KR810000327B1 - 항생물질 a-35512 구성요소 b 비당체의 제조방법 - Google Patents

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Description

항생물질 A-35512 구성요소 B 비당체의 제조방법

제1도는 A-35512 구성요소 B 비당체 염산염의 ir 흡수 스펙트럼(뉴졸뮬).

본 발명은 항균제로 유용한 항생물질 A-35512 구성요소 B 비당체의 제조 방법에 관한 것이다.

미생물학적으로 활성인 관련요소인 A, B, C, E, F, G와 H를 구성하는 항생물질 A-35512 혼합물은 신규의 스트렙토 마이세스 칸디두스(Ssreptomyces candidus) NRRL 8156의 호기성 발효에 의해 제조한다. A-35512 구성요소 B를 약산으로 가수분해하여 몇개의 당을 제거하여 A-35515 구성요소 B의 비당체를 제조한다.

A-35512 항생물질은 항균제이며, 성장촉진제이고 반추동물과 가금에서 사료의 이용효율을 증가시킨다. 덧붙여, A-35512 구성요소 B는 충치와 여드름의 치료에 유용하다.

A-35512 구성요소 B 비당체 및 그의 약학적으로 무독한 염은 어떤 병원성 미생물, 특히 그람양성 세균의 성장을 억제한다.

A-35512 항생물질은 글리코펩타이드 항생물질과 밀접하게 관련된다. A-35512 항생물질 화합물을 주로 특징지우는 요소인 항생물질 A-35512 구성요소 B는 반코 마이신(미국 특허원 제3,067,099호), A-4696A, B, C(미국특허원 제 3,952,095호), 아보파르신(미국특허원 제3,855,410호), 리스토마이신 A(참조)와 리스토세린 A(미국특허원 제2,990,329호)와 같은 펩타이드를 포함하는 항생물질 그룹의 새로운 요소이다〔참조 : Lomakina, N; 7th International Symposium of Chemistry of National Products, Riga Nativa page 625, 1970〕. A-35512 항생물질은 예를들면 여러가지의 크로마토그래프용 매계에서의 이동과 아미노산 및 당함량이 기지의 항생물질과 다르다.

비록 많은 항균제가 오늘날 알려졌다 하더라도, 신규의 향상된 항생물질의 필요성이 요구되고 있다.

현재 항생물질 치료에서 한가지 문제점은 항생물질이 병원미생물에 대한 효력이 다르다는 것이다.

또 다른 문제는 현재 사용되는 항생물질에 대해 내성이 생기는 미생물의 종류가 점차 증가한다는 사실이다. 그러나 또 다른 문제는 개개의 환자가 특수 항생물질에 있어서 격렬한 반응 즉 과민증 및 또는 독작용으로 괴로움을 당한다는 사실이다.

최근의 치료제의 이러하 문제들 때문에 본 발명의 목적은 미생물에 의한 질병에 사용할 수 있는 새로운 항생제를 제조하고자 하는 것이다.

또 다른 목적은 반추동물과 가금의 먹이 효용율을 증가시키기 위해 부가하는 기술을 제공하는 것이다. 음식물에 대한 욕구가 증가함에 따라 먹이 효용율은 점차 중요하게 되었다. 디에틸 스틸베스테롤과 다른 에스트로젠은 동물과 가금의 먹이 효용율을 증가시킨다. 먹을때 상기와 같이 처리한 고기에 남아있는 이러한 식품 첨가물의 잔사는 매우 해롭다. 그러므로 반추동물과 가금의 고기생산에 유용한 한정량의 먹이를 공급하여 효율을 증가시키는 신규의 방법이 실제로 요구된다. 항생물질 A-35512 혼합물 및 그것의 구성요소와 유도체는 이러한 방향에서 한층 진보된 것이다.

본 발명은 항생물질 A-35512 구성요소 B 비당체와 그의 유도체를 만드는 제조방법에 관한 것이다.

a) 항생활성이 일어날 수 있는 실질적인 양이 얻어질 때까지 호기성 심부 발효조건하, 탄수화물, 질소와 무기염원을 함유하는 배지중에 스트렙토 마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 배양,

b) 배양배지에서 항생물질 A-35512 혼합물의 분리,

c) 항생물질 A-35512 구성요소 B에서 항생물질 A-35512 구성요소 B 비당체의 제조를 특징으로 한다.

구성요소 B는 A-35512 혼합물의 주요 구성요소이다. A-35512 구성요소는 A-35512 혼합물에 존재하며, 혼합물로부터 각각 염산염으로써 발견된다. 각각의 구성요소는 예를들면 약 염기성 이온 교환수지를 이용한 크로마토그라피를 사용하여 그의 유리염기(이온성 유리염소)형태로 바꾸어질 수 있다. 유리염기와 염산염의 형과 함께 A-35512 구성요소의 약학적으로 무독한 다른 염들도 사용된다.

용도면에 있어서 ＂A-35512화합물＂이란 간략이 말해서 A-35512 구성요소 A, B, C, E, H와 그의 약학적으로 무독한 염을 함유하는 그룹으로 부터 선택된 화합물을 말한다.

다음과 같이 A-35512 구성요소 B의 물리화학적 성질을 설명한다.

[A-35512 구성요소 B]

A-35512 구성요소 B는 흰 무정형의 염기성 화합물이다. A-35512 구성요소 B의 실험식은 C_97-99H_101-105N_8-9O_46-48Cl이다. 또한 다음의 평균 원소 분석치를 갖는다.

탄소 : 53.97%, 수소 : 4.75%, 질소 : 5.25%, 산소 : 34.29%, 염소 : 1.59%.

이러한 원소분석을 하여 더 바람직한 실험식을 얻는다 : C₉₈H₁₀₄N₉O₄₇Cl(계산치; 탄소 : 53.60, 수소 : 4.75, 질소 : 5.74, 산소 : 34.30, 염소 : 1.61) 다른 하나의 더 바람직한 실험식은 C₉₈H₁₀₃O₄₇Cl(계산치; 탄소 : 54.00, 수소 : 4.75, 질소 : 5.15, 산소 : 34.50, 염소 : 1.60)이다.

A-35512 구성요소 B의 분자량 2,000을 사용하여 계산된 UV흡수 스펙트럼은 산성 및 중성메탄올에서는 흡수최대치가 282nm(ε 15,000)이고 염기성 메탄올에서는 흡수최대치가 292nm(ε 16,000)이다.

또한 말단 흡수는 225nm에서 일어난다.

A-35512 구성요소 B는 다음의 비선광도를 갖는다.

A-35512 구성요소 B를 전기 적정을 하여 66% 수용성 디메틸포름 아마이드에서 다음의 pka값을 갖는 4개의 그룹을 얻는다 : 7.15, 8.81, 10.20, 12.00 또한 pka값이 13.50보다 더 큰 다른 그룹도 존재한다.

A-35512 구성요소 B의 확실한 분자량이 2143임을 전기 적정을 하여 알아낸다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 흰 결정성 화합물이다. (50%수용성 메탄올에서) 비록 A-35512 구성요소 B 2염산염이 흡습성 물질이며 또한 뚜렷한 융점을 알아내지 못하고 온도 자기기를 사용하여 검사하면 25℃에서 중량 손실이 시작되며 그 결과 121℃에서 7.4%의 중량이 손실되고 135℃에서는 또 다른 손실이 일어나 분해됨을 알아낸다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 다음의 원소분석치를 얻는다(평균) : 탄소 52.57%, 수소 : 4.80%, 질소 : 5.66%, 산소 : 32.86%, 염소 : 4.51%.

원소분석에 의한 다른 하나의 실험식은 다음과 같다 : C₉₈H₁₀₃N₉O₄₇Cl. 2HCl(계산치; 탄소 : 51.93, 수소 : 4.65, 질소 : 5.75, 산소 : 33.20, 염소 : 4.65)

A-35512 구성요소 B 2염산염의 ir흡수 스펙트럼(kBr 페레트에서)에서 가장 중요한 흡수 최대치는 다음의 파수(㎝^-1)를 갖는다 :

3420(강), 3300(솔더), 2950(약), 1752(약), 1675(강), 1630(솔더), 1605(강), 1520(강), 1470(약), 1440(약), 1410(약), 1345(약), 1312(중), 1225(중), 1180(약), 1135(약), 1080(강), 1020(약),

A-35512 구성요소 B 2염산염의 분자량 2,000을 사용하여 계산된 UV 스펙트럼은 산성 및 중성 메탄올에서 최대 흡수치가 282㎚(ε 12,000)이고 염기성 메탄올에서 최대 흡수치가 292㎚(ε 14,000)이다. A-35512 구성요소 2염산염의 B 스펙트럼은 225㎚에서 말단흡수가 일어난다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 다음의 비선광도를 갖는다.

A-35512 구성요소 B 2염산염을 전기 적정하여 66%의 수용성 디메틸포름 아마이드에서 다음과 같은 pka값을 갖는 4개의 적정그룹을 얻는다 : 7.15, 8.87, 10.30, 12.10 또한 13.1보다 더 큰 pka값을 갖는 또 다른 그룹을 가지고 있다.

A-35512 구성요소 B 2염산염의 뚜렷한 분자량은 약 2027로 적정에 의해 결정되어진다.

A-35512 구성요소 B 2염산염의¹³cnmr(D₂O에서)은 다음과 같은 특성을 갖는다 :

* 디옥산 표준물질

메탄올-물로 결정화되는 A-35512 구성요소 B 2염산염은 다음과 같이 특징적인 분말 엑스-레이 회절 양식(니켈 필터를 띤 cu⁺복사장치, 1.5405λ, d=내측간격(A°))을 갖는다.

산으로 가수분해된 A-35512 구성요소 B 2염산염을 아미노산 분석을 하여 A-35512 구성요소 B가 최소한 5개의 아미노산 잔기를 갖고, 그중 1개가 글리신을 가짐을 알아낸다.

A-35512 구성요소 B 2염산염이 다음과 같은 당을 함유하고 있음은 그것의 산-가수분해 생성물의 분석에 의해 알수 있다; 포도당, 푸코즈, 만노즈, 람노즈, 3-아미노-2,3,6-트리데옥시-3-C-메틸-L-크실로-헥소피라노즈.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 에스테르화 할수 있는 최소한 한개의 하이드록실그룹을 갖는다.

A-35512 구성요소 B 염산염은 물에 녹으며, 메탄올 및 에탄올과 같은 알코올에서 약간 녹는다. 그러나 다른 극성이 작은 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)내에서 녹지 않는다.

A-35512 구성요소 B 2염산염은 pH 3 내지 10의 수용액에서 72시간 동안 안정하다.

A-35512 구성요소 B는 항생물질의 활성이 지속하여 나타날때까지 적절한 배지에서 호기성 조건하에 A-35512를 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 칸디두스(Streptomyces candidus) NRRL 8156을 배양함으로써 만들어진다. A-35512 구성요소 B는 발효물질에서 사용되는 여러가지의 분리 및 정제과정을 시행함으로써 생성된다.

[A-35512 구성요소 B 비당체]

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염은 다음의 대략의 원소분석치를 갖는 흰 무정형 화합물이다 :

탄소 : 54.29%, 수소 : 4.34%, 질소 : 7.40%, 염소 : 5.02%, 산소 : 28.95%(차이에 의해)

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염의 ir 흡수 스펙트럼(누졸뮬)은 다음 도면의 그림에서 보여진다. 가장 중요한 흡수 피크는 다음의 파수(㎝^-1)에서 나타난다.

3440(숄더), 3340(숄더), 3215(강), 2950(숄더), 2910(강), 2840(강), 2640(숄더), 1735(약), 1655(강), 1590(중), 1500(강), 1460(강), 1378(중), 1365(숄더), 1298(중), 1215(중), 1155(중), 1120(숄더), 1105(약), 1060(약), 1040(약), 1008(중), 925(약), 875(약), 765(숄더), 718(약),

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염의 전기적정은 66% 수용성 디메틸포름 아마이드에서 대략의 다음의 pka값을 갖는 3개의 적정그룹이 존재함을 밝혀낸다 :7.5, 9.25, 11.0 또한 11.0보다 더 큰 pka값을 갖는 2개의 부가그룹을 가질 수 있다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염의 분자량은 1282로 전기 적정에 의해 알아낸다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염은 다음의 비선광도를 갖는다 :

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염의 uv흡수 스펙트럼에서 산성 및 중성메탄올에서의 흡수 최대치는

이고 염기성 메탄올에서의 흡수 최대치는

이다.

DMSO-d₆를 표준물질로 사용하여 A-35512 구성요소 B 비당체의¹³Cnmr스펙트럼은 90℃에서 다음과 같은 특성을 갖는다.

* DMSO-d₆

A-35512 구성요소 B 비당체는 3-아미노-2,3,6-트리데옥시-3-C-메틸-L-크실로-헥소피라노즈 모핵(A-35512 구성요소 B에 존재하는 당의 1개)을 가지고 있음을¹³Cnmr 스펙트럼에 의해 알 수 있다.

디옥산으로 가수분해시킨 A-35512 구성요소 B 비당체를 아미노산 분석을 하여 A-35512 구성요소 B 비당체가 글리신을 함유하여 최소한 3개의 복합적인 아미노산 잔기를 가지고 있음을 알아낸다. 이러한 아미노산 잔기를 가지고 있음을 알아낸다. 이러한 아미노산 잔기중 1개의 구조는 다음과 같다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염은 에소테르화 할 수 있는 최소한 1개의 하이드록실 그룹을 갖는다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염은 물과 메탄올에서 녹으나 극성이 덜한 유기용매(벤젠, 클로로포름, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 헥산, 아세토니트릴, 디옥산)에서는 녹지 않는다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염은 1-부탄올 : 피리딘 : 초산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)용매계를 사용하여 TLC셀르로즈(알루미늄지지)상에서 실시하여 대략의 Rf치인 0.80을 얻는다. 사르시나 루테아(Sarcina lutea)를 사용하는 생물학적 자기 묘사법이 더 바람직한 검사방법이다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염은 메탄올 : 클로로포름 : 농수산화암모늄(3 : 2 : 1) 용매계를 사용하여 TLC 실리카겔상에서 실시하여 대략의 Rf치인 0.26을 얻는다.

A-35512 구성요소 B 비당체(유리염기)는 다음의 대략의 원소분석치(평균)를 갖는 흰 무정형 화합물이다 :

탄소 : 52.65%, 수소 : 4.57%, 질소 : 6.91%, 염소 : 2.94%, 산소 : 27.04%, 회분 : 4.70%

A-35512 구성요소 B 비당체(유리염기)의 ir흡수 스펙트럼(KBr페테르)은 다음의 파수(㎝^-1)를 갖는 중요한 흡수 피-크를 나타낸다 : 3360(강),

3260(숄더), 2940(숄더), 1735(숄더), 1660(강), 1598(중), 1510(강), 1440(중), 1295(약), 1215(중), 1165(중), 1122(약), 1070(약), 1018(강), 940(약), 920(약).

A-35512 구성요소 B 비당체(유리염기)의 전기 적정에 pka값을 갖는 45개의 적정 그룹이 존재함을 알아낸다 ; 6.2, 8.2, 10.1, 11.4, 12.4, 12.5보다 더큰 pka값을 갖는 1개 또는 2개의 부가그룹을 가질 수 있다 :

A-35512 구성요소 B 비당체(유리염기)는 다음의 비선광도를 갖는다.

스펙트럼에서 중성 및 산성 메탄올에서의 흡수 최대치는

이고 염기성 메탄올에서의 흡수 최대치는

이다.

A-35512 구성요소 B 비당체(유리염기)는 상기에 상술한 A-35512 구성요소 B 비당체 염산염과 같은 Rf치를 갖는다.

A-35512 구성요소 B 비당체의 유리염기 및 염산염의 형태와 더불어 A-35512 구성요소 B 비당체의 약학적으로 무독한 산부가염도 역시 본 발명의 일부분이다. ＂약학적으로 무독인＂염이란 대체로 온혈동물에 대한 화합물의 독성이 염이 아닌 형태의 것에 비해 증가하지 않는 염을 말한다. A-35512 구성요소 A, B, C, E, H의 대표적인 적절한 염 및 A-35512 구성요소 B 비당체는 유기산 및 무기산(예를들면, 황산, 인산, 아세트산, 호박산, 구연산, 젖산, 말레산, 푸말산, 팔미틴산, 콜린산, 파모인산, 뮤신산, D-글루타민산, d-캄포린산, 글루타린산, 글리콜린산, 프탈산, 주석산, 라우린산, 스테아린산, 살리실산, 메탄설폰산, 솔빈산, 피크린산, 벤조산, 신남산등)과 반응시켜 형성된 염을 함유한다.

A-35512 구성요소 B 2염산염을 완화한 산가수분해를 시켜 A-35512 구성요소 B 비당체 염산염을 제조한다.

실질적인 항균작용을 가진 항생물질을 생성될때까지 적당한 배지내에서 신규의 스트렙토마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 호기성 심층 배양을 시켜 A-35512 구성요소 B를 제조한다. A-35512 구성요소 B는 발효 분야에서 이미 사용하여온 여러가지 분리방법과 정제방법으로 회수한다.

A-35512 B 항생물질을 실제로 생산하기 위해서 탱크내에서 호기성 발효를 시키는 것이 더 바람직하다. 소량의 A-35512 B 항생물질은 진탕용 용기가 있는 배지에서 얻을 수 있다. 미생물의 포자형을 대형탱크에 접종시켜 항생물질을 생성시킬때 보통 시간이 지체되므로 영양형 균주를 접종하는 것이 더 바람직하다. 소량의 배지에 미생물의 포자형 또는 균사체를 새롭고 활발하게 성장하는 미생물 균주를 얻을 수 있다. 영양형 접종물질을 그 후 대형 탱크로 이동시킨다.

A-35512 B 항생물질을 생성하는 미생물은 20℃ 내지 40℃에서 자랄수 있다. 최적온도는 30℃ 내지 34℃이다.

호기성 배지의 제조 과정중 멸균된 공기를 배지에 송입시킨다.

미생물 성장에 바람직한 탱크내의 공기의 양은 매분당 배지당 공기의 약 0.1 부피(V/V/m)가 바람직하다. A-35512 B 항생물질 성장에 바람직한 탱크내의 공기의 양은 0.25 V/V/m이 더 바람직하다.

발효시, 항생물질에 민감하리라고 알려진 미생물에 대한 항생물질 활성에 대해 고체 균사체의 육즙 또는 추출물을 시험함으로써 A-35512 구성요소 B를 포함한 A-35512 항생물질이 생산될 수 있다. 이러한 항생물질을 시험하기에 유용한 실험미생물은 고초균(Bacillus subtilis) NRRL 6633이다. 생물학적 시험법은 영양을 제한시킨 배지를 함유하는 한천 플레이트위에 페이퍼-디스크 실험법으로 시행하는 것이 더 바람직하다.

호기성 발효 조건하에서 생성시킨후 A-35512 구성요소 B는 발효분야에서 알려진 방법에 의해 발효배지로 부터 얻을 수 있다. A-35512 B를 생산하는 미생물을 발효시키는 동안 생성되는 항생물질 활성은 일반적으로 여과한 육즙에서 일어난다. 그러므로 균사체의 양을 제거하기 위해 처음으로 여과할때 A-35512 구성요소 B가 최고로 회수된다. 여과한 육즙은 여러가지 방법에 따라 정제시켜 A-35512 혼합물을 얻을 수 있다.

폴리아마이드 칼럼에 여과한 육즙을 흡착시키고 물과 수용성 알콜의 혼액으로 칼럼을 용출시키는 방법이 더 바람직하다. 항생물질 활성을 나타내는 용출된 분획물을 TLC를 하여 정제된 A-35512 구성요소 B를 얻을 수 있다.

A-35512 구성요소 A, B, C, E, H와 미량의 구성요소 F와 G는 1-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)용매계를 사용하여 종이 크로마토그라피를 하여 쉽게 분리될 수 있다. 사르시나 루테아(Sarcina lutea)를 사용하는 생물학적 자기 묘사법이 더 바람직한 검사방법이다. 여기에서 A-35512 구성요소의 대략의 Rf치는 다음 표Ⅰ과 같다.

[표 Ⅰ]

개개의 A-35512 구성요소 B를 더욱 정제시키기 위해 또 한번의 흡착과 추출과정을 가질 수 있다. 알루미나, 실리카겔, 이온 교환수지 등과 같은 흡착물질이 보통 잘 쓰인다.

A-35512 구성요소는 염산염의 형태로 발효용 육즙에서 얻어진다. 더욱 더 폴리아마이드로 분리시켜 A-35512 구성요소 B를 2염산염으로 얻는다.

A-35512 구성요소 B 비당체는 묽은 산으로 A-35512 구성요소 B를 가수분해하여 제조된다. A-35512 구성요소 B는 대부분 2염산염의 형태가 더 유용하다. 그러므로 A-35512 구성요소 B 2염산염은 A-35512 구성요소 B 비당체 제조시 더 바람직한 출발물질이다. A-35512 구성요소 B 또는 다른 A-35512 구성요소 B 산부가염도 역시 사용될 수 있다. 산가수분해는 표준방법에 따라 행하여진다. 비록 많은산(acid)중 일부가 사용된다 하더라도 염산은 A-35512 구성요소 B 비당체를 제조할 때 더 바람직한 산이다. 염산이 사용될 때 A-35512 구성요소 B 비당체는 염산염으로 될 것이다. 가수분해는 약 1시간 내지 2시간동안 물로 환류시키면서 이루어진다. 반응시간이 더욱 길면 비당체의 분해가 일어나 활성이 감소되며 더욱 느리게, 불활성 생성물을 수득하게 된다.

특수반응 조건에서 최적 반응시간은 생물학적 활성을 위한 반응정수를 검사함으로써 결정될 수 있다.

A-35512 구성요소 B 및 약학적으로 무독한 그의 염은 어떤 병원성 미생물의 성장, 특히 그램양성균의 성장을 저해한다.

국제적인 디스크-분산 검정법을 사용하여 A-35512 구성요소 B 비당체의 활성을 측정한 결과가 표Ⅱ에 있다. (용액 1㎖당 시험화합물 1㎎을 함유하는 용액에 6㎜짜리 시험균주를 심은 한천 플래이트위에 놓는다).

[표 Ⅱ]

* 영양소를 제한시킨 한천

A-35512 B 비당체 염산염이 선택된 스타필로코쿠스 아우레우스에 대해 활성이 있는 최소 저지농도(MIC)를 표준한천-희석시험을 한 결과가 표Ⅱ에 있다.

[표 Ⅲ]

* 페니실린 G에 민감

** 페니실린 G에 내성

*** 페니실린 G에 내성 ; 메티실린에 내성

**** 페니실린 G에 내성 ; 메티실린에 내성 콜린다마이신에 내성

표 Ⅳ는 몇개의 D그룹인 스트렙토코쿠스에 대해 A-35512 구성요소 B 비당체 염산염을 또 한번 한천희석 시험을 한 결과이다.

[표 Ⅳ]

A-35512 구성요소 B 비당체는 인공적인 세균 감염에 대해 생체내에서 항균작용을 나타낸다. A-35512 구성요소 B 비당체 염산염의 두 개의 용량을 감염시킨 쥐에 피하주사시킬때 관찰되는 활성도는 ED₅₀치로써 측정된다.

A-35512 구성요소 B 비당체 염산염으로 처리한 ED₅₀치는 표 Ⅴ에 있다.

[표 Ⅴ]

본 발명에 따른 실험을 더욱 충분히 설명하기 위해서 다음의 실시예를 제공한다.

[실시예 1]

A-35512 구성요소 B의 제조

A-35512의 진탕발효

스트렙토 마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 동결 건조시킨 펠렛을 멸균수 1내지 2㎖에 녹인다.

이 용액을 박토(Bacto) 효모 맥아추출물(미쉬간주 디트로이트시 디프코실험실 제2호)을 함유하는 한천사면 배지에 접종한다.

접종한 사면배지를 약 7일간 30℃에서 배양한다. 성숙한 사면배양에 물 2㎖을 넣어 덮고, 포자를 떼어놓기 위해 멸균한 피펫으로 문질러 고르게 한다. 이러한 포자의 물 현탁액 일부(0.1㎖)를 또다른 ISP제2호 한천사면 배지에 접종시킨다. 이것을 약 7일간 30℃에서 배양시킨다.

성숙한 사면배양에 물 5㎖를 넣어덮고 포자를 느슨하게 떼어놓게하기 위하여 멸균된 피펫으로 문지른다. 이러한 포자 현탁액 일부(2.5㎖)를 다음의 조성물을 갖는 영양용배지 50㎖에 접종시킨다.

접종한 영양용배지를 직경이 2인치 짜리인 이-크가 250rpm에서 회전하는 진탕기상에서 30℃로 48시간 동안 250㎖짜리 얼랜 마이어 플라스크내에 놓고 배양시킨다.

배양시킨 영양용배지(0.5㎖)를 다음의 조성을 갖는 배지 50㎖에 접종한다 :

접종시킨 배지를 직경이 2인치인 아-크가 250rpm에서 회전하는 진탕기상에서 32℃로 8 내지 10일간 250㎖짜리 얼렌마이어 플라스크에 놓고 배양시킨다.

[B. A-35512의 탱크발효]

다량의 접종물을 만들기 위해 상기 상술한 바와같이 배양시킨 영양용 배지 20㎖를 영양형 배지의 조성과 똑같은 조성을 갖는 2단계의 영양형배지 400㎖에 접종시킨다. 이러한 2단계의 배지를 2ℓ짜리 플라스크에 넣고 직경이 2인치 짜리인 아-크가 250rpm에서 회전하는 진탕기상에서 32℃에서 24시간 동안 배양한다.

이와같이 제조한 2단계의 영향형 배지 800㎖를 멸균용배지 100ℓ에 접종시킨다. 접종시킨 배지를 32℃의 온도에서 약 8 내지 10일간 165ℓ의 발효용 탱크에서 발효시킨다. 발효시킨 배지에 0.25V/V/M의 속도로 멸균한 공기를 송입시키고 통상의 진탕기로 200rpm에서 교반시킨다.

[C. A-35512 항생물질 화합물의 분리]

B에 따라 얻은 전체의 발효용 육즙(250gal)을 육즙용 pH(pH 6.8-7.2)에서 여과보조제(하이플로 슈퍼-셋)에서 얻은 맑은 여액을 분당 150㎖의 속도로 육즙여액 100㎖당 다중합 흡착제 10㎖(암벨라이트 XAD-4, 롬 및 하스 CO)를 함유하는 칼럼에 통과시킨다.

분획물을 사르시나 루테아에 대해 표준 디스크 시험법을 사용하여 생물학적 활성 시험을 한다. 생물학적으로 불활성인 용출물을 버린다. 칼럼은 분당 150㎖의 속도로 물로 세척한다)(육즙용량의 1/8) 불활성인 물세척액은 버린다.

그후 칼럼을 분당 200㎖의 속도로 50%의 수용성 메탄올 용액을 넣고 용출시킨다. A-35512 항생물질 화합물을 함유하는 용출물을 진공 상태에서 ℓ당 A-35512 항생물질 혼합물 약 200g을 함유하는 15ℓ용량까지 농축시킨다.

[D. A-35512 구성요소 B의 분리]

C에 의해 얻은 A-35512 항생물질 화합물(메탄올 15ℓ에 약 3000g이 용해된)을 폴리아마이드 칼럼(Woelm, 100)으로 크로마토그래프한다. 칼럼에 분당 약 80 내지 120㎖의 유속으로 비이온성 물을 넣어 용출시킨다.

분획물을 n-부탄올 : 피리딘 : 초산 : 물(15 : 30 : 3 : 12) 용매계에서 셀루로우즈 TLC 또는 종이 크로마토그래피를 사용하여 검사하고 또한 사르시나 루테아의 생물학적 자기묘사법을 사용하여 검사한다.

용출물의 첫번째 100ℓ는 버린다. 그후 유속을 분당 약 160 내지 200㎖로 변화시키고 12ℓ의 분획물을 모은다. 20개의 분획물을 이러한 방법에 따라 모은다.

이때 용출용매를 다음의 제조방법을 사용하여 물-메탄올의 비율을 다음과 같이 변화시킨다 :

메탄올 360ℓ를 갖는 용기를 120ℓ의 물을 갖는 용기에 사이폰한다. 물이 담긴 용기에서 혼합용액을 교반하고 칼럼속으로 주입시킨다. 24개의 분획물(각각 24ℓ)을 유속 200 내지 300㎖/분에서 모은다.

생물학적 자기 묘사법에 의해 관찰된 결과중에서 분획물을 모아 진공상태에서 증발 건조시켜 A-35512 구성요소 B 2염산염을 얻는다. 다음은 구성요소의 혼합물의 양을 보여준다.

[E. A-35512 구성요소 B의 정제]

D에 의해 A-35512 구성요소 B 2염산염 일부의 정제를(400g)을 50%수용성 메탄올 1.2ℓ에 녹이고 다음과 같이 알루미나 칼럼에서 크로마토그래프한다 :

산성의 수산화알루미늄(10㎏, M. Woelm)을 50%수용성 메탄올 용액을 넣고 교반한다. 화합물을 정치시킨후 상등액을 경사시켜 버린다. 알루미나를 다시 50%수용성메탄올에 넣고 교반하고 직경이 13.5㎝인 칼럼에 충진시킨다. 알루미나 칼럼을 맑은 용출물이 얻어질 때까지 50%수용성 메탄올로 세척한다. 칼럼을 유속 약 8 내지 10㎖/분에서 50% 수용성 메탄올을 넣고 용출시켜 약 240 내지 300㎖의 양을 갖는 분획물을 모은다. 분획물을 실시예5와 같이 박층 생물학적 자기묘사법에 따라 검지한다. 이데이타를 기초로 하여 분획물을 모으고 다음과 같이 정제된 A-35512 구성요소 B 2염산염의 수율을 얻는다 :

각각의 분획물을 4℃에서 농축된 50% 수성메탄올로 결정화한다. 이와같이 정제된 A-35512 구성요소 B 2염산염은 약 4.3%의 염소를 함유한다. 66% 수성 디메틸포름 아마이드속에 함유된 A-35512 구성요소 B 2염산염의 용액은 pH 6.5이다.

[실시예 2]

실시예 1의 A에 상술된 바와같이 제조한 영양형 균주가 있는 배지를 다음의 제조방법에 따라 액체질소의 증기상태로 유지시키면서 교대로 저장한다.

멸균한 작은(13㎜×100㎜)스크류-켑 튜브에 다음의 조성을 갖는 현탁제 2㎖를 넣는다.

이 현탁제에 상술한 바와같이 제조한 48시간 배양시킨 영양형 균주를 함유하는 배지 2㎖를 가한다. 혼합한 용액을 얼리고 액상형 질소탱크의 가스상태에서 유지시킨다.

이와같이 저장한 영양형 균주를 함유하는 배지를 진탕 또는 발효용 탱크에 이용하기 위해 43℃의 수육에서 바이알 속에 넣는다. 바이알속에 넣은 용액 일부분을(1㎖) 실시예 1의 A에서와 같은 조성을 갖는 영양형배지 50㎖에 접종시킨다. 접종시킨 영양형 균주가 있는 배지를 실시예 1에서 상술한대로 진탕용 발효 또는 탱크발효를 위해 더 많은 접종용 물질을 만드는데 이용된다.

[실시예 3]

발효는 실시예 1의 방법에 따라 시행된다. 그러나 다음의 조성을 갖는 진탕용 및 탱크제조용 배지를 사용한다.

[실시예 4]

[A-35512 B 비당체의 제조]

실시예 1에 의해 얻어진 A-35512 구성요소 B 2염산염(5.0g)을 물(200㎖)에 녹인다. 이 용액은 4N 염산(14㎖)을 가해 산성으로 만든 후 이 용액을 2시간 동안 환류시킨다. 그후 용액을 냉각시키고 진공 상태에서 초기 용량이 3/4이 될때까지 증발 농축시킨다. 침전이 완결될때까지 이 용액에 염산(6N)을 적가시킨다. 침전물은 여과시켜 분리하고 건조시켜 조 A-35512 B 비당체 염산염 3.56G을 얻는다.

여액을 농축 분석한다. 여액은 포도당, 푸코즈, 만노즈, 람노즈를 함유한다.

A-35512 B 비당체 조생성물을 물 : 메탄올(1 : 9)용매개를 사용하여 산으로 세척한 알루미나(Woelm Grade I)로 크로마토그래피하여 정제한다. 칼럼의 용출은 셀루로오즈 TLC로 검지한다. A-35512 B 비당체를 함유하는 용출된 분획물을 모아 진공상에서 증발 농축시켜 일부가 정제된 생성물 398㎎을 얻는다. 검사를 위해 닌히드린 분무를 사용하여 TLC시험을 한 것을 비교하면 여전히 생화학적 활성이 없이 불순물이 존재함을 알게된다. 이렇게 일부가 정제된 A-35512 B 비당체 일부분(100㎎)을 물로 용출시키면서 폴리아마이드(4g; Machery, 니겔 앤드 캄파니 Mn-SC-6, 브링크맨 인스트르먼트 캄파니 : ＜ 0.07㎜)로 크로마토그래피하여 더욱 정제시킨다. 이러한 칼럼을 상기에 상술한 바와같이 셀루로오즈 TLC로 역시 검지한다. A-35512 구성요소 B 비당체를 함유하는 용출된 분획물을 모아 동결 건조시켜 정제된 A-35512 구성요소 B 비당체 염산염 64㎎을 얻는다(총 수율은 출발물질 A-35512 구성요소 B의 5.08%).

[실시예 5]

[A-35512 구성요소 B 비당체 유리염기의 제조]

실시예 4에 의해 얻은 A-35512 구성요소 B 비당체 염산염(90㎎)을 메탄올-물(1 : 1) 30㎖로 녹인다. 이 용액을 이온 교환수지〔3.5㎖, 비오-래드 AG-3∼4×(OH)^-〕로 중화시킨다. 이때의 용액을 실온에서 5분간 교반시킨다. 그후 수지를 여과시켜 제거한다. 여액을 60℃ 이하로 유지시키면서 약 절반의 용량까지 진공상태에서 농축시키고 동결 건조하여 A-35512 구성요소 B 비당체 유리염기 68㎎을 얻는다.

Claims (1)

1. 탄수화물, 질소, 무기염의 동화원을 함유하는 배지에 실질적인 양의 항균작용을 갖는 물질이 생성될때 까지 호기성심층 배양 조건하에서 스트렙토 마이세스 칸디두스 NRRL 8156을 배양하여 배지로 부터 항생물질 A-35512 혼합물을 분리한 후, 항생물질 A-35512 구성요소 B를 가수분해하여 비당체를 제조함을 특징으로 하는 항생물질 A-35512 구성요소 B 비당체 또는 그 유도체를 제조하는 방법.

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