DE69015393T2 - Immunosuppressives Mittel. - Google Patents
Immunosuppressives Mittel.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein neues Immunsuppressivum, L-687 819, hergestellt durch Fermentation des neuen mutanten Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus (MA 6646), ATCC Nr. 53855, der eine blockierte Mutante von Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus (MA 6475), ATCC Nr. 14891, ist. Das Verfahren umfaßt die Anzucht des neuen Mikroorganismus unter aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Kohlehydratmedium, das einen Stickstoff-Nährstoff enthält.
- 1983 genehmigte die US-FDA Cyclosporin, ein extrem wirksames Arzneimittel gegen Abstoßung, das das Gebiet der Organtransplantation revolutionierte. Das Arzneimittel wirkt dadurch, daß das körpereigene Immunsystem daran gehindert wird, sein immenses Arsenal an natürlichen Schutzmitteln zur Abstoßung des Transplantat-Fremdproteins zu mobilisieren.
- So wirksam das Arzneimittel bei der Bekämpfung der Transplantatabstoßung ist, so besitzt es doch die Nachteile, daß es Nierenversagen, Leberschaden und Ulcera verursacht, die in vielen Fällen sehr gravierend sein können.
- Die EP-A-0184162 von Fujisawa beschreibt ein neues Macrolid- Immunsuppresivum FK-506, das angeblich 100mal wirksamer ist als Cyclosporin. Das Macrolid sowie das strukturell verwandte FK-525 werden durch Fermentation eines bestimmten Stammes von Streptomyces tsukubaensis hergestellt. Ebenso beschrieben werden die eng verwandten Macrolid-Immunsuppressiva FK-520 und FK-523, produziert von S. hygroscopicus subsp. yakushimaensis.
- Die US-A-3 244 592 von T. Arai beschreibt die Kultur von Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus zur Herstellung des Fungizids "Ascomycin".
- Die US-Seriennummer 213 025 von S.T. Chen, E.S. Inamine, B.H. Arison, L.S. Wicker (Merck & Co. Inc. zugesprochen), entsprechend der EP-A-349061, beschreibt ein neues Immunsuppressivum "Demethimmunomycin", L-683 742, ein C-31-demethyliertes Analogon von L-683 590 (FK-520), hergestellt durch Kultur des Mikroorganismus Actinoplanacete sp. (MA 6559), ATCC Nr. 53771, in Gegenwart von L-683 590, um eine biologische Umwandlung von L-683 590 zu bewirken.
- Es existiert in der Literatur jedoch keine Beschreibung der Herstellung des Immunsuppressivums L-687 819, das das demethylierte C-31-Derivat von L-683 795 (FK-523) ist.
- Auf diesem Gebiet wird ständig nach neuen Makrolid-Immunsuppressiva der Strukturfamilie FK-506 gesucht.
- Figur 1 ist ein kermagnetisches (NMR) Protonen-(¹H)-Resonanzspektrum von L-687 819 bei 400 MHz in CDCl&sub3;.
- Figur 2 ist ein kernmagnetisches (NMR) 13-Kohlenstoff-(¹³C)- Spektrum von L-687 819 bei 100 MHz in CDCl&sub3;.
- Figur 3 gibt die zugeordnete chemische Struktur für L-687 819 auf der Grundlage des spektralen und massenspektrometrischen Beweises an.
- Es wurde gefunden, daß das Immunsuppressivum L-687 819 direkt durch Fermentation des mutanten Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus (MA 6646), ATCC Nr. 53855, der von der ATCC-Nr. 14891 (MA 6475) abstammt, durch eine Mutagen-Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin erhalten werden kann. Die Fermentation erfordert nicht die Anwesenheit des Makrolid-Immunsuppressivums L-683 795 (FK-523) und wird unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kohlehydratmedium durchgeführt, das einen Stickstoff-Nährstoff enthält, wobei die genannten Bedingungen bei einem pH-Wert unter 8,0, z.B. bei etwa 7, genügend lange angewendet werden, um L-687 819, die mono-demethylierte C-31-Version von L-683 795 (FK-523) herzustellen.
- Das resultierende L-687 819 zeigt eine immunsuppressive Aktivität, d.h. eine positive Hemmung der T-Zellen-Aktivierung, wie gezeigt durch den T-Zellen-Stimulationstest durch ein Calciumionophor (Ionomycin) plus Phorbolmyristatacetat (PMA), der im folgenden auch als "T-Zellen-Proliferationstest" bezeichnet wird. Das Prinzip dieses Tests besteht darin, die Proliferation von Maus-T-Lymphozyten zu messen, die mit einer Kombination von Ionomycin plus PMA stimuliert worden sind. Eine positive Probe in diesem Test hemmt die T-Zellen-Proliferation, was durch die verringerte Aufnahme von tritiiertem Thymidin angedeutet wird.
- Erfindungsgemäß wird eine neues Immunsuppressivum bereitgestellt, das als L-687 819 identifiziert wird und die Summenformel C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub2; (berechnet 1051,6088, gefunden 1051,6089 für C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub2; + T&sub4;, worin T = SiC&sub3;H&sub8;) besitzt, wie bestimmt durch Elektronenstoß-Massenspektrometrie, und ein kernmagnetisches Protonenresonanzspektrum, wie in Figur 1 angegeben, zeigt, hergestellt durch Anzucht eines Stammes von Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus (MA 6646), ATCC Nr. 53855, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Kohlehydratmedium, das einen Stickstoff-Nährstoff enthält, genügend lange, um das L-687 819-Produkt zu produzieren.
- Die Erfindung betrifft die Fermentation von Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC Nr. 53855 zur Herstellung von L-687 819. Der Mikroorganismus ist derzeit hinterlegt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive in Rockville, Maryland, unter der ATCC-Nr. 53855, eingereicht am 12. Januar 1989, und in der Merck-Kultursammlung in Rahway, New Jersey, als MA 6646. Die physikalischen Eigenschaften und die Taxonomie, einschließlich der morphologischen, kulturellen, biologischen und physiologischen Eigenschaften werden im folgenden kurz beschrieben.
- Mikroskopische Beobachtungen - verzweigte filamentöse Myzelien mit einem Durchmesser von 0,6 um. Sporophoren erscheinen als kurze kompakte Spiralen.
- vegetatives Wachstum: revers: grau-weiß
- Luftmasse: reichlich, matt, grau bis schwarz
- lösliches Pigment: keines
- vegetatives Wachstum: revers: nicht ganz weiß, durchscheinend obvers: nicht ganz weiß, durchscheinend, ausgefranster Rand
- LuftMyzel: spärlich, nicht ganz weiß, pulverig lösliches Pigment: keines
- vegetatives Wachstum: revers: cremefarben-gelb
- Luftmasse: reichlich, samtig, hellgrau bis schwarz
- LuftMyzel: weiß, samtig
- lösliches Pigment: keines
- vegetatives Wachstum: revers: grau-gelb
- Luftmasse: reichlich, leicht- bis mittelgrau, matt, baumwollartig
- lösliches Pigment: keines
- d-Glucose ++ d-Maltose + Saccharose -
- d-Arabinose +/- d-Mannit ++ d-Xylose ++
- l-Arabinose +/- d-Mannose ++ l-Xylose -
- d-Fructose ++ l-Mannose - alpha-d-Lactose ++
- l-Glucose - d-Raffinose - beta-d-Lactose ++
- Inosit +/- l-Rhamnose ++
- wobei ++ für ein beträchtliches Wachstum steht, + ein mäßiges Wachstum andeutet, +/- ein Wachstum in Spuren andeutet, und - kein Wachstum bedeutet.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jedem "L-687 819- produzierenden" Stamm der Mutante Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus durchgeführt werden. Besonders bevorzugt wird der Stamm mit der ATCC Nr. 53855.
- Im allgemeinen kann L-687 819 durch Züchten (Fermentieren) des oben beschriebenen "L-687 819-produzierenden Stammes" in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen (d.h. Schüttelkultur, submerse Kultur etc.) hergestellt werden. Das wäßrige Medium wird zu Beginn und Ende (Ernte) des Fermentationsprozesses vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7 gehalten. Ein höherer pH-Wert führt zu einem deutlichen und/oder gesamten Verlust des Produkts. Der gewünschte pH-Wert kann unter Verwendung eines Puffers, wie Morpholinoethansulfonsäure (MES), Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) und dergleichen, oder durch die Wahl der Nährstoffmaterialien, die von Natur aus Puffereigenschaften besitzen, wie die im folgenden beschriebenen Produktionsmedien, beibehalten werden.
- Die bevorzugten Quellen für Kohlenstoff in dem Nährmedium sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Xylose, Galactose, Glycerin, Stärke, Dextrin und dergleichen. Weitere Quellen, die eingeschlossen sein können, sind Maltose, Rhamnose, Raffinose, Arabinose, Mannose, Salicin, Natriumsuccinat und dergleichen.
- Die bevorzugten Quellen für Stickstoff sind Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojamehl und weitere pflanzliche Mehle (teilweise oder vollständig entfettet), Caseinhydrolysate, Sojabohnehydrolysate und Hefehydrolysate, Maisquellwasser, Trockenhefe, Weizenkeime, Federmehl, Erdnußpulver, lösliche Brennereibestandteile etc., sowie anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat etc.), Harnstoff, Aminosäuren und dergleichen.
- Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, obwohl zweckmäßigerweise als Kombination eingesetzt, brauchen nicht in ihrer reinen Form verwendet zu werden, da weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen mineralischer Nährstoffe enthalten, ebenfalls zur Verwendung geeignet sind. Auf Wunsch können zu dem Medium Mineralsalze hinzugegeben werden, wie Natrium- und Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Natrium- oder Kaliumiodid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Kobaltsalze und dergleichen. Wenn nötig, insbesondere wenn das Kulturmedium stark schäumt, kann ein Entschäumungsmittel, wie flüssiges Paraffin, Fettöl, Pflanzenöl, Mineralöl oder Silicon, hinzugegeben werden.
- Was die Bedingungen zur Produktion von L-687 819 in sehr großen Mengen betrifft, werden dafür submerse aerobe Kulturbedingungen bevorzugt. Zur Produktion in kleinen Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben, einer Flasche, oder einer Kulturschale eingesetzt. Wenn das Wachstum in großen Tanks durchgeführt wird, wird es ferner bevorzugt, die vegetative Form des Organismus zum Animpfen der Produktionstanks zu verwenden, um eine Wachstumsverzögerung bei dem Produktionsverfahren von L-687 819 zu vermeiden. Demgemäß ist es wünschenswert, zunächst ein vegetatives Inoculum des Organismus durch Animpfen einer relativ kleinen Menge von Kulturmedium mit Sporen oder Myzelien des Organismus herzustellen, der in "Schrägkultur" produziert worden ist, und das genannte angeimpfte Medium, das auch "Stammedium" genannt wird, zu züchten und das gezüchtete vegetative Inoculum anschließend aseptisch in große Tanks überzuführen. Das Fermentationsmedium, in dem das Inoculum produziert worden ist, ist im wesentlichen dasselbe oder unterscheidet sich von dem Medium, das zur Produktion von L-687 819 verwendet wird und wird im allgemeinen autoklaviert, um das Medium vor dem Animpfen zu sterilisieren. Der pH-Wert des Mediums wird im allgemeinen vor der Autoklavierungsstufe durch eine geeignete Zugabe einer Säure oder Base, vorzugsweise in Form einer Pufferlösung, auf etwa 7,0 eingestellt.
- Schütteln und Belüften des Kulturgemisches können auf eine Vielzahl von Wegen durchgeführt werden. Schütteln kann durch einen Propeller oder eine gleichartige mechanische Schüttelapparatur, durch Umrühren oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pumpapparaturen oder durch Hindurchleiten von steriler Luft durch das Medium bereitgestellt werden. Die Belüftung kann durch Hindurchleiten von steriler Luft durch das Fermentationsgemisch durchgeführt werden.
- Die Fermentation wird im allgemeinen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 ºC und 40 ºC, vorzugsweise zwischen 25- 35 ºC, für einen Zeitraum von etwa 48 Stunden bis 96 Stunden durchgeführt, der je nach Fermentationsbedingungen oder Ansatzgrößen variiert werden kann. Vorzugsweise werden die Produktionskulturen etwa 96 Stunden lang bei 27 ºC auf einem Rotationsschüttler, der bei 240 upm betrieben wird, inkubiert, wobei der pH-Wert des Fermentationsmediums bis zur Ernte bei 7,0 gehalten wird.
- Bevorzugte Kultur/Produktionsmedien zur Durchführung der Fermentation umfassen die folgenden Medien: Stammedium A Glucose Difco-Hefeextrakt Hycase SF KNO3 FeSO&sub4;.7H&sub2;O NaCl MgSO&sub4;.7H&sub2;O MnSO&sub4;.7H&sub2;O ZnSO&sub4;.7H&sub2;O CaCl&sub2;.2H&sub2;O Produktionsmedium B Glucose Glycerin Maisquellwasser Difco-Hefeextrakt Milchsäure L-Tyrosin MOPS CaCO&sub3; Einstellen des pH-Wertes auf 6,8
- Das produzierte L-687 819 kann aus dem Kulturmedium durch herkömmliche Mittel gewonnen werden, die im allgemeinen zur Gewinnung von anderen bekannten biologisch aktiven Substanzen angewendet werden. Die produzierte Substanz L-687 819 wird in dem kultivierten Myzel und im Filtrat gefunden und kann demgemäß aus Myzel und Filtrat isoliert und gereinigt werden, die durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe durch ein herkömmliches Verfahren erhalten werden, wie Konzentrieren unter reduziertem Druck, Lyophilisation, Extraktion mit einem herkömmlichen Lösungsmittel wie Methanol und dergleichen, pH-Einstellung, Behandlung mit einem herkömmlichen Harz (z.B. einem anionischen oder kationischen Austauscherharz, einem nichtionischen Adsorptionsharz etc.), Behandeln mit einem herkömmlichen Adsorbens (z.B. Aktivkohle, Kieselsäure, Kieselgel, Cellulose, Aluminiumoxid etc.), Kristallisation, Umkristallisation und dergleichen. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Lösungsmittelextraktion insbesondere unter Verwendung von Methanol.
- Das Produkt L-687 819 aus der Fermentation zeigt eine positive immunsuppressive Aktivität in dem "T-Zellen-proliferationstest" und besitzt diesbezüglich Verwendung und zeigt die folgenden physikalischen Eigenschaften:
- 1. farbloses, amorphes Pulver
- 2. Löslichkeit in Methanol
- 3. Summenformel C&sub1;&sub4;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub2;, berechneter Wert von 1051,6088, gefunden 1051,6089 für C&sub1;&sub4;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub2; + T&sub4;, worin T = SiC&sub3;H&sub8;, wie bestimmt durch Elektronenstoß-Massenspektrometrie, was mit der in Figur 3 zugeordneten Molekülstruktur im Einklang steht.
- L-687 819, das durch die in den oben erklärten Fermentationsverfahren erhalten worden ist, kann auf herkömmliche Weise isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Fällung, fraktionierte Kristallisation, Umkristallisation, Chromatographie und dergleichen.
- Geeignete Formulierungen des Materials können auch herkömmliche pharmazeutisch verträgliche biolabile Ester von L-687 819, gebildet über die Hydroxygruppen im Molekül, wie beispielsweise über das Acetat, umfassen.
- Es sei angemerkt, daß bei den vorgenannten Fermentationsreaktionen und der Nachbehandlung des Fermentationsgemisches darin, die tautomeren und Konformationsisomere(n) von L-687 819 ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.
- Das erfindungsgemäße L-687 819 besitzt eine pharmakologische Aktivität, wie eine immunsuppressive Aktivität, eine antimikrobielle Aktivität und dergleichen, und ist darum zur Behandlung und Prävention der Transplantat-Abstoßung von Organen oder Geweben, wie Herz, Niere, Leber, Medulla Ossium, Haut etc., Pfropf-auf-Wirt-Krankeiten durch Medulla-Ossium- Transplantation, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus Erythematodis, Hashimoto's Thyroiditis, Multiple Sklerose, Myasthenia Gravis, Diabetis vom Typ 1, Uveitis und dergleichen, geeignet.
- Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat kann in Form einer pharmazeutischen Präparation verwendet werden, beispielsweise in fester, halbfester oder flüssiger Form, die das erfindungsgemäße L-687 819 als aktiven Bestandteil in einem Gemisch mit einem organischen oder anorganischen Trägerstoff oder mit einem Hilfsstoff, der für externe, enterale oder parenterale Anwendungen geeignet ist, enthalten. Der aktive Bestandteil kann kompoundiert werden, beispielsweise mit den üblichen nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen für Tabletten, Pellets, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und für jede weitere Form, die zur Verwendung geeignet ist. Die Trägerstoffe, die verwendet werden können, sind Wasser, Glucose, Lactose, Akaziengummi, Gelatine, Mannit, Stärkepaste, Magnesiumtrisilicat, Talk, Maisstärke, Keratin, kolloidale Kieselsäure, Kartoffelstärke, Harnstoff und weitere Trägerstoffe, die zur Verwendung bei der Herstellung von Präparationen in fester, halbfester oder flüssiger Form geeignet sind, und ferner können auch Hilfsstoffe, Stabilisatoren, Verdickungsmittel und Farbstoffe und Parfüme verwendet werden. Die aktive erfindungsgemäße Verbindung ist in dem pharmazeutischen Präparat in einer Menge eingeschlossen, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung während des Prozesses Zustandes von Krankheiten hervorzurufen.
- Zur Anwendung dieses Präparats beim Menschen ist es vorteilhaft, es durch parenterale oder enterale Verabreichung zu verabreichen. Während die Dosis der therapeutisch wirksamen Menge von L-687 819 je nach Alter und Zustand eines jeden einzelnen zu behandelnden Patienten variiert und auch davon abhängt, wird im allgemeinen eine Tagesdosis (berechnet auf der Grundlage eines 70-kg-schweren Mannes) von etwa 0,01- 1 000 mg, vorzugsweise von 0,1-500 mg und mehr bevorzugt von 0,5-100 mg des aktiven Bestandteils zur Behandlung von Krankheiten gegeben, und im allgemeinen wird eine durchschnittliche Einzeldosis von etwa 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg und 500 mg verabreicht.
- Die folgenden Beispiele sind zum Zweck der Erläuterung der Erfindung angegeben und sollten nicht als Einschränkungen von Umfang und Geist der Erfindung betrachtet werden.
- Die Fermentation von MA6646 wurde durch Animpfen eines Erlenmeyer-Bafflekolbens, der 44 ml eines autoklavierten Stammediums, bestehend aus 0,2 % KNO&sub3;, 2 % Hycase SF, 2 % Difco-Hefeagar, 2 % Glucose, 0,0025 % FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,05 % NaCl, 0,05 % MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,0005 % MnSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,001 % ZnSO&sub4; 7H&sub2;O und 0,002 % CaCl&sub2; 2H&sub2;O, enthält. Das Stammedium wurde mit MA6646-(ATCC Nr. 53855)-Sporen aus dem Bennett-Medium angeimpft und 42-48 Stunden lang bei 27 ºC auf einem Rotationsschüttler, der bei 220 upm betrieben wurde, inkubiert. Ein Aliquot von 1,0 ml der resultierenden Stammkultur wurde zum Animpfen eines 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens ohne Baffle verwendet, der ein Produktionsmedium enthielt, bestehend aus 2,5 % Glycerin, 2,2 % Glucose, 1 % Maisquellwasser, 1,5 % Difco-Hefeextrakt, 0,2 % (Vol./Vol.) Milchsäure, 0,4 % L-Tyrosin, 1 % MOPS und 0,025 % CaCO&sub3;, worin der pH-Wert mit NaOH vor dem Autoklavieren auf 6,8 eingestellt wurde. Die Produktionskultur wurde 96 Stunden lang bei 27 ºC auf einem Rotationsschüttler, der bei 220 upm arbeitete, inkubiert. Eine Methanolextraktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens Methanol zu der flüssigen Kultur und Schütteln bei hoher Geschwindigkeit auf einem Eberbach-Umkehrschüttler für 30 Minuten und durch anschließendes Zentrifugieren erreicht. Die wäßrigen methanolischen Extrakte wurden durch TLC und HPLC analysiert.
- Bei der Reverse-phase-HPLC (Whatman Partisil 5 ODS-3, 0,1 % wäßriges H&sub3;PO&sub4;:CH&sub3;CN, 40:60, 1 ml/min) besaß die Hauptkomponente sämtlicher Isolate eine Retentionszeit von 7,79 min und besaß gemäß HPLC dieselbe Retentionszeit und gemäß TLC denselben Rf-Wert wie 31-Desmethyl-L-683-590 (L-687 819).
- Eine Nebenkomponente wurde bei einer Retentionszeit von 6,98 min beobachtet. Die Nebenkomponente wurde über eine halbpräparative Reverse-phase-Octadecyl-(C&sub1;&sub8;)-HPLC-Säule (RAININ -Dynamax-C-18-Säule) isoliert. Sechs Schüttelkolbenkulturen der Mutante wurden mit einem gleichen Volumen Methanol extrahiert, zentrifugiert, und der Überstand wurde zur Entfernung des Methanols eingedampft. Die resultierende wäßrige Phase wurde 2mal mit Ethylacetat extrahiert und unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol resuspendiert, und ein 50-ul-Aliquot wurde auf eine halbpräparative Säule aufgegeben. Das Lösungsmittelsystem war wäßriges 0,1%iges H&sub3;PO&sub4;:CH&sub3;CN (50:50) bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min. Der breite Peak, der bei 12,5 min eluierte, wurde in 1-ml-Fraktionen gesammelt, die mit MOPS-Puffer auf pH 6,0 eingestellt wurden. Eine Probe wurde für den T-Zellen-Proliferationstest (IL-2) herangezogen, und es zeigte sich, daß sie eine immunsuppressive Aktivität besaß.
- Eine Vergrößerung des Fermentationsverfahrens in Beispiel 1 wurde durchgeführt, um eine größere Materialmenge herzustellen. Die Feststoffe in der Kultur wurden aus 45 l Fermentationsbrühe durch Zentrifugieren entfernt. Der resultierende Kuchen wurde sodann 2mal mit Methanol (jeweils 1 l) extrahiert. Der Kulturüberstand wurde mit einem halben Volumen Ethylacetat (20 l) extrahiert, und der resultierende Ethylacetat-Extrakt mit dem Methanol-Extrakt der Kultur-Feststoffe vereinigt und durch Flash-Verdampfung unter reduzierten Druck von dem organischen Lösungsmittel befreit, so daß sich eine wäßrige Dispersion ergab. Diese wäßrige Dispersion wurde bis zu einem Endvolumen von 1,5 l mit destilliertem Wasser verdünnt und mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde sodann mit destilliertem Wasser gewaschen, um die restlichen wasserlöslichen Verunreinigungen zu entfernen. Der gewaschene Ethylacetat-Extrakt wurde durch Flash-Verdampfung unter reduziertem Druck von Lösungsmittel befreit, so daß sich 55,3 g eines rohen aktiven Extraktes ergaben.
- Der rohe aktive Extrakt wurde auf einer 5-l-Säule aus Kieselgel (Aldrich Chemical, Nr. 24398-1, Qualität 62, 60-200 Mesh) in Hexan:Aceton, 3:1, chromatographiert. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit zwei Bettvolumina desselben Lösungsmittels gewaschen und mit Hexan:Aceton (11:9) eluiert, wobei 2-l-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 10-14, die die gesuchte Verbindung enthielten, wurden vereinigt und unter reduziertem Druck eingedampft, so daß sich 4,05 g einer angereicherten Fraktion ergaben. Dieses Material wurde nochmals über eine 1-l-Säule von Kieselgel-60 (E. Merck, Nr. 9385, 230-400 Mesh) in Hexan:Aceton (11:9) chromatographiert. Nach dem Aufragen der Probe wurde die Säule mit Lösungsmittel derselben Zusammensetzung bei 25 ml/min eluiert. Fraktionen von 250 ml wurden gesammelt, wobei die Hauptcharge in den Fraktionen 22-40 eluierte. Diese Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, so daß sich 2,91 g eines öligen Rückstandes ergaben.
- Eine weitere Reinigung wurde mittels präparativer Reversephase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) erzielt. Ungefähr 100 mg der Hauptcharge wurden in 1 ml Methanol aufgelöst und in zwei Teilen auf einer Rainin-Dynamax-C18-Säule, 21,4 x 250 mm, die bei 60 ºC betrieben wurde, chromatographiert und mit Acetonitril:Wasser (3:2) bei 10 ml/min eluiert, wobei die Detektion mit der UV-Absorption bei 205 nm erfolgte. 15-ml-Fraktionen wurden während der chromatographischen Trennungen gesammelt. Die Fraktionen 9-11 aus jeder Trennung enthielten die gesuchte Verbindung und wurden darum vereinigt und unter reduziertem Druck bis zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde nochmals auf derselben Säule bei 60 ºC chromatographiert und mit Acetonitril:Wasser (1:1) bei 10 ml/min eluiert. Die gesuchte Verbindung eluierte unter diesen Bedingungen bei 42-48 min. Das Eindampfen der zentralen Charge dieses Peaks lieferte 2,7 mg der gesuchten Verbindung in einem Zustand von hoher Reinheit als weißen amorphen Feststoff.
- Das Protonen-NMR-Spektrum dieses Produkts in CDCl&sub3; ist in Figur 1 gezeigt, wobei die chemischen Verschiebungen in ppm (delta) relativ zu Tetramethylsilan (TMS = 0 ppm) angegeben sind. Die Lösungsmittel-Restprotonen wurden als interner Standard (7,24 ppm) herangezogen. Das 13C-NMR-Spektrum des Produkts in CDCl&sub3; ist in Figur 2 gezeigt, wobei die chemischen Verschiebungen in ppm (delta) relativ zu Tetramethylsilan (TMS = 0 PPM) angegeben sind. Die Kohlenstoff-Resonanz des Lösungsmittels wurde als interner Standard (77,0 PPM) herangezogen. Hochauflösende Elektronenstoß-Massenspektroskopie des Tetra-(trimethylsilyl)-Derivats der Titelverbindung lieferte ein Molekülion von 1051,6089 (C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub2; + T&sub4;, worin T = SiC&sub3;H&sub8;, berechnet 1051,6088) und eine mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang stehende Fragmentierung. Die gereinigte Probe wurde dem T-Zellen-Proliferationstest (IL-2) unterzogen. Die Ergebnisse sind in Beispiel 3 aufgeführt.
- Gereinigtes L-687 819, hergestellt durch HPLC wie vorstehend, wurde in absolutem Ethanol zu 1 mg/ml aufgelöst.
- Die Milz von C57B1/6-Mäusen wurde unter sterilen Bedingungen entnommen und vorsichtig in eiskaltem RPMI-1640-Kulturmedium (GIBCO, Grand Island, N.Y.), angereichert mit 10 % wärmeinaktiviertem fetalem Kälberserum (GIBCO), dissoziiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 15 000 upm 8 Minuten lang pelletisiert. Die verunreinigenden roten Blutkörperchen wurden durch Behandlung des Pellets mit Ammoniumchlorid- Lysepuffer (GIBCO) 2 Minuten lang bei 4 ºC entfernt. Das kalte Medium wurde hinzugegeben, und die Zellen wurden erneut bei 15 000 upm 8 Minuten lang zentrifugiert. T-Lymphozyten wurden sodann durch Abtrennen der Zellsuspension über Nylonwolle-Säulen wie folgt isoliert. Nylonwolle-Säulen wurden hergestellt, indem ungefähr 4 g gewaschene und getrocknete Nylonwolle in 20-ml-Kunststoffspritzen gepackt wurden. Die Säulen wurden durch Autoklavieren bei 250 ºF 30 Minuten lang sterilisiert. Die Nylonwolle-Säulen wurden mit warmem (37 ºC) Kulturmedium benetzt und mit demselben Medium gespült. Gewaschene, in warmem Medium resuspendierte Milzzellen wurden langsam auf die Nylonwolle aufgegeben. Die Säulen wurden sodann in aufrechter Position 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Nichthaftende T-Lymphozyten wurden mit warmem Kulturmedium von den Säulen eluiert, und die Zellsuspensionen wurden wie oben zentrifugiert.
- Die gereinigten T-Lymphozyten wurden zu 2,5 x 10&sup5;-Zellen/ml in komplettem Kulturmedium, bestehend aus RPMI-1640-Medium mit 10 % wärmeinaktiviertem fetalem Kälberserum, 100 mM Glutamin, 100 mM Natriumpyruvat, 2 x 10&supmin;&sup5;M2-Mercaptoethanol und 50 um/ml Gentamycin resuspendiert. Ionomycin wurde zu 250 ng/ml und PMA zu 10 ng/ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde sofort in flachbödige Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) zu 200 ul/Vertiefung verteilt. Die Kontrolle, die das Medium ohne Testarzneimittel darstellte, und verschiedene nachstehend angegebene Verdünnungen der zu testeten Probe (aus oben beschriebenen L-687 819), wurden sodann zu 20 ul/Vertiefung in dreifacher Ausführung in die Vertiefungen gegeben. L-679 934 (FK-506) wurde als Standard verwendet. Die Kulturplatten wurden anschließend bei 37 ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 % CO&sub2;-95 % Luft 44 Stunden lang inkubiert. Die Proliferation der T-Lymphozyten wurde durch Messen des Einbaus von tritiiertem Thymidin bewertet. Nach 44 Stunden Kultivieren wurden die Zellen mit 2 uCi/Vertiefung tritiiertem Thymidin (NEN, Cambridge, MA) pulsmarkiert. Nach weiteren 4 Stunden Inkubieren wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern geerntet, wobei eine Erntevorrichtung für mehrere Proben verwendet wurde. Die Radioaktivität der Filterscheiben, die den einzelnen Vertiefungen entsprach, wurde durch Standardflüssigkeitsscintillationszählmethoden (Betacounter) gemessen. Die mittleren Zählraten pro Minute in den Vertiefungen von doppelter Ausführung wurden berechnet und die Ergebnisse in Prozent als Hemmung der Aufnahme von tritiiertem Thymidin (Proliferation) wie folgt ausgedrückt:
- % Hemmung = 100 - [cpm-Mittel von getesteter Probe/cpm-Mittel von Kontrollmedium x 100]
- Die Ergebnisse in Prozent der Hemmung bei verschiedenen L-687 819-Konzentrationen sind in der folgenden Tabelle angegeben: TABELLE Hemmung der T-Zellen-Proliferation durch L-687 819 L-687 819 (ng/ml) % Hemmung
- Anmerkungen: 1. Maus-T-Zellen-Kulturen wurden mit ³H-Thymidin 4 Stunden lang 48 Stunden vor dem Ernten gepulst.
- 2. Standard-L-679 934 (10 ng/ml) ergab eine Hemmung von 99 %.
- 3. IC&sub5;&sub0; = 7,0 ng/ml = 9,17 nM für L-687 819.
- 4. Die Hemmung der Proliferation wurde durch Zugabe von 50 Einheiten/ml von rekombinantem Human-IL-2 umgekehrt.
Claims (4)
1. Immunsuppressivum, bezeichnet als L-687 819, das
folgendes aufweist: positive Hemmung der T-Zellen-
Aktivierung durch den T-Zellen-Proliferationstest, ein
Protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum, wie in
Figur 1 abgebildet, ein ¹³C-kernmagnetisches
Resonanzspektrum, wie in Figur 2 abgebildet, und eine
Summenformel von C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub2;, bestimmt durch Elektronenstoß-
Massenspektrometrie.
2. Immunsuppressivum L-687 819 das eine Molekülstruktur wie
in Figur 3 beschrieben besitzt.
3. Pharmazeutisches Präparat, das eine therapeutisch
wirksame Menge von L-687 819 in Kombination mit einem
pharmazeutisch verträglichen, im wesentlichen
nichttoxischen Träger oder Hilfsstoff enthält.
4. Verwendung von L-687 819 zur Herstellung eines Präparats,
das zur Behandlung eines menschlichen Wirtes geeignet
ist, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern oder zur
Behandlung einer Autoimmunkrankheit oder einer
Infektionskrankeit geeignet ist.
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