DE4003975A1

DE4003975A1 - Janthinomycin

Info

Publication number: DE4003975A1
Application number: DE4003975A
Authority: DE
Inventors: Joseph O'sullivan; John E Mccullough; Mar Janice H Del
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1990-02-09
Publication date: 1990-08-16
Also published as: IT9019303A1; CA2007895A1; GB2228009A; JPH02270896A; FR2642762A1; US5081225A; FR2642762B1; GB2228009B; GB9002873D0; IT9019303A0; IT1238681B

Description

Die Kultivierung eines Stammes des Mikroorganismus Janthinobacterium lividum, der in der American Type Culture Collection als A.T.C.C. Nr. 53 857 hinterlegt worden ist, liefert eine neue Klasse von Antibiotika, die mit den chemischen Trivialnamen "Janthinomycin A, B und C" bezeichnet werden. Janthinomycin A, B und C haben Aktivität gegen Gram-positive, Gram-negative und anaerobe Bakterien. Janthinomycin wurde analysiert und es wurde folgende allgemeine chemische Struktur (I) gefunden:

in der

Δ-Abu Dehydro-α-Aminobuttersäure bedeutet,
βHL D-erythro-β-Hydroxyleucin darstellt, und
X β-Hydroxytryptophan für Janthinomycin A, β-Ketotryptophan für Janthinomycin B und Dehydrotryptophan für Janthinomycin C ist.

In Lösung existiert der β-Ketotryptophanrest von Janthinomycin B als ein Gemisch geometrischer Isomerer, d. h. als E- und Z-Enole von β-Keto tryptophan. Die beiden Isomere sind chromatographisch trennbar, aber wandeln sich langsam ineinander um. Dabei entsteht ein pH-Wert- und Lösungs mittel-abhängiges Gleichgewichtsgemisch. Die beiden Isomere werden nachstehend als Janthinomycin B₁ und B₂ bezeichnet.

Fig. 1 zeigt das Ultraviolettspektrum von Janthinomycin A in Wasser und in 0,01 M HCl und 0,01 M NaOH.

Fig. 2 zeigt das Infrarotspektrum von Janthinomycin A in Kaliumbromid.

Fig. 3 zeigt das 67,5-MHz-Kohlenstoff-NMR-Spektrum von Janthinomycin A in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (1 : 4).

Fig. 4 zeigt das 400-MHz-Protonen-NMR-Spektrum von Janthinomycin A in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1).

Fig. 5 zeigt das Ultraviolettspektrum von Janthinomycin B in Wasser.

Fig. 6 zeigt das Infrarotspektrum von Janthinomycin B in Kaliumbromid.

Fig. 7 zeigt das 67,5-MHz-Kohlenstoff-NMR-Spektrum von Janthinomycin B (B₁ : B₂ etwa 3 : 1) in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (1 : 4).

Fig. 8 zeigt das 400 MHz-Protonen-NMR-Spektrum von Janthinomycin B (B₂ : B₁ etwa 4 : 1) in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (1 : 1, pH-Wert 7,1 mit Na₂DPO₄).

Fig. 9 zeigt das 400-MHz-Protonen-NMR-Spektrum von Janthinomycin B (B₂ : B₁ etwa 1 : 4) in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1).

Fig. 10 zeigt das Ultraviolettspektrum von Janthinomycin C in Wasser.

Fig. 11 zeigt das Infrarotspektrum von Janthinomycin C in Kaliumbromid.

Fig. 12 zeigt das 67,5-MHz-Kohlenstoff-NMR-Spektrum von Janthinomycin C ein deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1).

Fig. 13 zeigt das 400-MHz-Protonen-NMR-Spektrum von Janthinomycin C in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1).

Der Mikroorganismus

Der Mikroorganismus, der für die Produktion der Janthinomycine A, B und C verwendet wird, ist ein Stamm von Janthinobacterium lividum, der aus stehendem Gewässer, welches im Tyler State Park, Newtown, PA gesammelt worden war, isoliert wurde. Eine Subkultur des Organismus kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD erhalten werden. Seine Zugangsnummer in dieser Hinterlegungsstelle ist A.T.C.C. Nr. 53 857.

Über den spezifischen Mikroorganismus hinaus, der hier beschrieben und charakterisiert wird, sollte verstanden werden, daß Mutanten des Mikroorganismus, die durch den Gebrauch von chemischen oder physikalischen Mutagenen erzeugt werden, auch zur Produktion des Produktes kultiviert werden können.

Die Kultur von Janthinobacterium lividum kann aus Proben stehenden Wassers isoliert werden, indem eine passende Verdünnung in einem Medium bereitet wird, das folgendes enthält:


Gramm
NaCl
8,5
KH₂PO₄	0,3
Na₂HPO₄	0,6
Gelatine	0,1
und destilliertes Wasser ad 1 Liter.

0,1 ml dieses Materials wurde auf Agarplatten ausplattiert, die folgendes enthielten:


Maß
Pepton\|1 g
K₂HPO₄	0,2 g
Glucose	1 g
% Kristallviolett	0,1 ml
Erdextrakt	1 Liter
Agar	15 g

Der pH-Wert wird auf 6,8 eingestellt und die Mischung bei 121°C für 15 Minuten autoklaviert. Zehn ml einer 1%igen (W/V) Cycloheximidlösung wird dann zu einem Liter Medium zugegeben. Der Erdextrakt wird folgendermaßen hergestellt: 1000 ml Erde werden in 2 Liter Wasser für eine Stunde gekocht. Die festen Bestandteile werden durch ein Seihtuch heraus filtriert und die Lösung dann für 20 Minuten bei 28 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird dann durch Whatman-Papier filtriert und für 30 Minuten bei 121°C autoklaviert.

Der Organismus ist ein bewegungsfähiges Gram-negatives Bakterium, das stabförmig mit sub-polaren bis lateralen Flagellen ist. Kolonien auf Nähragar sind gelatinös und dunkel-purpurartig-schwarz gefärbt. Das gelatinöse Material sind extrazelluläre Polysaccharide; das produzierte Pigment ist Violacein. Glucose wird oxidativ verwertet. Säure wird aus Trehalose, aber nicht aus 1-Arabinose oder d-Xylose produziert. Der Organismus ist negativ für Arginindihydrolase, für die Produktion von HCN und für die Esculinhydrolyse. Das Bakterium wird als ein aberranter Stamm von Janthinobacterium lividum identifiziert.

Das Antibiotikum Janthinomycin

Das Antibiotikum Janthinomycin kann durch Kultivierung von Janthino bacterium lividum, A.T.C.C. Nr. 53 857 bei oder nahe bei 25°C unter untergetauchten aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen enthält, produziert werden. Die Fermentation wird ausgeführt bis das Medium substantielle Aktivität erhalten hat, gewöhnlich etwa 24 bis 28 Stunden. Nach der Fermentation wird festes Ammoniumsulfat zu der ganzen Brühe gegeben (25% wt/v), die Brühe zentrifugiert und das resultierende Pellet mit Methanol extrahiert. Die Methanol-Pellet-Mischung wird zentrifugiert und der resultierende Methanolextrakt durch Zugabe von Wasser etwa 10% wäßrig gemacht und dann mit Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Die Schichten werden getrennt und der Methanolextrakt für die Isolierung bereitgestellt.

Der Methanolextrakt wird zu MCI Gel CHP20P (CHP20P) in Wasser gegeben und die Mischung für eine Stunde gerührt. Das geladene Harz wird durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Methanol, Wasser und Acetonitril gewaschen. Das geladene Harz wird dann in eine Säule gepackt und die Antibiotika mit Acetonitril-Wasser-Ameisensäure eluiert. Weitere Reinigung wird durch Chromatographie mit Sephadex LH-20 in Acetonitril- Wasser erreicht. Partielle Trennung der drei Antibiotika Janthinomycine A, B und C wird durch Chromatographie mit CHP20P erzielt, wobei mit einem Gradienten aus Acetonitril-Wasser-Ameisensäure eluiert wird. Vollständige Trennung und Reinigung der Janthinomycin B und C wird durch Chromatographie mit CHP20P erreicht, wobei mit einem Acetonitril-wäßrigem Ammoniumdihydrogenphosphat puffer-Gradienten eluiert wird, der sich eine Entsalzung mit CHP20P anschließt, wobei mit Acetonitril-Wasser-Ameisensäure eluiert wird, um die reinen Antibiotika als naturweiße Pulver zu erhalten.

Die Menge von Janthinomycin C in den Fermentationen ist variabel und seine Anwesenheit ist vielleicht ein Kunstprodukt der Iso lierungsbedingungen (Janthinomycin A wird unter sauren Bedingungen in Janthinomycin C verwandelt). Wenn Janthinomycin C vorhanden ist, koeluiert es mit Janthinomycin B in jeder der anfänglichen Chromato graphien.

Das Ultraviolettspektrum von Janthinomycin A ist in Fig. 1 dargestellt und zeigt: λ max (E ) 337(8), 287(30), 276(36), 204 nm (270). Das Infrarotspektrum von Janthinomycin A in Kaliumbromid ist in Fig. 2 gezeigt. Folgende Peaks sind evident: 3342, 2962, 1743, 1659, 1602, 1525, 1383 und 1126 cm^-1. Das FAB Massenspektrum von Janthinomycin A in Dithiothreitol-dithioerythritol-dimethylsulfoxid-glycerol mit zugegebenem Natriumjodid zeigt folgende Ionen: (M+Na)⁺ 1215, (M+H)⁺ 1193 (schwach), (M+H-H₂O)⁺ 1175, (M+I)^- 1319. Ohne Zugabe von Natriumjodid werden nur die (M+H-H₂O)⁺ 1175 und die (M-H-H₂O)^- Ionen beobachtet. Das 67,5 MHz-¹³C NMR-Spektrum von Janthinomycin A in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (1 : 4) wird in Fig. 3 gezeigt. Das 400 MHz-¹H NMR-Spektrum von Janthinomycin A in deuteriertem Aceto nitril-deuteriertem Wasser (4 : 1) wird in Fig. 4 gezeigt. Dünnschicht chromatographie von Janthinomycin A mit Merck Silicagel-60 unter Benutzung von Chloroform-Methanol-70% wäßrigem Ethanol, 7 : 3 : 5, ergibt einen R_f-Wert von 0,38. Hochdruckflüssigkeitschromatographie von Janthinomycin A mit einer Hamilton PRP-1 Säule (150×4,1 mm), wobei mit Puffer A bei 1 ml/min. eluiert wird und die Extinktion bei 220 nm beobachtet wird, ergibt eine Retentionszeit von 3,90 min. Puffer A ist CH₃CN-H₂O (33 : 67), 1% in NH₄H₂PO₄, eingestellt auf einen pH-Wert von 3,6 mit 85%iger H₃PO₄.

Das Ultraviolettspektrum von Janthinomycin B ist in Fig. 5 dargestellt und zeigt λ max (E ), 312(82), 260(sh), 242(120), 204 nm (350). Das Infrarotspektrum von Janthinomycin B in Kaliumbromid wird in Fig. 6 gezeigt. Die folgenden Peaks sind evident: 3322, 3066, 2967, 1742, 1655, 1522, 1384, 1116 cm^-1. Das FAB Massenspektrum von Janthinomycin B in Dithiothreitol-dithioerythritol-dimethylsulfoxid-glycerol mit zugegebenem Natriumjodid zeigt die folgenden Ionen: (M+Na)⁺ 1213, (M+H)⁺ 1191, (M+I)^- 1317. Ohne zugegebenes Natriumjodid werden nur die (M+H)⁺ 1191 und die (M-H)^- 1189 Ionen beobachtet. Das hochaufgelöste FAB-Massenspektrum zeigt ein (M+H)⁺ von 1191, 6142, das mit der Molekülformel C₅₇H₈₃N₁₂O₁₆ (1191, 6050) übereinstimmt. Das 67,5-MHz-¹³ C-NMR-Spektrum von Janthinomycin B in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (1 : 4) ist in Fig. 7 dargestellt. Das Verhältnis von Janthinomycin B₁ : B₂ in diesem Beispiel ist etwa 3 : 1. Das 400-MHz-¹H NMR-Spektrum von Janthinomycin B (B₂ : B₁ etwa 4 : 1) in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (1 : 1, pH 7,1 mit Na₂DPO₄) ist in Fig. 8 gezeigt. Das 400-MHz- ¹H-NMR-Spektrum von Janthinomycin B (B₂ : B₁ etwa 1 : 4) in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1) ist in Fig. 9 gezeigt. Dünn schichtchromatographie von Janthinomycin B mit Merck Silicagel-60, wobei Chloroform-Methanol-70% wäßriges Ethanol, 7 : 3 : 5, benutzt wird, ergibt einen R_f-Wert von 0,35 für Janthinomycin B₂ und 0,39 für Janthinomycin B₁. Hochdruckflüssigkeitschromatographie von Janthinomycin B mit einer Hamilton-PRP-1-Säule (15×4,1 mm), wobei mit Puffer A bei 1 ml/min eluiert wird und die Extinktion bei 220 nm betrachtet wird, ergibt eine Retentionszeit von 1,74 min. für B₁ und 2,76 min. für B₂.

Das Ultraviolettspektrum von Janthinomycin C ist in Fig. 10 dargestellt und zeigt: λ max (E ) 339(100), 220(250), 195 nm (400). Das Infrarotspektrum von Janthinomycin C in Kaliumbromid ist in Fig. 11 gezeigt. Die folgenden Peaks sind evident: 3342, 3066, 2968, 1744, 1654, 1602, 1526, 1384, cm^-1. Das FAB Massenspektrum von Janthinomycin C in Dithio threitol-dithioerythritol-dimethylsulfoxid-glycerol zeigt die folgenden Ionen (M+H)⁺ 1175, (M-H)^- 1173 und das hochaufgelöste FAB-Massenspektrum zeigt ein (M+H)⁺ von 1175, 6205, welches übereinstimmt mit der Molekülformel C₅₇H₈₃N₁₂O₁₅ (1171, 6101). Das 67,5-MHz-¹³C-NMR-Spektrum von Janthinomycin C in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1) ist in Fig. 12 dargestellt. Das 400-MHz-¹H-NMR-Spektrum von Janthinomycin C in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser (4 : 1) ist in Fig. 13 gezeigt. Dünnschichtchromatographie von Janthinomycin C mit Merck Silicagel-60, wobei Chloroform-Methanol-70% wäßriges Ethanol, 7 : 3 : 5, benutzt wird, ergibt einen R_f-Wert von 0,37. (Janthinomycin C wird nicht von B₁ getrennt, wenn beide anwesend sind.) Hochdruckflüssigkeitschromatographie von Janthinomycin C mit einer Hamilton-PRP-1-Säule (150×4,1 mm), wobei mit Puffer A bei 1 ml/min eluiert und die Extinktion bei 220 nm betrachtet wird, ergibt eine Retentionszeit von 2,06 min.

Verbindungen der Formel I und physiologisch verträgliche Salze davon können als Agenzien zur Behandlung bakterieller Infektionen (besonders Gram- positiver Infektionen) in Säugetierarten wie z. B. Haustieren (z. B. Hunden, Katzen, Kühen, Pferden und ähnlichen) und Menschen benutzt werden. Sie können unter Zuhilfenahme der gleichen Verabreichungsarten verabreicht werden, die in der Vergangenheit benutzt wurden, um Penicilline und Cephalosporine zum Infektionsherd zu bringen. Solche Methoden der Verabreichung schließen die intravenöse, intramuskuläre Art und als Zäpfchen ein. Die Dosis des Antibiotikums der Formel I, die eingesetzt wird, wird natürlich vom jeweiligen Antibiotikum, der Größe des Wirtes und der Schwere der Infektion abhängen. Für einen menschlichen Erwachsenen ist eine tägliche Dosis von etwa 250 Milligramm bis etwa 2 Gramm exemplarisch. Weitere Information über die Potenz der Verbindungen dieser Erfindung wird nachstehend unter der Überschrift "Biologische Aktivität" gegeben.

Die folgenden Beispiele erläutern weiterhin die Herstellung und Nützlichkeit von Janthinomycin.

Beispiel 1

Janthinobacterium lividum wird in folgendem sterilisiertem Medium (A) gehalten:

Das Medium wird bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert.

Eine Öse voll Oberflächenbewuchs von Janthinobacterium lividum auf Schrägagar (Medium A) wird zum Animpfen eines jeden von drei 500 ml Erlenmeyerkolben benutzt, von denen jeder 100 ml des folgenden sterilisierten Mediums (B) enthält:


Gramm
Hefeextrakt
5,0
Glucose	5,0
MgSO₄ · 7 H₂O	0,1
FeSO₄ · 7 H₂O	0,1
Leitungswasser ad 1 Liter

Das Medium wird bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert.

Nach dem Animpfen werden die Kolben dann bei 25°C auf einem Rotationsschüttler (300 rpm; 2 Zoll Hub) für etwa 96 Stunden inkubiert mit einem nachfolgenden pH-Wert der Brühe von 8,0-8,5. Nach der oben beschriebenen entsprechenden Inkubation werden 2% (vol/vol) von den Wachstumskulturkolben in zweihundert 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt, von denen jeder 100 ml sterilisiertes Medium (B) enthält, wie oben beschrieben. Nach dem Animpfen werden die Kolben nochmals bei 25°C auf einem Rotationsschüttler (wie vorher beschrieben) für etwa 24-28 Stunden inkubiert mit einem resultierenden pH-Wert der Brühe von 7,1-7,5. (NH₄)₂SO₄ (5 kg, 25% wt/vol) wird zu den vereinigten Brühen gegeben (etwa 19-20 l) und die Mischung für eine Stunde gerührt. Die Brühe-(NH₄)₂SO₄- Mischung wird dann zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet (800-900 g) wird mit Methanol extrahiert (2,5 l, 1,5 Stunden) und die Mischung wieder zentrifugiert. Der Methanolüberstand wird durch Zugabe von 0,2 l Wasser etwa 10% wäßrig gemacht und dann mit 0,8 l Tetrachlor kohlenstoff extrahiert. Die Schichten werden getrennt und die obere Schicht zu 0,6 l Wasser und 0,6 l CHP20P zugegeben. Dies wird für eine Stunde gerührt und das Harz durch Vakuumfiltration gesammelt. Das geladene Harz wird mit 2 l Methanol, 1 l Wasser und 2 l CH₃CN gewaschen (im Trichter). Das geladene Harz wird dann in eine Säule (5×50 cm) gepackt und die aktiven Komponenten als eine 60 ml purpurrote Bande an der Säurefront mit CH₃CN-H₂O-HCO₂H, 70 : 30 : 1, eluiert. Diese Fraktionen werden unter Vakuum getrocknet (109,2 mg). Dieses Material, eine Mischung von Janthinomycin A und B sowie anderer Verunreinigungen wird auf einer 2,5×23-cm-Sephadex-LH-20-Säule in CH₃CN-H₂O, 8 : 2 chromatographiert. Die aktiven Komponenten koeluieren zwischen 105 und 180 ml. Das aktive Eluat wird unter Vakuum auf 53,5 ml Material konzentriert. Teilweise Auflösung von Janthinomycin A und B wird durch Chromatographie mit CHP20P (1,5×34 cm, 2 ml/min) erreicht, indem mit einem linearen Gradienten, der aus CH₃CN-H₂O-HCO₂H, 20 : 80 : 0 und 60 : 40 : 1 (jeder 220 g) hergestellt wird, eluiert wird. Fraktionen, die vorwiegend Janthinomycin B (das zwischen 138 und 152 ml eluiert) oder Janthinomycin A (das zwischen 166 und 192 ml eluiert) enthalten, werden separat vereinigt und unter Vakuum bis zur Trockenheit konzentriert, um 5,5 mg Roh-Janthinomycin B und 22,8 mg Roh-Janthinomycin A zu ergeben.

Beispiel 2

Die Endreinigung von 84,8 mg Roh-Janthinomycin A, das aus 60 l Brühe wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wird, wird durch Wiederholung der Chromatographie mit CHP20P (1,5×36 cm, 2 ml/min) mit einem linearen Gradienten von CH₃CN-H₂O-HCO₂H, 20 : 80 : 0 bis 60 : 40 : 1 (jeder 225 g) erreicht. Janthinomycin A eluiert zwischen 124 und 148 ml und wird gut abgetrennt von einer kleinen Menge Janthinomycin B und auch von einer gelben Verunreinigung. Die aktiven Fraktionen werden unter Vakuum zur Trockenheit gebracht, der Rest in 0,5 ml Wasser gelöst und CH₃CN zugegeben bis sich Präzipitat bildet. Nochmals wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, um 58,5 mg Janthinomycin A als naturweißes Pulver zu ergeben.

Beispiel 3

5,5 mg zum Teil gereinigtes Janthinomycin B aus der Chromatographie mit CHP20P (beschrieben in Beispiel 1) wird mit 101,1 mg vergleichbarem Material aus früheren Fermentationen kombiniert. Endgültige Reinigung wird erreicht durch eine Wiederholung der Chromatographie mit CHP20P (2,5×35 cm) mit einem linearen Gradienten, der aus CH₃CN-H₂O-HCO₂H, 20 : 80 : 0 und 60 : 40 : 1 (jeder 640 g) hergestellt wird. Janthinomycin B eluiert zwischen 250 und 376 ml. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert und unter Vakuum zur Trockene konzentriert. Janthinomycin B wird als ein naturweißes Pulver durch Auflösen des getrockneten Restes in einer minimalen Menge Wasser, Zugabe von CH₃CN bis sich ein Präzipitat bildet und Konzentration der Probe bis zur Trockene unter Vakuum (86,1 mg) erhalten.

Beispiel 4

Rohantibiotikum, das aus mehreren 20 l Fermentationen wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wird, welches sowohl Janthinomycin B (eine Mischung von B₁ und B₂) und 125,1 mg C enthält, wird in einem Puffer suspendiert, der durch Zugabe von 3,3 ml CH₃CN zu einer Lösung von 6,7 ml Wasser und 0,1 g (NH₄)₂HPO₄ hergestellt und mit 85% H₃PO₄ auf pH 7,1 eingestellt wird. Der pH-Wert dieser Probe wird unmittelbar vor der Chromatographie mit CHP20P, wobei mit 50 ml Puffer A, gefolgt von einem linearen Gradienten von Puffer A zu Puffer B (jeder 220 g) eluiert wird, mit 85% H₃PO₄ auf einen pH-Wert 3,6 eingestellt. Puffer A wird gemacht durch Zugabe von 330 ml CH₃CN zu einer Lösung von 670 ml H₂O und 10,0 g NH₄H₂PO₄ und mit 85% H₃PO₄ auf 3,6 eingestellt. Puffer B wird gemacht durch Zugabe von 600 ml CH₃CN zu einer Lösung von 400 ml H₂O und 10,0 g NH₄H₂PO₄ und mit 85% H₃PO₄ auf einen pH-Wert 3,6 eingestellt. Janthinomycin C eluiert zwischen 63 und 75 ml, während Janthinomycin B₂ zwischen 150 und 225 ml eluiert. Die Aktivitäten werden separat vereinigt und unter Vakuum zur Trockene gebracht. Jede wird zum Teil entsalzt durch Trennung zwischen BuOH-H₂O (dreimal, 3 ml sowohl von BuOH als auch von H₂O), Vereinigen der BuOH-Schichten und deren Eindampfen zur Trockene unter Vakuum, wobei 44,8 mg Janthinomycin B (als eine Mischung von B₁ und B₂) und 39,5 mg von Janthinomycin C erhalten werden. Die Endreinigung wird erreicht durch Entsalzen mit CHP20P (1,5×20 cm), wobei mit einem linearen Gradienten von CH₃CN-H₂O-HCO₂H, 20 : 80 : 0 bis 60 : 40 : 1 (jeder 120 g) eluiert wird, um 37,0 mg Janthinomycin B zu ergeben. Die Entsalzung eines vereinigten Ansatzes ähnlicher Proben von 94,1 mg Janthinomycin C ergab 53,5 mg reines Material.

Biologische Aktivität

Die folgende Methodik wurde benutzt, um die minimale Hemmkonzentration (danach als MIC bezeichnet) der Verbindung dieser Erfindung zu bestimmen. Die aeroben Testorganismen wurden in etwa 15-20 ml Antibiotic Assay Broth (Difco) wachsen gelassen, indem die Brühe (in Röhrchen) mit einer Öse voll mit dem Organismus von einem BHI (Difco) Schrägagar angeimpft wurde. Die angeimpften Röhrchen wurden bei 37°C für 18 bis 24 Stunden inkubiert. Es wird angenommen, daß diese Kulturen 10⁹ koloniebildende Einheiten (CFU) pro ml enthalten. Die Kulturen wurden 1 : 100 verdünnt, um ein endgültiges Inokulum-Niveau von 10⁷ CFU zu erhalten; Verdünnungen wurden mit Yeast Beef Broth (Difco) gemacht.

Janthinomycin wurde in einem passenden Verdünnungsmittel zu einer Konzentration von 1000 µg/ml gelöst. Zweifache Verdünnungen wurden in Yeast Beef Broth (Difco) gemacht, woraus ein Bereich von 1000 µg/ml bis 0,05 µg/ml resultierte. 1,5 ml jeder Verdünnung wurden in individuelle Petrischalen gegeben und dazu 13,5 ml K-10 Agar gegeben. Die Zusammensetzung von K-10 Agar war:


Gramm
Rindfleischextrakt
1,5
Hefeextrakt	3,0
Pepton	6,0
Dextrose	1,0
Agar	15,0
Destilliertes Wasser ad 1 Liter.

Die Endkonzentration des Arzneistoffes im Agar reichte von 100 µg/ml bis 0,05 µg/ml. Organismenwachstumskontrollplatten, die nur Agar enthalten, wurden vor und nach den Testplatten hergestellt und angeimpft. Die Organismen wurden auf die Agaroberfläche jeder Platte mit einem Denly Multipoint Inoculator (der ungefähr 0,001 ml jedes Organismus liefert) aufgebracht, was zu einem End-Inokulum von 10⁴ CFU auf der Agaroberfläche führte.

Die Platten wurden bei 37°C 18 Stunden lang inkubiert und die MICs bestimmt. Der MIC war die niedrigste Konzentration einer Verbindung, die das Wachstum des Organismus verhindert.

Die Ergebnisse der Agar-Verdünnungs-Tests waren folgendermaßen:

Tabelle I

Tabelle II

Die Empfänglichkeit einer Anzahl von anaeroben Bakterien gegenüber einer Mischung von Janthinomycin A und B wurde auch mit Hilfe einer Agar-Verdünnungstechnik bestimmt. Die Testorganismen wurden aus 24-48 Stunden alten Kulturen präpariert, die in Chopped Meat Broth (Scott Laboratories, Fiskeville, R. I.) gewachsen waren oder aus Waschungen von Schokoladenschrägagar. Diese Schrägagar wurden durch Zugabe von Hämoglobin zu Protease 3 Agar (Difco) in einer Konzentration von 1 Prozent präpariert. Der Bewuchs wurde mit Brain Heart Infusion Broth (BBl Microbiology Systems) vom Schrägagar gewaschen und zu einer Dichte von 1×10⁸ CFU/ml verdünnt. Das Trifluoracetatsalz einer Mischung der Janthinomycine A und B wurde in dem passenden Verdünnungsmittel zu einer Konzentration von 1000 µg/ml gelöst. Zweifache Verdünnungen wurden in Yeast Beef Broth (Difco) gemacht, woraus ein Bereich von 1000 µg/ml bis 0,5 µg/ml resultierte. Eine 1,5-ml-Probe jeder Verdünnung wurde in individuelle Petrischalen gegeben, denen 13,5 ml DST Agar (Oxoid USA, Inc. Red Branch Road, Columbia, Md.), der 5% lysiertes Schafsblut enthielt, und 0,5 µg/ml Vitamin K zugegeben wurden. Die endgültige Konzentration des Arzneistoffes in dem Agar reichte von 100 µg/ml bis 0,05 µg/ml. Organismus-Wachstums- Kontrollplatten, die nur Agar allein enthielten, wurden hergestellt und vor und nach den Testplatten angeimpft. Die Organismen wurden mit einem Denyl Multipoint Inoculator (welcher etwa 0,001 ml jedes Organismus liefert) auf die Oberfläche jeder Platte aufgebracht, woraus ein endgültiges Inokulum-Niveau von 10⁵ CFU auf der Agarplatte resultierte. Die Platten wurden bei 37°C für 18 Stunden in einer anaeroben Kammer (Forma Scientific, Marietta, Ohio) inkubiert und dann die MIC-Werte bestimmt. Der MIC ist die niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, die das Wachstum des Organismus verhindert.

Die Ergebnisse der Agar-Verdünnungs-Versuche sind:

Claims

1. Verbindung der Formel oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, in der
Δ-Abu Dehydro-α-Aminobuttersäure bedeutet,
βHL D-erythro-β-Hydroxyleucin darstellt, und
X β-Hydroxytryptophan, β-Ketotryptophan oder Dehydrotryptophan ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, in der X Threo-β-Hydroxytryptophan ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, in der X β-Ketotryptophan ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, in der X Dehydrotryptophan ist.

5. Verbindung oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, die das Ultraviolettspektrum von Fig. 1, das Infrarotspektrum von Fig. 2, das 67,5-MHz-Kohlenstoff-NMR- Spektrum von Fig. 3 und das 400-MHz-Protonen-NMR-Spektrum von Fig. 4 hat.

6. Verbindung oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, die das Ultraviolettspektrum von Fig. 5, das Infrarotspektrum von Fig. 6, das 67,5-MHz-Kohlenstoff-NMR- Spektrum von Fig. 7 und die 400-MHz-Protonen-NMR-Spektren von Fig. 8 und 9 hat.

7. Verbindung oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, die das Ultraviolettspektrum von Fig. 10, das Infrarotspektrum von Fig. 11, das 67,5-MHz-Kohlenstoff-NMR- spektrum von Fig. 12 und das 400-MHz-Protonen-NMR-Spektrum von Fig. 13 hat.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als Arzneistoff.

9. Arzneimittel zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7.