KR810000089B1

KR810000089B1 - A-35512 항생물질의 제조방법

Info

Publication number: KR810000089B1
Application number: KR770001196A
Authority: KR
Inventors: 하인즈 미켈 칼; 유겐 히겐스 캘빈; 데보노 마뉴엘
Original assignee: 에베레트 에프. 스미스; 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 1977-05-02
Filing date: 1977-05-02
Publication date: 1981-02-14

Abstract

내용 없음.

Description

A-35512 항생물질의 제조방법

제1도는 A-35512 구성요소 A2 염산염의 IR 흡수 스펙트럼 (kBr 페레트).

제2도는 A-35512 구성요소 B2 염산염의 IR 흡수 스펙트럼 (kBr 페레트).

제3도는 A-35512 구성요소 H 염산염의 IR 흡수 스펙트럼 (kBr 페레트).

제4도는 A-35512 구성요소 C 2 염산염의 IR 흡수 스펙트럼 (kBr 페레트)

제5도는 A-35512 구성요소 E 염산염의 IR 흡수 스펙트럼 (kBr 페레트)

본 발명은 항균제, 성장촉진제 및 사료로 유용한 항생물질 A-35512 구성요소 A, B, C, E, F, G, H의 제조방법에 관한 것이다.

미생물학적으로 활성인 관련요소인 A, B, C, E, F, G와 H를 구성하는 항생물질 A-35512 혼합물은 신규의 스트렙토마이세스 칸디두스(Streptomyces Condidus) NRRL 8156의 호기성 발효에 의해 제조한다.

A-35512 항생물질은 항균제이며 성장촉진제이고 반추동물과 가금에서 사료의 이용효율을 증가시킨다.

덧붙여, A-35512 구성요소 B는 충치와 여드름의 치료에 유용하다.

A-35512 항생물질은 글리코펩타이드 항생물질과 밀접하게 관련된다. A-35512 항생물질 화합물의 대체로 완전히 특징지우는 요소인 항생물질 A-35512 구성요소 B는 반코마이신(미합중국특허 제3,067,099호), A-4696 A, B, C(미합중국 특허 제3,952,095호), 아보파르신(미합중국 특허 제3,855,410호), 리스토마이신A(참조)와 리스토세린A(미합중국특허 제2,990,329호)를 함유하는 펩타이드를 포함하는 항생물질 그룹의 새로운 요소이다.

로마키나, 엔, 7판 인터내셔날 심포지움 오브 케미스트리 오브 내셔날 프로덕트스 625페이지, 1970〔참조 : Lomakina N., 7th In ternational symtosium pf Chenistry of national preducts, page P625, 1970〕

A-35512 항생물질은 예를들면 여러가지의 크로마토그라피용 대계에서의 이동과 아미노산 및 당함량이 기지의 항생물질과 다르다.

비록 많은 항균제가 오늘날 알려졌다 하더라도, 신규의 향상된 항생물질의 필요성이 요구되고 있다.

현재 항생물질 치료에서 한가지 문제점은 항생물질이 병원미생물에 대한 효력이 다르다는 점이다.

또 다른 문제는 현재 사용되는 항생물질에 대해 내성이 생기는 미생물의 종류가 점차 증가한다는 사실이다. 그러나 또 다른 문제는 개개의 환자가 특수 항생물질에 있어서 격렬한 반응 즉 과민증 및 또는 독작용으로 괴로움을 당한다는 사실이다.

최근의 치료제의 이러한 문제들 때문에 본 발명의 목적은 미생물에 의한 질병에 사용될 수 있는 새로운 항생제를 제조하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 또 다른 목적은 반추동물과 가금의 먹이 효용율을 증가시키기 위해 부가하는 기술을 제공하는 것이다. 음식물에 대한 욕구가 증가함에 따라 먹이 효용율은 점차 중요하게 되었다. 디에틸스틸베스테롤과 다른 에스트로겐은 동물과 가금의 먹이 효용율을 증가시킨다.

상기와 같이 처리한 고기에 남아있는 이러한 식품 첨가물의 잔사를 먹게되면 매우 해롭다. 그러므로 반추동물과 가금의 고기생산에 유용한 한정량의 먹이를 공급하여 효율을 증가시키는 신규의 방법이 실제로 요구된다. 항생물질 A-35512 혼합물 및 그것의 구성요소와 유도체는 이러한 방향에서 한층 진보된 것이다.

그러므로 본 발명은 다음에 상술한 것을 특징으로 하는 구성요소 A, B, C, E, F, G와 H 즉, A-35512 구성요소, A, A-35512 구성요소 B, A-35512구성요소 C, A-35512구성요소 E, A-35512구성요소 F, A-35512구성요소 G, A-35512구성요소H를 구성하는 항생물질 A-35512 혼합물의 제조방법에 관한 것이다.

a) 항생활성이 일어날 수 있는 실질적인 양을 얻을때까지 호기성 심부 발효 조건하에서 탄수화물, 질소와 무기염원을 함유하는 배지중에 스트렙토 마이세스 칸디두스 NRRL 8156 을 배양하거나 또는 A-35512를 만드는 그의 변이체를 배양하여,

b) 배지로부터 항생물질 A-35512 혼합물을 분리,

c) 항생물질 A-35512혼합물에서 항생물질 A-35512 구성요소 A, B, C, E, F, G와 H들의 분리를 특징으로 한다.

이러한 항생물질에서 재생산되는 개개의 구성요소의 수와 비율은 발효조건에 따라 변경될 것이다.

본 발명에 따른 항생물질을 임의로 본 명세서에서 A-35512 항생물질로 표시하고자 한다. 구성요소 B는 A-35512 혼합물의 주요 구성요소이다. B-35512 구성요소 B는 A-35512 혼합물에 존재하며, 혼합물로부터 각각 염산염으로써 발견된다. 각각의 구성요소는 예를들면 약염기성 이온 교환수지를 이용한 크로마토그라피를 사용하여 그의 유리염기(이온성 유리염소) 형태로 전환시킬 수 있다. 유리염기와 염산염의 형과 함께 A-35512 구성요소의 약학적으로 무독한 다른 염들도 사용된다.

용도면에 있어서, ＂A-35512 화합물＂이란 간략히 말해서, A-35512 구성요소 A, B, C, E, H와 그의 약학적으로 무독한 염을 함유하는 그룹으로부터 선택된 화합물을 말한다.

다음의 A-35512 구성요소의 IR 흡수 스펙트럼(kBr 페레트)은 다음과 같다.

그림 1 : A-35512 구성요소 A 2염산염 그림 4 : A-35512 구성요소 C 2염산염

그림 2 : A-35512 구성요소 B 2염산염 그림 5 : A-35512 구성요소 E 염산염

그림 3 : A-35512 구성요소 H 염산염

본 발명에 따른 A-35512 구성요소는 화합물들에 밀접하게 관련된다. 항생물질 A-35512 혼합물에서 발효를 시켜 7개의 항생물질 구성요소를 얻는다. 개개의 구성요소는 각각 구성요소 A, B, C, E, H로 분리된다. A-35512 혼합물은 물에 용해되고 메탄올, 에탄올과 같은 알코올에 부분적으로 녹는다.

그러나 다른 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테르, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 아세톤)에는 녹지 않는다.

[A-35512 구성요소 A]

A-35512 구성요소 A는 흰색의 무정형의 염기성 화합물이다. A-35512 구성요소 A는 다음의 원소분석치를 갖는다.

탄소 : 54.29％ 수소 : 5.19％ 질소 : 5.58％ 산소 : 33.76％ 염소 : 1.69％

A-35512 구성요소 A2 염산염은 흰색의 무정형 흡습성 화합물이다. A-35512 구성요소 A2 염산염은 다음의 원소 분석치를 갖는다.

탄소 : 51.03％ 수소 : 5.10％ 질소 : 4.75％ 산소 : 34.20％ 염소 : 4.80％

A-35512 구성요소 A2 염산염의 IR 흡수 스펙트럼(kBr 페레트)은 도면의 그림(Ⅰ)에서 볼수 있다.

가장 중요한 흡수 최대치는 다음에서 볼수 있다.

단위 : 3405(강), 3300(쇼올더), 2950(약), 1750(약), 1670(강), 1625(쇼울더), 1602(강), 1520(강), 1470(약), 1440(약), 1450(약), 1345(쇼올더), 1312(중간), 1225(중간), 1180(약), 1130(약), 1080(강), 1020(쇼울더).

A-35512 구성요소 A2 염산염의 분자량 2000을 사용하여 계산된 UV흡수 스펙트럼은 산성 및 중성 메탄올에서는 흡수 최대치가 282nm(ε11,700)이고, 염기성 메탄올에서는 흡수 최대치가 292nm(ε14,000)이다. A-35512 구성요소 A2 염산염의 UV 흡수 스펙트럼은 역시 22nm에서 말단흡수가 일어난다.

A-35512 구성요소 A2 염산염의¹³CNMR 스펙트럼(D₂O에서)은 다음의 특성을 갖는다.

^*디옥산 표준물질

A-35512 구성요소 A2 염산염은 다음의 비선광도를 갖는다.

-100(

, H₂O)

-400 (

, H₂O)

A-35512 구성요소 A2 염산염의 전기적정은 55％ 수용성 디메틸포름 아마이드에서 pka값이 4개의 그룹으로 나타난다. Pka; 7.35, 9.09, 10.49, 12.44(최초의 pH 6.2)

A-35512 구성요소 A 2염산염의 확실한 분자량은 약 2106으로, 적정을 하여 알 수 있다.

A-35512 구성요소 A 2염산염은 물에 녹고, 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올에 부분적으로 녹는다. 그러나 일반적으로 다른 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테트, 에틸아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)에는 불용이다.

A-35512 구성요소 A 2염산염은 pH 약 3 내지 10을 갖는 수용액에서 72시간 동안 안정하다.

산 가수분해된 A-35512 구성요소 A 2염산염을 아미노산 분석을 하여, A-35512 구성요소 A가 최소한 5개의 아미노산 잔기를 갖고 있고, 그중 1개는 글리신을 가지고 있음을 알 수 있다.

[A-35512 구성요소 B]

A-35512 구성요소 B는 흰색의 무정형의 염기성 화합물이다. A-35512 구성요소 b의 실험식은 C_97-99H_101-105N_8-9O_46-46Cl이다. 또한 다음의 평균 원소분석치를 갖는다.

탄소 : 53.97％, 수소 : 4.75％, 질소 : 5.25％, 산소 : 34.29％, 염소 : 1.59％

이러한 원소분석을 하여 더 바람직한 실험식을 얻는다.

C₉₈H₁₀₄N₉O₄₇Cl(계산치 : 탄소; 53.60, 수소; 4.75, 질소; 5.74, 산소; 34.30, 염소; 1.61)

다른 하나의 더 바람직한 실험식은 C₉₈H₁₀₃N₈O₄₇(계산치 : 탄소; 54.00, 수소; 4.75, 질소; 5.15, 산소; 34.50, 염소; 1.60)이다.

A-35512 구성요소 B의 분자량 2,000을 사용하여 계산된 UV흡수스펙트럼은 산성 및 중성메탄올에서는 흡수최대치가 282nm(ε15,000)이고 염기성 메탄올에서는 흡수최대치가 292nm(ε16,000)이다. 또한 말단흡수는 225nm에서 일어난다.

A-35512 구성요소 B는 다음의 비선광도를 갖는다.

-123°(

, H₂O),

-4460°(

, H₂O)

A-35512 구성요소 B를 전기 적정을 하여 66％ 수용성 디메틸포름아마이드에서 다음의 P^ka값을 갖는 4개의 그룹을 얻는다; 7.15, 8.81, 10.20, 12.00 또한 P^ka값이 13.50보다 더 큰 다른 그룹도 존재한다.

A-35512 구성요소 B의 확실한 분자량이 약 2143임을 전기 적정을 하여 알 수 있다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 흰색 결정성 화합물이다(50％ 수용성 메탄올에서). 비록 A-35512 구성요소 B 2염산염이 흡습성 물질이며 또한 뚜렷한 융점을 알아내지 못해도 열그래프를 하여 25℃에서 중량이 손실되고 그 결과 121℃에서 7.4％의 중량이 손실되며 135℃에서는 또 다른 손실이 일어나므로 분해됨을 알 수 있다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 다음의 원소분석치를 얻는다(평균).

탄소; 52.57％, 수소; 4.80％, 질소; 5.66％, 산소; 32.86％, 염소; 4.51％

원소분석에 의한 다른 하나의 실험식은 다음과 같다.

C₉₈H₁₀₃N₉O₄₇Cl·2HCl(계산치 : 탄소; 51.93, 수소; 4.65, 질소; 5.57, 산소; 33.20, 염소; 4.65)

A-35512 구성요소 B 2염산염의 분자량 2,000을 사용하여 계산된 UV스펙트럼은 산성 및 중성메탄올에서 최대흡수치가 282nm(ε12,000)이고, 염기성 메탄올에서 최대흡수치가 292nm(ε14,000)이다. A-35512 구성요소 B 2염산염의 UV스펙트럼은 225nm에서 말단흡수가 일어난다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 다음의 비선광도를 갖는다.

-128°(

, H₂O),

-475°(

, H₂O)

A-35512 구성요소 B 2염산염을 전기 적정하여 66％의 수용성 디메틸포름아마이드에서 다음과 같은 pka값을 갖는 4개의 적정그룹을 얻는다; 7.15, 8.87, 10.30, 12.10 또한 13.1보다 더 큰 pka값을 갖는 또 다른 그룹을 가지고 있다.

A-35512 구성요소 B 2염산염의 뚜렷한 분자량은 약 2027로 적정에 의해 결정되어 진다.

A-35512 구성요소 B 2염산염의 C¹³NMR(D₂O에서)은 다음과 같은 특성을 갖는다 :

^*디옥산 표준물질

메탄올-물로 결정화되는 A-35512 구성요소 B 2염산염은 다음과 같이 특징적인 분말엑스-레이회절양식(니켈로 필터를 댄 Cu⁺⁺복사장치, 1.5405λ, d=내측간격(A°))을 갖는다.

A-35512 구성요소 B 2염산염의 IR흡수스펙트럼(KBr페레트에서)은 도면의 그림 2에 있다. 가장 중요한 흡수최대치는 다음의 파수(Cm^-1)를 갖는다.

3420(강), 3300(쇼올더), 2950(약), 1752(약), 1675(강), 1620(쇼울더), 1605(강), 1520(강), 1470(약), 1440(약), 1410(약), 1345(쇼올더), 1345(중간), 1312(중간), 1225(약), 1180(약), 1135(약), 1080(강), 1020(약).

산으로 가수분해된 A-35512 구성요소 B 2염산염을 아미노산 분석을 하여 A-35512 구성요소 B가 최소한 5개의 아미노산 잔기를 갖고, 그중 1개가 글리신을 가짐을 알아낸다. A-35512 구성요소 B중 4개가 남아있는 아미노산 잔기는 복합적이며 A-35512 구성요소 A에서 나타난 것과 동일하게 나타난다. 어떠한 아미노산 잔기중 1개의 구조는 다음과 같다.

A-35512 구성요소 B 2염산염의 다음의 양을 함유하고 있는 것은 그것의 산-가수분해 생성물을 분석하여 알 수 있다 : 포도당, 과당, 만노즈, 람노즈, 3-아미노-2,3,6-트리데옥시-3-C-메틸-L-크실로-헥소피라노즈.

A-35512 구성요소 B 2염산염을 묽은산으로 가수분해하여 과당, 만노즈, 람노즈 그룹을 제거하여 특징있는 비당체 유도물질을 만든다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 에스테르화할 수 있는 최소한 한개의 하이드록실그룹을 갖는다.

A-35512 구성요소 B 염산염은 물에 녹으며, 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올에서 약간 녹는다. 그러나 다른 극성이 작은 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테트, 에틸아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)에서는 녹지 않는다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 PH 3내지 10의 수용액에서 72시간동안 안정하다.

[A-35512 구성요소 C]

A-35512 구성요소 C는 흰 무정형의 염기성 화합물이다.

A-35512 구성요소 C는 다음의 원소분석치를 갖는다.

탄소; 53.9％, 수소; 5.15％, 질소; 5.80％, 산소; 32.25％, 염소; 1.90％

상기의 원소분석에 의한 더 바람직한 실험식은 다음과 같다; C₈₄H₉₉N₈O₃₈Cl

A-35512 구성요소 C는 분자량이 1862이다.

A-35512 구성요소 C 2염산염은 다음의 원소분석치를 갖는다 :

탄소; 51.76％, 수소; 5.07％, 질소; 5.61％, 산소; 30.29％, 염소 4.88％

A-35512 구성요소 C 2염산염의 실험식은 C_83-85H_97-101N₈O_37-39Cl₃의 범위내에 있다. 원소분석을 하여 특히 더욱 바람직한 다음과 같은 실험식을 얻는다; C₈₄H₉₇O₃₈Cl. 2HCl(계산치 : 탄소; 52.2％, 수소; 5.1％, 질소; 5.8％, 산소; 31.5％, 염소; 5.4％)

A-35512 구성요소 C 2염산염의 IR흡수 스펙트럼(KBr페레트)은 다음의 도면중 그림 4에 있다. 가장 중요한 최대흡수치는 다음의 파수(m^-1)을 갖는다.

3370(강), 3280(쇼울더), 3040(쇼울더), 2980(쇼울더), 2920(약), 1740(약), 1658(강), 1620(약), 1589(중간), 1503(강), 1460(약), 1428(중간), 1385(약), 1295(중간), 1210(강), 1162(중간), 1120(약), 1060(강), 1005(중간).

A-35512 구성요소 2염산염의 분자량 2,000을 사용하여 계산된 UV흡수 스펙트럼은 산성 및 중성메탄올에서 최대흡수치가 282nm(ε14,600)이고, 염기성 메탄올에서 최대흡수치는 292nm(ε16,400)이다.

A-35512 구성요소 C 2염산염의 C¹³NMR스펙트럼(D₂O에서)은 다음과 같은 특성을 갖는다.

^*디옥산 표준물질

A-35512 구성요소 C 2염산염은 다음과 같은 비선광도를 갖는다.

-161°(

.05, H₂O)

-614°(

.05, H₂O)

A-35512 구성요소 C 2염산염의 전기적정은 66％ 수용성 디메틸포름아미드에서 다음과 같은 PKa값을 갖는 3개의 그룹을 가지고 있다; 7.30, 8.92, 10.99 또한 11.5보다 더 큰 PKa값을 갖는 2개 또는 그 이상의 그룹이 존재할 수 있다.

A-35512 구성요소 C2염산염의 뚜렷한 분자량은 전기적정에 의해 약 1982임을 알게 된다.

산으로 가수분해된 A-35512 구성요소 C2염산염의 아미노산 분석에 의해 이것은 최소한 5개의 아미노산 산기를 갖고, 그중 하나는 글리신임을 알 수 있다. 남아있는 4개의 아미노산 잔기는 아직 밝혀지지 않았다.

A-35512 구성요소 C2염산염은 물, 디메틸설폭사이드에서 녹고 수용성 디메틸포름아미드는 메탄올, 에탄올과 같은 알코올에서 부분적으로 녹으며, 더 작은 극성을 갖는 다른 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)에서는 녹지 않는다.

A-35512 구성요소 C2염산염은 pH 3 내지 10의 수용액에서 146시간 동안 안정하다.

[A-35512 구성요소 E]

A-35512 구성요소 E는 흰색 무정형의 염기성 화합물이다.

A-35512 구성요소 E는 다음의 원소분석치를 얻는다.

탄소 ; 54.84％, 수소 ; 4.73％, 질소 ; 5.26％, 산소 ; 32.67％, 염소 ; 1.72％

A-35512 구성요소 E 염산염은 흰색 무정형 화합물이다.

A-35512 구성요소 E 염산염은 다음의 원소분석치를 얻는다.

탄소 ; 52.67％, 수소 ; 4.59％, 질소 ; 5.55％, 산소 ; 33.51％, 염소 ; 3.62

A-35512 구성요소 E 염산염의 IR 흡수 스펙트럼(kBr 페레트)은 다음 도면의 그림 5에서 볼 수 있다.

가장 중요한 흡수 최대치는 다음의 파수(m^-1)에서 나타난다.

3360(강), 3220(쇼울더), 2900(약), 1725(약), 1650(강), 1580(중간), 1498(강), 1450(약), 1419(약), 1295(중간), 1205(중간), 1172(중간), 1110(약), 1060(강), 1000(약).

A-35512 구성요소 E 염산염의 UV 흡수 스펙트럼은 다음의 흡수 스펙트럼을 갖는다 ; 중성 메탄올에서는 270nm(SH)와 359nm(ε16,216)이고 산성 메탄올에서는 286nm(ε18,018)와 310nm(ε16,216), 354nm(ε17,568)이다. 이것은 분자량 2000을 기준으로 시행한 것이다.

A-35512 구성요소 E 염산염의 다음의 비선광도를 갖는다 ;

-108.3(

1, H₂O)

A-35512 구성요소 E 염산염의 전기적정은 66％ 수용성 디메틸포름아마이드에서 다음과 같은 pka 값을 갖는 3개의 적정그룹을 가지고 있음을 알 수 있다; 6.30, 9.09, 11.62 또한 12.5 또는 그보다 큰 pka 값을 갖는 1개 또는 2개의 그룹이 존재할 수 있다(초기의 pH 5.45).

A-35512 구성요소 E 염산염의 확실한 분자량은 2018로 적정에 의해 결정되어진다.

산으로 가수분해된 A-35512 구성요소 E 염산염의 아미노산 분석에 의해, A-35512 구성요소 E가 6개의 아직 밝혀지지 않은 아미노산 잔기를 가지고 있음을 알아낸다.

A-35512 구성요소 E 염산염은 물에 녹고, 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올에 부분적으로 녹으며, 대부분의 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)에 녹지 않는다.

[A-35512 구성요소 H]

A-35512 구성요소 H는 흰 무정형의 염기성 화합물이다.

A-35512 구성요소 H는 다음의 원소분석치를 갖는다.

탄소 ; 53.76％, 수소 ; 5.32％, 질소 ; 5.53％, 산소 ; 33,48％, 염소 ; 1.59％

A-35512 구성요소 H의 실험식은 C_85-87H_103-107N₈O_28-40Cl의 범위내에 있으며, 바람직한 실험식은 C₈₆H₁₀₄N₈O₃₉Cl이고 분자량은 1908이다.

A-35512 구성요소 H 염산염은 흰 무정형의 습윤성 화합물이다. A-35512 구성요소 H 염산염은 다음의 평균 원소분석치를 갖는다.

탄소 ; 53.10％, 수소 ; 5.37％, 질소 ; 5.35％, 산소 ; 30.12％, 염소 ; 3.78％

A-35512 구성요소 H 염산염의 IR 흡수 스펙트럼(kBr 페레트)은 다음 도면의 그림 3에 있다. 가장 중요한 흡수 최대치는 다음과 같은 파수(cm-1)를 갖는다; 3410(강), 3240(쇼울더), 2940(약), 1670(강), 1630(쇼울더), 1605(강), 1520(강), 1470(약), 1442(약), 1400(약), 1345(쇼울더), 1310(중간), 1225(중간), 1180(약), 1135(약), 1080(강), 1020(쇼울더)

A-35512 구성요소 H 염산염의 UV 흡수 스펙트럼은 산성 및 중성 메탄올에서는 흡수 최대치가 282nm(ε12,500)이고 염기성 메탄올에서는 흡수 최대치가 292nm(ε14,000)이며 분자량 2000을 사용하여 계산된다. A-35512 구성요소 H 염산염의 UV 스펙트럼은 역시 225nm에서 말단흡수가 일어난다.

A-35512 구성요소 H 염산염의 13CNMR 스펙트럼(D₂O에서)은 다음의 특성을 갖는다.

A-35512 구성요소 H 염산염은 다음의 비선광도를 갖는다 :

-123.5°(

1, H₂O)

A-35512 구성요소 H 염산염의 전기적정은 66％ 수용성 디메틸포름아마이드에서 다음과 같은 pka 값을 갖는 5개의 적정그룹이 있음을 알 수 있다; 5.0, 7.46, 9.80, 11.43, 13.02(초기 pH 5.93).

A-35512 구성요소 H 염산염의 확실한 분자량은 1660으로, 적정으로 알 수 있다.

산 가수분해된 A-35512 구성요소 H 염산염의 아미노산 분석에 의해 A-35512 구성요소 H가 최소한 5개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며 그중 1개는 글리신을 가지고 있음을 알 수 있다. A-35512 구성요소 H 중 남아있는 4개의 아미노산 잔기는 A-35512 구성요소 H와 B에 있는 것과 동일하다.

A-35512 구성요소 H 염산염은 물에 녹고, 메탄올, 에탄올과 같은 알코올에 부분적으로 녹는다. 그러나 대부분의 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)에는 녹지 않는다.

A-35512 구성요소 H 염산염은 pH 3 내지 10의 수용액에서 72시간 동안 안정하다.

A-35512 구성요소 A, B, C, E, H와 미량의 구성요소 F와 G는 1-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12) 용매계를 사용하여 종이 크로마토그라피를 하여 쉽게 분리할 수 있다. 사르시나 루테아(Sarcina lutea)를 사용하는 생물학적 자기 묘사법이 더 바람직한 검사방법이다. 이 계에서 A-35512 구성요소의 대략의 Rf치는 다음 표 Ⅰ과 같다.

[표 Ⅰ]

여러계에서 A-35512 구성요소 H는 항생물질 AM 374(미합중국 특허 3,700,768)의 크로마토그라피의 유형과 매우 유사한 측면도를 가지고 있다. 항생물질 A-35512 구성요소 H는 최소한 2개의 종이 크로마토그라피가 존재하므로 항생물질 AM 374와 구별된다. 이러한 2개의 계에서 A-35512 구성요소 H.2 HCl과 AM 374의 Rf치는 표 Ⅱ와 같다.

[표 Ⅱ]

몇개의 A-35512 구성요소는 고압 액체 크로마토그라피에 의해 분리될 수 있다. 상기의 크로마토그라피는 고정상으로 폴리아마이드(ZIPAX, 듀퐁)를 사용하고 이등상으로 1.33몰의 수용성 1염기성 인산 칼륨용액을 사용하며 UV(250nm)로 검사하도록 장치되어 있다. A-35512 구성요소를 다음 조건을 사용하여 HPLC로 대표적인 분리를 할 때 정체시간은 표 Ⅲ과 같다.

칼럼크기 : 1/8＂×6'

충진물질 : 폴리아마이드(ZIPAX, 듀퐁)

용 매 : kH₂PO₄(327g)/H₂O(1800㎖)

유 속 : 0.5㎖/분

챠드속도 : 2＂/시간

압 력 : 1500PSI

[표 Ⅲ]

A-35512 구성요소의 염산염 및 유리염기의 형태에 덧붙여 다른 약학적으로 무독한 A-35512 구성요소 A, B, C, E, H의 염도 역시 본 발명의 일부분이다. ＂약학적으로 무독인＂염이란 대체로 온혈동물에 대한 화합물의 독성이 염이 아닌 형태의 것에 비해 증가하지 않는 염을 말한다. A-35512 구성요소 A, B, C, E, H의 대표적인 적절한 염은 유기산 및 무기산(예를들면 황산, 인산, 아세트산, 호박산, 구연산, 젖산, 말레산, 푸말산, 팔리틴산, 콜린산, 파모인산, 유신산, D-글루타민산, d-캄포린산, 글루타린산, 글리콜린산, 프탈산, 주석산, 라우린산, 스테아린산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 솔빈산, 피크린산, 벤조산, 신나민산 등)과 반응시켜 형성된 염을 함유한다.

본 발명에 따른 신규의 항생물질은 항생물질의 활성이 지속하여 나타날 때까지 적절한 배지에서 호기성 조건하에 A-35512를 생산하는 균주인 스트랩토마이세스 칸다두스(Streptomyces Candidus) NRRL 8156을 배양함으로써 만들어진다. 항생물질은 발효물질에서 사용되는 여러가지의 분리 및 정제과정을 시행함으로써 생성된다.

A-35512 항생물질의 제제에 유용한 새로운 미생물은 에니웨톡 아톨(Eninwetok Atoll)로 모은 토양샘플에서 분리된다. 이 미생물은 왁스만이 발견한 신규의 균주인 스트랩토마이세스 칸디두스(Streptomyces Candidus, Krassilnikov)로 분류된다.

〔참조 : 이·비·셔링 및 디·고틀리프, ＂코퍼레이티브 디스크립션 오브 다잎 컬춰 오브 스트렙토 마이세스 Ⅱ, 스피시스 디스크립션 2차 연구 ;^*18(4) 279-392(1968) ; 에스.에이. 웩스맨, ＂더 악티노미세테스 2권, 종 및 속의 분류, 동정기술 E.B. Shirling과 D. Gottlieb, ＂Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces II. Species Descriptions from Second Study ; 18(4) 279-392(1968); S.A. Waksman , ＂The Actinomycetes Vo1.2, Classification, Identification, and Descriptions of Gonera and Species, 윌리암 윌킨스사판, 발티모어, 1961〕.

이러한 분류는 어떤 보족시험에 따라 다음 참조에 있는 세계적인 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로젝트에 언급된 방법에 기초를 두고 있다.

^*인터내셔날 제이·시스티메틱 박테리올 Intern. J. Systematic Bacteriol

〔참조 : 이·비·셔링 및 디·고트리프 ＂스트렙토미세스 종의 특성화방법＂ 인터내셔날·불·시스티메틱박테리올, 16 : 313-340(1966). E.B. Shirling and D. Gottlieb, ＂Methods for Characterization of Streptomyces Species＂, Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16 : 313-340(1966)〕.

색명은 ISCC-NBS 방법에 따라 색인된다.

〔캐이·엘·켈리 및 디·비·쥬드, ＂색검정의 ISCC-NBS 방법 및 색명사전＂ 미합중국 상무성 서. 553, 위싱톤 디·시., 1955. K.L. Kelly and D.B. Judd, ＂The ISCC-NBS Method of Determinding Colors and a Dictionary of Color Names＂, U.S. Department of Commerce Cir. 553, Washington D.C., 1955〕.

삽입구내의 도면은 트레스너(Tresner)와 백쿠스(Backus) 색열에 따라 정해지며(참조Ⅰ) 색표시는 밑줄을 긋는다. 메르즈(Maerz)와 파울(Paul)의 색명은 괄호로 묶는다(참조 Ⅱ). 배지는 별도의 지시가 없는한 30℃에서 14일간 배양시킨다.

〔참조 Ⅰ : 애치·디·트레스너 및 에스·제이·바쿠스 ＂시스팀 오브 컬러 휠스 포스트렙토미세테 텍소노미＂, 응용미생물학 Ⅱ : 335-338(1963). OH H.D. Tresner and S.J. Backus, ＂System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy＂, Appl. Microbiol Ⅱ : 335-338(1963)〕.

〔참조 Ⅱ : 애이·매르즈 및 앰·아르·쿨, ＂색사전＂ 매크로힐, 뉴욕, 1960. A.Maerz and M.R. Pqul, ＂Dictionary of Color＂, McGraw-Hill, New York, N.Y., 1960〕.

A-35512를 생산하는 균주인 모르폴로지(Morphology)의 특성

길고 구불구불한 포자체가 형성된다. 고리가 10 내지 50인 포자는 원주모양이고, 크기는 (0.7-1.05μ)×(1.4-3.5μ)이다. 스크레로치아형의 구조가 몇개의 배지에 형성된다. 빗자루모양 또는 다발형의 균사도 종종 관찰된다. 포자표면은 전자 현미경으로 관찰할 때 매끈하다.

[여러 배지상에 나타나는 배양의 특성]

미생물을 일반제조방법에 따라 선택된 생리학적 성질에 대한 연구를 한다. 관찰된 성질 및 특성은 다음과 같다.

미생물 NRRL 8156에 대한 탄소를 이용한 시험을 한 결과가 아래에 주어진다.

성장반응을 저지하는데 사용되는 부호는 다음과 같다.

A-35512를 생산하는 S. 칸디두스 NRRL 8156 균주의 특성은 다음 참조에 기술된 미생물의 특성과는 다르다.

〔참조 : 엘 우드 비 셔링 및 데이비드 고드리프, ＂코포레이티브 디스크립션 오브 스트렙토미세스 Ⅲ. 어디셔널 스피시스 디스크립션 프럼 lst, znd 스터디에＂, 인터내셔날 제이. 시스티메릭 박테리올. 18(2), 69-189(1968) ; 에스·애이. 웩스만, 더 악티노미세테스. 종 및 속의 분류, 동정 및 기술. Elwood B. Shirling and David Gottlieb, ＂Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces Ⅲ. Additional Species Descriptions from First and Second Studter＂, Intern. J. Systematic Bacteriol. 18(2), 69-189(1968); S.A. Waksman, ＂The Actinomycetes. Classification, Identification and Descriptions of Genera and species＂, Vol,2, 윌리암 윌킨스사판, Baltimore, Md., 1961〕.

이러한 차이점은 표에 요약되어 있다.

[표 Ⅳ]

A-35512 항생물질을 생성시킬 수 있는 스트렙토마이세스 칸디두스 균주는 NRRL 8156으로 알려져 있으며, 이것은 일리노이주 61604의 페오리아에 있는 미 농무성의 농업연구기관의 산하기관인 북부지방연구소에 저장된 원균주의 일부로부터 얻는다.

다른 미생물인 경우 A-35512를 만드는 균주인 스트렙토마이세스 칸디두스 NRRL 8156의 특성은 여러가지이다. 예를들면, NRRL 8156 균주의 인공적인 변종 및 변이체는 자외선, X-선, 고주파선, 방사선, 화학물질과 같은 여러가지 기지의 돌연변이시키는 물질로 처리하여 얻을 수 있다. 스트렙토마이세스 칸디두스에 속하고 A-35512 항생물질을 만들어내는 천연 및 인공적인 모든 변종 및 변이체는 본 발명에서 이용될 수 있다.

스트렙토마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 배양시키는 배지는 많은 배지 중 어떤 하나일 수 있다. 그러나 경제적으로 생산할 수 있는 최적의 수율을 얻을 수 있고, 생성물의 분리가 용이한 그러한 배지는 더 바람직하다. 예를들면 포도당, 갈근호정, 과당, 만니톨, 말토즈, 락토즈 등도 쓰일 수 있으나, 대규모 발효시의 더욱 바람직한 탄수화물원은 서당이다. 대두박, 선지피가루, 글루타민산과 같은 아미노산 등도 역시 질소원으로 쓰인다. 녹을 수 있는 팹톤분말이 더욱 바람직하다. 배지에 혼합할 수 있는 영양무기염 중에 아연, 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염화물, 탄산염, 황산염, 질산염, 그의 이온을 산출할 수 있는 보통 녹기 쉬운 염이 있다.

미생물의 성장과 발육에 필요한 필수 미량원소도 역시 배지에 첨가해 주어야 한다. 그러나 과량의 미량원소는 보통 미생물의 성장에서 불필요한 불순물로 될 수 있다.

기포발생이 문제가 될 때에는 대량 발효시에 폴리프로필렌글리콜과 같은 소량을 첨가하는 것이 필요하다.

A-35512 항생물질을 실제로 생산하기 위해서 탱크내에서 호기성 발효를 시키는 것이 더욱 바람직하다. 소량의 A-35512 항생물질은 진탕용 용기를 사용하여 배지에서 얻을 수 있다.

포자형의 미생물을 대형탱크에 접종시켜 항생물질을 생성시킬 때 보통 시간이 지체되므로 영양형 균주를 접종시키는 것이 더욱 바람직하다. 소량의 배지에 미생물의 포자형 또는 균사체를 접종시켜 새롭고 활발하게 성장하는 미생물 균주를 얻을 수 있다. 영양형 접종물질은 그후 대형탱크에 이동시킨다.

A-35512를 생성하는 미생물은 20°내지 40℃에서 자랄 수 있다. 최적온도는 30°내지 34℃이다.

호기성 배지의 제조과정 중 멸균된 공기를 배지로 송입시킨다. 미생물 성장에 필요한 탱크내의 공기의 양은 매분당 배지당 공기의 약 0.1부피(V/V/M)가 바람직하다. A-35512 항생물질 성장에 필요한 탱크내의 공기의 양은 0.25V/V/M일 경우 더욱 바람직하다.

발효시, 항생물질에 민감하리라고 알려진 미생물에 대한 항생물질 활성에 대해 고체 균사체의 육즙 또는 추출물을 시험함으로써 A-35512 항생물질이 생산될 수 있다. 이러한 항생물질은 시험하기에 유용한 실험미생물은 고초균(Bacillus subtills) NRRL 6633이다. 생물학적 시험법은 영양을 제한시킨 배지를 함유하는 한천 플레이트 위에 페이퍼 디스크 실험법으로 시행하는 것이 더욱 바람직하다.

호기성 발효조건하에서 생성시킨 후 A-35512 항생물질은 발효분야에서 알려진 방법에 의해 발효배지로부터 얻을 수 있다. A-35512를 생산하는 미생물을 발효시키는 동안 생성되는 항생물질 활성은 일반적으로 여과한 육즙에서 일어난다. 그러므로 균사체의 양을 제거하기 위해 처음으로 여과할 때 A-35512 항생물질이 최고로 회수된다. 여과한 육즙은 여러가지 방법에 따라 정제시켜 A-35512 혼합물을 얻을 수 있다. 플리아마이드칼럼에 여과한 육즙을 흡착시키고 물과 수용성 알코올의 혼액으로 칼럼을 용출시키는 방법이 더욱 바람직하다. 항생물질 활성을 나타내는 용출된 분획물을 모아 A-35512 혼합물을 얻을 수 있다. 이러한 방법을 사용하는 또 다른 한가지 방법을 용출된 분획물을 TLC에 기초를 두어 모으면 정제된 A-35512 구성요소 B와 풍부한 다른 A-35512 구성요소의 혼합물을 얻을 수 있다.

개개의 A-35512 구성요소를 더욱 정제시키기 위해 또 한번의 흡착과 추출과정을 갖는다. 알루미나, 실리카겔, 이온교환수지 등과 같은 흡착물질은 보통 잘 사용된다.

A-35512 구성요소는 염산염의 형태로 발효성 육즙에서 얻어진다. 또 다시 폴리아마이드로 분리시켜 A-35512 구성요소 B를 얻고, 남아있는 A-35512 혼합물의 일부분을 염산염으로 얻는다. 약염기성 이온교환수지를 사용하는 크로마토그라피와 같이 잘 알려진 방법에 따라 각각의 구성요소는 유리염기(염소이온유리)로 될 수 있다.

추출 또는 분리없이, 그러나 바람직하기로는 물을 제거하여, A-35512 항생물질의 원료로서 배지조정물 및 균사체를 함유하는 배지용 고체물을 사용할 수 있다. 예를들면, A-35512 항생물질의 활성이 나타난 후, 배지를 동결 건조시키고, 먹이 혼합물에 직접 혼합시킨다.

A-35512 항생물질 혼합물인 A-35512 항생물질 구성요소 A, B, C, E, H는 어떤 병원 미생물, 특히 그램양성균의 성장을 억제한다. A-35512 구성요소 A, B, C, H가 선택된 세균을 억제하는 최소 저지농도는 표준 한천-희석시험에 의해 결정되며, 다음 표 Ⅴ에 요약되어 있다.

[표 Ⅴ]

한가지 중요한 사실은 A-35512 항생물질이 다른 항생물질에 내성을 가진 미생물의 성장을 억제한다는 사실이다. 대표적 미생물에 대한 A-35512 구성요소 A, B, C, E, H의 활성(30mcg/oisc)을 표준-디스크 플레이트 시험을 한 것이 다음 표 Ⅵ에 있다. 활성도는 관찰된 억제영역의 직경(㎜)으로써 측정된다.

[표 Ⅵ]

표 Ⅶ은 A-35512 구성요소 B 2염산염을 또 한번 한천-희석시험을 한 결과이며 몇개의 그룹 A인 스트렙토코쿠스와 디플로코쿠스 뉴모니아에 대한 최소 저지농도는 다음과 같다.

[표 Ⅶ]

표 Ⅷ은 몇개의 D 그룹 스트렙토코쿠스에 대한 A-35512 구성요소 B를 처리하는 또 한번의 한천-희석시험의 결과이다.

[표 Ⅷ]

표 Ⅸ는 다른 그램양성미생물에 A-35512 구성요소 B2염산염을 한천-희석시험을 한 결과이다.

[표 Ⅸ]

^*페니실린-G에 민감함

^**페니실린-G에 내성임

^***페니실린-G에 내성임 ; 메티실린에 내성임

^****페니실린-G에 내성임 ; 메티실린에 내성임 ; 클린다마이신에 내성임

A-35512 항생물질은 역시 어떤 호기성 세균의 성장을 저지한다. 표 Ⅹ은 여러가지의 호기성 세균에 대한 A-35512 구성요소 B 2염산염의 활성을 표준 한천-희석시험을 한 결과이다.

[표 Ⅹ]

항생물질 A-35512 구성요소 B 2염산염은 실험적인 세균감염에 대한 항균활성을 생체내에 실험해 본다. A-35512 구성요소 B의 두가지 용량을 감염시킨 쥐에 피하 주사했을 때 관찰되는 활성은 ED₅₀값으로 측정된다. 〔시험동물의 50％를 치유시킬 수 있는 유효량(㎎/㎏) ; 참조 ; Warren Wick, et ol., J. Bacterial 81, 233-235(1961)〕

A-35512 구성요소 B 2염산염을 투여한 ED₅₀의 값은 표 XI에 있다.

[표 XI]

염기성 균주민 클로스크리디움 챠우베이(Clostridium chauvDeix) 〔소에 블렉레그(Black leg)를 일으키는 법원균〕를 감염시킨 쥐에 A-35512 구성요소 B 2염산염을 투여하면 역시 치유될 수 있다. 이러한 시험은 클로스트리디움 챠우베이를 함유하는 제제의 역가시험에 대한 U.S.D.A 보조검정방법에 따라 이루어진다. (SAM 200, 미농무성, 참조 ; 동식물 건강 검사소 비터리너스 써비스 시험실, 아메스, 아이오와 Ammal and plant Healsh Inspection Service, Veteri nary Services Laborat'ories, Ames, Iowa 50010, April 7, 1975, wnder 9 C.F.R 113.91) 시험결과는 표 XII에 주어진다.

[표 XII]

-35512 항생물질은 비교적 독성이 없다. 예를들면 절식시킨 콕스앤드할란 암쥐에 피하로 주사할 때 A-35512 항생물질은 비교적 독성이 없다. 예를들면 절식시킨 콕스앤드할란 ICR 암쥐에 피하로 주사할 때 A-35512 구성요소 A 2염산염의 LD는 8,000㎎/㎏ 보다 더 크다. 복강내 주사시 쥐의 A-35512 구성요소 B 2염산염의 LD₅₀은 대략 1356㎎/㎏이며 정맥주사시의 LD₅₀은 ＞1000 ＜1250㎎/㎏이다. A-35512 구성요소 C 2염산염과 A-35512 구성요소 E 염산염 300㎎/㎏ 이상을 쥐에 복강내 주사할 때에는 급성독성을 일으킨다.

A-35512 혼합물 및 화합물의 또 다른 중요한 성질은 동물 중 먹이이용 능력을 개선시킬 수 있는 능력을 말한다. 이러한 능력은 혹위의 발달된 기능을 갖는 반추동물에서 제시되어진다.

반추동물에서의 탄수화물 이용능력은 동물의 혹위를 자극시키는 처리법을 사용하여 아세테이트 또는 부티레이트 화합물보다는 오히려 프로피오네이트 화합물을 생산해냄으로써 증가된다. 〔참조 ; 처치외 수인, 다이제스티브 피지올로지 앤드, 뉴르리션 오브 루미넌트스 Church et al., im ＂Dogestive physiology 뭄 Nutrition of Ruminants＂ VOl 1971, pp 622 및 625〕.

다음 참조에 따라 부스럼이 있는 소의 먹이이용 효능을 생체내 시험을 하여 측정할 수 있다. 〔참조 ; P.Raum이 쓴 미합중국 특허 제3,794,732호 ; 특히 실시예 8〕. 표 XVIII은 A-35512 구성요소 2염산염으로 시험한 결과를 요약한 것이다. 이때 혹위의 프로피온산 농도의 몰 백분율은 21일간 처치하는 동안 5번 분석한 것의 평균치이다.

[표 XVIII]

A-35512 화합물 및 혼합물은 프로피온산을 증가시키는데 전형적으로 유효하며 또한 반추동물에 0.15 내지 10.0㎎/㎏/day의 비율로 경구로 투여할 때 먹이이용 효능도 유효하다. 가장 유용한 투여량은 약 1.0 내지 2.0㎎/㎏/day이다.

A-35512 혼합물 또는 화합물의 바람직한 투여방법은 이것을 동물의 먹이와 혼합시키는 것이다; 그러나 이것은 다른 방법 즉 정제, 물약, 환약, 또는 캡슐제의 형태로 투여할 수 있다. 이러한 여러 체형의 제제는 수의학 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 만들어질 수 있다. 각각의 용량단위는 처치되는 동물의 적당한 매일매일의 양에 따라 직접 A-35512 화합물 또는 화합물의 양을 함유한다.

A-35512 혼합물 및 화합물은 역시 동물의 성장촉진제로 유용하다. 싸움 잘하는 병아리에 A-35512 구성요소 B 2염산염을 톤당 20g의 비율로 먹이에 섞어 투여하면 체중이 증가하고 먹이 효율이 증가한다. 표 XVIII은 각각 두번 반복한 것에 대한 8마리의 새를 네번 반복하여 사용한 배터리식 시험을 한 결과를 요약한 것이다.

[표 XVIII]

표 XIX는 80마리의 새를 각각 12번 반복하여 시행하는 플로어-펜(floor-pen)식 시험을 한 결과를 요약한 것이다.

[표 XIX]

^*P

0.05

A-35512 혼합물 및 화합물은 톤당 A-35512 혼합물 또는 화합물 약 1g 내지 100g의 비율로 동물의 먹이에 투여될 때 가금의 성장을 촉진시키는데 유효하다.

본 발명에 따른 실험을 더욱 충분히 설명하기 위해서 다음의 실시예를 제공한다.

[실시예 1]

[A. A-35512 진탕발효]

스트렙토마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 동결 건조시킨 작은 알약을 멸균수 1 내지 2㎖에 녹인다. 이 용액을 박토 효모 맥아추출물(미쉬간주 디트로이트시 디프코실험실 ISP 제2호)을 함유하는 한천 사면배지에 접종시킨다.

이것을 약 7일간 30℃에서 배양시킨다.

성숙한 사면배양에 물 2㎖를 넣어 덮고 포자를 느슨하게 떼어놓기 위해 멸균된 피펫으로 문지른다.

이러한 포자현탁액 일부(2.5㎖)를 다음의 조성물을 갖는 영양용 배지 50㎖에 접종시킨다.

직경이 2인치짜리인 아-크가 250rpm에서 회전 진탕기상에서 30℃로 48시간 동안 접종한 영양형 배지를 250㎖짜리 엘렌 마이어 플라스크내에 넣고 배양시킨다.

배양시킨 영양용 배지(0.5㎖)를 다음의 조성을 갖는 생산용 배지 50㎖에 접종한다 ;

접종시킨 생산용 배지를 직경이 2인치인 아-크가 250rpm에서 회전하는 진탕기상에서 32℃로 8 내지 10일간 250㎖짜리 얼렌마이어 플라스크에 넣고 배양시킨다.

[B. A-35512의 탱크발효]

다량의 접종재료를 만들기 위해 상기 상술한 바와 같이 배양시킨 영양용 배지 20㎖를 영양형 배지의 조성과 똑같은 조성을 갖는 2단계의 영양성장배지 400㎖에 접종시킨다. 이러한 2단계의 배지를 2ℓ짜리 플라스크에 넣고 직경이 2인치짜리인 아-크가 250rpm에서 회전하는 진탕기상에서 32℃에서 24시간 동안 배양한다. 이와같이 제조한 2단계의 영양형 배지 800㎖를 멸균시킨 생산용 배지 100ℓ에 접종시킨다. 접종시킨 생산용 배지를 32℃의 온도에서 약 8 내지 10일간 165ℓ의 발효용 탱크에서 발효시킨다. 발효시킨 배지에 0.25v/v/M의 속도로 멸균한 공기를 송입시키고 통상의 교반기로 200rpm에서 교반시킨다.

[실시예 2]

실시예 1의 A에 상술한 바와 같이 제조한 영양형 균주가 있는 배지를 다음의 절차에 따라 액체질소가 유지되도록 한다.

작은(13-×100nm) 멸균한 스크류-캡튜브에 다음의 조성을 갖는 현탁제 2㎖를 넣는다.

이 현탁제에 상기 상술한 바와같이 제조한 48시간 배양시킨 영양형 균주를 함유하는 배지 2㎖를 가한다. 혼합한 용액을 얼리고 액상형 질소탱크의 가스상태에서 유지시킨다.

이와같이 저장한 영양형 균주를 함유하는 배지를 진탕 또는 발효용 탱크에 이용하기 위해 43℃의 수욕에서 바이알속에 넣는다. 바이알속에 녹여서 넣은 용액 일부분을(1㎖) 실시예 1의 A에서와 같은 조성을 갖는 영양형 배지 50㎖에 접종시킨다. 접종시킨 영양형 균주가 있는 배지를 실시예 1에서 상술한 바대로 진탕용 발효 또는 탱크발효를 위해 더 많은 접종용 물질을 만드는데 이용한다.

[실시예 3]

발효는 실시예 1의 방법에 따라 시행된다. 그러나 다음의 조성을 갖는 진탕용 및 탱크제조용 배지를 사용한다.

[실시예 4]

[A-35512 항생물질 혼합물의 분리]

실시예 1에 따라 수득된 전체의 발효용 육즙(250gal)을 육즙용 pH(pH 6.8내지 7.2)에서 여과보조제(하이플로 슈퍼-셀, 규조토, 죤스-만빌회사)를 사용하여 여과시킨다. 이와같이하여 수득한 맑은 여액을 분당 150㎖의 속도로 육즙여액 100㎖당 다중합 흡착제 10㎖(암벨라이트 XAD-4, Rohm and Haas CO)를 함유하는 칼럼에 통과시킨다. 분획물을 사르시나 루테아에 대해 표준디스크 시험법을 사용하여 생물학적 활성시험을 한다. 생물학적으로 불활성인 용출물을 버린다. 칼럼은 분당 150㎖의 속도로 물로 세척한다(육즙용량의

). 불활성인 물세척액은 버린다.

그후 칼럼을 분당 200㎖의 속도로 50％의 수용성 메탄올 용액(600㎖)을 넣고 용출시킨다. A-35512 항생물질 혼합물을 함유하는 용출물을 진동상태에서 ℓ당 A-35512 항생물질 혼합물 약 200g을 함유하는 15ℓ용량까지 농축시킨다.

[실시예 5]

[A-35512 항생물질 혼합물로부터 구성요소의 분리]

실시예 4에 의해 수득한 A-35512 항생물질 혼합물(메탄올 15ℓ에 약 3000g이 용해된)을 폴리아마이드 칼럼(Woelm, 100ℓ)으로 크로마토그라피한다. 칼럼에 분당 약 80내지 120㎖의 유속으로 비이온성 물을 넣어 용출시킨다.

분획물을 n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 30 : 3 : 12) 용매계에서 셀루로오즈 박층크로마토그라피 또는 종이 크로마토그라피를 사용하여 검사하고 또한 사르시나 루테아의 생물학적 자기 묘사법을 사용하여 검사한다.

용출물의 첫번째 100ℓ는 버린다. 그후 유속을 분당 약 160내지 200㎖로 변화시키고 12ℓ의 분획물을 모은다. 20개의 분획물을 이러한 방법에 따라 모은다.

이때 용출용매를 다음의 제조방법을 사용하여 물-메탄올 그래디엔트(gradient)로 변화시킨다.

메탄올 360ℓ를 갖는 용기를 120ℓ의 물을 갖는 용기에 사이폰한다. 물이 담긴 용기에서 혼합용액을 교반하고 칼럼속으로 주입시킨다. 24개의 분획물(각각 24ℓ)을 유속 200내의 300㎖/분에서 모은다.

생물학적 자기 묘사법에 의해 관찰된 결과중에서 분획물이 무리를 모아 진공상태에서 증발 건고시켜 A-35512 구성요소 2염산염을 얻는다.

다음은 구성요소의 혼합물의 양이다.

[실시예 6]

[염소이온이 없는 A-35512 구성요소 B의 제조]

실시예 5에 의해 수득한 A-35512 구성요소 B 2염산염 정제물을 물 40㎖에 녹이고 유속 0.5㎖/분으로 2.5-×18-㎝ 이온교환칼럼(BiO-Rad AG 3-4×, OH)에 통과시키면 비이온성 물과 함께 용출된다. 첫번째 용출물(5㎖)은 버린다. 다음의 용출물(50㎖)을 진공상에서 증발 건조시켜 약 1.59％의 염소를 함유하는 백색의 분말상으로써 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 B 0.76g을 수득한다. 66％의 수용성 디메틸포름아마이드에 있는 이러한 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 B 용액은 pH 9.13이다.

[실시예 7]

[A-35512 구성요소 A의 정제]

실시예 5(분획물 1-10)에 의해 수득한 A-35512 구성요소 A 2염산염(1g) 일부의 정제물을 50％ 수용성 메탄올 5㎖에 용해시킨다. 이 용액을 실시예 5에서 제조한 3-×16-㎝ 산성알루미나(M.Woelm)칼럼에서 크로마토그라피한다. 칼럼은 유속 0.5㎖/분에서 50％ 수용성 메탄올에 용출된다. 분획물 5㎖를 모은다; 모든 분획물은 실시예 5에서 상술한 바와같이 박층 생물학적 자기 묘사법으로 분석한다. 이러한 시험에 기초를 두어 분획물 7-15를 모으고 감압하에서 소량이 될때까지 농축시킨후 동결 건조시켜 A-35512 구성요소 A 2염산염(471％의 염소) 0.3g을 수득한다.

[실시예 8]

[염소이온이 없는 A-35512 구성요소 A의 제조]

실시예 7에 의해 제조된 A-35512 구성요소 A 2염산염 200㎎을 물 10㎖에 녹인다 : 이 용액을 0.5㎖/분의 유출속도로 1.5-×10-㎝ 이온교환칼럼(Bio-Rad AG 3-4, OH)에 주입시키고 비이온성 물로 용출시킨다. 초기의 용출물 10㎖를 버린다. 다음의 용출물 20㎖를 감압하에서 소량이 될때까지 농축시킨 후 동결 건조시켜 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 A 115㎎을 수득한다.

[실시예 9]

[A-35512 구성요소 C의 제조]

실시예 5(분획물 25-31)에 의해 수득된 A-35512 구성요소 2염산염(15g) 일부의 정제물을 비이온성물(40㎖)에 녹인다. 이 용액을 다음 참조의 4-×115-㎝ 폴리아마이드 칼럼에 넣는다.

참조 : MN, ＞0.07mm, Brinknan, Instwmems INC; 제조품을 일야 수세함.

칼럼을 분당 3㎖의 유출속도로 비이온성 물로 용출시킨다. 첫번째 용출물(250㎖)을 버린다 : 그후 분획물 24㎖를 얻는다.

분획물은 박층 크로마토그라피로 검지한다. 셀루로즈 활석판(알루미늄 쉬-트; E.Merck, W.Germany), 2급-부탄올; 피리딘 : 아세트산 : 물(10 : 10 : 3 : 8)용매계와 고초균을 검지 미생물로 사용한다. 활석판 시험에 의해 분획물 1-33을 수득하고 진공상에서 150㎖까지 농축시킨 후 동결 건조시킨다.

일부분 정제된 A-35512 구성요소 C 2염산염을 2번이상 똑같은 조건을 사용하여 크로마토그라피한다. 매번 분획물 1-33을 모으고 진공상에서 농축시켜 150㎖를 모아 동결 건조시킨다. 3개의 칼럼으로부터 3개의 동결 건조시킨 샘플을 모아 12.3g의 일부 정제된 A-35512 구성요소 C 2염산염을 수득한다.

이러한 A-35512 구성요소 C 2염산염을 상기에 상술한 바와같이 또 다른 폴리아마이드칼럼으로 크로마토그라피하여 더욱더 정제시킨다. 그러나 분당 1㎖의 유출속도로 15㎖의 분획물 36-58을 모아 진공상태에서 농축시켜 150㎖를 수득하여 동결 건조시켜 더욱더 정제된 A-35512 구성요소 C 2염산염 5.3g을 수득한다.

A-35512 구성요소 C 2염산염을 5-×41-㎝ 산성 수산화알루미늄(woelm)칼럼으로 크로마토그라피하여 마지막으로 정제시킨다. 칼럼을 충진시키고 50％의 수용성 메탄올로 세척한다. 세척한 용출물이 맑을때까지 A-35512 구성요소 C(5.3g을 50％ 수용성 메탄올 30㎖로 녹임)를 칼럼에 주입한다. 칼럼을 분당 1㎖의 유출속도로 50％ 수성메탄올을 사용하여 용출시킨다. 12㎖의 분획물을 모으고 먼저 상술한 바와같이 활성 생물학적 자기묘사법으로 검지한다. 분획물 22-74를 모으고 진공상에서 농축시켜 250㎖까지 얻어 동결 건조시킨다. 이때 A-35512 구성요소 C 2염산염 3.86g을 수득한다.

[실시예 10]

[염소이온이 없는 A-35512 구성요소 C의 제조]

실시예 9에 의해 제조된 A-35512 구성요소 C 2염산염 200㎎은 실시예 9의 제조방법을 사용하여 약 염기성 이온교환수지로 크로마토그라피하여 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 C 156㎎을 수득한다.

염소이온이 없는 A-35512 구성요소 C는 약 1.90％의 염소를 함유한다.

[실시예 11]

[A-35512 구성요소 E의 정제]

실시예 5(분획물 32-44)에 의해 수득한 A-35512 구성요소 E 염산염 일부의 정제물(8.1g)을 비이온성 물(40㎖)로 녹이고 이 용액은 제조품을 일야 수세한 5-×110-㎝ 폴리아마이드칼럼(MN, ＜0.07mm, Brinkman, Instruments, Inc)에 주입시킨다. 칼럼을 20㎖/15분의 유출속도로 비이온성물을 사용하여 용출시키고 20㎖의 분획물을 모은다. 분획물 118에서 50％ 수성메탄올로 용출제를 교환한다. 분획물은 실시예 10에 상술한 박층 크로마토그라피의 생물학적 자기 묘사법으로 검지한다.

분획물 148-195의 A-35512 구성요소 E를 모으고 감압하에서 농축시켜 150㎖를 얻으며, 이것을 동결 건조시켜 A-35512 구성요소 E 염산염 2.7g을 수득한다.

이렇게 정제된 A-35512 구성요소 E 염산염 일부(615㎎)를 50％ 수용성 메탄올(5㎖)에 녹이고 용출물이 맑을때까지 50％ 수용성 메탄올로 일야 세척한 1.5-×50-㎝ 산성 수산화알루미늄에 제조품을 주입시킨다. 칼럼을 분당 1㎖의 유출속도로 50％ 수용성 메탄올을 사용하여 융출시켜 10㎖의 분획물을 모은다. 다시 분획물을 박층크로마토그라피의 생물학적 자기 묘사법으로 검지한다. 분획물 5-8을 모으고 감압하에서 농축시켜 약 10㎖를 모은다. 비이온성 물(약 50㎖)을 가하고 동결 건조시켜 A-35512 구성요소 E 염산염 480㎎을 수득한다.

[실시예 12]

[염소이온이 없는 A-35512 구성요소 E의 제조]

실시예 11에 의해 제조된 A-35512 구성요소 E 염산염(200㎎)을 실시예 9의 제조방법을 사용하여 약염기성 이온교환수지로 크로마토그라피한다. 이때 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 E 170㎎이 수득된다. 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 E는 약 1.72％의 염소를 함유한다.

[실시예 13]

[A-35512 구성요소 H의 정제]

실시예 5(분획물 1-10)에서 수득된 A-35512 구성요소 H 염산염 일부의 정제물(30g)을 메탄올 : 물(7 : 3)용액 최소량에 녹인다. 이때의 용액을 참조에 의한 산성 수산화알루미늄 칼럼에 흡착시킨다.[참조 : 3-×60-㎝; Woelm; 메탄올로 충진시키고 용출물이 맑을때까지 메탄올로 용출시킨다. 그후 칼럼을 4㎖/분의 유출속도에서 메탄올로 용출시킨다. 24㎖의 분획물을 모은다. 분획물 59에서 용출제는 메탄올 : 물(1 : 1)로 교환한다.

분획물을 클로로포름 : 메탄올 : 수산화암모늄(2 : 3 : 1) 용매제를 사용하여 TLC로 검지하고 알칼리성 pH에서 고초균을 사용한 생물학적 자기묘사법으로 검지한다.

분획물 51-118을 모으고 진공하에서 증발농축시켜 정제된 A-35512 구성요소 H 염산염 6.4g을 수득한다.

[실시예 14]

[염소이온이 없는 A-35512 구성요소 H의 제조]

실시예 13에 의해 제조된 A-35512 구성요소 H 염산염(200㎎)을 실시예 8의 제조방법을 사용하여 약 염기성 이온교환수지로 크로마토그라피하면 염소이온이 없는 A-35512 구성요소 H 143㎎이 수득된다.

이것은 약 1.59％의 염소를 함유한다.

Claims

탄수화물, 질소, 무기염의 동화원을 함유하는 배지에 실질적인 양의 항균작용을 갖는 물질이 생성될때까지 호기성 심층배양 조건하에서 스트렙토마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 배양하여 항생물질 A-35512 혼합물(A-35512 구성요소 A, A-35512 구성요소 B, A-35512 구성요소 C, A-35512 구성요소 E, A-35512 구성요소 F, A-35512 구성요소 G, A-35512 구성요소 H)을 제조하는 방법.