DE69204734T2

DE69204734T2 - Antibakterielle Verbindung.

Info

Publication number: DE69204734T2
Application number: DE69204734T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki C O Sankyo C Haruyama; Akira C O Sankyo Company Ishii; Takeshi C O Sankyo Co Kagasaki; Kentaro C O Sankyo Comp Kodama; Hideyuki C O Sankyo C Shiozawa; Shuji Takahashi
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-05-07
Filing date: 1992-05-07
Publication date: 1996-05-09
Anticipated expiration: 2012-05-08
Also published as: FI922058A; CA2068083C; KR0139515B1; KR920021550A; CS139292A3; IE70452B1; CN1067921A; IS3855A; RU2077534C1; FI100112B; AU646615B2; CN1043786C; TW224488B; HU9201526D0; HU211594A9; HUT63197A; CA2068083A1; CZ279780B6; NO921783D0; NZ242648A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verbindung, die wir "Thiomarinol" genannt haben, und welche die nachstehende Formel aufweist. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Thiomarinol zur Verfügung, umfassend die Fermentation unter Verwendung eines Mikroorganismus des Genus Alteromonas, und insbesondere eines Stammes der neuen Spezies Alteromonas rava, bezeichnet als SANK 73390, der selbst neu ist und einen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt. Thiomarinol besitzt eine Vielzahl an therapeutischen, insbesondere antibakteriellen Wirkungen, und infolgedessen stellt die Erfindung auch Zusammensetzungen und Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder Prophylaxe unter Ve:wendung dieser Verbindung zur Verfügung.
Organismen des Genus Alteromonas können aus Meerwasser isoliert werden, und es wurde gezeigt, daß einige von ihnen Verbindungen produzieren, die potentiell therapeutisch anwendbar sind. Beispielsweise wurde eine Verbindung, die als Viscabelin bekannt ist, aus einer Alteromonasspezies erhalten, und es wurde gezeigt, daß diese Verbindung Antitumoraktivität entfaltet. (Japanische Patentanmeldung Kokai Nummer Sho 63- 27484).
In Bezug auf die Struktur des Thiomarinols sind einige Antibiotikasubstanzen mit ähnlichen Strukturen bekannt, und diese können in drei Gruppen unterteilt werden.
Die erste Gruppe umfaßt die Pseudomonas-Säuren, die zuerst aus Pseudomonas spp. isoliert wurden. Diele umfassen die Pseudomonas-Säure A [produziert von Pseudomonas fluorescens, offenbart in J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294 (1977)], die Pseudomonas-Säure D [ibid., 318 (1977], Pseudomonas-Säure C [ibid., 2827 (1982)] und die Pseudomonas-Säure D [ibid., 2655 (1983)]. Die Pseudomonas-Säure A wird unter dem Namen "Bactroban" (Beecham, registriertes Warenzeichen) in Form einer 2%-igen dermatologischen Salbe zur antibakteriellen Verwendung vertrieben.
Andere Pseudomonassäurederivate wurden aus marinen Bakterien erhalten [Am. Chem. Soc. Abstr. Pap., 200 (2), (1990)], wobei aber dafür dieses Dokument keine antibakterielle Aktivität offenbart.
Die zweite Gruppe von Substanzen, die mit den Verbindungen der Erfindung eine strukturelle Ähnlichkeit gemeinsam haben, umfaßt die Gruppe, welche die Antibiotika Holomycin [Helv. Chim. Acta, 42, 563 (1959)], Pyrrothin [J. Am. Chem. Soc., 77, 2861 (1955)], Thiolutin [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], Aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)] und andere beinhaltet. Diese Antibiotika werden normalerweise von Actinomyceten produziert und sind durch ein schwefelhaltiges Chromophor gekennzeichnet. Xenorhabdine I - V sind Substanzen, die mit Holomycin verwandt sind und wurden ebenfalls aus Bakterien isoliert (offenbart in WO 84/01775).
Verschiedene Studien wurden an Derivate- dieser beiden Gruppen durchgeführt, wobei uns aber nicht bekannt ist, daß eine Substanz beschrieben wurde, die die molekulare Struktur des Thiomarinols hat oder die Eigenschaften des Thiomarinols aufweist.
Die dritte Gruppe von Verbindungen wird in Veröffentlichungen, wie beispielsweise in den japanischen Anmeldungen Kokai Nr. 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 und 54-125672 offenbart, welche Pseudomonassäurederivate mit einer ähnlichen Struktur wie Thiomarinol beschreiben, worin aber die terminale Carbonsäure durch eine Amidgruppe ersetzt ist. Diese Verbindungen weisen keine vergleichbare antibakterielle Aktivität auf, und sie zeigen auch kein breites Spektrum an antibakterieller Aktivität. Tatsächtich zeigen diese Verbindungen eine Tendenz, schwächere antibiotische Aktivität als die der eigentlichen Pseudomonassäuren zu entfalten.
Keine der oben beschriebenen Verbindungen wurde aus Alteromonas spp. isoliert, und keine ist identisch mit Thiomarinol. Beispielsweise ist eines der Strukturmerkmale von Thiomarinol das Vorhandensein einer OH-Gruppe, die zwischen dem sechsgliedrigen Ring und der α,ß-ungesättigten Carbonylgruppe angeordnet ist. Demgemäß unterscheidet sich Thiomarinol eindeutig vom Stand der Technik.
Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I) zur Verfügung:
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Thiomarinol zur Verfügung, das die Züchtung von Thiomarinol-produzierenden Mikroorganismen des Genus Alteromonas und die Isolierung von Thiomarinol aus der Kultur umfaßt.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die Thioarinol in Form einer Mischung mit einem pharmazeütisch geeigneten Trägermaterial oder einem Verdünnungsmittel umfaßt.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des Thiomarinols zur therapeutischen Behandlung, speziell zur Behandlung oder Prophylaxe bakterieller Infektionen, zur Verfügung.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung von Thiomarlnol zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe bakterieller Infektionen zur Verfügung.
Infolgedessen stellen wir Thiomarinol zur Verfügung, welches eine neue Verbindung ist, und eine verbesserte Wirkung und ein breiteres Spektrum an antibakterieller Aktivität im Vergleich mit den oben beschriebenen Gruppen von Antibiotika aufweist.
Aus der oben genannten Formel wird deutlich, daß Thiomarinol eine Reihe von asymmetrischen Kohlenstoffatomen und mehreren Doppelbindungen enthält. Isomerisierung ist insbesondere an der α,ß-ungesättigten Carbonyl-Einheit des Thiomarinols möglich. Thiomarinol kann deswegen verschiedene optische und geometrische Isomere bilden. Obgleich diese in ihrer Gesamtheit durch eine einzige Molekülformel dargestellt werden, umfaßt die vorliegende Erfindung sowohl die einzelnen, isolierten Isomere als auch deren Gemische, einschließlich der Racemate. In den Fällen, in denen stereospezifische Synthesetechniken angewandt werden, oder optisch aktive Verbindungen als Ausgangsmaterial verwendet werden, können einzelne Isomere direkt hergestellt werden; wenn andererseits ein Isomerengemisch hergestellt wird, können die einzelnen Isomere durch herköminliche Trennungstechniken erhalten werden.
Natürlich vorkommendes Thiomarinol wird sicherlich dazu neigen, eine gängige optische Konfiguration einzunehmen. Die natürliche Konfiguration ist infolgedessen bevorzugt, obgleich auch andere Konfigurationen zur Verfügung gestellt werden.
Thiomarinol kann hergestellt werden, indem ein Thiomarinolproduzierender Mikroorganismus des Genus Afteromonas gezüchtet wird, und das Thiomarinol anschließend aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Varianten des Thiomarinols, die die erforderliche antibakterielle Aktivität aufweisen, können in ähnlicher Weise aus anderen Alteromonas-Stämmen oder -Spezies erhalten werden, die die erforderliche Verbindung produzieren, oder sie können durch geeignete Modifizierung einer Verbindung die mittels der oben genannten Fermentation erhalten wird, gewonnen werden, oder sie können direkt chemisch synthetisiert werden.
Insbesondere bevorzugen wir, speziell die neue Spezies Alteromonas rava und insbesondere den neu isolierten Alteromonas rava-Stamm, dem wir die Stammbezeichnung SANK 73390 gegeben haben, als Mikroorganismus zu verwenden. Der Stamm SANK 73390 ist ein mariner Mikroorganismus, der aus Meerwasser isoliert wurde, das vor der Küste von Koina, Minami-Izu Machi, Präfektur Shizuoka, Japan erhalten wurde, und dieser Stamm wurde bei der Hinterlegungsstelle, Fermenation Resarch Institut, Agency of Industrial Science & Technology, Japan am 30. April 1991 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-3381 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
Die taxonomischen Eigenschaften des Alteromonas rava-Stammes SANK 73390 werden nachstehend dargelegt.

1. Morphologische Eigenschaften

Der Alteromonas rava Stamm SANK 73390 wurde bei 23ºC 24 Stunden lang auf Marine Agar (Difco) gezüchtet. Die anschließende mikroskopische Untersuchung zeigte, daß die Zellen stäbchenförmig waren, und jede einen Durchmesser von 0,8 bis 1,8 um und eine Länge von 2,0 bis 3,6 um aufwies. Dieser Stamm ist Gram-negativ und bewegt sich mit Hilfe einer polar monotrich angeordneten Geißel.

2. Wachstum auf Marine Agar

SANK 73390 wurde bei 23ºC 24 Stunden lang auf Marine Agar (Difco) gezüchtet. Es wurde beobachtet, daß die erhaltenen Kolonien eine blaß-graugelbe Färbung hatten sowie trüb, kreisförmig, flach und vollständig waren. Wasserlösliches Pigment wurde nicht gebildet.

3. Physiologische Eigenschaften

(1) Meerwasserbedarf: SANK 73390 benötigt Meerwasser für das Wachstum
(2) Oxidativer Fermentationstest (Hugh-Leifson- Verfahren) [J. Bact., 66, 24-26 (1953)], in einem aus künstlichem Meereswasser hergestellten Medium): keine Wirkung auf Kohlenhydrat
(3) Oxidase: +
(4) Catalase: +
(5) Sauerstoffbedarf: aerob
(6) Reduktion von Nitrat: -
(7) Hydrolyse von Stärke: +
(8) Zersetzung von Agar: -
(9) Verflüssigung von Gelatine: +
(10) DNase-Produktion: +
(11) Lipase-Produktion: +
(12) Wachstumstemperatur: schlechtes Wachstum bei 4ºC, gutes Wachstum zwischen 17ºC und 26ºC, kein Wachstum bei 35ºC.
(13) Wachstumsfaktorbedarf: auf dem Grundmedium, das im Journal of Bacteriology 107, 268-194 (1971) beschrieben ist, benötigt SANK 73390 vitaminfreie Casaminosäure.
(14) Assimilation von Kohlenstoffquellen: auf dem Grundmedium, das im Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971), beschrieben ist, welches zusätzlich 0,1% (Gew./Vol. vitaminfreie Casaminosäure enthält, in einer Schüttelkultur: Tabelle L-Arabinose D-Xylose D-Galactose Maltose Trehalose Melibiose Sorbit Natriumacetat D-Ribose D-Glucose D-Fractose Saccharose Cellovbiose Mannit Glycerin Natriumpropionat

4. Chemotaxonomische Eigenschaft

(1) Mol % Guanin und Cytosin (G + C-Gehalt) von DNA: 43,4 % (HPLC-Methode)
(2) Chinon-System: Ubichinon Q-8
In Bezug auf die oben dargestellten taxonomischen Eigenschaften wurde der Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 mit den Stämmen, die in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1, (1984), sowie mit den Stämmen, die in den neueren Ausgaben des International Journal of Systematic Bacteriology beschrieben wurden, verglichen. Wir stellten fest, daß der Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 gewisse Ähnlichkeiten mit Alteromonas citrea, einem anderen marinen Mikroorganismus gemeinsam hatte. SANK 73390 und Alteromonas citrea, ATCC 29719 (ein Standardstamm), wurden auf vergleichbare Weise gezüchtet und miteinander verglichen.
Verglichen mit der blassen graugelben Färbung von SANK 73390 waren die ATCC 29719 Kolonien grünlich-gelb gefärbt. SANK 73390 unterschied sich von Alteromonas citrea auch hinsichtlich des Wachstums bei 4ºC, und in der Fähigkeit, Trehalose und Natriumpropionat als Kohlenstoffquellen zu verwerten.
Demgemäß stellt der Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 einen neuen Stamm der neuen Spezies Alteromonas rava dar und unterscheidet sich in wesentlichen Eigenschaften von der nächstbekannten Spezies, die mit der Hinterlegungsnummer ATCC 29719 hinterlegt wurde.
Die oben beschriebenen Eigenschaften sind für SANK 73390 typisch. Es ist jedoch gut bekannt, daß die Eigenschaften von Alteromonas spp. sowohl natürlich als auch synthetisch veränderbar sind. Die oben definierten Eigenschaften bestimmen den Alteromonas rava-Stamm so wie er hinterlegt wurde. Sie-sind aber nicht notwendigerweise typisch für andere Alteromonas-Spezies oder Alteromonas rava-Stämme, die befähigt sind, Thiomarinol oder eine seiner natürlich vorkommenden Varianten zu produzieren. Solche anderen Stämme werden vom Wesen der Erfindung mit umfaßt.
Es wird angenommen, daß SANK 73390 oder irgendein anderer Stamm, der befähigt ist, Thiomarinol oder eine seiner Varianten zu produzieren, sub-kultiviert oder biotechnologisch verändert oder modifiziert werden kann, um einen Organismus mit anderen Eigenschaften zu produzieren. Die einzige Bedingung ist die, daß der erhaltene Organismus in der Lage ist, die gewünschte Verbindung zu produzieren.
Solche Veränderungen und Modifizierungen können jede gewünschte Form annehmen oder sich aus Faktoren wie beispielsweise den Kulturbedingungen ergeben. Stämme können durch Züchtung modifiziert und so selektiert werden, daß sie Eigenschaften wie beispielsweise verbessertes Wachstum oder Wachstum bei niedrigeren/höheren Temperaturen aufweisen.
Biotechnologische Modifikationen werden normalerweise beabsichtigt und können selektierbare Eigenschaften, wie beispielsweise bakteriostatische Widerstandsfähigkeit oder Empfindlichkeit oder Kombinationen davon initiieren, um die Reinheit zu erhalten oder um von Zeit zu Zeit die Reinigung von Kulturen, insbesondere Impfkulturen, zu ermöglichen.
Andere Eigenschaften, die durch genetische Manipulation eingeführt werden können, sind alle, die bei Alteromonas spp. möglich sind. Beispielsweise können Plasmide, die Resistenzen kodieren, eingebaut werden, oder jedes natürlich vorkommende Plasmid kann entfernt werden. Vorteilhafte Plasmide beinhalten diejenigen, die Auxotrophie verleihen. Plasmide können aus jeder geeigneten Quelle erhalten werden, oder sie können durch Isolierung eines natürlich vorkommenden Alteromonas-Plasmids und durch Insertion eines gewünschten Gens oder von Genen aus einer anderen Quelle gentechnisch hergestellt werden. Natürliche Plasmide können ebenfalls auf jede Art, die wünschenswert erscheint, modifiziert werden.
Um Thiomarinol aus einer Kultur eines geeigneten Mikroorganismus zu erhalten, sollten die Mikroorganismen in einem geeigneten Medium fermentiert werden. Solche Medien sind im allgemeinen aus dem Stand der Technik gut bekannt und werden häufig bei der Produktion anderer Fermentationsprodukte verwendet.
Typischerweise wird es erforderlich sein, daß das Medium irgendeine Kombination aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle un einem oder mehreren anorganische Salzen umfaßt, die von den betreffenden Mikroorganismen assimiliert werden können. Die an das Medium gestellte minimale Bedingung wird die sein, daß es diejenigen Bestandteile enthält, die für das Wachstum des Mikroorganismus essentielle sind.
Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Fructose, Maltose, Sacchrarose, Mannit, Glycerin, Dextrin, Fafermehl, Roggen, Maisstärke, Kartoffeln, Maispulver, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenöl, Sirup, Zitronensäure und Weinsäure, die jeweils allein oder in Komination mit einer oder mehreren anderen Kohlenstoffquellen verwendet werden können. Die üblichen Mengen liegen in einem Bereich von ungefähr 1 bis 10 % (Gew./Vol.) bezogen auf die Menge des Mediums, wobei die Menge in gewünschter Weise und in Übereinstimmung mit dem gewünschten Ergebnis variiert werden kann.
Geeignete Stickstoffquellen umfassen beispielsweise alle Substanzen, die ein Protein enthalten. Repräsentative Beispiele für Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen aus Tieren und Pflanzen und können Extrakte aus natürlichen Quellen wie beispielsweise Sojabohnenpulver, Kleie, Erdnußpulver, Baumwollsamenpulver, Caseinhydrolysat, Fermanin, Fischmehl, Maiseinweichwasser, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt un Malzextrakt sein; und anorganische Stofkstoffquellen, wie beispielsweise Natriumnnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. Wie im Falle der Kohlenstoffquelle können diese allein oder in Kombination verwendet werden. Geeignete Mengen liegen üblicherweise in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis 6 % (Gew./Vol.), bezogen auf die Menge des Mediums.
Geeignete anorganische Nährsalze sind diejenigen, die sowohl Spurenelemente als auch den Nauptbestandteil des Salcves zur Verfügung stellen. Vorzugsweise sollten die Salze Ionen, wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Magnesium, Eisen, Phosphat, Sulfat, Chlorid und Carbonat zur Verfügung stellen. Spurenmetalle, wie beispielsweise Kobalt, Mangan und Strontium oder Salze, die befähigt sind, Ionen, wie beispielsweise Bromid-, Fluorid-, Borat- oder Silikat-Ionen bereitzustellen, können ebenfalls vorhanden sein.
Es wird davon ausgegangen, das Alteromonas rava in Meerwasser natürlich vorkommt, so daß, wenn nichts dagegen spricht, die Kulturbedingungen idealerweise einer marinen Umgebung entsprechen. Daher enthält jedes Medium, das für die Züchtung von Alteromonas verwendet wird, vorteilhafterweise Spurenelemente, die im Meer vorkommen.
Wenn der Mikroorganismus in Form einer flüssigen Kultur fermentiert wird, wird bevorzugterweise ein Antischaummittel, wie beispielsweise ein Silikonöl oder Pflanzenöl oder ein anderes geeignetes oberflächenaktives Mittel eingesetzt.
Bevorzugterweise wird der pH-Wert des Kulturmediums für den Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 in einem Bereich von pH 5,0 bis pH 8,0 gehalten, wenn dieser zur Produktion von Thiomarinol verwendet wird, obgleich die einzige Einschränkung darin besteht, daß der pH-Wert nicht das Wachstum des Mikroorganismus verhindern sollte oder die Qualität des Endprodukts nachteilig irreversibel beeinflußt. Es kann bevorzugt. sein, einen Überschuß an Säure oder Alkali zuzugeben, um die Fermentation zu stoppen.
Üblicherweise wächst der Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 bei Temperaturen im Bereich von 4ºC bis 32ºC, und er wächst gut bei 17ºC bis 26ºC. Andere Temperaturen, die nicht in diesen Bereichen liegen, können in den Fällen angewendet werden, in denen ein Stamm entwickeln wurde, der bei niedrigeren oder höheren Temperaturen wachsen kann. Eine bevorzugte Temperatur für die Produktion von Thiomarinol liegt zwischen 20ºC und 26ºC.
Thiomarinol wird idealerweise durch eine aerobe Kultur erhalten, wobei jede der geeigneten aeroben Kulturmethoden, wie beispielsweise eine Festphasen-Kultur, eine Schüttelkultur und eine unter Rühren belüftete Kultur verwendet werden kann.
Wenn die Züchtung im kleinen Maßstab durchgeführt wird, ist eine Schüttelkultur, die bei 20ºC bis 26ºC einige Tage lang fermentiert wird, üblicherweise bevorzugt.
Um eine Fermentationskultur zu starten, besteht eine bevorzugte Technik darin, daß man, beispielsweise in einem Erlenmeyerkolben, ein Ausgangsimpfmaterial verwendet, das in ein oder zwei Verfahrensschritten hergestellt wurde.
Eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle können in Kombination für das Kulturmedium verwende werden. Der Kolben mit dem Impfgut wird in einem thermostatischen Inkubator bei 23ºC 1 bis 3 Tage lang oder solange, bis ausreichendes Wachstum beobachtet wird, geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur kann dann verwendet werden, um eine zweite Impfkultur oder eine Produktionskultur anzuimpfen. Wenn eine zweite Inpfung durchgeführt wird, kann diese in ähnlicher Weise durchgeführt werden und teilweise zur Animpfung des Produktionsmediums benutzt werden. Der Kolben, in dem das Impfgut durch Impfung eingebracht wurde, wird 1-3 Tage lang oder bis zur maximalen Produktion bei einer geeigneten Temperatur geschüttelt. Wenn die Inkubation beendet ist, kann der Inhalt des Kolbens durch Zentrifugieren oder Filtrieren gewonnen werden.
Die Züchtung in einem geeigneten Rührfermenter mit Belüftungvorrichtung kann bevorzugt sein, wenn sie im großen Maßstab durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren kann das Nährmedium in einem Fermenter hergestellt werden. Nach der Sterilisation bei 125ºC wird das Medium abgekühlt und mit einem Impfmaterial, das vorher auf einem sterilisierten Medium gezüchtet wurde, beimpft. Die Züchtung wird bei 20ºC bis 26ºC unter Rühren und Belüften durchgeführt. Dieses Verfahren ist geeignet, um eine große Menge der Verbindung zu erhalten.
Die Menge an Thiomarinol, die von der Kultur im Laufe der Zeit produziert wird, kann beispielsweise durch Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie kontrolliert werden. Üblicherweise erreicht die Menge an produziertem Thiomarinol nach einer Zeit zwischen 19 Stunden und 96 Stunden ein Maximum.
Nach einer geeigneten Züchtungszeit kann das Thiomarinol isoliert und durch irgendwelche bekannten Methoden gereinigt werden. Beispielsweise kann das in der Kulturlösung verbliebene Thiomarinol erhalten werden, indem die Feststoffe beispielsweise unter Verwendung von Diatomit als Filtrierhilfe abfiltriert werden, oder aus der überstehenden Lösung zentrifugiert und extrahiert wird, und indem das Thiomarinol entsprechend seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften gereinigt wird.
Beispielsweise kann das Thiomarinol, das im Filtrat oder in der überstehenden Lösung vorliegt, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat, Chloroform, Dichlorethan, Dichlormethan oder irgendeiner Mischung davon unter neutralen oder sauren Bedingungen extrahiert und gereinigt werden.
Alternativ kann als Absorptionsmittel Aktivkohle oder ein adsorbierendes Harz, wie beispielsweise Antberlite XAD-2, XAD-4 (Rohm & Haas) oder Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation) verwendet werden. Verunreinigungen können nach Adsorption entfernt werden, indem man die das Thiomarinol enthaltende Flüssigkeit durch eine Schicht von Adsorptionsmittel laufen läßt oder Thiomarinol kann nach der Adsorption gereinigt werden, indem es mit einem geeigneten Elutionsmittel, wie beispielsweise wäßrigem Methanol, wäßrigem Aceton oder Butanol/Wasser eluiert wird.
Intrazelluläres Thiomarinol kann gereinigt werden, indem man es mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise 50 bis 90%-igem wäßrigem Aceton oder wäßrigen Methanol extrahiert, anschließend das organische Lösungsmittel entfernt und danach, wie oben für das Filtrat oder die überstehende Lösung beschrieben, extrahiert.
Das erhaltene Thiomarinol kann nach bekannten Methoden weiter gereinigt werden, beispielsweise durch: Säulenadsorptionschromatographie unter Verwendung eines Trägers wie beispielsweise Kieselgel oder Magnesiumoxid-Kieselgel, das beispielsweise unter dem Warenzeichen "Florisil" vertrieben wird; Säulenverteilungschromatographie unter Verwendung eines Adsorptionsmittels, wie beispielsweise Sephadex LH-20 (Handelsname für ein Produkt von Pharmacia); oder Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung einer Säule mit normaler Phase oder einer Umkehrphasen-Säule. Es ist aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt, daß diese Isolierungs- und Reinigungsverfahren allein oder in irgendeiner geeigneten Kombination und, falls gewünscht, auch wiederholt durchgeführt werden können, um das gewünschte Endprodukt zu isolieren und zu reinigen.
Wenn beabsichtigt wird, die erfindungsgemäßen Verbindungen therapeutisch zu verwenden, können sie allein oder in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung, die zusätzlich zu der aktiven Verbindung eine oder mehrere herkömmliche Streckmittel, Trägersubstanzen, Bindemittel oder Hilfsmittel enthält, verabreicht werden. Die Beschaffenheit der Formulierung hängt natürlich von dem geplanten Verabreichungsweg ab. Für den oralen Verabreichungsweg jedoch wird die Verbindung vorzugsweise als Pulver, Granulate, Tabletten, Kapseln oder Sirup formuliert. Für die parenterale Verabreichung wird sie bevorzugterweise als Injektion (die intravenös, intramuskulär oder subkutan erfolgen kann) oder als Tropf oder Zäpfchen formuliert.
Die Zubereitungen können durch bekannte Verfahren hergestellt werden, indem Additive, wie beispielweise Trägermaterialien, Bindemittel, Zerfallhilfsmittel, Gleitmittel, Stabilisatoren, geschmacksverbessernde Zusätze, Lösungsvermittler, Suspendiermittel oder Beschichtungsmittel, zugegeben werden. Obgleich die Dosierung in Abhängigkeit von den Symptomen und dem Alter des Patienten, der Art und Stärke der Infektion und dem Verabreichungsweg und der Verabreichungsart variieren kann, können die erfindungsgemäßen Verbindungen bei oraler Verabreichung an einen erwachsenen Patienten normalerweise mit einer täglichen Dosis von 20 mg bis 2000 mg verabreicht werden. Die Verbindungen können als Einzeldosis oder aufgeteilt auf beispielsweise zwei- oder dreimal pro Tag verabreicht werden.
Da Thiomarinol eine antibakterielle Wirkung gegenüber Grampositiven und Gram-negativen Bakterien in Säugetieren (z.B. Mensch, Hund, Katze und Ratte) aufweist, ist es häufig wünschenswert, es äußerlich, üblicherweise in Form einer Creme, einer Salbe oder eines Gels, anzuwenden.
Für die Bestandteile und Herstellung dieser Verabreichungsformen gelten ähnliche Überlegungen wie die oben genannten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Thiomarinol und dessen antibakterielle Aktivität, sind jedoch nicht derart auszulegen, daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.

Beispiel 1

Gefäßfermentation von Thiomarinol

A) Kultur

Der Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 wurde bei 22ºC drei Tage lang auf einer Schrägschicht aus Marine Agar (Difco- Produkt) gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde in 3 ml künstlichem Meerwasser suspendiert. 0,1 ml der Suspension wurde unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen 500 ml Erlenmeyerkolben, der 100 ml eines sterilisierten Mediums [37,4 g Marine Broth (Difco-Produkt) in 1 Liter entionisiertem Wasser, keine Einstellung des pH-Wertes], enthielt, eingeimpft.
Der Kolben wurde bei 23ºC 24 Stunden lang unter Schütteln bei 200 U/min (Rotationsradius 70 mm) unter Verwendung eines Rotationsschüttlers inkubiert. Danach wurde jeder von vier 30 Liter- Schüttelfermentern, von denen jede:- 15 Liter des oben beschriebenen sterilen Mediums enthielt, jeweils mit 15 ml der aus dem Erlenmeyerkolben steril entnommenen Kultur beimpft. Die Schüttelfermenter wurden bei 23ºC 23 Stunden lang bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 7,5 Liter/Minute unter Rühren (100 U/min) inkubiert.

B) Isolierung

Nach 23 Stunden wurden die Fermenterinhalte vereinigt, um 60 Liter der Kulturlösung zu erhalten. Der pH-Wert der Lösung wurde anschließend durch Zugabe von Salzsäure auf einen Wert von 3 eingestellt, und anschließend wurden 60 Liter Aceton zugegeben, und das Gemisch 30 Minuten lang unter Rühren extrahiert. Unter Verwendung von 1,2 kg Celite 545-Filtrierhilfe (Warenzeichen eines Produkts, das von Johns Manville Co. erhältlich ist) wurde die Lösung filtriert. 110 Liter des erhaltenen Filtrats wurden anschließend einmal mit 60 Liter Ethylacetat und zweimal mit jeweils 30 Liter Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit 30 Liter 5%-iger. (Gew./Vol.) wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und nachfolgend mit 30 Liter gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft, um 14 g einer öligen Substanz zu erhalten. Die erhaltene ölige Substanz wurde in Dichlormethan gelöst, und die Lösung wurde an einer Säule, die mit 200 g Kieselgel in Dichlormethan gefüllt war, adsorbiert. Die Zielverbindung wurde durch Steigerung der Polarität des Entwicklungslösungsmittels in der folgenden Reihenfolge eluiert: Dichlormethan/Ethylacetat; Ethylacetat; Ethylacetat/Methanol. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 18 ml gewonnen, und die mit Ethylacetat-Methanol eluierten Fraktionen, welche das Thiomarinol enthielten, wurden aufbewahrt.
Die aufbewahrten Fraktionen wurden bis zur Trockne eingedampft, um 7 g einer öligen Substanz zu erhalten, die in 400 ml 50%-igem (Vol-%). wäßrigem Methanol gelöst wurde und an einer 600 ml-Säule adsorbiert wurde, die mit Diaion HP-20 (Warenzeichen eines Produkts, das von Mitsubishi Chem. Ind. erhältlich ist) in Wasser gefüllt war. Nach dem Waschen mit 50%-igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol wurde die Zielsubstanz mit 90%-igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol eluiert und anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 1 g eines gelben Pulvers erhalten wurde. Das gelbe Pulver wurde nochmals säulenchromatographisch unter Verwendung von Sephadex LH-20 eluiert und mit Dichlormethan : Ethylacetat : Methanol (19 : 19 : 2 Volumenteile) entwickelt, um die aktiven Fraktionen zu gewinnen. 750 mg Thiomarinol wurden als gelbes Pulver erbalten.
Das erhaltene Thiomarlnol hatte die nachstehend aufgeführten Eigenschaften.
1) Art und Aussehen: gelbes Pulver.
2) Schmelzpunkt: 84 - 89ºC
3) Molekülformel C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub9;S&sub2;.
4) Molekulargewicht: 640, bestimmt durch die FAB-MS- Methode ("FAB-MS" bedeutet Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen).
5) Hochauflösungs-Massenspektrum: C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub5;N&sub2;O&sub9;S&sub2; [ (M+H)&spplus; mittels der FAB-MS-Methode]:
berechnet: 641,2567
gefunden: 641,2585.
6> Elementaranalyse:
berechnet: C, 56,23%; H, 6,92%; N, 4,37%; S, 10,01%
gefunden: C, 55,92%; H, 6,82%; N, 4,23%; S, 9,90%
7) Infrarot-Absorptionsspektrum: Das Infrarotspektrum zeigte folgende Ansorptionsmaxima (KBR-Pressling, νmax cm&supmin;¹):
3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.
8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
In Methanol oder in Methanol + HCl zeigt Thiomarinol das nachstehend gezeigte Ultraviolett-Aösorptionsspektrum [angegeben als λ max nm (&epsi;)] 387 (12.000), 300 (3.500), 214 (26.000) und in Methanol + NaOH das nachstehend gezeigte Ultraviolett-Ahsorptionsspektrum: [angegeben als λmax nm (&epsi;)] 386 (9.600), 306 (3.200), 206 (25.000).
9) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5; +4,3º (C=1,0, Methanol).
10) Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie:
Trennsäule: Senshu-Pak ODS H-2151 (Säulengröße, 6 x 150 mm, Produkt der Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel 40%-iges (Vol./Vol.) wäßriges Acetonitril
Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/Min
Wellenlänge: 220 - 350 nm (Nachweis durch Photodiodenanordnung)
Retentionszeit: 5,9 Min.
11) Kernmagnetisches ¹H-Resonanzspektrum (δ ppm) das kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHZ) in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard ist nachstehend gezeigt:
0,91 (3H, Dublett, J=6,8 Hz);
0,95 (3H, Dublett, J=5,9 Hz);
1,30 (6H, breites Multiplett);
1,55 (5H, breites Multiplett);
2,03 (3H, Singulett);
2,09 (3H, Multiplett);
2,34 (2H, Triplett, J=7,3 Hz);
3,33 (1H, Dublett, J=10,7 Hz);
3,52 (2H, Multiplett);
3,64 (2H, Multiplett);
3,73 (1H, Dublett von Dubletts);
4,02 (2H, Triplett, J=6,6 Hz);
4,18 (1H, breites Dublett, J=7,3 Hz);
4,30 (1H, Dublett, J=4,4 Hz);
4,44 (1H, Dublett, J=7,8 Hz);
4,63 (1H, Dublett, J=3,4 Hz);
4,89 (1H, Dublett, J=7,3 Hz);
5,37 (2H, Multiplett);
5,97 (1H, breites Singulett);
7,04 (1H, Singulett);
9,80 (1H, breites Singulett);
10,68 (1H, breites Singulett);
12) Kernmagnetisches ¹³C-Resonanzspektrum (δ ppm): das kernmagnetische Resonanzspektrum (68 MHz) in tetradeuteriertem Methanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard wird nachstehend gezeigt:
174,3 (Singulett), 170,4 (Singulett), 168,6 (Singulett),
161,1 (Singulett), 137,9 (Singulett), 135,7 (Dublett),
135,1 (Singulett), 129,8 (Dublett), 116,3 (Dublett),
115,8 (Singulett), 113,7 (Dublett) 77,6 (Dublett),
74,4 (Dublett), 72,1 (Dublett), 718 (Dublett),
66,0 (Triplett), 65,7 (Dublett), 64,9 (Triplett),
45,3 (Dublett), 43,9 (Dublett), 36'6 (Triplett),
33,4 (Triplett), 30,1 (Triplett), 30,0 (Triplett),
29,7 (Triplett), 27,0 (Triplett), 26,7 (Triplett),
20,3 (Quartett), 16,6 (Quartett), 6,3 (Quartett).
13) Löslichkeit:
Löslich in Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol, und Butanol; und löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Aceton und Diethylether; unlöslich in Hexan und Wasser. 14) Farbreaktion:
Positiv mit Schwefelsäure, Jod und Kaliumpermanganat.
15) Dünnschichtchromatographie:
Rf-Wert: 0,57
Adsorptionsmittel: Silicagel (Merck & Co. Inc., Art 5715)
Entwicklungslösungsmittel: Methylenchlorid : Methanol = 85 : 15 Volumenteile.

TESTBEISPIEL 1

Antibakterielle Aktivität von Thiomarinol

Die inhibierende Mindestkonzentration (MIK) von Thiomarinol, in ug/ml angegeben, gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien wurde durch die Agarmedium-Verdünnungsmethode unter Verwendung eines Agarnährmediums (Produkt von Eiken Chemical Co., Ltd.) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Test-Bakterienstamm Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Salmonella enteritidis Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Serratia marcescens Proteus vulgaris Morganella morganii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

Testbeispiel 2

Antimycoplasma-Aktivität von Thiomarinols
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Testbeispiel 1 wurde die Aktivität von Thiomarinol gegen verschiedene Mycoplasma-Spezies getestet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Stamm Mycoplasma bovis Donetta gallisepticum synoviae hyosvnoviae
Impfmaterial: 0,005 ml 10&sup5; CFU/ml
Assay-Medien:
M. bovis und M. gallisepticum Chanock-Medium [hergestellt wie in P.N.A.S., 48, 41-49 (1962) beschrieben und mit 20% Pferdeserum angereichert]
M. synoviae Frey Medium [hergestellt wie in Am. J. Vet. Res., 29, 2163-2171 (1968) beschrieben und mit 12% Schweineserum angereichert]
N. hyosynoviae Mucin PPLO* Agarmedium (angereichert mit 15% Pferdeserum)
Kulturbedingungen: 37ºC, 5 Tage, schwach aerob (BBL-Gaspack- Verfahren [Kultivierung in einem C0&sub2;-Einweggenerator von Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, ND 2103 USA].
*PPLO (PleuroPneumonia-Like Organism)
PPLO-Broth ohne CV (Difco) 21 g
Bakteriologisches Mucin (Difco) 5 g
Destilliertes Wasser 800 ml
Agar Noble (Difco) 12 g
Pferdeserum 150 ml
25%-iger frischer Hefeextrakt 50 ml

Claims

1. Verbindung der Formel (I)

2. Verbindung mit folgenden Eigenschaften:

Art und Aussehen: Gelbes Pulver;

Schmelzpunkt 84 bis 89ºC;

Molekülformel: C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub9;S&sub2;;

Molekulargewicht: 640, bestimmt durch die FAB-MS- Methode ("FAB-MS" bedeutet Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen);

Hochauflösungs-Massenspektrum:

C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub5;N&sub2;0&sub9;S&sub2; [(M+H)+ mittels der FAB-MS-Methode]:

Berechnet: 641,2567

Gefunden: 641,2585;

Elementaranalyse:

Berechnet: C, 56,23%; H, 6,92%; N, 4,37%; S, 10,01%;

Gefunden: C, 55,92%; H, 6,82%; N, 4,23%; S, 9, 90%;

Infrarot-Absorptionsspektrum: Das Infrarotspektrum zeigte folgende Absorptionsmaxima (KBR-Pressling, νmax cm&supmin;¹): 3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, J216, 1154, 1102, 1052;

Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

In Methanol oder Methanol + HCl zeigt Thiomarinol das nachstehend gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum [angegeben als λmax nm (&epsi;)] 387 (12.000), 300 (3.500), 214 (26.000) und in Methanol + NaOH das nachstehend gezeigte Ultraviolett- Absorptionsspektrum: [angegeben als λmax nm (&epsi;)] 386 (9.600), 306 (3.200), 206 (25.000);

Spezifische Drehung [α]D²&sup5; = +4,3º (C = 1,0, Methanol);

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie:

Trennsäule: Senshu-Pak ODS H-2151 (Säulengröße 6 x 150 mm, Produkt der Senshu Scientific Co. Ltd.)

Lösungsmittel: 40%-iges (vol./vol.) wäßriges Acetonitril

Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min.

Wellenlänge 220 bis 350 nm (Nachweis durch Photodiodenanordnung)

Retentionszeit: 5,9 Minuten;

Kernmagnetisches ¹H-Resonanzspektrum (δ ppm) das kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in hexadeuteriertem Dimethylsulphoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als inneren Standard ist nachstehend gezeigt:

0,91 (3H, Dublett, J=6,8 Hz);

0,95 (3H, Dublett, J=5,9 Hz);

1,30 (6H, breites Multiplett);

1,55 (5H, breites Multiplett);

2,03 (3H, Singulett);

2,09 (3H, Multiplett);

2,34 (2H, Triplett, J=7,3 Hz);

3,33 (1H, Dublett, J=10,7 Hz);

3,52 (2H, Multiplett);

3,64 (2H, Multiplett);

3,73 (1H, Dublett von Dubletts);

4,02 (2H, Triplett, J=6,6 Hz);

4,18 (1H, breites Dublett, J=7,3 Hz);

4,30 (1H, Dublett, J=4,4 Hz);

4,44 (1H, Dublett, J=7,8 Hz);

4,63 (1H, Dublett, J=3,4 Hz);

4,89 (1H, Dublett, J=7,3 Hz);

5,37 (2H, Multiplett);

5,97 (1H, breites Singulett);

7,04 (1H, Singulett);

9,80 (1H, breites Singulett);

10,68 (1H, breites Singulett);

Kernmagnetisches ¹³C-Resonanzspektrum (δ ppm): das kernmagnetische Resonanzspektrum (68 MHz) in tetradeuteriertem Methanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard ist nachstehend gezeigt:

174,3 (Singulett), 170,4 (Singulett), 168,6 (Singulett), 161,1 (Singulett), 137,9 (Singulett), 135,7 (Dublett), 135,1 (Singulett), 129,8 (Dublett), 116,3 (Dublett), 115,8 (Singulett), 113,7 (Dublett), 77,6 (Dublett), 74,4 (Dublett), 72,1 (Dublett), 71,8 (Dublett), 66,0 (Triplett), 65,7 (Dublett), 64,9 (Triplett), 45,3 (Dublett), 43,9 (Dublett), 36,6 (Triplett), 33,4 (Triplett), 30,1 (Triplett), 30,0 (Triplett), 29,7 (Triplett), 27,0 (Triplett), 26,7 (Triplett), 20,3 (Quartett), 16,6 (Quartett), 16,3 (Quartett),

Löslichkeit:

Löslich in Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol und löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Aceton und Diethylether; unlöslich in Hexan und Wasser;

Farbreaktionen:

Positiv mit Schwefelsäure, Iod und Kaliumpermanganat; und

Dünnschichtchromatographie:

Rt-Wert: 0,57

Adsorptionsmittel: Silicagel (Merck & Co. Inc., Art. 5715)

Entwicklungslösungsmittel: Methylenchlorid : Methanol = 85 : 15 Volumteile.

3. Biologisch reine Kultur eines Alteromonas rava-Stammes, die zur Produktion einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2 befähigt ist.

4. Biologisch reine Kultur von Alteromonas rava-Stamm SANK 73390, gekennzeichnet durch die Hinterlegungsnummer FERN BP-3381.

5. Stoffzusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 und ein für diese pharmazeutisch geeignetes Trägermaterial.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, die zur dermatologischen Verabreichung zubereitet ist.

7. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer bakteriellen Infektion.

8. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur therapeutischen Verwendung.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, das darin besteht, daß ein zur Produktion dieser Verbindung befähigter Mikroorganismus des Genus Alteromonas gezüchtet wird und die Verbindung aus der Kultur isoliert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Alteromonas rava ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Alteromonas rava Stamm SANK 73390, gekennzeichnet durch die Hinterlegungsnummer FERN BP-3381, ist.