DE3782199T2

DE3782199T2 - Biologisch aktive peptide tan-866.

Info

Publication number: DE3782199T2
Application number: DE8787109649T
Authority: DE
Inventors: Setsuo Harada; Nozomi Katayama; Hideo Ono
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1987-07-04
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-07-05
Also published as: DE3782199D1; EP0253245A3; US4816559A; EP0253245B1; JP2640932B2; EP0253245A2; JPS6425795A; CA1334287C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die neuen Peptide TAN-866 A, B, C oder D oder ihre verwandten Verbindungen, welche als ein therapeutisches Mittel für bakterielle Infektionskrankheiten brauchbar sind, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung und einen Mikroorganismus, welcher befähigt ist, wenigstens eine Spezies von TAN-866 A, B, C und D zu produzieren.
Als TAN-866 A, B, C und D in den wie nachstehend beschriebenen physiko-chemischen Eigenschaften am meisten ähnelnde Verbindung kann Succinimycin [Journal of Antibiotics, Bd. 16, S. 67 (1963)] erwähnt werden.
Es ist der Entwicklung von Therapeutika unter Verwendung von Antibiotika zu verdanken, daß durch Bakterien verursachte Krankheiten zum größten Teil überwunden sind. Es bestehen jedoch noch einige ernste zu lösende Probleme auf dem Gebiet der Therapeutika von Infektionskrankheiten. Zum Beispiel verursacht die Medikation mit herkömmlichen Antibiotika über einen langen Zeitraum oder in hoher Dosierung Veränderungen der Flora der krankheitserregenden Bakterien (Ersatz von Bakterien) und das Auftreten wirkstoffresistenter Bakterien (Erwerb einer Wirkstoffresistenz) oder die Zunahme opportunistischer Mikroorganismen aufgrund der Verringerung der Autoimmunität, was eine Zunahme an Krankheiten zur Folge hat. Um diese Probleme zu lösen, sind solche Substanzen, welche neue Strukturen besitzen und neue biologische Wirksamkeiten zeigen oder Zwischenprodukte, um sie zu synthetisieren, immer verlangt worden.
Die vorliegenden Erfinder isolierten eine große Zahl von Mikroorganismen aus Böden und Pflanzen zum Zwecke der Suche nach neuen Substanzen und untersuchten die von diesen Mikroorganismen produzierten Substanzen, wobei sie fanden, daß Mikroorganismen gewisser zur Gattung Pseudomonas gehörender Arten eine neue Substanz produzieren und daß diese Mikroben befähigt sind, in einem Kulturmedium eine gegen hauptsächlich gramnegative Bakterien antibakterielle Wirksamkeit besitzende Substanz anzureichern. Die vorliegenden Erfinder isolierten diese Substanzen und bestätigten sowohl auf der Grundlage ihrer physiko-chemischen Eigenschaften als auch ihrer biologischen Eigenschaften, daß diese Substanzen neu waren, und beschlossen, sie TAN-866 A, B, C beziehungsweise D zu nennen.
Auf der Grundlage dieser Befunde unternahmen die vorliegenden Erfinder weitere Untersuchungen, um die vorliegende Erfindung zu vervollständigen.
Und zwar bezieht sich die vorliegende Erfindung auf:
(1) eine Verbindung der Formel [I] oder deren eisenfreie Verbindung:
worin R&sub1; H oder OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind,
(2) ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel [I] oder deren eisenfreier Verbindung, welches das Kultivieren eines zu der Gattung Pseudomonas gehörenden und zu Erzeugung wenigstens einer Spezies der durch die besagte Formel dargestellten Verbindungen befähigten Mikroorganismus auf einem Kulturmedium, um zu ermöglichen, daß wenigstens eine Spezies der besagten Verbindungen in dem Medium angereichert wird, und das Isolieren des auf diese Weise angereicherten Produkts, anschließend erforderlichenfalls die Befreiung des Produkts von Eisen, umfaßt,
(3) Pseudomonas fluorescens, befähigt eine Verbindung der Formel [I] zu bilden,
(4) eine Verbindung der Formel [II] oder deren eisenfreie Verbindung
worin R&sub1; H oder OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind, und
(5) ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel [II] oder deren eisenfreier Verbindung, welches das Unterwerfen einer Verbindung der Formel [I] der Hydrolyse durch alkalische Lösungen zur Spaltung der Lacton-Bindung und der Hydrolyse durch Amidasen zur Eliminierung der Gruppe CH&sub3;(CH&sub2;)&sub5;-CH=CH-CH&sub2;-CO-, anschließend erforderlichenfalls die Befreiung des Produkts von Eisen, umfaßt.
In der vorliegenden Beschreibung wird auf die durch die Formel [I] dargestellten Verbindungen entsprechend den nachstehend beschriebenen Bedeutungen von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; manchmal kurz als TAN-866 A, B, C oder D Bezug genommen:
TAN-866 A: R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; sind jeweils H
TAN-866 B: R&sub1; ist OH und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; sind jeweils H
TAN-866 C: R&sub1; ist H, irgend zwei von R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; sind H und das andere ist CH&sub3;, und die Retentionszeit der später erwähnten HPLC beträgt 5,8 Minuten
TAN-866 D: R&sub1; ist H, irgend zwei von R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; sind H und das andere ist CH&sub3;, und die Retentionszeit der später erwähnten HPLC beträgt 6,2 Minuten.
TAN-866 A, B, C und D werden manchmal allgemein "TAN-866" genannt und auf die Verbindungen, welche durch Befreiung der entsprechenden Verbindungen der Formel [I] von Eisen erhalten werden, wird manchmal als "eisenfreie Verbindungen" Bezug genommen. Weiterhin wird auf die durch die Formel [II] dargestellten Verbindungen manchmal als "Deacyl-TAN-866 A, B, C und D" und ihre entsprechenden "eisenfreien Verbindungen" Bezug genommen.
Als TAN-866 produzierende, in der vorliegenden Erfindung einsetzbare Mikroorganismen können irgendwelche zur Gattung Pseudomonas gehörende und zur Bildung von TAN-866 befähigte erwähnt werden, zum Beispiel Pseudomonas fluorescens, vollständiger Pseudomonas fluorescens Stamm YK-310, isoliert aus bei Zentsuji, Präfektur Kagawa, Japan, gesammelten Böden (nachfolgend manchmal als "Stamm YK-310" abgekürzt).
Die bakteriologischen Merkmale von Stamm YK-310 sind wie folgt:

(a) Morphologie

Die morphologischen Merkmale wurden nach 5 Tagen Inkubation auf einem Fleischextrakt-Schrägagarmedium bei 24ºC beobachtet.
Zellform und -größe: Stäbchen, 0,6-1,2 um Durchmesser 0,8-2,1 um Länge
Mit polarer multitricher Flagellation beweglich;
Keine Sporenbildung; gramnegativ.

(b) Wachstum auf verschiedenen Medien

Die Beobachtung wurde 1 bis 14 Tage unter Inkubation bei 24ºC ausgeführt.

1 Nähragar-Platte:

Die Kolonien sind farblos, undurchsichtig und kreisförmig. Die Kolonienoberfläche ist kopfartig. Der Kolonienrand ist gewellt. Kein diffundierbares Pigment wird produziert.

2 Nähragar-Schräge:

Reichlich, glänzend und einem entfalteten Tuch ähnlich, undurchsichtig und farblos.

3 Nährbrühe:

Wächst in dickflüssiger Suspension. Bildet ein dünnes Häutchen. Es tritt kein Niederschlag auf.

4 Stichgelatine:

Gutes Wachstum hauptsächlich im oberen Abschnitt. Verflüssigung wird beobachtet.

5 Lackmusmilch:

Lackmus-Reduktionsaktivität wird nicht beobachtet. Peptonisierungsaktivität wird beobachtet aber keine Koagulation.

(c) Physiologische Merkmale

1 Nitratreduktion: -
2 Denitrifikation: -
3 MR- (Methylrot) Test: -
4 VP- (Voges-Proskauer) Test: -
5 Indol-Produktion: -
6 Schwefelwasserstoff-Produktion (TSI-Agar und Bleiacetat-Papier): -
7 Stärkehydrolyse: -
8 Citrat-Verwertung (Kosers, Christeansens und Simons Medium): +
9 Verwendung anorganischer Stickstoffquellen
i) Kaliumnitrat: +
ii) Ammoniumsulfat: +
10 Pigment-Produktion (Kings A-, Kings B- und Mannit-Hefeextrakt-Agar-Medium): Produktion eines gelblich-grünen, diffundierbaren Pigments wird in Kings B-Medium beobachtet. Keine Produktion eines diffundierbaren Pigments wird entweder in Kings A-Medium oder Hefeextrakt-Agar-Medium beobachtet.
11 Urease: +
12 Oxidase: +
13 Katalase: +
14 Wachstumsbedingungen:
i) pH : 4,7-10,0, optimal 7,2-8,4
Medium: Glucose 0,1%, Hefeextrakt 0,01%, Ammoniumsulfat 0,1%, Natriumchlorid 0,1%, Magnesiumsulfat (7-Hydrat) 0,05%, Phosphatpuffer 0,1M (getrennt sterilisiert) ii) Temperatur: 10-34ºC, optimal 10-30ºC
Medium: Flüssigbouillonmedium
15 Sauerstoffbedarf: aerob
16 O-F- (oxidativ-fermentativ) Test [Hugh-Leifson-Methode]: oxidativ
17 Säure- und Gasproduktion aus Zuckern und ihre Verwertung: Säure (Pepton Wasser) Gas (Pepton Wasser) Verwertung (Davis Medium) L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fructose D-Galactose Maltose Sucrose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke
18 G + C- (Guanin-Cytosin) Gehalt der DNA:
65,9% ± 1,0% (Tm-Methode) 19 Polysaccharid-Zersetzung:
Carboxymethylcellulose: -
kolloidales Chitin: -
Natriumarginat: -
20 Zersetzung von Tween 80: +
Der Stamm YK-310 mit den vorerwähnten bakteriologischen Merkmalen wurde mit den in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 30, S. 225-420 (1980) und ibid., Bd. 32, S. 146-149, beschriebenen Bakterienarten verglichen. Begründet auf die folgenden Merkmale, d. h. der Stamm besteht aus gramnegativen Stäbchen, ist mit multitricher Flagellation beweglich, aerob, Katalase-positiv und Oxidase-positiv und der G+C-Gehalt seiner DNA beträgt 65,9 ± 1,0 Mol%, wurde angenommen, daß dieser Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört.
Gemäß besagtem Bergey's Manual of Determinative Bacteriology wird die Gattung Pseudomonas durch ihre die Erfordernis von Wachstumsfaktoren, die intrazelluläre Anreicherung von Polyβ-hydroxybutyrat, die Verwertung von DL-Arginin und das Wachstum bei 40ºC betreffenden Merkmale in vier Abschnitte aufgeteilt, d. h. Abschnitte I, II, III und IV.
Tabelle 1 zeigt die Merkmale des Stammes YK-310, wie sie in weiteren Experimenten erhalten wurden. Tabelle 1 Merkmale von Stamm YK-310 Tests Ergebnis* Poly-β-hydroxybutyrat-Anreicherung Arginindihydrase Pigmentproduktion: Kings A-Medium Kings B-Medium Denitrifikation Gelatinehydrolyse Poly-β-hydroxybutyrathydrolyse Verwertung von Kohlenstoff-Quellen**: Sucrose L-Arabinose Propionat Butyrat Propylenglykol Ethanol * +: Positiv, -: Negativ ** Stainers Medium [in Journal of General Microbiology, Bd. 43, S. 159-271 (1966) beschrieben] wurde verwendet.
Es wurde als zutreffend angesehen, daß der Stamm YK-310 auf der Grundlage der Tatsachen, daß der Stamm keine Auxotrophie besitzt und Poly-β-hydroxybutyrat nicht intrazellulär anreichert, dem Abschnitt I angehört.
Zehn Arten sind in Abschnitt I enthalten. Da der Stamm YK-310 ein fluoreszierendes Pigment produziert und Arginindihydrolase besitzt, wurde der Stamm YK-310 als zu irgendeinem von Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlorographis und Pseudomonas aureofaciens angehörig angesehen.
Der Stamm YK-310 war von Pseudomonas aeruginosa und Pseudomonas chlorographis in der Denitrifikation verschieden. Er war auch von Pseudomonas putida in der Gelatinehydrolyse und der Verwertung von Sucrose, und von Pseudomonas aureofaciens in der Produzierbarkeit nichtfluoreszierender Pigmente und der Nitratreduktion verschieden. Die Merkmale des Stammes YK-310 waren mit denjenigen von Pseudomonas fluorescens in guter Übereinstimmung. Daher wurde der Stamm YK-310 als Pseudomonas fluorescens identifiziert und als Pseudomonas fluorescens YK-310 bezeichnet.
Das vorerwähnte Pseudomonas fluorescens YK-310 ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI, 1-3, Higashi-1 Chome, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Präfektur Ibaraki, Japan) unter der Zugangsnummer FERM P-8833 ab 3. Juli 1986 und ebenfalls beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO, 2-17-85, Juso-honmachi, Yodogawa-ku, Osaka, Japan) unter der Zugangsnummer IFO 14516 seit dem 24. Juni 1986 hinterlegt worden. Die vorstehende Hinterlegung beim FRI ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1369 umgewandelt worden.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete, zur Gattung Pseudomonas gehörende Bakterien sind im allgemeinen gegenüber Mutagenen sehr empfindlich, d. h. sie können durch Mutation unter Verwendung ultravioletter Strahlen, Röntgenstrahlen, Chemikalien (z. B. Nitrosoguanidin und Methansulfonsäure-ethylester) usw. leicht verändert werden, und Stämme, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen alle zur Produktion von TAN-866 befähigten Mutanten ein.
Bei der Inkubation von TAN-866 produzierenden Bakterien werden Substanzen, welche von den Bakterien assimiliert werden können, geeigneterweise als Kohlenstoffquellen verwendet: Glucose, Fructose, Galactose, lösliche Stärke, Dextrin, Öle und Fette (z. B. Sojabohnenöl, Olivenöl usw.), organische Säuren (z. B. Citronensäure, Bernsteinsäure, Gluconsäure usw.) usw.; als Stickstoffquellen organische Stickstoffverbindungen, wie etwa Sojabohnenmehl, Baumwollsamenpulver, Maisklebermehl, Trockenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Harnstoff usw. Anorganische Salze, wie etwa Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, primäres Kaliumphosphat und sekundäres Kaliumphosphat, welche für gewöhnliche Bakterienkulturen wesentlich sind, können geeigneterweise einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Schwermetalle, wie etwa Eisensulfat und Kupfersulfat, und Vitamine, wie etwa Vitamin B&sub1; und Biotin, werden falls nötig ergänzt. Antischaummittel, wie etwa Silikonöl und Polyalkylenglykolether, und oberflächenaktive Mittel können dem Medium ebenfalls zugesetzt werden. Weiterhin können irgendwelche anderen organischen oder anorganischen Substanzen, welche das Wachstum von Mikroorganismen erleichtern und damit die TAN-866-Produktion fördern, erforderlichenfalls ebenfalls zugesetzt werden.
Was die Kulturverfahren anbetrifft, so können gewöhnliche Verfahren für Antibiotika angewandt werden. Es können entweder feste oder flüssige Kulturen angewandt werden. Im Falle flüssiger Kulturen können gegebenenfalls stationäre Kulturen, bewegte Kulturen, Schüttelkulturen, belüftete Kulturen usw. durchgeführt werden. Eine bewegte Kultur unter Belüftung ist besonders bevorzugt. Die Kulturtemperatur ist vorzugsweise in einem Bereich von etwa 15ºC-32ºC, der pH ist in einem Bereich von etwa 5-8, und die Kultur wird etwa 8-168 Stunden, vorzugsweise 24-144 Stunden, durchgeführt.
Zum Ernten des Zielproduktes TAN-866 aus Kulturen, können Trennverfahren, welche gewöhnlich zum Isolieren von durch Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukten aus ihren Kulturen verwendet werden, geeigneterweise verwendet werden. Zum Beispiel ist TAN-866, welches eine neutrale Substanz ist, hauptsächlich im Kulturfiltrat enthalten, und es wird vorteilhafterweise nach unter anderem den folgenden Verfahren gewonnen. Und zwar wird die gesamte Kulturbrühe nach Zugabe eines Filterhilfsmittels der Filtration oder Zentrifugation unterzogen, um Zellen zu entfernen, und das entstandene Kulturfiltrat wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel zusammengebracht, um den aktiven Bestandteil zu extrahieren, oder die Kulturflüssigkeit wird mit einem geeigneten Träger zusammengebracht, um die aktiven Bestandteile im Filtrat zu absorbieren und die Zielprodukte durch fraktionierendes Desorbieren mit einem geeigneten Lösungsmittel durch Chromatographie zu gewinnen. Der vorteilhafterweise anzuwendende Träger schließt Kieselgel, Cellulose, Adsorptionsharze usw., welche den Unterschied in der Adsorptionsfähigkeit zwischen Verbindungen ausnutzen, oder Molekularsieb-Träger, welche den Unterschied im Molekulargewicht zwischen Verbindungen ausnutzen, ein. Elutionen, welche in einer geeigneten Kombination verwendet werden können, um Zielverbindungen von diesen Trägern zu eluieren, schließen organische Lösungsmittel, wasserhaltige Lösungen wasserlöslicher organischer Lösungsmittel, z. B. wäßriges Aceton, wäßrige Alkohole usw. ein, obwohl die Kombination mit dem Typ und den Eigenschaften der Träger schwankt. In Abhängigkeit von den Fällen werden auf diese Weise chromatographisch erhaltene Rohprodukte der Umkehrphasen- HPLC zur Reinigung unterzogen, um eine weitere Aufreinigung durchzuführen.
Zur Beschreibung in größerer Einzelheit wird als Träger zum Beispiel von Amberlite XAD-II (Rohm & Haas Co., USA), Diaion HP-10, HP-20 und SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) usw. Gebrauch gemacht, um die aktiven Substanzen im Filtrat zu adsorbieren, darauf werden die auf diese Weise adsorbierten Materialien mit einem Gemisch eines organischen Lösungsmittels und einer wäßrigen Lösung, d. h. einem Gemisch von Aceton oder Methanol oder dergleichen und Wasser oder einer Säuren oder Salze enthaltenden wäßrigen oder Pufferlösung eluiert.
TAN-866 kann auch aus seinen wäßrigen Lösungen mit einem organischen Lösungsmittel, welches aus Wasser abgetrennt werden kann, z. B. n-Butanol, Isobutanol, n-Amylalkohol, Isoamylalkohol usw. extrahiert werden. Weiterhin kann TAN-866 auf einem Träger, wie etwa einem Träger vom Kieselgel- oder Molekularsiebtyp, z. B. Kieselgel 60 (E. Merck AG, W.-Deutschland), oder Molekularsiebträgern, wie etwa Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) adsorbiert werden, und darauf kann das derart adsorbierte Material mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Alkoholen (z. B. Methanol usw.) oder deren Gemisch eluiert werden.
Als für die Umkehrphasen-HPLC zu verwendende Säule wird zum Beispiel von YMC-Gel (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) Gebrauch gemacht. Als mobile Phase wird von einem Gemisch von Methanol oder Acetonitril usw. und einer Pufferlösung Gebrauch gemacht. Zur Reinigung von TAN-866 kann neben Kombinationen der vorstehend erwähnten Verfahren eine beliebige Kombination aus Einengen, Kristallisation, Lyophilisierung usw., welche in Laboratorien üblicherweise verwendet werden, angewandt werden.
TAN-866 liegt in der Kulturbrühe als ein dreiwertiger Eisenkomplex vor und kann so wie er ist mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt und isoliert werden. Ein so isolierter Eisenkomplex kann in eine eisenfreie TAN-866-Verbindung unter Verwendung eines üblichen, Eisenionen entfernenden Mittels, wie etwa 8-Hydroxychinolin, oder einem starken Kationenaustauscherharz, wie etwa Amberlite IR-120 (Rohm & Haas Co., USA), Dowex 50W (Dow Chemical Co., USA) usw. umgewandelt werden. Die Zugabe einer dreiwertigen Eisenverbindung, z. B. Eisenchlorid oder Eisensulfat oder dergleichen, zu einer wäßrigen Lösung der freien Verbindung von TAN-866 liefert TAN-866.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von TAN-866 A, B, C und D, welche in den später zu zeigenden Beispielen 1 und 2 erhalten wurden, sind wie folgt:

TAN-866A

1) Erscheinungsbild: rötlich-orangefarbener Feststoff
2) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5;+170º (c=0,1, in Wasser) 3) Molekularformel: C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;Fe
4) Elementaranalyse (%): Proben wurden der Analyse unterzogen, nachdem sie über Phosphorpentoxid 6 Stunden bei 40ºC getrocknet wurden (berechnet als 5 Mol Wasser enthaltend)
5) Molekulargewicht: m/z 1237 (M + H)&spplus; (SI-MS-Methode) 6) Ultraviolett- und sichtbares (UV & VS) Absorptionsspektrum (in Wasser): max 423 ± 3 nm (E1 cm1% = 25 ± 5) 7) Infrarot- (IR) Absorptionsspektrum: in KBr Hauptabsorptionen sind wie folgt (Fig. 1) 3350, 2950, 1750, 1660, 1530, 1460, 1380, 1240, 1040, 980, 720, 550 (cm&supmin;1)

8) Zusammensetzung der Aminosäure-Bestandteile:

a) in 6N HCl bei 110ºC 15 Stunden hydrolysierte Proben: Serin (2 Mol), Glycin (3 Mol), Alanin (1 Mol), Valin (1 Mol) b) in 57%iger Iodwasserstoffsäure bei 100ºC 15 Stunden hydrolysierte Proben: Serin (2 Mol), Glycin (3 Mol), Alanin (1 Mol), Valin (1 Mol), Ornithin (3 Mol)

9) HPLC: Säule: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories)

Mobile Phase: 36% CH&sub3; CN Wasser
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min, RT = 5,3 (min)

10) Löslichkeit:

Löslich : Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol
Schwerlöslich : n-Hexan, Diethylether
11) Einordnung der Substanz: Neutralsubstanz

TAN-866B

1) Erscheinungsbild: rötlich-orangefarbener Feststoff
2) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5;+164º (c=0,1, in Wasser) 3) Molekularformel: C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub2;N&sub1;&sub3;O&sub2;&sub0;Fe
4) Elementaranalyse (%): Proben wurden der Analyse unterzogen, nachdem sie über Phosphorpentoxid 6 Stunden bei 40ºC getrocknet wurden (berechnet als 6 Mol Wasser enthaltend)
5) Molekulargewicht: m/z 1253 (M + H)&spplus; (Si-MS-Methode) 6) Ultraviolett- und sichtbares (UV & VS) Absorptionsspektrum (in Wasser): max 422 ± 3 nm (E1 cm1% = 20 ± 5) 7) Infrarot- (IR) Absorptionsspektrum: in KBr Hauptabsorptionen sind wie folgt (Fig. 2) 3370, 2930, 1750, 1660, 1530, 1470, 1380, 1230, 1040, 980, 730, 560 (cm&supmin;1)

8) Zusammensetzung der Aminosäure-Bestandteile

a) in 6N HCl bei 110ºC 15 Stunden hydrolysierte Proben: Serin (3 Mol), Glycin (3 Mol), Valin (1 Mol) b) in 57%iger Iodwasserstoffsäure bei 100ºC 15 Stunden hydrolysierte Proben: Serin (3 Mol), Glycin (3 Mol), Valin (1 Mol), Ornithin (3 Mol)

9) HPLC: Säule: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories)

Mobile Phase: 36% CH&sub3;CN Wasser
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min, RT = 4,7 (min)

10) Löslichkeit:

TAN-866C

1) Erscheinungsbild: rötlich-orangefarbener Feststoff
2) spezifische Drehung: [α]D²&sup5;+187º (c=0,1, in Wasser) 3) Molekularformel: C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub4;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;Fe
4) Elementaranalyse (%): Proben wurden der Analyse unterzogen, nachdem sie über Phosphorpentoxid 6 Stunden bei 40ºC getrocknet wurden (berechnet als 4 Mol Wasser enthaltend)
5) Molekulargewicht: m/z 1251 (M + H)&spplus; (Si-MS-Methode) 6) Ultraviolett- und sichtbares (UV & VS) Absorptionsspektrum (in Wasser): max 423 ± 3 nm (E1 cm1% = 24 ± 5) 7) Infrarot- (IR) Absorptionsspektrum: in KBr
Hauptabsorptionen sind wie folgt (Fig. 3) 3400, 2930, 1750, 1660, 1540, 1470, 1380, 1240, 1020, 980, 730, 560 (cm&supmin;1)

8) Zusammensetzung der Aminosäure-Bestandteile:

9) HPLC: Säule: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories)

Mobile Phase: 36% CH&sub3; CN Wasser
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min, RT = 5,8 (min)

10) Löslichkeit:

TAN-866D

1) Erscheinungsbild: rötlich-orangefarbener Feststoff
2) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5;+176º (c=0,1, in Wasser) 3) Molekularformel: C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub4;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;Fe
4) Elementaranalyse (%): Proben wurden der Analyse unterzogen, nachdem sie über Phosphorpentoxid 6 Stunden bei 40ºC getrocknet wurden (berechnet als 4 Mol Wasser enthaltend) 5) Molekulargewicht: m/z 1251 (M + H)&spplus; (SI-MS-Methode) 6) Ultraviolett- und sichtbares (UV & VS) Absorptionsspektrum (in Wasser): max 423 ± 3 nm (E1 cm1% = 22 ± 5) 7) Infrarot- (IR) Absorptionsspektrum: in KBr
Hauptabsorptionen sind wie folgt (Fig. 4) 3400, 2940, 1750, 1660, 1540, 1370, 1240, 1010, 980, 730, 560 (cm&supmin;1)

8) Zusammensetzung der Aminosäure-Bestandteile:

9) HPLC: Säule: YMC-PAK A312 (Yamamura Chemical Laboratories)

Mobile Phase: 36% CH&sub3;CN Wasser
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min, RT = 6,2 (min)

10) Löslichkeit:

Löslich : Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol
Schwerlöslich : n-Hexan, Diethylether
11) Einordnung der Substanz: Neutralsubstanz
Weiterhin werden die ¹H-NMR-Spektren von TAN-866 A, B, C und D in D&sub2;O in Fig. 5, 6, 7 beziehungsweise 8 gezeigt (400 MHz, δ ppm, JEOL GX-400).
Wie vorstehend beschrieben besitzt jedes TAN-866 drei Mol Ornithin unter seinen Aminosäuren-Bestandteilen. Aus diesen Ergebnissen und ihren ¹H-NMR-Spektraldaten wird abgeschätzt, daß TAN-866 A und B drei N&sup5;-Acetyl-N&sup5;-hydroxyornithin und TAN-866 C und D zwei N&sup5;-Acetyl-N&sup5;-hydroxyornithin und ein N&sup5;-Propionyl-N&sup5;-hydroxyornithin besitzen. Es ist bekannt, daß die N-Hydroxyl-Gruppe der besagten Aminosäuren in Gegenwart eines dreiwertigen Eisen-Ions sich zum N-Hydroxyanion (-N-O&supmin;) ändert und ein solches Eisen-Ion von drei N-Hydroxyanionen als Liganden umgeben ist (J. Antibiotics, 24, 380, 1974).
Wenn TAN-866 A in einer basischen wäßrigen Lösung bei 20 bis 60ºC, vorzugsweise 25 bis 50ºC, 30 Minuten bis 8 Stunden, vorzugsweise 1 bis 4 Stunden, gerührt oder stehen gelassen wird, wird die Lacton-Bindung des TAN-866 A-Moleküls hydrolysiert, um seine Verbindung in Carbonsäure-Form (C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub3;N&sub1;&sub3;O&sub2;&sub0;FeNa) zu ergeben. Die derart hydrolysierte Verbindung kann unter Anwendung einer Chromatographie an Diaion HP-20 usw. als ihr Mononatriumsalz isoliert und gereinigt werden.
Deacyl-TAN-866 A (C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub8;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;Fe) wird durch Hydrolyse der vorstehend erwähnten Verbindung in Carbonsäure-Form mit einer Amidase, welche in den Bakterienzellen von Pseudomonas acidovorans IFO 13582 enthalten ist, erhalten. Diese Hydrolyse wird in einem Phosphatpuffer mit pH 3 bis 9, vorzugsweise pH 5 bis 8, bei 25 bis 45ºC, vorzugsweise 30 bis 40ºC, über 5 bis 30 Stunden, vorzugsweise 10 bis 25 Stunden, ausgeführt. Die Amidase wird in einer Menge vom 5- bis 15-fachen, vorzugsweise 8- bis 12-fachen, des Substratgewichts angewandt. Wenn das Enzym zur Reaktion verwendet wird, werden die Bakterienzellen entweder so wie sie sind oder in zuvor mit Aceton usw. behandelter Form zugeführt.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Deacyl- TAN-866 A, welches in Beispiel 5 erhalten wurde, sind wie folgt:
1) Erscheinungsbild: rötlich-orangefarbener Feststoff
2) Molekulargewicht: m/z 1103 (M+H)&spplus; (SI-MS-Methode) 3) Elementaranalyse (%) (berechnet als 7 Mol Wasser
4) Molekularformel: C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub8;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;Fe

5) Sichtbares Absorptionsspektrum (in Methanol):

max 422 ± 3 nm (E1 cm1% = 26 ± 5) 6) Infrarot-Absorptionsspektrum in KBr
Hauptabsorptionen sind wie folgt:
3380, 3020, 2950, 1660, 1590, 1540, 1470, 1380, 1240, 1050, 980, 790, 730, 560 (cm&supmin;1)

7) Löslichkeit:

Löslich : Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol
Schwerlöslich : Ethylacetat, Chloroform
8) Einordnung der Substanz: amphotere Substanz
TAN-866 B, C und D ergeben durch ein zu jenem zur Herstellung von Deacyl-TAN-866 A ähnlichen Verfahren die entsprechenden Deacyl-TAN-866 B, C und D. Die HPLC- und SI-MS-Daten dieser Verbindungen sind wie folgt: Tabelle 2 Deacyl-TAN 866- HPLC* (rt) (Retentionszeit) * Säule: ODS, YMC-Pack A-312 Mobile Phase: 8% Acetonitril/0,01M Phosphatpuffer (pH 6,3) Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min Nachweis: 214 nm
Die Zusammensetzung der Aminosäurebestandteile dieser Deacyl- Verbindungen sind mit jenen der entsprechenden TAN-866 A, B, C und D alle identisch.
Gemäß den vorstehenden Daten und den nachstehend beschriebenen Verfahren wurden die chemischen Formeln von TAN-866 und Deacyl-TAN-866 wie in den Formeln [I] beziehungsweise [II] gezeigt bestimmt. Und zwar wurde aufgrund der nach der SI-MS-Methode von TAN-866 subtrahierten Daten des entsprechenden Deacyl-TAN-866 und dem ¹H-NMR-Spektrum [COSY-Methode (¹H-¹H)] des eisenfreien TAN-866 festgestellt, daß der Fettsäureteil von TAN-866 durch die Formel CH&sub3;(CH&sub2;)&sub5;CH=CHCH&sub2;CO- dargestellt wird. Die Sequenz der C- und N-terminale Aminosäuren enthaltenden Aminosäuren wurde durch Aussetzen eines jeden TAN-866 einem Aminsäurensequenzer bestimmt. Die Bindungsstelle der Lacton-Gruppe wurde durch die NOESY-Methode im ¹NMR-Spektrum von TAN-866, wie in der Formel [I] gezeigt, bestimmt.
Die biologischen Merkmale von TAN-866 und seinen eisenfreien Verbindungen werden wie folgt beschrieben. Die antibakteriellen Wirksamkeiten von TAN-866 sind wie in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Testorganismus Minimale Hemmkonzentration (ug/ml) (Anmerkung 1) Staphylococcus aureus FDA 209P Micrococcus luteus IFO 12708 Bacillus subtilis NIHJ PCI 219 Bacillus cereus FDA 5 Escherichia coli NIHJ JC 2 Salmonella typhimurium IFO 12529 Citrobacter freundii IFO 12681 Klebsiella pneumoniae IFO 3317 Serratia marcescens IFO 12648 Proteus mirabilis ATCC 21100 Proteus vulgaris IFO 3988 Proteus morganii IFO 3168 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 Alcaligenes faecalis IFO 13111 Acinetobacter calcoaceticus IFO 13006

(Anmerkung 1) Mediumszusammensetzung

Bacto antibiotisches Medium 3: 17,5 g
(Difco Laboratories, USA) Bacto Hefeextrakt: 5,0 g
(Difco Laboratories, USA) Bacto Agar: 20 g
(Difco Laboratories; USA) Destilliertes Wasser: 1000 ml
(pH nicht eingestellt) Impfgröße: eine Öse voll mit etwa 10&sup6; CFU/ml
Tabelle 4 zeigt die therapeutischen Wirkungen von TAN-866 und seinen eisenfreien Verbindungen durch subkutane Verabfolgung auf experimentelle Infektionskrankheiten in Mäusen unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa P-9. Tabelle 4 Verbindung eisenfreie Verbindung * Summe aus drei Dosierungen
Nach intraperitonealer oder oraler Verabreichung in einer Dosis von 1000 mg/kg wurde bei TAN-866 A in Mäusen keine akute Toxizität beobachtet.
Wie von diesen Daten eindeutig gezeigt wird, besitzen TAN-866 und seine eisenfreien Verbindungen eine antibakterielle Wirksamkeit, hauptsächlich gegen gramnegative Bakterien, während sie in Säugern zum Beispiel keine Toxizität zeigen. Daher können TAN-866 oder seine eisenfreien Verbindungen in Therapeutika für bakterielle Infektionen in Menschen und Haustieren (z. B. Kühe, Pferde, Schweine usw.), Hausgeflügel (z. B. Hühnern usw.) usw. verwendet werden.
Zur Verwendung von TAN-866 oder seinen eisenfreien Verbindungen als therapeutische Wirkstoffe, zum Beispiel bei Infektionskrankheiten durch Pseudomonas aeruginosa, werden sie, zum Beispiel in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, als Injektionen parenteral, subkutan oder intramuskulär in einer Dosis von 0,1-20 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,5-10 mg/kg/Tag verabfolgt. TAN-866 oder seine eisenfreien Verbindungen werden durch Vermischen mit Lactose in Kapseln zubereitet und in einer Dosis von 0,5-100 mg/kg/Tag, vorzugsweise 2-50 mg/kg/Tag an TAN-866 oder dessen eisenfreier Verbindung verabfolgt.
Deacyl-TAN-866 hat eine Amino-Gruppe und eine Carboxyl-Gruppe als derivatisierbare Funktionen,- welche durch Umsetzen mit Säurehalogeniden, wie etwa Fettsäurehalogeniden mit der Kohlenstoffzahl 1 bis 20 (z. B. Myristylchlorid, Linoleinylchlorid oder Caprylchlorid) in schwach basischer Lösung leicht N-Acyl-Derivate liefern. Derart erhältliche N-acylierte Verbindungen werden durch Kondensationsmittel, z. B. DCC in geeigneten Lösungsmitteln (z. B. DMF) oder durch Ansäuern der Reaktionslösungen lactonisiert. Von den so erhaltenen neuen Verbindungen kann angenommen werden, daß antimikrobielle Wirksamkeiten zum Beispiel gegen Pseudomonas aeruginosa auftreten. Demzufolge sind TAN-866 und Deacyl-TAN-866 ebenfalls als Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte für die Synthese neuer medizinischer Produkte aussichtsreich.
Die folgenden Beispiel beschreiben die Erfindung in größerer Einzelheit, bedeuten aber nicht, daß die Erfindung darauf beschränkt ist. Solange nicht anders angegeben bedeutet % Gewicht/Volumen-%.

Beispiel 1

Fünfhundert ml eines durch Zugabe von 0,5% gefälltem Calciumcarbonat zu einer 2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1% rohes Sojabohnenmehl, 0,3% Maiseinweichwasser, 0,5% Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd.) und 0,3% Natriumchlorid enthaltenden wäßrigen Lösung (pH 7,0) hergestellten Mediums in einem 2 L-Sakaguchi-Kolben wurden mit auf einer Nähragarschräge gezogenem Pseudomonas fluorescens YK-310 (FERM BP-1369; IFO 14516) angeimpft und 48 Stunden der Pendelschüttelkultur bei 24ºC unterzogen. Mit der gesamten Menge der entstandenen Kulturbrühe wurden 120 l eines Medium, welches durch Zugabe von 0,05% Actocol (Takeda Chemical Industries, Ltd.), einem Antischaummittel, zu dem vorstehend erwähnten Medium in einem 200 l-Tank hergestellt wurde, angeimpft. Die Kultivierung wurde 48 Stunden bei 24ºC unter Belüftung mit 120 l/min und Rühren mit 180 Upm durchgeführt. Mit 50 l der entstandenen Kulturbrühe wurden 1200 l eines Mediums, welches durch Zugabe von 0,05% Actocol zu einer 2% Glycerin, 0,5% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0,1% Natriumchlorid und 0,1% Hefeextrakt (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd.) enthaltenden wäßrigen Lösung (pH 6,5) in einem 2000 l-Tank hergestellt wurde, angeimpft. Die Kultivierung wurde 42 Stunden bei 17ºC unter Belüftung mit 1200 l/min und Rühren mit 150 Upm durchgeführt.
Die derart erhaltene Kulturbrühe wurde der Filtration mit Hilfe von Hyflo Super-Cel (Johns Manville Sales Corp.) unterzogen. Das Filtrat (1300 l) wurde einer Säulenchromatographie an Diaion HP-20 (50 l) unterzogen. Die aktive Substanz wurde mit 80% Methanol-Wasser (350 l) eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und Methanol wurde aus ihm abgedampft. Der wäßrige Anteil (30 l) wurde auf pH 7 eingestellt, gefolgt von der Extraktion mit Isobutanol (20 l). Der Extrakt wurde mit einer 2%igen Natriumbicarbonat-Lösung und 0,05 N Salzsäure gewaschen, gefolgt vom Einengen der Isobutanol-Schicht. Das Konzentrat (3 l) wurde n-Hexan (10 l) zugesetzt, um Niederschläge zu ergeben. Der überstand wurde durch Dekantieren abgetrennt. Den zurückbleibenden Niederschlägen wurde weiter n-Hexan (3 l) zugesetzt, um eine rohe, TAN-866 A enthaltende Substanz (21,1 g) zu ergeben. Die rohe Substanz (20,5 g) wurde in 50%igem methanolischem Wasser gelöst und die Lösung wurde einer Säulenchromatographie an Diaion HP-20 (50-100 Mesh, 1 l) unterzogen. Die Säule wurde mit 60%igem methanolischen Wasser (6 l) gewaschen und die antibiotische Substanz wurde darauf fraktionsweise eluiert. Die Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt. Das Konzentrat wurde in einem kleinen Volumen Methanol gelöst, welchem Ether zugesetzt wurde, um ein pulveriges Produkt zu ergeben (532 mg). Das nach einem ähnlichen Verfahren erhaltene pulverige Produkt (1 g) wurde der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 (1 l) unterzogen und mit Methanol eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und das Konzentrat (530 mg) wurde in Wasser gelöst (10 ml), welches mittels einer Chromatographie an Diaion HP-20 (50-100 Mesh, 200 ml) gereinigt wurde. Von dem derart gereinigten Pulver (274 mg) wurde nach dem Peak-Muster der HPLC angenommen, daß es ein Gemisch eng analoger Verbindungen ist. Das pulverige Produkt (250 mg) wurde darauf der Umkehrphasen-HPLC zur Trennung (Säule: YMC-PAK SH343; mobile Phase: 30% Acetonitril/Wasser) unter Sammeln des Mittelteils der Hauptkomponenten unterzogen, welcher eingeengt wurde, um TAN-866 A als ein rötlich-orangefarbenes Pulver (64 mg) zu ergeben.

Beispiel 2

In einer der von Beispiel 1 ähnlichen Größenordnung wurden die Kultivierung, Filtration, HP-20-Säulenchromatographie und Isobutanol-Extraktion durchgeführt, gefolgt vom Unterwerfen des Konzentrates (3 l) der Extrakt-Lösung der Chromatographie an Kieselgel (1,5 l). Die Säule wurde mit Isobutanol (4,5 l), Isopropanol (4,5 l) und Isopropanol:Methanol (1:1) (4,5 l) gewaschen, gefolgt von der Elution mit Methanol (4,5 l). Das Eluat wurde zur Trockene eingeengt, um ein pulveriges Produkt (10,6 g) zu ergeben. Es wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt, daß das pulverige Produkt TAN-866 A enthielt (3,5 g).
Danach wurden 31 g des nach einem zu dem vorstehenden ähnlichen Verfahren erhaltenen pulverigen Produktes in 50%igem methanolischen Wasser (1 l) gelöst und die Lösung wurde einer Säulenchromatographie an Diaion HP-20 (100-200 Mesh, 1 l) unterzogen. Die Säule wurde mit 50%igem methanolischem Wasser (3 l) und 60%igem methanolischen Wasser (1 l) gewaschen, gefolgt vom fraktionierten Eluieren der antibiotischen Substanz mit 70%igem methanolischen Wasser (3 l) und 75%igem methanolischem Wasser (2 l). Jede Fraktion wurde eingeengt und lyophilisiert, was ein Pulver I (Gehalt an A: 67%, 7,6 g), Pulver II (Gehalt an TAN-844 A: 48%, 8,0 g) und Pulver 111 (Gehalt an TAN-866 A: 34%, 4,4 g) lieferte.
Darauf wurde das Pulver I (7,5 g) der präparativen Umkehrphasen-HPLC unterzogen. Aus der Säule wurde die antibiotische Substanz mit einem Lösungsmittelsystem aus einer 32%igen wäßrigen Acetonitril-Lösung unter Verwendung von YMC-PAK R-355 (25/44) (Yamamura Chemical Laboratories) eluiert. Jede Fraktion wurde der HPLC zur Analyse unterzogen, um die Menge jedes Bestandteils quantitativ zu bestimmen, gefolgt vom Einengen und der Lyophilisierung, um TAN-866 A und B enthaltendes Pulver (1,7 g), nur TAN-866 A enthaltendes Pulver (2,2 g) und TAN-866 A, C und D enthaltendes Pulver (0,33 g) zu erhalten. Das TAN-866 A und B enthaltende Pulver wurde erneut der präparativen HPLC unterzogen (Säule: YMC-PAK S-363 I-15, Lösungsmittelsystem: dasselbe wie bei der vorstehend erwähnten HPLC zur Trennung), um auf diese Weise TAN-866 A (1,15 g) und TAN-866 B (209 mg) als rötlich-orangefarbenes Pulver zu isolieren. Das TAN-866 A, C und D enthaltende Pulver wurde ähnlich aufgearbeitet, um TAN-866 C (70 mg) und TAN-866 D (150 mg) als rötlich-orangefarbenes Pulver zu ergeben.

Beispiel 3

Das in Beispiel 1 erhaltene gereinigte Pulver (40 mg) von TAN-866 A wurde in Wasser (2 ml) gelöst, welchem eine Lösung von 8-Hydroxychinolin (40 mg) in Methanol (2 ml) zugesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde 15 Stunden bei 4ºC stehen gelassen. Die entstandenen schwarzen Niederschläge wurden mit einem Filterpapier abfiltriert. Das Methanol im Filtrat wurde abdestilliert, gefolgt von der Zugabe von Wasser (20 ml), welches mit Chloroform (10 ml) viermal gewaschen wurde. Der wäßrige Anteil wurde eingeengt und lyophilisiert, um eine eisenfreie Verbindung (29 mg) von TAN-866 A als weißes Pulver zu erhalten.
Molekularformel: C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub5;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;
Elementaranalyse (%): (8 Stunden bei 60ºC über Phosphorpentoxid getrocknete Proben, berechnet als 3 Mol Wasser enthaltend)
Molekulargewicht durch die SI-MS-Methode bestimmt:
m/z 1184 (M + H)&spplus;
UV-Spektrum: (in Wasser) Endabsorption
IR-Spektrum: (in KBr) Hauptabsorptionen sind gezeigt
3300, 2930, 1640, 1520, 1230, 570 (cm&supmin;1)

Beispiel 4

Nach einem zu jenem in Beispiel 3 ähnlichen Verfahren wurden ausgehend von den in Beispiel 2 erhaltenen pulverigen Produkten von TAN-866 B, C, D (20 mg, 10 mg beziehungsweise 20 mg) die eisenfreien Verbindungen von TAN-866 B, C und D als weiße pulverige Produkte (20 mg, 8 mg beziehungsweise 19 mg) erhalten.
eisenfreie TAN-866 B-Verbindung:
Molekularformel: C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub5;N&sub1;&sub3;O&sub2;&sub0;
Elementaranalyse (%): (8 Stunden bei 60ºC über Phosphorpentoxid getrocknete Proben, berechnet als 2,5 Mol Wasser enthaltend)
Molekulargewicht durch die SI-MS-Methode bestimmt:
m/z 1200 (M + H)&spplus;
UV-Spektrum: (in Wasser) Endabsorption
IR-Spektrum: (in KBr) Hauptabsorptionen sind gezeigt
3300, 2940, 1665, 1530, 1240, 590 (cm&supmin;1) eisenfreie TAN-866 C-Verbindung:
Molekularformel: C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub7;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;
Elementaranalyse (%): (8 Stunden bei 60ºC über Phosphorpentoxid getrocknete Proben, berechnet als 3,5 Mol Wasser enthaltend)
Molekulargewicht durch die SI-MS-Methode bestimmt:
m/z 1198 (M + H)&spplus;
UV-Spektrum: (in Wasser) Endabsorption
IR-Spektrum: (in KBr) Hauptabsorptionen sind gezeigt
3300, 2940, 1665, 1530, 1235, 590 (cm&supmin;1) eisenfreie TAN-866 D-Verbindung:
Molekularformel: C&sub5;&sub2;H&sub8;&sub7;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub9;
Elementaranalyse (%): (8 Stunden bei 60ºC über Phosphorpentoxid getrocknete Proben, berechnet als 3 Mol Wasser enthaltend)
Molekulargewicht durch die SI-MS-Methode bestimmt:
m/z 1198 (M + H)&spplus;
UV-Spektrum: (in Wasser) Endabsorption
IR-Spektrum: (in KBr) Hauptabsorptionen sind gezeigt
3400, 2940, 1665, 1530, 1240, 590 (cm&supmin;1)

Beispiel 5

In 0,05M Phosphatpuffer (pH 9, 150 ml) wurde TAN-866 A (150 mg) gelöst und 2 Stunden bei 40ºC gerührt. Die Reaktionslösung wurde einer Säulenchromatographie an Diaion HP-20 (20 ml) unterzogen und die Elution wurde mit 50%igem methanolischem Wasser ausgeführt. Das Eluat wurde zur Trockene eingeengt, um ein Natriumsalz der Carbonsäureform der TAN-866 A-Verbindung zu liefern. SI-MS: m/z 1277 (M+H)&spplus;, Molekularformel:
C&sub5;&sub1;H&sub8;&sub3;N&sub1;&sub3;O&sub2;&sub0;FeNa.
Die derart erhaltene Verbindung in Carbonsäureform (150 mg) wurde rohe, von Pseudomonas acidovorans IFO 13582 gelieferte Amidase (1,5 g) enthaltendem 0,05M Phosphatpuffer (pH 7, 150 ml) zugesetzt und danach 18 Stunden bei 37ºC gerührt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde auf pH 2,5 eingestellt, gefolgt von der Extraktion mit Ethylacetat. Diese Extrakt-Lösung enthielt die Fettsäure. Die wäßrige Schicht wurde einer Säulenchromatographie an Diaion HP-20 (50-100 Mesh, 30 ml) unterzogen. Die Säule wurde mit 5-20%igem methanolischem Wasser fraktioniert eluiert. Die ein Peptid enthaltenden Fraktionen wurden zur Trockene eingeengt, um Deacyl-TAN-866 A als ein rötlich-orangefarbenes Pulver (97 mg) zu liefern.

Beispiel 6

TAN-866 B (10 mg), TAN-866 C (2 mg) und TAN-866 D (10 mg) wurden auf eine zu jener von Beispiel 5 ähnliche Weise hydrolysiert, um Deacyl-TAN-866 B (5 mg), Deacyl-TAN-866 C (1,5 mg) beziehungsweise Deacyl-TAN-866 D (5,7 mg) zu ergeben.

Claims

1. Verbindung der Formel

oder deren entsprechende Eisen-freie Verbindung, worin R&sub1; H oder OH ist und

R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub1; OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;&sub1; R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 5,8 min beträgt.

5. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 6,2 min beträgt.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

oder deren entsprechender Eisen-freier Verbindung, worin R&sub1; H oder OH ist und

R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind, umfassend das Kultivieren eines zu der Gattung Pseudomonas gehörenden und zur Erzeugung wenigstens einer Species der durch die obige Formel dargestellten Verbindungen befähigten Mikroorganismus auf einem Kulturmedium, um zu ermöglichen, daß wenigstens eine Species der genannten Verbindungen in dem Medium angereichert wird, das Isolieren des auf diese Weise angereicherten Produkts und anschließend erforderlichenfalls die Befreiung des Produkts von Eisen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin R&sub1; OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 5,8 min beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 6,2 min beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens YK-310 (lFO 14516, FERM BP-1369) ist.

13. Biologisch reine Kultur des zu der Gattung Pseudomonas gehörenden Mikroorganismus mit den Kennwerten, die mit denjenigen von FERM BP-1369 identifizierbar sind, wobei diese Kultur befähigt ist, in einem Kulturmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und verdaulichen Stickstoff enthält, eine isolierbare Menge wenigstens einer Species des Eisen-haltigen Peptids nach den Ansprüchen 1 bis 5 zu produzieren.

114. Pseudomonas fluorescens YK-310 (IFO 14516, FERM BP-1369), befähigt, wenigstens eine Species des Eisenhaltigen Peptids nach den Ansprüchen 1 bis 5 zu produzieren.

15. Verbindung der Formel

oder deren entsprechende Eisen-freie Verbindung, worin R&sub1; H oder OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind.

16. Verbindung nach Anspruch 15, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

17. Verbindung nach Anspruch 15, worin R&sub1; OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

18. Verbindung nach Anspruch 15, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 5,2 min beträgt.

19. Verbindung nach Anspruch 15, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 5,0 min beträgt.

20. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

oder deren entsprechender Eisen-freier Verbindung, worin R&sub1; H oder OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind, worin eine Verbindung der Formel

in der R&sub1; H oder OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H oder CH&sub3; sind, der Hydrolyse durch alkalische Lösungen zur Spaltung der Lacton-Bindung und der Hydrolyse durch Amidasen zur Eliminierung der Gruppe CH&sub3;(CH&sub2;)&sub5;-CH=CH-CH&sub2;-CO- unterworfen wird und danach das Produkt erforderlichenfalls von Eisen befreit wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

22. Verfahren nach Anspruch 20, worin R&sub1; OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils H sind.

23. Verfahren nach Anspruch 20, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 5,2 min beträgt.

24. Verfahren nach Anspruch 20, worin R&sub1; H ist, irgendwelche zwei der Substituenten R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; H sind und der verbleibende Substituent CH&sub3; ist und die HPLC- Retentionszeit 5,0 min beträgt.