可溶性色素なし。ゼラチン寒天（Gordon and Mihm、J.Bact.73、
15−27、1957）生育中位、白色、薄い、なめらか、縁に近い部
分がわずかにしわになつていることもある。気中
菌糸体白色、裏面無色ないしクリーム色（１ 1/2
ca）、可溶性色素なし。でんぷん寒天（上記文献）生育中位、白色、薄い、なめらか、あるいは近
縁部がわずかにしわになつており、気中菌糸体白
色、裏面クリーム色（１ 1/2ca）、可溶性色素な
し。ばれいしよにんじん寒天（Lecheralier、Lab.
Clin.Med、71、934−944、1968、30ｇのばれい
しよ、2.5ｇのにんじんおよび20ｇの寒天のみ使
用）生育中位、白色、薄い、なめらか、気中菌糸体
白色、裏面無色、可溶性色素なし。水道水寒天（２％）生育乏しく、白色、薄い、なめらか、深部、気
中菌糸体まばら、顕微鏡下でのみ観察され、裏面
無色、可溶性色素なし。形態学的特性グルコース−アスパラギン寒天上で５日目迄毎
日１度無糸分裂に関して研究した。気菌糸体の無
糸分裂は接種後５日して生じた。グルコース−ア
スパラギン寒天上で16日間接種培養した結果、次
のような形態学的観察がなされた：気中菌糸体は
白色、屈曲性、波状またはジグザグ、直径0.5−
0.9μｍであり、ふくらみと断片を含み、ふくらみ
は末端部、側部あるいは他層間にあり、単独ある
いは接種しており、球状の卵型ないし楕円形であ
つて、直径0.8−1.6μｍ、あるいは1.2−３×0.7−
1.8μｍであり；断片は1.8−６（あるいはこれより
長く）×0.7−0.9μｍ、走査電子顕微鏡で検鏡でき
る程なめらかであり；ふくらみと断片は両者とも
しばしば屈曲性の油滴を含んでいる。生化学的特性グラム陽性；部分的に抗酸性；メラニン生産
（−）；硫化水素生産（−）；硝酸塩生産（＋）；ゼ
ラチン液（−）；エスクリン、馬尿酸塩およびで
んぷんの加水分解（＋）（Gordon et rl、Int.J.
Syst.Bact.、24、54−63、1974）；アデニン、ヒ
ポキサンチンおよびキサンチンの分解（上記文
献）（＋）；マレイン酸カルシウム、カゼイン、セ
ルロース、チロシンおよび尿素の分解（上記文
献）（−）；リゾチームに対する耐性（上記文献）
（＋）；Jensen（Proc.Linn、Soc.N.S.W.55：231−
248、1930）あるいはLevineおよびSchoenlein
（Ａ Compilation of Culture Media、培地
＃2511、1930）のブロス中での生育なし；スキム
ミルク（デイフコ社製）上での凝集およびペプト
ン化なし。有機酸の資化（Gordon et al.、上記文献）アセテート、マレート、プロピオネート、ピル
ベートを資化し；ベンゾエート、シトレート、デ
キストリン、ラクテート、ムケート、オキザレー
ト、フエノール、サクシネートおよびタルトレー
トは資化せず。炭水化物からの酸生産（上記文献）フラクトース、ガラクトース、グルコース、グ
リセリン、イノシトール、マンニトール、マンノ
ース、ラフイノース、リボース、サリシン、でん
ぷんおよび庶糖から酸を生産し；アドニトール、
アラビノース、セロビオース、ズルシトール、エ
リスリトール、ラクトース、マルトース、メレジ
トース、メリビオース、ラムノース、ソルビトー
ル、ソルボース、トレハロース、キシロースおよ
びα−メチル−ｄ−グリコシドから酸を生産せ
ず。炭水化物の資化（上記文献）アラビノース、フラクトース、ガラクトース、
グルコース、グリセリン、イノシトール、マルト
ース、マンニトール、マンノース、メレジトー
ス、ラフイノース、リボース、サリシン、ソルビ
トール、でんぷん、庶糖、トレハロース、および
キシロースは資化され；セロビオース、ソルボー
スおよびα−メチル−ｄ−グリコシドは資化され
るかどうか疑わしく；アドニトール、ズルシトー
ル、エリスリトール、ラクトース、メリビオース
およびラムノースは資化されない。温度との関係（“ATCC Culture Collection
Catalog”14th ed.、p519、1980のATCC培地
＃196） 28℃で良好ないしすぐれた生育を示し、21℃と
37℃で良好な生育を示し、10℃と45℃で生育せ
ず、50℃で８時間生存する。細胞壁の分析細胞壁はメソ−ジアミノピメリン酸、アラビノ
ースおよびガラクトースを含んでいる。ミコレートの分析細胞壁は放線菌のミコレートを含有する。形態学的特性、ノカルドミコール酸、および
型細胞壁（メソージアミノピメリン酸、アラビノ
ースおよびガラクトース）は本発明の培養物がノ
カルジア属に位置することを示す。この培養物
は、いくつかの形態学的および生物化学的特性に
おいて、ノカルジア・パラフイナエ（Nocardia
paraffinae）〔イエンセン（Jensen）〕ワクスマン
（Waksman）およびヘンリツチ（Henrici）およ
びノカルジア・オチチデイス・カヴイアラム
（N.Otitidis−Caviarum）スニーダース
（Snijders）に関連している。それは、マルトー
スから酸を生成できないこと、安息香酸塩および
こはく酸塩を利用できないことおよび尿素を加水
分解できないことで、ノカルジア・パラフイナエ
（N.paraffinae）とは異なつている。５つの相違
点により、それはノカルジア・オチチデイス−カ
ヴイアラム（N.Otitidis−Caviarum）と識別さ
れる：すなわち、マルトースおよびトレハロース
から酸を生成できず、尿素の加水分解することが
できず、ミルク上で凝固せず、そして45℃で生育
しない。エリスロマイシンＤおよびそのエステル類
（3″，4″−ジ酢酸エステル、3″−酢酸エステル−
4″−プロピオン酸エステルおよび4″−酢酸エステ
ル）より成る、抗生物質複合物を生成するために
は、本発明のノカルジア種を３ないし13日間、液
内条件下適当には24−36℃で、かくはんと通気を
行ないながら、砂糖、でんぷん、グリセロールの
ような炭水化物源；大豆ミール、カサミノ酸、酵
母エキスのような有機窒素物質；穀物可溶物、魚
粉末綿実粉末のような生長物質；鉄、コバル
ト、銅、亜鉛等のような微量元素を含有する鉱酸
塩および緩衝剤としての炭酸または燐酸−カルシ
ウム、より成る培地上で発酵させる。この発酵に必要な接種物はノカルジア培養物を
培養された斜面またはルーびんから栄養細胞を掻
き取ることによつて製造された。斜面およびルー
びん上の初期生長に適する固体培地は、アメリカ
模式菌培養蒐集（ATCC）培地＃172である：グラム／リツトル庶糖 10 可溶性でんぷん 20 酵母エキス５ NZアミンＡ５炭酸カルシウム１蒸留水を加えて1000mlとする；KOHでPH7.0とす
る加える寒天 20 斜面からの栄養細胞が、振盪フラスコまたは接
種物槽のどちらかに接種するために用いられる；
または別法として、接種物槽は振盪フラスコから
接種される。振盪フラスコ中では、生育は、一般
に、４ないし６日でその最高に達するであろう
が、一方接種物槽内では、生長は、通常接種後３
ないし５日のうちに最も好ましい期間となるであ
ろう。発酵器は完全に無菌の条件下で、接種物フ
ラスコまたは槽からの栄養液体培地を接種され
て、４ないし６日間発酵させられることができ
る。通気は、振盪フラスコ内では振盪器上でかく
はんすることにより、あるいは、槽内では毎分、
液体培地１容積あたり空気1/2ないし２容積の速
度で、散布器を通じて無菌の空気を送りこむこと
により保持される。かくはんの速度は、用いるか
くはん機の型により；振盪フラスコは通常毎分
150から200サイクルで作動され、発酵器は毎分
300から1700回転で作動させられる。無菌性はい
つも保持される。温度は26℃と34℃の間に調節さ
れる。発酵中の発泡は、製造中および接種後無菌
的に必要とされるとき、精製した大豆油のような
無菌の消泡剤、またはその他の適当な消泡剤を用
いて抑制することができる。典型的な発酵培地〔フアイザー社（Pfizer
Inc）のコード文字表示による〕は、次の通りで
ある：

【表】

【表】抗生物質は、クロロホルム、酢酸エチルまたは
メチルイソブチルケトンのような、適当な、水と
混和しない有機溶媒を用いて、アルカリ性PHで全
液体培地を抽出することによつて回収することが
できる。この溶媒は、分離され、酸性水中に逆抽
出される。異なつたエリスロマイシンＡ、エリス
ロマイシンＤおよびそのエステル類は、酸性PH
（2.5から5.0）でかなり安定である。水性層を分
離し、PH8.0−9.0に調節して、同一または異な
る、水と混和しない有機溶媒で再抽出する。抗生
物質複合物を、溶媒の蒸発および残留物のクロマ
トグラフイーによつて回収する。この抗生物質複
合物の各成分を、さらにクロマトグラフにかける
ことにより分離する。上に限定した、本発明の抗生物質複合物を構成
する化合物の薬学的に許容し得る酸付加塩は、標
準的な方法によつて容易に製造される。例えば、
当量の酸を、有機または水性有機溶媒中で、遊離
アミンの形のこの化合物と化合させる。この塩
を、濃縮および／または非溶媒の添加によつて単
離する。ある場合には、この塩は、遊離アミンを
単離することなく、反応混合物から直接単離され
る。エリスロマイシンＤが所望の最終生成物である
ならば、精製されたエリスロマイシンＤの単離の
前に、この方法のどこかの段階で、エステル類を
加水分解するのが好適である。このことにより、
操作工程は最小となり、エリスロマイシンＤの収
率は最大となる。加水分解は、液体培地を、飽和
水酸化バリウムまたは水酸化ナトリウムまたは炭
酸ナトリウムまたはカリウムの希水溶液のような
塩基で弱塩基性にするだけで、液体培地上で実施
されることができる。別法として、加水分解は、
粗製濃縮物単離された抗生物質複合物、または、
単離されたエステル類について、水性またはアル
コール性溶媒中で上に限定した塩基を用いて実施
される。本発明の複合物のエリスロマイシンＤおよびエ
ステル類は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の
培地スペクトルに対し試験管内活性を示す、第
表は試験管内MIC（最小抑制濃度）試験の結果を
要約したものである。この標準試験のために、各
細菌を、栄養培地を含有し、連続的に希釈した濃
度の抗生物質を含有する一連の管内に接種する。
MICは、24時間という培地試験期間にわたつて
微生物の生長を妨げるその抗生物質の最低濃度で
ある。本発明の複合物のエリスロマイシンＤおよびエ
ステル類は、また、第表に要約されたように、
敏感な細菌による感染に対して生体内活性を示
す。そのような活性の決定には、５パーセントの
豚の異粘素中に懸濁させた試験細菌の標準化培養
物をマウスに腹腔内接種することにより、マウス
の急性の実験的な感染を起こさせる。感染の重さ
は、マウスが少なくとも細菌の1LD₁₀₀投与量
（LD₁₀₀：感染させられ処理されていない対照マ
ウスの100パーセントを一貫して殺すのに必要と
される最少細菌接種物）、を受けるように標準化
される。

【表】

【表】チルエリスロマイ
シンD
エリスロマイシン 54 25
A
試験化合物は、感染後1/2、４および24時間で、
種々の投与量水準で各感染マウス群に経口的に投
与される。試験の終りに、与えられた投与量での
処理動物の中の生存者の数を数えることにより、
この混合物の活性を評価する。活性は、与えられ
た投与量で生き残る動物の百分率として表わされ
るか、またはPD₅₀（感染から50％の動物を保護す
る投与量）として計算される。敏感な微生物によりひき起こされた、人を含む
動物における全身感染の治療には、本発明の複合
物の化合物は、通常は分割用量で、１日に2.5−
100mg／Kg、好適には５−50mg／Kg／日、の水準
で投与される。投与量の変動は、個体および微生
物の感受性によつて行なわれるであろう。これら
の化合物は、経口的または非経口的に投与される
が、好適な投薬経路は経口によるものである。診
療所で単離された微生物の感受性は、周知のデイ
スク−平板法によつて臨床検査室で常套的に試験
される。最適剤形の製造は、薬剤師の技術分野で周知の
方法によつて行なわれるであろう。経口投薬用に
は、これらの化合物は、単独であるいは、不活性
固体希釈剤、水溶液または種々の非毒性有機溶媒
のような製薬担体と組み合わせて、ゼラチンカプ
セル、錠剤、粉末、ロゼンジ、シロツプおよびこ
れに類するもののような剤形に処方される。その
ような担体には、水、エタノール、ベンジルアル
コール；グリセリン、プロピレングリコール、食
用油、乳糖、でんぷん、滑石、ゼラチン、ゴムお
よびその他の周知担体がある。非経口投薬用に
は、これらの化合物を、水、塩水、ごま油、およ
びこれに類するもののような薬学的に許容し得る
担体中に溶解または懸濁させる。懸濁性および分
散性を改良する試験を添加することもできる。敏感な微生物によつてひき起こされた、人間を
含む動物における表在性感染の局部的治療のため
には、本発明の複合物の化合物は、薬剤師の技術
分野で周知の方法により、５−200mg／剤形c.c.、
好適には10−100mg／c.c.の範囲の濃度で、外用水
薬、軟膏、クリーム、軟膏、ゲル、またはこれに
類するものに処方される。この剤形は、感染部位
に、任意に、通常は１日に少なくとも１回、適用
される。本発明の複合物の抗菌化合物を、生物的に分解
する物質の防腐剤として用いる時は、それらを、
少なくとも、生物的な分解をひきおこす細菌の生
長を阻害するに十分な濃度で生物的に分解する物
質と単に混ぜ合わせる。所望の目的を達成するの
に必要な濃度を決定するためには、常用の連続希
釈法を用いることができる。本発明の複合物の抗菌化合物を、食用家畜にお
ける生長促進剤として用いるときは、それらは低
水準（例えば、飼料１トンあたり化合物10ｇから
100ｇ）で与えられる。この化合物と飼料との混
合は、普通、二段階で行なわれ、最初に前混合物
を調製し（例えば化合物10−100ｇを普通の大豆
またはそれに類するもの4.54〜9.08Kg（10−20
ｂ）と混合する）、次いでこれを製粉のとき飼料
と混合する。これらの化合物を工業用の消毒剤として用いる
とき、それらは一般に希溶液として、消毒される
べき表面に適用される。本発明は、次の実施例により詳しく説明され
る。しかしながら、本発明は、これらの実施例の
特定の細部に限定されないことは理解されねばな
らない。実施例１ 2.5リツトルのポツト中での発酵 JL培地を用いて20のポツトを用意したが、各
ポツトあたり2.5リツトルの培地を用いた。１ミ
リリツトルの泡止剤を加えて、各容器を密封し、
120℃ 15p.s.i.で45分間殺菌した。各ポツトに、
１（２％）または２（４％）本のノカルジア種
ATCC39043の接種物フラスコを用いて接種し、
30℃で３ないし６日間発酵させた〔毎分1700回転
（RPM）でかくはんし、毎分１容積あたり１容積
で液体培地を通して空気散布した〕。発酵が完了
した時〔ミクロコツカス・ルテウス
（Micrococcus luteus）ATCC9431または枯草菌
（B.subtilis）ATCC6633に対する抗生物質デイス
ク評価に基づく〕、発酵器を停止させ、50％の水
酸化ナトリウムを用いてPH8.0ないし9.0に調整し
そして1/3の体積のメチルイソブチルケトンで抽
出した。溶媒層を遠心分離により分離した。泡立
てた後、この抗生物質を、PH3.0の酸性水中に逆
抽出して、分離し、使われた溶媒を捨てた。酸性
水を、PH8.0ないし9.0に調整した後、酢酸エチル
中に抽出した。溶媒を泡立たせ、無水硫酸ナトリ
ウムを用いて乾燥させ、濃縮した。濃縮物の重量
は2.5グラムであつた。この濃縮物をメタノールに溶解させ、溶離酸と
してメタノールを用いて、ヒドロキシプロピル化
架橋デキストランゲル〔フアーマシア・フアイ
ン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）
から得られるセフアデクス LH−20〕のカラム
を通した。活性なカツトを合わせて濃縮し、重量
約1.7グラムのシロツプとした。この濃縮物をシ
ルカゲル上のクロマトグラフにかけると、実施例
３に詳しく示したように精製された抗生物質複合
物を単離することができた。液体培地、抽出物およびカラムカツトの生物活
性は、枯草菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633、
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
ATCC 6538、またはミクロコツカス・ルテウス
（Micrococus luteus）ATCC9341の敏感な菌株
を用いることによつて追跡された。液体培地、抽
出物またはカラムカツト中の個々の成分は、次の
系、クロロホルム／メタノール９：１または３：
1V／Ｖまたはクロロホルム／アセトン／水酸化
アンモニウム25：25：1V／Ｖ／Ｖ、中のアナル
テク（Analtech）シリカゲルGF板を用い、この
展開した板をバニリン試薬（エタノール100mlお
よび85％リン酸50ml中５グラムのバニリン）で噴
霧する。TLCによつて視覚化された。各板は80
℃に加熱され、抗生物質は白の背景上で灰色ない
し青／紫であつた。個々の成分はまた、展開され
た板を寒天中の先述の細菌でおおい、テトラゾリ
ウムを加え、この板を１夜37℃で培養することに
よつても視覚化された。抗生物質は、赤味がかつ
た背景に対して透明な領域としてあらわれた。実施例２大規模なノルカルデイア種ATCC39043発酵 0.7リツトルのJDたはJL培地を含有する大きな
振盪フラスコを用意することによつて、大きな発
酵器（25ないし1000ガロン）内での規模拡大を行
なつた。振盪フラスコ接種物を、28℃で３ないし
６日間発酵させ、そして25、100または1000ガロ
ンのJLまたはJL2M−１培地を含有する、50、
250または1500ガロンの発酵器に接種するために
使用した。各発酵器は５ないし７日で収穫され
た。 1000ガロン発酵は、PH9.2で、200ガロンのメチ
ルイソブチルケトン（MIBK）を用いて、全液体
培地を抽出することによつて回収された。この
MIBK抽出物を水の層から分離し、PH3.4の酸性
水25ガロン中に逆抽出した。この酸性水をPH9.5
に調整し、10ガロンのMIBKで抽出した。MIBK
層を、PH2.5の酸性水１ガロン中に逆抽出して、
分離した。この酸性水を9.5に調整してから、１
リツトルの酢酸エチルで抽出した。溶媒層を泡立
たせた後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。
酢酸エチルを濃縮してほぼ乾燥させて、18グラム
を得た。その後、メタノール中のこの濃縮物をメタノー
ル中のLH20セフアデクスを降下させ、活性カツ
トを合わせて濃縮した。濃縮物の収量は12ｇで、
これからシリカゲル上で精製された抗生物質複合
物を分離することができた。実施例３精製された抗生物質複合物の単離ノカルデイア種ATCC 39043の50ガロン発酵
を、PH約9.0でメチルイソブチルケトンを用いて
抽出した。溶媒を除去すると、黒い油状残留物が
残るので、これを下記のように酸−塩基処理し
た。この油を、500mlの酢酸エチル（EtOAc）に
溶解させ、500mlの水を加えた。希NaOHを用
い、かくはんして、PHを9.0に調整し、水性層を
捨てた。EtOAc層を水500mlで層にして、かくは
んしながら燐酸でPHを3.0に調整した。EtOAc層
を捨て、EtOAc500mlを用いて酸性の水性部を層
にし、そして希NaOHを用い、かくはんしなが
らPHを9.0に調整した。酢酸エチル層を硫酸ナト
リウム上で乾燥させ、溶媒除去（Strip）して、
赤かつ色の油32.5グラムを得た。それからこの油
を、1200グラムのセフアデクスLH−20上のクロ
マトグラフにかけ、溶離剤としてメタノールを用
いて、粘性のあるゴムをほぼ16グラムを得た。
100％クロロホルムを用い、メタノールの量を増
して行く（５％までのメタノール）、シリカゲル
上のクロマトグラフイにより、抗生物質複合物を
２ｇ得た。実施例４エステルの液体培地内加水分解を伴なうポツト
発酵 TLC分析により、発酵年令の拡張が、PHの上
昇に伴ない、液体培地中のエステルに対するエリ
スロマイシンＤの割合を増大させることが観察さ
れた。そのため、液体培地中でのエステルのエリ
スロマイシンＤへの加水分解に対し、アルカリ性
の加水分解条件が確立された。発酵は、実施例１の方法に従つて、６のかく
はんされたポツト中の種々の培地（３）中で、
26℃で13日までの期間、実施された。加水分解の
ために、0.5mlの液体培地全体を飽和Ba（OH）₂水
溶液0.5mlと混合した。30℃で、水浴中で15分振
盪した後、0.92NのHCl0.2mlを添加することによ
りPHを6.0−8.0に調整した。そのままおよび加水
分解された液体培地について、標準としてのエリ
スロマイシンＤの3″，4″−ジ酢酸エステルと共に
黄色ブドウ球菌（Staph.aureus）005を用いる寒
天拡散（平板）検定を用いて、効力を評価した
（すなわち、活性はジ酢酸エステルを当量として
表わされる）。次の評価分析が決定された：

【表】加水分解後に、今やエリスロマイシンＤに富ん
でいる、濃縮抗生物質複合物は、実施例１および
２に従つて単離される。実施例５単離された抗生物質複合物の加水分解によるエ
リスロマイシンＤ先述の各実施例に従つて製造された抗生物質複
合物（16ｇ）を、メタノール中の濃NH₄OH20ml
で、室温で120時間処理した。この反応混合物を
溶媒除去（strip）して泡沫とし、酢酸エチルに
再溶解させた。実施例３の酸−塩基抽出処理法に
従つて、エリスロマイシンＤ（5.1ｇ）を回収し
た。実施例５エリスロマイシンＤ，3″，4″−ジ−Ｏ−アセチ
ルエリスロマイシンＤ，4″−Ｏ−アセチルエリ
スロマイシンＤおよび3″−Ｏ−アセチル−4″−
Ｏ−プロピオニルエリスロマイシンＤの単離先の各実施例に従つて製造した抗生物質複合物
（49.05ｇ）を、ヘプタン中に作製された、1600ｇ
のシリカゲル（230−400メツシユ）を詰めた分取
クロマトグラフイーカラム〔ジヨバン（Jobin）−
イボン（Yvon）クロマトスペク
（Chromatospec）上に置いた。溶媒を、クロロ
ホルムに、そしてその後、次第に量の増えるメタ
ノール（20％まで）を含有するクロロホルムに、
変えたとき、500mlづつの分画をとつた。各分画
を、溶離剤としての１：１クロロホルム：メタノ
ールと、実施例１に記載したバニリン噴霧とを用
いるTLCによつて検査した。個々の成分のRf価
および適当に合わせた分画の蒸発による粗生成物
の収量は次の通りである：

【表】合わせた分画(1)、(2)および(4)の各々を、25×
1000mmのシリカゲルカラム上のカラムクロマトグ
ラフにかけ、メタノールを順次増加させた（５％
まで）クロロホルム溶液を用いて、次のような分
析的に純粋な試料を生成した： (1) 3″−酢酸エチル−4″−プロピオン酸エステル
80mg (2) 3″，4″−ジ酢酸エステル 760mg (4) エリスロマイシンＤ 1.0ｇ合わせた分画(3)を、分取カラム上で再操作し
て、分析用4″−酢酸エステル2.19ｇを得た。これらの生成物に関して、次の物理化学的性質
がわかつた： 3″−Ｏ−アセチル−4″−Ｏ−プロピオニルエリス
ロマイシンＤ：融点122−132℃；メタノール中で
意味のあるuvはない；ir（KBr）3500、2980、
2960、1470、1380、1240、1180、1020、1010、
755cm^-1。 3″，4″−ジ−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤ：
融点123−130℃；uv（MeOH）282nｍ（最
大）；ir（KBr）3490、2980、2960、1740、
1460、1380、1230、1180、1050、1010cm^-1。 4″−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤ：融点124
−130℃；メタノール中で意味のあるuvなし；
ir（KBr）3510、2980、2940、1742、1460、
1380、1240、1180、1110、1030、1010cm^-1。エリスロマイシンＤ：先に特性を決定したエリス
ロマイシンＤと一致する。

Claims

【特許請求の範囲】１エリスロマイシンＤ、3″，4″−ジ−Ｏ−アセ
チルエリスロマイシンＤ、3″−Ｏ−アセチル−
4″−Ｏ−プロピオニルエリスロマイシンＤおよび
4″−Ｏ−アセチルエリスロマイシンＤからなる抗
生物質複合物。２ノカルデイア（Nocardia）種
（ATCC39043）（微工研菌寄第8649号）を資化性
の炭素源および窒素源を含有する水性栄養培地中
で充分な抗生物質活性が得られるまで培養し、エ
リスロマイシンＤ、3″，4″−ジ−Ｏ−アセチルエ
リスロマイシンＤ、3″−Ｏ−アセチル−4″−Ｏ−
プロピオニルエリスロマイシンＤおよび4″−Ｏ−
アセチルエリスロマイシンＤからなる抗生物質複
合物を分離することからなる該抗生物質複合物の
製法。