DE69013809T2

DE69013809T2 - Antibiotikum.

Info

Publication number: DE69013809T2
Application number: DE69013809T
Authority: DE
Inventors: Teruo Hattori; Koichi Matsumoto; Jun Ichi Shoji; Tadashi Yoshida
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1989-07-24
Filing date: 1990-07-20
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2010-07-21
Also published as: US5171836A; EP0413967B1; AU631666B2; DK0413967T3; EP0413967A1; DE69013809D1; CA2019463A1; ATE113608T1; JPH03188098A; KR960007618B1; ES2066054T3; JP2863934B2; KR910003113A; CA2019463C; AU5972690A

Description

NEUES ANTIBIOTIKUM

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Plusbacin, das eine Verbindung mit antibakterieller Aktivität darstellt und durch Züchtung eines Mikroorganismus' hergestellt wird, der zur Gattung Pseudomonas gehört und Plusbacin produziert.
Die neue erfindungsgemäße Verbindung ist eine Verbindung der Formel:
in der X L-HyPro oder L-Pro bedeutet, R -CH&sub3; oder -CH(CH&sub3;)&sub2; darstellt und n eine ganze Zahl von 9 bis 12 ist, oder ein Salz davon.
Die Verbindung der vorstehenden Formel ist als "Plusbacin" bezeichnet worden.
Als Folge der in jüngster Zeit häufigen Antibiotikaverwendung ist die Entstehung von Bakterien mit mehrfacher Arzneimittelre sistenz, besonders von Methicillin-resistenten Bakterien, zu einem ernsthaften klinischen Problem geworden. Methicillin-resistente Bakterien sind nicht nur gegen Methicillin resistent, sondern auch gegen viele andere Antibiotika, umfassend Aminoglycoside, Tetracycline, Cepheme, Penicilline, Carbapeneme und Macrolide. Daher bestand großer Bedarf an einer Verbindung mit hervorragender antibakterieller Aktivität gegen Methicillin-resistente Bakterien.
Daptomycin (ungeprüfte JP-Patentveröffentlichung 92353/1980) ist ein Beispiel für ein Antibiotikum, das wie die erfindungsgemäße Verbindung eine Lipopeptidstruktur besitzt. Daptomycin unterscheidet sich jedoch strukturell von der erfindunggemäßen Verbindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Plusbacin, das hochwirksam gegen Methicillin-resistente Bakterien ist und durch Züchtung eines Mikroorganismus hergestellt wird, der zur Gattung Pseudomonas gehört und Plusbacin produziert.
Die neue erfindungsgemäße Verbindung ist eine Verbindung der Formel:
in der X L-HyPro oder L-Pro bedeutet, R -CH&sub3; oder -CH(CH&sub3;)&sub2; darstellt und n eine ganze Zahl von 9 bis 12 ist, oder ein Salz davon.
Gegenwärtig stellen Infektionen mit Methicillin-resistenten Bakterien ein ernsthaftes Problem auf klinischem Gebiet dar und es ist deshalb nach einer Verbindung mit hervorragender antibakterieller Aktivität gegen diese Bakterien gesucht worden. Da die erfindungsgemäße Verbindung starke antibakterielle Wirksamkeit gegen Methicillin-resistente Bakterien besitzt, besonders gegen Staphylococcus aureus, kann sie einen großen Beitrag in der Medizin leisten.
Fig. 1 zeigt IR-Spektren von Plusbacin A&sub2;- und B&sub2;-Hydrochloriden.
Die Erfinder stellten fest, daß ein zur Gattung Pseudomonas gehörender Stamm eine Verbindung produziert, welche die Formel:
hat, in der X L-HyPro oder L-Pro bedeutet, R -CH&sub3; oder -CH(CH&sub3;)&sub2; darstellt und n eine ganze Zahl von 9 bis 12 ist, und die starke antibakterielle Wirksamkeit gegen Methicillin-resistente Bakterien besitzt.
Staphylococcus aureus, der gegen Methicillin resistent ist, besitzt Kreuzresistenz gegen viele Antibiotika. Daher ist es sehr wichtig, ein Antibiotikum bereitzustellen, das gegen den Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus stets wirksam ist. Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt eine starke antibakterielle Wirksamkeit gegen den Methicillinresistenten S. aureus und ist deshalb in hohem Grade nützlich.
Bei den vorstehend erwähnten Verbindungen ist die Verbindung als Plusbacin A&sub1; bezeichnet, wenn X L-HyPro darstellt, n 10 ist und R -CH&sub3; bedeutet; wenn X L-HyPro darstellt, n 9 ist und R -CH(CH&sub3;)&sub2; bedeutet, als Plusbacin A&sub2;; wenn X L-HyPro darstellt, n 10 ist und R -CH(CH&sub3;)&sub2; bedeutet, als Plusbacin A&sub3;; wenn X L-HyPro darstellt, n 12 ist und R -CH&sub3; bedeutet, als Plusbacin A&sub4;; wenn X L-Pro ist, n 10 ist und R -CH&sub3; bedeutet, als Plusbacin B&sub1;; wenn X L-Pro bedeutet, n 9 ist und R -CH(CH&sub3;)&sub2; darstellt, als Plusbacin B&sub2;; wenn X L-Pro bedeutet, n 10 ist und R -CH(CH&sub3;)&sub2; darstellt, als Plusbacin B&sub3;; und wenn X L-Pro darstellt, n 12 ist und R -CH&sub3; bedeutet, ist die Verbindung als Plusbacin B&sub4; bezeichnet. Die vorliegende Erfindung stellt nicht nur diese Verbindungen bereit, sondern auch deren Salze.
Salze können mit Substanzen, wie Alkalimetallen, z.B. Lithium, Kalium und Natrium; mit Erdalkalimetallen, z.B. Magnesium und Calcium; mit anorganischen Säuren, z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und Bromwasserstoffsäure; und mit organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Apfelsäure, Adipinsäure und Bernsteinsäure, gebildet werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet Plusbacin jede der vorstehend erwähnten 8 Verbindungen, aber auch alle Verbindungen, die durch Anspruch 1 erfaßt sind.
Die hier verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
L-HyPro: L-Trans-3-hydroxyprolin
D-HyAsp: D-Threo-ß-hydroxyasparaginsäure
L-HyAsp: L-Threo-ß-hydroxyasparaginsäure
aThr: Allo-threonin.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen sind nachstehend erwähnt:
Physikalisch-chemische Eigenschaften:
Eigenschaften: Plusbacin A&sub1;-A&sub4; und B&sub1;-B&sub4; sind sich in ihren Eigenschaften äußerst ähnlich. Sie sind amphoter und ihre Hydrochloride werden als farbloses Pulver gewonnen.
Löslichkeit: Jedes der Hydrochloride ist in Methanol und Dimethylsulfoxid leicht löslich, in Ethanol etwas löslich und in Aceton, Ethylacetat sowie Chloroform unlöslich. Die Hydrochloride sind in gereinigtem Wasser nur sehr wenig löslich, in alkalischem Wasser jedoch löslich.
HPLC: Keiner der Plusbacinbestandteile kann durch DC (Dünnschichtchromatographie), aber jeder Bestandteil kann durch HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) abgetrennt werden. Die HPLC- Bedingungen sind nachstehend gezeigt. Die eluierten Volumen sind in Tabelle 1 gezeigt.
HPLC-Bedingungen:

Chromatogramm 1

Säule: Ultron 7CN 4,6 x 250 mm
Mobile Phase: 50 mM Phosphatpufferlösung, pH 2,2, enthaltend Acetonitril - 50 mM Natriumsulfat (25:75)
Durchlaufgeschwindigkeit: 1,575 ml/min
Nachweis: UV-Licht 220 nm

Chromatogramm 2

Säule: Nucleosil 5C&sub1;&sub8; 4,6 x 150 mm
Mobile Phase: 50 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,5, enthaltend Acetonitril - 50 mM Natriumsulfat (34:66)
Durchlaufgeschwindigkeit: 1,575 ml/min
Nachweis: UV-Licht 220 nm Tabelle 1 HPLC-Analyse von Plusbacin A&sub1; - A&sub4; und B&sub1; - B&sub4; Eluiertes Volumen (ml) Chromatogramm
Farbumsetzung
Ninhydrinumsetzung: Negativ
Sakaguchi-Umsetzung: Positiv
Elementaranalyse
Die Summenformel von Plusbacin A&sub2; wurde als C&sub4;&sub9;H&sub8;&sub1;N&sub1;&sub1;O&sub2;&sub0; auf der Grundlage der Ergebnisse der Elementaranalyse seines Natriumsalzes und der Analyse seines Hydrochlorids mit einem hochauflösenden Massenspektrometer bestimmt.
Analytisch berechnet (%) für C&sub4;&sub9;H&sub8;&sub0;O&sub2;&sub0;Na x H&sub2;O: C49,70, H6,98, N13,01, Na 1,94
Gefunden (%): C 49,54, H 7,09, N 12,76, Na 1,91
Massenspektrometrie: m/z 1144,5735 (MH+)
Alle Verbindungen außer Plusbacin A&sub2; wurden auf der Grundlage der Untersuchungsergebnisse mit einem hochauflösenden Massenspektrometer wie folgt bestimmt:
Plusbacin A&sub1;
Summenformel: C&sub4;&sub8;H&sub7;&sub9;N&sub1;&sub1;O&sub2;&sub0;
Massenspektrometrie: m/z 1130,5569 (MH&spplus;)
Plusbacin B&sub1;
Summenformel: C&sub4;&sub8;H&sub7;&sub9;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub9;
Massenspektrometrie: m/z 1114,5614 (MH&spplus;)
Plusbacin B&sub2;
Summenformel: C&sub4;&sub9;H&sub8;&sub1;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub9;
Massenspektrometrie: m/z 1128,5796 (MH&spplus;)
Plusbacin A&sub3;
Summenformel: C&sub5;&sub0;H&sub8;&sub3;N&sub1;&sub1;O&sub2;&sub0;
Massenspektrometrie: m/z 1158,5883 (MH&spplus;)
Plusbacin B&sub3;
Summenformel: C&sub5;&sub0;H&sub8;&sub3;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub9;
Massenspektrometrie: m/z 1142,5943 (MH&spplus;)
Plusbacin A&sub4;
Summenformel: C&sub5;&sub0;H&sub8;&sub3;N&sub1;&sub1;O&sub2;&sub0;
Massenspektrometrie: m/z 1158,5893 (MH&spplus;)
Plusbacin B&sub4;
Summenformel: C&sub5;&sub0;H&sub8;&sub3;N&sub1;&sub1;O&sub1;&sub9;
Massenspektrometrie: m/z 1142,5934 (MH&spplus;)
Außer mit Plusbacin A&sub2; wurde mit kefner der Verbindungen eine Elementaranalyse durchgeführt. Da die Summenformeln mit einem hochauflösenden Massenspektrometer bestimmt wurden, war die Durchführung einer Elementaranalyse nicht notwendig.
Aminosäuren und Fettsäuren, die Bestandteile der Verbindungen sind:
Jede Verbindung wurde 20 Stunden lang bei 110ºC mit konstant kochender Salzsäure hydrolysiert und dann einer Untersuchung mit einem automatischen Aminosäureanalysator unterworfen. Es wurden die in Tabelle 2 gezeigten Aminosäuren nachgewiesen. Fettsäuren wurden mit Ether aus dem Hydrolysat extrahlert, das nach 4stündiger Hydrolyse bei 110ºC mit konstant kochender Salzsäure erhalten wurde. Die gewonnenen Stoffe wurden mit Trimethylsilyldiazomethan in Methylester umgesetzt und dann einer Untersuchung mit Hilfe von Gaschromatographie unterworfen, danach folgte ein Vergleich mit Vergleichssubstanzen und Massenspektrometrie. Es wurden die in Tabelle 2 gezeigten Fettsäuren gefunden. Tabelle 2 Aminosäuren und Fettsäuren. die Bestandteile von Plusbacin A&sub1; - A&sub4; und B&sub1; - B&sub4; sind Fettsäuren ( ): Molverhältnis HyAsp: ß-Hydroxyasparaginsäure L-Trans-3-hydroxyprolin 3-Hydroxy-tetradekansäure 3-Hydroxy-isopentadekansäure 3-Hydroxy-hexadekansäure 3-Hydroxy-isohexadekansäure
UV-Spektrum: Terminale Absorption
IR-Spektrum: Im IR-Spektrum zeigten alle Verbindungen eine ähnliche Absorption. Beispiele repräsentativer Absorptionen sind die in Fig. 1 gezeigten IR-Spektren von Plusbacin A&sub2;-Hydrochlorid und Plusbacin B&sub2;-Hydrochlorid.
Aus den physikalisch-chemischen Eigenschaften und den verschiedenen, vorstehend erwähnten chemischen Analysen wird die Schlußfolgerung gezogen, daß die erfindungsgemäße Verbindung Plusbacin folgende Formel besitzt:
in der X L-HyPro oder L-Pro darstellt, R -CH&sub3; oder -CH(CH&sub3;)&sub2; bedeutet und n eine ganze Zahl von 9 bis 12 ist.
Wie vorstehend gezeigt, ist Plusbacin ein Acylpeptid mit einer neuen Struktur.
Der Stamm, der das erfindungsgemäße Plusbacin produziert, besitzt folgende bakteriologische Eigenschaften:

(1) Morphologische Eigenschaften

Mikroorganismuszellen, die auf Herzinfusionsagar (Difco) 24 Stunden bei 28ºC gezüchtetet worden waren, wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop untersucht und zeigten folgende typische Merkmale: die Zellen sind relativ schmale Stäbchen, ihre Größe beträgt 2 - 3 (um) x 0,5 - 0,7 (um). Mit ihren abgerundeten Enden haben sie die Form von Wiener Würstchen. Die meisten von ihnen besitzen keine Flagellen, doch einige haben ein oder mehrere Flagellen, die schlank, zart und polar angeordnet sind. Deshalb zeigen diejenigen, die in Flüssigmedium gezüchtet wurden, geringe Beweglichkeit, wie später erläutert wird.

(2) Gramfärbung

Der Mikroorganismus ist gramnegativ. Die Gramfärbung wurde an jungen Zellen durchgeführt, die auf einem Schrägnähragarmedium 24 Stunden bei 28ºC gezüchtet worden waren. Es wurde keine Fähigkeit zur Sporenbildung festgestellt.

(3) Kulturmerkmale

1) Kultur in Nährbrühe: Das Wachstum war dürftig. Es wurde eine einheitliche Trübung festgestellt. Eine Häutchenbildung, Gasbildung und Bildung von löslichem Pigment wurde nicht festgestellt. Die Zellen zeigten eine sehr schwache Beweglichkeit.
2) Nähragarstichkultur: Ein sehr geringes fadenförmiges Wachstum wurde entlang der Einstichlinie festgestellt. Eine Gasbildung und Bildung von löslichem Pigment wurde nicht festgestellt. Der Mikroorganismus war aerob. Die Oberfläche besaß eine bräunliche, grau-milchige Farbe von mattem Glanz.
3) Schrägnähragarkultur: Das Wachstum war üppig und zeigte einen fadenförmigen Verlauf. Die Kolonien des Mikroorganismus besaßen einen glatten Rand, der jedoch manchmal wellenförmig war. Die Form der Erhöhung war konvex. Es wurde keine Gasbildung festgestellt, jedoch die Bildung eines löslichen, braunen Pigments, das an den Agar abgegeben war. Die Bakterienkolonien waren feucht und trübe, und von glänzender bräunlicher Cremefarbe.
4) Nähragarplattenkultur: Die Kolonien waren rund und trübe, und hatten einen glatten Rand. Die Erhöhung war konvex. Es wurde keine Gasbildung, aber die Bildung eines braunen Pigments festgestellt, das an den Agar abgegeben war. Die Kolonien waren feucht und von glänzender bräunlicher Cremefarbe.
5) Lackmusmilch: Es wurde Säureproduktion festgestellt. Die Peptonisierung der Milch war stark. Auf der Oberfläche hatte sich ein gräuliches, rot-violettes und etwas dickes Häutchen und an den Oberflächenwänden ein grauer Ring gebildet. Die obere Schicht war rot-violett und lichtdurchlässig. Die untere war rot-orange und lichtdurchlässig. Es wurden kleine Mengen eines orangegelben Präzipitats, aber keine Gasbildung festgestellt.
6) MacConkey-Agarplatte: Das Wachstum war gut. In das Medium war ein dunkelbraunes, lösliches Pigment abgegeben.
7) Wachstum auf einer Trypton-Soyton-Agarplatte, enthaltend 0,2 % (Gew./Vol.) Cetrimid: Es wurde kein Wachstum festgestellt. Das Wachstum war durch Cetrimid (Cetyltrimethylammoniumbromid) gehemmt.
8) Wachstum auf einer Trypton-Soyton-Agarplatte, enthaltend 6,5 % (Gew./Vol.) Natriumchlorid: Es wurde kein Wachstum festgestellt. Das Wachstum war durch 6,5 % (Gew./Vol.) Natriumchlorid gehemmt.
9) Wachstum auf einer Trypton-Soyton-Agarplatte, enthaltend 1 % (Gew./Vol.) TTC: Es wurde kein Wachstum festgestellt. Das Wachstum war durch TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid) gehemmt.
(4) Physiologische und biochemische Eigenschaften
1. Anreicherung von PHB in Zellen: Es wurde keine Anreicherung von PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat) festgestellt.
2. Catalase-Test: Schwach positiv
3. Oxidase-Test: Stark positiv
4. O-F-Test: oxydativ (C-Typ). Glucose wurde oxydativ assimiliert.
5. Desoxyribonuclease-Test: Negativ
6. Urease-Test: Negativ
7. Ornithindecarboxylase-Test: Negativ
8. Lysindecarboxylase-Test: Negativ
9. Arginindihydrolase-Test: Negativ
10. Acylamidase-Test: Negativ
11. Gelatinehydrolyse: Positiv. Der Test wurde mit Hilfe einer Nährgelatine-Einstichkultur bei Raumtemperatur (22ºC - 25ºC) durchgeführt.
12. Stärkehydrolyse: Negativ
13. Lipase-Test (Hydrolyse von Tween 80): Positiv
14. Citronensäureverwertung: Positiv (getestet mit Hilfe von Simon- Medium)
15. Reduktion von Nitrat zu Nitrit: Negativ
16. Denitrifikationsumsetzung: Negativ
17. H&sub2;S-Bildung: Negativ
18. Indolbildung: Negativ
19. Bildung von Leuchtpigment: Negativ
20. VP-Test: Negativ
21. MR-Test: Negativ
22. Esculinhydrolyse: Positiv
23. ONPG-Test: Negativ (ß-Galactosidase wurde nicht gebildet)
24. Phenylalanindesaminierungstest: Negativ
25. Auf D-Glucose, D-Fructose, Maltose und Trehalose wurde Säure ohne Gasbildung festgestellt. Auf L-Arabinose, Lactose, D-Mannit, Sucrose oder D- Xylose bildete sich weder Säure noch Gas.
26. G + C Mol-Anteil der DNA: 69,4
Angesichts der vorstehend erwähnten Merkmale kann der Plusbacinproduzierende Mikroorganismus als ein Stamm folgender Beschreibung betrachtet werden. Der Plusbacin-produzierende Mikroorganismus ist ein gramnegatives aerobes Bakterium. Er wurde aus einer in Okinawa Prefecture gesammelten Bodenprobe isoliert. Der Mikroorganismus ist Catalase-positiv und besitzt keine Sporulierungsfähigkeit. Da er Oxidase-positiv ist, kann er Pseudomonadaceae oder Flavobacterium zugeordnet werden. Nach Bergey, Manual of Systematic Bacteriology, 1 (1984) beträgt jedoch der G + C Mol-Anteil der DNA in Flavobacterium 31% -42% (Tm-Verfahren). Da das des vorstehend erwähnten Mikroorganismus bei 69,4% (HPLC-Verfahren), einem außerordentlich hohen Wert, liegt, kann der Mikroorganismus Flavobacterium nicht zugeordnet werden. Außerdem zeigte der Mikroorganismus geringe Beweglichkeit und Flagellen, wenn auch nur bei einer sehr kleinen Anzahl der Mikroorganismuszellen. Deshalb kann er zu Recht den Pseudomonadaceae zugeordnet werden.
Innerhalb der Pseudomonadaceae könnte der Mikroorganismus somit der Gattung Pseudomonas oder Xanthomonas zugeordnet werden. Nach Bergey, Manual of Systematic Bacteriology, 1 (1984) bewegt sich Xanthomonas mit einem polaren Flagellum und ist im Oxidase-Test negativ bis schwach positiv. Xanthomonas ist außerdem ein kurzes Stäbchen, das 0,7-1,8 (um) x 0,4 - 0,7 (um) groß ist. In dieser Hinsicht unterscheidet es sich von dem vorliegenden Mikroorganismus. Der G + C Mol-Anteil der DNA in Xanthomonas beträgt 63% - 71% (Tm-, Bd-Verfahren), der des Mikroorganismus 69,4%. In bezug auf den G + C Mol-Anteil der DNA ist der Mikroorganismus daher Xanthomonas sehr ähnlich. Aufgrund seiner Größe, der hochgradig positiven Reaktion im Oxidase-Test und seiner Beweglichkeit ist der Mikroorganismus jedoch nicht der Gattung Xanthomonas zuzuordnen. Der Organismus sollte deshalb der Gattung Pseudomonas zugeordnet werden. Innerhalb der Gattung Pseudomonas ist keine der in Bergey, Manual of Systematic Bacteriology, 1 (1984), verzeichneten Arten mit dem vorliegenden Mikroorganismus identisch. Wenn man eine, dem Mikroorganismus ähnliche Art nennen müßte, so wäre das Pseudomonas aucimobilis, der sich aber in verschiedenen biochemischen Eigenschaften offensichtlich von dem vorliegenden Mikroorganismus unterscheidet.
Nun wird der G + C Mol-Anteil der DNA in Pseudomonas paucimobilis mit 58% - 70% (Bd-Verfahren) angegeben. Da der des vorliegenden Mikroorganismus mit 69,4% hoch ist, erscheint seine Zuordnung zur Gattung Pseudomonas gerechtfertigt.
Obwohl der Mikroorganismus möglicherweise eine neue Pseudomonas-Art ist, haben wir uns entschieden, ihn als Pseudomonas sp. PB-6250 zu bezeichnen. Der Stamm wurde am Fermentation Research Institute, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Prefecture Ibaragi, Japan, am 27. Juni 1989 unter dem Namen Pseudomonas sp. PB-6250 (FERM P-10794) hinterlegt und wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrages im Juni 1990 erneut hinterlegt (FERM BP-2938).
In der vorliegenden Erfindung können alle Stamme verwendet werden, die nicht nur den vorstehend erwähnten Pseudomonas sp. PB-6250 und dessen natürliche und künstliche Varianten umfassen, sondern auch alle Stämme, die zu Pseudomonas gehören und fähig sind, mindestens eine der Verbindungen Plusbacin A&sub1; - A&sub4; und B&sub1; - B&sub4; zu produzieren.
Plusbacin wird hergestellt, indem zuerst ein Plusbacin-produzierender Stamm in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird und Plusbacin dann nach Beendigung der Züchtung von der Kultur abgetrennt wird.
Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Plusbacin ist nachstehend gezeigt:
Es können die Medienzusammensetzung und die Züchtungsbedingungen verwendet werden, die üblicherweise zur Antibiotikaproduktion verwendet werden können. In der Regel enthält das Medium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze, usw. Gegebenenfalls können Vitamine und Vorstufen zugesetzt werden. Als Kohlenstoffquelle können Substanzen wie Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melasse und organische Säuren verwendet werden, entweder allein oder im Gemisch. Als Stickstoffquelle können Substanzen wie Sojapulver, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Baumwollsamenpulver, Pepton, Weizenkeime, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat verwendet werden, entweder allein oder im Gemisch. Beispiele für anorganische Salze sind Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Manganchlorid, Zinksulfat, Cobaltchlorid und verschiedene Phosphate, die gegebenenfalls dem Medium zugesetzt werden können.
Die Züchtung kann mit Hilfe eines üblicherweise für die Antibiotikaproduktion angewandten Verfahrens durchgeführt werden, vorzugsweise in Flüssigkultur und zur Produktion in großem Umfang vorzugsweise in aerober Submerskultur. Wenn der pH-Wert des Mediums variabel ist, kann ein Puffer, z.B. Calciumcarbonat, dem Medium zugesetzt werden. Die Züchtung kann bei etwa 20º - 40ºC, vorzugsweise bei 25ºC - 32ºC, durchgeführt werden. Die Züchtungszeit ist unterschiedlich und hängt sehr vom Fermentationsumfang ab. Die normale Züchtungszeit, die zur Produktion in großem Umfang erforderlich ist, beträgt etwa 1 Tag - 7 Tage. Wenn während der Fermentation starke Schaumbildung auftritt, empfiehlt es sich, vor oder während der Züchtung ein Mittel gegen Schaumbildung zuzusetzen, z.B. ein pflanzliches Öl, Schweinefett oder Polypropylenglykol.
Zur Abtrennung von Plusbacin aus der Kultur nach Beendigung der Züchtung kann ein Trennverfahren angewendet werden, das üblicherweise zur Trennung fermentierter Produkte angewandt wird. Je nach Umständen kann beispielsweise eine Kombination von Verfahren wie Filtration, Zentrifugation, Adsorption oder Desorption unter Verwendung verschiedener Ionenaustauscherharze und anderer wirksamer Adsorptionsmittel, Chromatographie und/oder Extraktion mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln eingesetzt werden.
Bei der Trennung und auch bei der Verwendung als Arznei- und Veterinärarzneimittel wird aus praktischen Gründen in einigen Fällen die Umwandlung der Verbindung in ein Salz bevorzugt. Nützliche salzbildende Stoffe sind Alkalimetalle, wie z.B. Lithium, Kalium und Natrium, Erdalkalimetalle, wie z.B. Magnesium und Calcium, anorganische Säuren, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und Bromwasserstoffsäure, und organische Säuren, wie z.B. Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Apfelsäure, Adipinsäure und Bernsteinsäure.
Plusbacin und dessen Salz können als Wirkstoff in einem antibakteriellen Präparat Menschen und Tieren oral oder parenteral verabreicht werden. Durch Zusatz eines üblichen Excipienten, Stabilisierungsmittels, Konservierungsmittels, Befeuchtungsmittels, oberflächenaktiven Mittels, usw., können sie zu Tabletten, Kapseln und/oder Pulverpräparaten zur oralen Verabreichung verarbeitet werden. Sie können auch zu injizierbaren Präparaten, Einreibungsmitteln und/oder Zäpfchen zur parenteralen oder äußerlichen Verabreichung verarbeitet werden. Die Dosierungsmenge ändert sich mit dem therapeutischen Zweck, dem Alter und Zustand des Patienten, usw. Im Fall einer intravenösen Injektion für Erwachsene liegt die tägliche Dosis jedoch bei etwa 0,01 - 10 g.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher, schränken sie aber in keiner Weise ein.

Beispiel 1

(a) Herstellungsverfahren mit Hilfe von Fermentation: Auf Schrägagarkultur gezüchtete Pseudomonas sp. PB-6250 (FERM BP-2938)- Zellen werden unter aseptischen Bedingungen in einem 2 1-Erlenmeyerkolben suspendiert, enthaltend 1 l Medium, das aus 10 g Glucose, 5 g Hefeextrakt und 1000 ml Wasser (ohne pH-Einstellung) besteht. Die Suspension wird unter Schütteln bei 250 Upm 18 Stunden lang bei 28ºC gezüchtet. Sieben Liter Kultur werden in 200 l Medium überimpft, das aus 10 g Maisstärke, 10 g Kartoffelstärke, 20 g CA-1 (ein Tierfutter) und 1000 ml Wasser (ohne pH- Einstellung) besteht und in einem 500 l-Behälter enthalten ist. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 28ºC bei 250 Upm unter Belüftung mit 200 l/Minute gezüchtet.
(b) Extraktions- und Reinigungsverfahren
(1) 25 kg Natriumchlorid werden etwa 200 l der vorstehend erhaltenen Kulturlösung zugesetzt und der pH-Wert des Gemisches wird mit verdünnter Salzsäure auf 3,0 eingestellt. Das Gemisch wird mit einer Sharples-Zentrifuge zentrifugiert. Der die feuchten Zellen enthaltende Teil wird zweimal mit 54 l 70%-igem Aceton extrahiert. Die extrahierte Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert und das Aceton größtenteils verdampft. 10 l Wasser werden der restlichen wäßrigen Lösung (15 l) zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt. Danach läßt man die Lösung durch eine Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) enthaltende Säule (10 l) hindurchlaufen, damit das Antibiotikum am Adsorptionsmittel adsorbieren kann. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird das Antibiotikum durch ein Konzentrationsgradienten-Elutionsverfahren mit Aceton in einer Konzentration im Bereich von 30% bis 100% eluiert. Fraktionen wirksamer Eluate werden gesammelt (10 l), bei denen dann das Aceton unter vermindertem Druck größtenteils verdampft wird. Die Lösung wird dann mit 5 l n-Butanol bei einem pH-Wert von 2,5 (eingestellt mit verdünnter Salzsäure) extrahiert. Die mit n-Butanol extrahierte Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert und Aceton wird dem Konzentrat zugesetzt, wodurch 23,9 g eines das Antibiotikum enthaltenden Rohpulvers gewonnen werden.
(2) Das vorstehend erwähnte, in einem Gemisch aus Chloroform, Ethanol und 10%-iger Essigsäure (4:7:2) gelöste Rohpulver (23 g) wird einer Chromatographie an Kieselgel-Säulen (hergestellt von Merck, Maschenzahl 70 -230, 1000 g) unterworfen. Fraktionen des wirksamen Eluates werden gesammelt und unter Zugabe von Wasser und Butanol konzentriert. Das Antibiotikum wird aus dem Konzentrat mit Butanol bei einem pH-Wert von 2,0 extrahiert. Die extrahierte Lösung wird mit Wasser gewaschen, unter vermindertem Druck konzentriert und mit Aceton gemischt, wodurch 6,34 g Antibiotikum als Rohpulver gewonnen werden.
(3) Das vorstehende Rohpulver wird einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen unterworfen, wodurch eine gereinigte Fraktion gewonnen wird.
Säule: YMC AP-324 S15/30 300A ODS (hergestellt von Yamamura Chemical Co.).
Mobile Phase: 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend Acetonitril - 50 mM Natriumsulfat (36:64).
Durchlaufgeschwindigkeit: 100 ml/Minute.
Der Nachweis erfolgt bei 220 nm mit einem UV-Detektor. Die Probe wird in Wasser mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst. 500 mg werden auf einmal injiziert. Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Chromatographie erhält man zuerst eine A&sub1; und B&sub1; enthaltende Fraktion, gefolgt von einer A&sub2; und B&sub2; enthaltenden Fraktion und zuletzt eine A&sub3;, A&sub4;, B&sub3; sowie B&sub4; enthaltende Fraktion. Jede Fraktion wird gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird mit Butanol bei einem pH-Wert von 2,5 extrahiert. Die extrahierte Lösung wird mit 0,1 N Salzsäure sowie Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck weiter konzentriert. Dem Gemisch wird Aceton zugesetzt, wodurch 150 mg eines Gemisches aus A&sub1;- und B&sub1;- Hydrochloriden, 214 mg eines Gemisches aus A&sub2;- und B&sub2;-Hydrochloriden und 1,0 g eines Gemisches aus A&sub3;-, A&sub4;-, B&sub3;- sowie B&sub4;-Hydrochloriden gewonnen werden.
(4) Jede der Verbindungen A&sub1; - A&sub4; und B&sub1; - B&sub4; wird aus den vorstehenden Gemischen abgetrennt, indem jedes Gemisch einer Hochdruckflüssigkeitschromatographje unter den folgenden Bedingungen unterworfen wird:
Säule: Ultron 7CN 20 x 250 mm (hergestellt von Shinwa Kako Co.)
Mobile Phase: 50 mM Phosphatpuffer, pH 2,2, enthaltend Acetonitril- 50 mM Natriumsulfat (26:74 zur Trennung von A&sub1; und B&sub1; und 28:72 zur Trennung von B&sub2;, A&sub3;, B&sub3;, A&sub4; und B&sub4;)
Durchlaufgeschwindigkeit: 11,25 ml/Minute
Der Nachweis erfolgt bei 220 nm mit einem UV-Detektor. Die Probe wird in 50% Methanol gelöst und 5 mg werden auf einmal injiziert.
Die Fraktion jeder Verbindung wird gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert, danach folgt eine Extraktion mit n-Butanol bei einem pH- Wert von 2,5. Die exträhierte Lösung wird mit 0,1 N Salzsäure und mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck weiter konzentriert. Dem Konzentrat wird Aceton zugesetzt, wodurch das Hydrochlorid jeder Verbindung gewonnen wird.
Aus 77 mg eines Gemisches aus A&sub1; und B&sub1; wurden 23 mg A&sub1;-Hydrochlorid und 6 mg B1-Hydrochlorid gewonnen.
Aus 100 mg eines Gemisches aus A&sub2; und B&sub2; wurden 68 mg A&sub2;-Hydrochlorid und 4 mg B&sub2;-Hydrochlorid gewonnen.
Aus 150 mg eines Gemisches aus A&sub3;, A&sub4;, B&sub3; und B&sub4; wurden 52 mg A&sub3;- Hydrochlorid, 10 mg A&sub4;-Hydrochlorid, 5 mg B&sub3;-Hydrochlorid und 2 mg B&sub4;- Hydrochlorid gewonnen.

Erfindungsgemäße Wirkung

Bezüglich der antibakteriellen Wirkung von Plusbacin A&sub1; - A&sub4; und B&sub1; - B&sub4; wurden in vitro-Tests gemäß dem von der Japan Society of Chemotherapy festgelegten Testverfahren unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
1) Herstellung einer Mikroorganismus-Suspension
Mit einer Platin-Impföse wird ein Teststamm (10&sup8; koloniebildende Einheiten/ml) von einem Schrägagarmedium auf 1 ml Zuchtmedium (Agarmedium für Scheibchen-Empfindlichkeitste5t, hergestellt von Nissui Co., Ltd.) überimpft, das dann 18 - 20 Stunden bei 37ºC gezüchtet wird. Eine 100- fache Verdünnung des Zuchtprodukts wird als Suspension des zu überimpfenden Mikroorganismus verwendet.
2) Probenlösung
9 - 10 mg der Probe werden in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst.
3) Agarplatte
Die Probenlösung wird mit sterilisiertem Wasser mit Hilfe des schrittweisen Mehrfach-Verdünnungsverfahrens (2000 - 0,25 ug/ml) verdünnt. Von jeder verdünnten Probenlösung werden 0,5 ml in eine sterilisierte Plastik-Petrischale (Durchmesser 9 cm) überführt. 9,5 ml Agarmedium (Medium zum Empfindlichkeitstest, hergestellt von Eiken Chemical Co., Ltd.) werden der Schale zugesetzt. Das Gemisch wird langsam gerührt, danach läßt man es erstarren.
4) Zur Messung des MIC-Wertes (MIC = minimale Hemmkonzentration) wird die Suspension mit einer Platin-Impföse (0,5 -1 ,ul) auf jede Agarplatte überführt, die vorstehend hergestellte Proben verschiedener Konzentrationen enthält. Das Gemisch wird 18 - 20 Stunden bei 37ºC gezüchtet, danach wird das Wachstum auf der Agaroberfläche kontrolliert. Die niedrigste Konzentration, bei der das Wachstum vollständig gehemmt worden ist, wird als MIC genommen, die mit der Maßeinheit ug/1 angegeben wird.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Plusbacin Getestete Mikroorganismen Staphylococcus aurcus Staphylococcus epidermidis Enterococcus faccalis *Methicillin-resistenter Mikroorganismus, **Methicillin-empfindlich

Claims

1. Verbindung der Formel:

in der X L-HyPro oder L-Pro bedeutet, R -CH&sub3; oder -CH(CH&sub3;)&sub2; darstellt und n eine ganze Zahl von 9 bis 12 ist, oder deren Salz.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei n die ganze Zahl 9, 10 oder 12 bedeutet.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, umfassend:

(a) Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und die Verbindung nach Anspruch 1 produziert, in einem Nährmedium und

(b) Gewinnung der Verbindung aus dem Nährmedium.

4. Biologisch reine Kultur von Pseudomonas sp. PB-6250, der die Verbindung nach Anspruch 1 produziert.