DE3685764T2 - Antibiotikum hergestellt von lysobacter sp. sc 14,067. - Google Patents
Antibiotikum hergestellt von lysobacter sp. sc 14,067.Info
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Description
- Die Züchtung eines Stammes des Mirkoorganismus Lysobacter sp. Sc 14,067, der bei der American Type Culture Collection als A.T.C.C. Nr. 53042 hinterlegt worden ist, ergibt die neue antibiotische Substanz EM5587. Das Antibiotikum ist wirksam gegen eine Reihe von gram-positiven und gram-negativen Bakterien und weist eine besonders gute Aktivität gegen gram-positive Bakterien auf.
- Fig. 1 zeigt das UV-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in Methanol.
- Fig. 2 zeigt das IR-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in Kaliumbromid.
- Fig. 3 zeigt das Fast Atom Bombardment-Massenspektrum des Trifluoracetatssalzes von EM5587 im positiven Modus.
- Fig. 4 zeigt das 67,5 MHz-¹³C-NMR-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser-Trifluoressigsäure (50:50:0,1).
- Fig. 5 zeigt das 400 MHz-¹H-NMR-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser-Trifluoressigsäure (50:50:0,1).
- Bei dem zur Bildung von EM5587 verwendeten Mikroorganismus handelt es sich um einen Stamm von Lysobacter sp. SC 14,067. Eine Unterkultur des Mikroorganismus kann von der Dauersammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, bezogen werden. Die Hinterlegungsnummer in dieser Hinterlegungsstelle lautet A.T.C.C. Nr. 53042. Es ist darauf hinzuweisen, daß neben dem hier beschriebenen und charakterisierten speziellen Mikroorganismus auch Mutanten des Mikroorganismus (z.B. unter Verwendung von Röntgenstrahlen, UV-Strahlen oder Stickstofflost gebildete Mutanten) ebenfalls zur Bildung von EM5587 gezüchtet werden können.
- Die Isolierung von Lysobacter sp. SC 14,067 aus einer Probe aus feuchtem Blätterunrat (in diesem Fall gewonnen aus einem Wasserlauf im Washington's Crossing State Park, New Jersey), in dem dieser Mikroorganismus vorliegt, kann durchgeführt werden, indem man das Erdreich auf Littman-Agar (BBL Microbiology Systems, P.O. Box 243, Cockeysville, Maryland 21030), das mit einer sterilen Streptomycinlösung zur Erzielung einer Endkonzentration von 30 µg/ml im Medium supplementiert ist, ausstreicht.
- Nach 6-tägiger Inkubation bei etwa 25ºC werden die Kolonien von Lysobacter sp. SC 14,067 von der ausgestrichenen Probe isoliert. Die isolierten Kolonien werden auf ein Agarmedium der folgenden Zusammensetzung überimpft:
- Hefeextrakt 5,0 g
- Glucose 5,0 g
- MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,1 g
- FeSO&sub4; 7H&sub2;O 0,1 g
- Agar 17,5 g
- Leitungswasser 800 ml
- Bodenextrakt-Filtrat * 200 ml
- * Das Bodenextrakt-Filtrat wird hergestellt, indem man eine Suspension des Erdreichs in Wasser (1:2, Gew./Vol.) 1 Stunde am Sieden hält und den gekühlten Extrakt filtriert.
- Das Medium wird 30 Minuten bei 121ºC in einem Autoklaven sterilisiert.
- Bei Lysobacter sp. SC 14,067 handelt es sich um gram-negative Stäbchen, die je nach dem Medium eine unterschiediche Morphologie aufweisen. In Trypticase-Soja-Agar handelt es sich um kurze Stäbchen mit abgerundeten Enden und einigermaßen gleichmäßiger Länge. Auf 0,2 % Tryptone-Agar sind die Stäbchen dünn und leicht gekrümmt und liegen im Längenbereich von etwa 0,4 bis 40 µm. Auf diesem Medium weisen sie eine charakteristische gleitende Beweglichkeit auf. Es werden keine Fruchtkörper gebildet. Die Kolonien sind schleimig oder mukoid und weisen eine schmutzig-gelbe Färbung auf.
- Beim Hugh-Leifson-O/F-Glucosetest (J. Bacteriol., Bd. 66 (1953), S. 24) wächst Lysobater sp. SC 14,067 oxidativ, aber es ergibt sich keine Säurebildung. Die schwache Säurebildung wird durch Ammoniak aus dem Pepton im Medium maskiert. Auf peptonfreiem Board and Holding-Medium (Manual of Methods for General Bacteriology. Herausg. Gerhardt et al., A.S.M., Washington, D.C., 1981, S. 433) mit monobasischem Ammoniumphosphat in einer Menge von 0,05 % als Stickstoffquelle und 0,5 % Glucose als einziger Kohlenstoffquelle erfolgt eine nachweisbare Säurebildung. Der organismus ist positiv gegenüber Cytochrom-oxidase, Katalase und Phosphatase.
- Lysobater sp. SC 14,067 wirkt chitinolytisch und bewirkt eine Lysis von Hefezellen, z.B. von Saccharomyces. Es wirkt stark proteolytisch auf Gelatine und Casein. Es gibt keine Anzeichen für eine zellulolytische oder agarolytische Aktivität. Tests auf Indol, Methylrot sowie die Voges- Proskauer-Reaktion sind alle negativ. Der Mol-%-Wert G+C von Lysobacter sp.SC 14,067-DNA beträgt 64,9.
- Die vorstehenden Merkmale stimmen alle mit denen von Mitgliedern der Gattung Lysobacter gemäß der Beschreibung von Christiansen und Cook (1978), Int. J. Bacteriol., Bd. 28 (3), S 367-393 überein.
- Das Antibiotikum EM5587 kann durch Züchtung von Lysobacter sp. SC 14,067, A.T.C.C., Nr. 53042 bei oder in der Nähe von 25ºC unter aeroben Submersbedingungen in einem wässrigen Nährmedium mit einem Gehalt an assimilierbaren Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen gebildet werden. Die Fermentation wird solange durchgeführt, bis im Medium eine wesentliche Aktivität entstanden ist, üblicherweise etwa 24 bis 28 Stunden.
- Nach Beendigung der Fermentation wird die Brühe zentrifugiert, um die Zellen der produzierenden Mikroorganismen vom Fermentationsüberstand abzutrennen. EM5587 liegt sowohl in den festen als auch in den flüssigen Bestandteilen vor. Die Feststoffe werden mit Aceton-Wasser (4:1) extrahiert, und der Extrakt wird unter vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingeengt. Der Rückstand wird mit einer möglichst geringen Menge an Methanol verrieben. Das in Methanol lösliche Material wird an einer Säule mit MCI-Gel CHP20P* unter Elution mit Wasser-Acetonitril- Trifluoressigsäure-Gemischen chromatographiert (* MCI-Gel CHP20P ist ein makroreticuläres Styrol-Divinylbenzol-Copolymer der Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.). Fraktionen mit Aktivität gegen Staphylococcus aureus, die dünnschichtchromatographisch homogen sind, werden vereinigt. Eine Kristallisation läßt sich erreichen, indem man Acetonitril-Wasser- Trifluoressigsäure-Lösungen von EM5587 unter einem Stickstoffstrom eindampft. Das kristalline EM5587-Trifluoracetatsalz wird durch Vakuumfiltration gewonnen. Die überstehende Brühe wird auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und mit n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck eingeengt und sodann auf die vorstehend für den Zellextrakt beschriebene Weise verrieben und chromatographiert, wobei man EM5587 als Trifluoracetatsalz erhält.
- Weitere Salze lassen sich herstellen, indem man eine Wasser-Acetonitril-Lösung (1:1, Vol./Vol.) des EM5587-Trifluoracetatsalzes über ein basisches Ionenaustauscherharz, z.B. AG MP-1 (Bio-Rad, Richmond, Californien), in der geeigneten anionischen Form gibt. Beispiele für anorganische Salze sind Hydrohalogenide (z.B. Hydrochloride und Hydrobromide), Sulfate, Nitrate, Phosphate und Borate. Beispiele für organische Salze sind Acetate, Tartrate, Maleate, Citrate, Succinate, Benzoate, Pamoate, Ascorbate, Salicylate, Alkansulfonate (z.B. Methansulfonate) und Arylsulfonate (z.B. Benzolsulfonate).
- Pharmazeutisch verträgliche Salze von EM5587 können als Mittel zur Bekämpfung bakterieller Infektionen (z.B. gram-positiver Infektionen) bei Säugetier-Species, wie Haustieren (z.B. Hunden, Katzen, Rindern, Pferden und dergl.) und Menschen, verwendet werden. Sie können unter Einsatz von Verabreichungsarten verabfolgt werden, die bisher dazu dienten, Penicilline und Cephalosphorine an die Infektionsstelle zu bringen. Zu derartigen Verabreichungsmethoden gehören die intravenöse und intramuskuläre Verabreichung sowie als Suppositorium. Die angewandte Dosierung von EM5587 variiert naturgemäß je nach der Größe des Wirtes und je nach der Schwere der Infektion. Für eine erwachsene Person kommen beispielsweise Tagesdosen von etwa 250 mg bis etwa 2 g in Frage. Weitere Informationen über die Wirkung der Verbindungen der Erfindung finden sich unter dem Stichwort "biologische Aktivität".
- Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Herstellung und Brauchbarkeit der Salze von EM5587.
- Lysobacter sp. SC 14,067, A.T.C.C. Nr. 53042 wurde auf dem folgenden sterilisierten Agarmedium (A) gehalten:
- Hefeextrakt 5,0 g
- Glucose 5,0 g
- MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,1 g
- FeSO&sub4; 7H&sub2;O 0,1 g
- Bodenextrakt-Filtrat * 200 ml
- Agar 17,5 g
- Leitungswasser 800 ml
- * Das Bodenextrakt-Filtrat wurde durch einstündiges Vermischen von 1 Volumenteil Erdreich mit 2 Volumenteilen Wasser bei 100ºC und anschließendes Filtrieren hergestellt. Das Medium wurde vor der Verwendung 15 Minuten bei einer Temperatur von 121ºC und einem Dampfdruck von 15 lb sterilisiert.
- Eine Öse mit Oberflächenwachstum aus einer Agar-Schrägkultur (Medium A) von Lysobacter sp. SC 14,067, A.T.C.C. Nr. 53042 wurde jeweils zur Beimpfung von zwei 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben die jeweils 100 ml des folgenden sterilisierten Mediums B enthielten, verwendet.
- Hefeextrakt 5,0 g
- Pepton 3,0 g
- Mannit 5,0 g
- destilliertes Wasser auf 1,0 Liter
- Das Medium wurde vor der Verwendung 15 Minuten bei 121ºC sterilisiert.
- Nach der Beimpfung wurden die Kolben etwa 24 Stunden bei 35ºC auf einer Drehschüttelvorrichtung (330 U/min; Ausschlag 2 Zoll) inkubiert. Aus den der Züchtung unterworfenen Kulturkolben wurden Übertragungen von 1% (Vol./Vol.) auf fünfzig 500 ml fassende Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml des vorstehend beschriebenen sterilisierten Mediums B enthielten, durchgeführt. Nach der Beimpfung wurden die Kolben erneut auf einer Drehschüttelvorrichtung (gemäß der vorstehenden Beschreibung) bei 25ºC etwa 24 - 28 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kolbeninhalte vereinigt, und die Brühe wurde zentrifugiert. Man erhielt etwa 4,8 Liter überstehende Brühe und 33 g Zellen (Feuchtgewicht).
- Die Zellmasse (33g) wurde mit drei 200 ml-Portionen Aceton-Wasser (4:1) extrahiert. Die filtrierten Extrakte wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit Methanol verrieben und der lösliche Teil zu einer gelben glasigen Masse (705 mg) eingeengt. Eine Chromatographie des in Methanol löslichen Materials wurde an einer MCI- Gel-CHP20P-Säule der Abmessungen 2,5 x 43 cm mit einem linearen Gradienten von 1 Liter 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser bis 1 Liter 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril durchgeführt. Fraktionen mit einer bei dünnschichtchromatographischer Untersuchung (Merck Silicagel-60; n-Butanol-Essigsäure-Wasser 4:1:1; Rf = 0,42) einzigen Rydon-positiven Komponente wurden vereinigt und zu einem grau-weißen Feststoff (173 mg) getrocknet. Der Feststoff wurde in Acetonitril-Wasser-Trifluoressigsäure (50:50:0,1) gelöst und unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Man erhielt 73 mg kristallines EM5587 als Trifluoracetatsalz.
- Eine Elementaranalyse wurde an einer Probe nach 3-stündiger Trocknung unter vermindertem Druck bei 70ºC durchgeführt. Gefunden: C 50,01; H 6,92; N 13,98; F 7,4.
- Das UV-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 ist in Fig. 1 dargestellt und zeigt: lambda max (E1%1cm) 250 (sh 1,4), 257 (1,5) 262 (1,4) und 268 nm (0,9) neben einer Endabsorption. Das IR-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in Kaliumbromid ist in Fig. 2 dargestellt. Es ergeben sich folgende Maxima: 3345 (br), 2965, 2937, 2878, 1745 (w), 1666 (s), 1530 (s), 1203, 1138, 838, 800, 722 und 702 cm&supmin;¹.
- Das FAB-Massenspektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in Dithiothreit-Dithioerythrit ist in Fig. 3 dargestellt.
- Das 67,5 MHz-¹³C-NMR-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser-Trifluoressigsäure (50:50:0,1) ist in Fig. 4 dargestellt.
- Das 400 MHz-¹H-NMR-Spektrum des Trifluoracetatsalzes von EM5587 in deuteriertem Acetonitril-deuteriertem Wasser-Trifluoressigsäure (50:50:0,1) ist in Fig. 5 dargestellt.
- Eine Dünnschicht-Verteilungschromatographie des Trifluoracetatsalzes von EM5587 an Merck-Silicagel 60 unter Verwendung von n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1) ergibt einen Rf-Wert von 0,42.
- Das Trifluoracetatsalz von EM5587 ist in Methanol, Acetonitril-Wasser (1:1) und Dimethylsulfoxid löslich, jedoch in Acetonitril, Chloroform, Benzol, Essigsäureethylester oder Wasser nicht in wesentlichem Umfang löslich.
- Für aerobe Bakterien wurde die minimale Hemmkonzentration (MIC) des Trifluoracetatsalzes von EM5587 nach der Agar-Verdünnungsmethode bestimmt. Die Testorganismen wurden aus gefrorenen Vorräten vorbereitet und auf eine Endkonzentration von 10&sup7; CFU/ml verdünnt. Das Trifluoressigsäuresalz von EM5587 wurde im entsprechenden Verdünnungsmittel auf eine Konzentration von 1000 µg/ml verdünnt. Zweifach-Verdünnungen wurden in Hefe- Rinder-Brühe (Yeast Beef Broth (Difco) in einem Bereich von 1000 µg/ml bis 0,5 µg/ml hergestellt. Eine 1,5 ml Probe der Verdünnungen wurde jeweils in einzelne Petri-Schalen, die mit 13,5 ml K-10-Agar* versetzt waren, gegeben. (* K-10-Agar: Rindsextrakt 1,5 g; Hefeextrakt 3,0 g; Pepton 6,0 g; Dextrose 1,0 g; Agar 15,0 g; destilliertes Wasser auf 1000 ml). Die Wirkstoff-Endkonzentration im Agar lag im Bereich von 100 µg/ml bis 0,05 ug/ml. Platten zur Kontrolle des Mikroorganismen-Wachstums, die nur Agar enthielten, wurden hergestellt und vor und nach den Testplatten beimpft. Die Organismen wurden auf die Oberflächen der einzelnen Platten mit einem Denley Multipoint Inoculator (der etwa 0,001 ml der einzelnen Organismen abgibt) aufgebracht, was eine endgültige Inoculum-Konzentration von 10&sup4; CFU auf der Agaroberfläche ergab.
- Die Platten wurden 18 Stunden bei 37ºC inkubiert und anschließend wurden die MIC-Werte ermittelt. Beim MIC-Wert handelt es sich um die niedrigste Konzentration der Verbindung, die das Wachstum der Organismen hemmt.
- Die Ergebnisse der Agar-Verdünnungstests sind nachstehend zusammengestellt. Organismus Staphylococcus aureus (Penicillin )** (Methicillin ) (Gentamicin ) (Erythromycin ) Staphylococcus faecalis Staphylococcus agalactiae Micrococcus luteus Escherichia coli Klebsiella aerogenes Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Proteus rettgeri Proteus vulgaris Salmonella typhosa Shigella sonnei Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter calcoaceticus * SC Nr. ist die Nummer des Mikroorganismus in der Sammlung von E.R. Squibb & Sons, Inc. Princeton, New Jersey ** ( ) gibt an, daß der Organismus gegenüber dem bezeichneten Antibiotikum resistent ist.
- Die Empfindlichkeit einer Anzahl von anaeroben Bakterien wurde ebenfalls nach einem Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt. Testorganismen wurden aus 24- bis 48-stündigen Kulturen auf Hackfleisch-Brühe (Chopped Meat Broth, Scott Laboratories, Fiskeville, Rhode Island) oder aus Waschflüssigkeiten von Schokolade-Agar-Schrägkulturen gewonnen. Diese Schrägkulturen wurden hergestellt, indem man Hämoglobin in einer Konzentration von 1 % zu Protease #3-Agar (Difco) gab. Das Wachstum wurde von den Schrägkulturen mit Hirn-Herz-Infusionsbrühe (Brain Heart Infusion Broth, BBL Microbiology Systems) ausgewaschen und auf eine Dichte von 1 x 10&sup8; CFU/ml verdünnt. Das Trifluoracetatsalz von EM5587 wurde im entsprechenden Verdünnungsmittel in einer Konzentration von 1000 µg/ml gelöst. Zweifach-Verdünnungen wurden in Hefe-Rinder-Brühe (Yeast Beef Broth, Difco) in einem Bereich von 1000 µg/ml hergestellt. Eine 1,5 ml-Probe der einzelnen Verdünnungen wurde jeweils in einzelne Petri-Schalen, die mit 13,5 ml DST-Agar (Oxoid USA, Inc., Red Branch Road, Columbia, Maryland) mit einem Gehalt an 5 % lysiertem Schafsblut und mit 0,5 µg/ml Vitamin K gegeben. Die endgültige Wirkstoffkonzentration im Agar lag im Bereich von 100 µg/ml bis 0,05 µg/ml. Platten zur Kontrolle des Mikroorganismenwachstums, die nur Agar enthielten, wurden hergestellt und vor und nach den Testplatten beimpft. Die Organismen wurden auf die Oberfläche der einzelnen Platten mit einem Denley Multipoint Inoculator (der etwa 0,001 ml der einzelnen Organismen abgibt) aufgebracht, wobei sich eine endgültige Inoculum-Konzentration von 10&sup5; CFU auf der Agar-Oberfläche ergab. Die Platten wurden 18 Stunden bei 37ºC in einer anaeroben Kammer (Forma Scientific, Marietta, Ohio) inkubiert, und die MIC-Werte wurden sodann ermittelt. Der MIC-Wert ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums, die das Wachstum des Mikroorganismus hemmt. Nachstehend sind die Ergebnisse der Agar-Verdünnungstests zusammengestellt. Organismus Clostridium difficile Clostridium perfringens Clostridium histolyticum Clostridium septicum Peptococcus variabilis Peptostreptococcus anaerobius Propionibacterium acnes Eubacterium lentum Bifidobacterium dentium Hemophilus vaginalis Fusobacterium necrophorum Bacteroides fragilis Bacteroides thetaiotaomicron
Claims (4)
1. Pharmazeutisch verträgliches Salz von EM5587; wobei
das Trifluoracetatsalz von EM5587 folgende annähernde
Elementaranalyse ergibt: C 50,01, H 6,92, N 13,98 und F 7,4, das in
Fig. 1 gezeigte UV-Spektrum aufweist, das in Fig. 2 gezeigte
IR-Spektrum aufweist, das in Fig. 3 gezeigte Massenspektrum
aufweist, das in Fig. 4 gezeigte 67,5 MHz-¹³ C NMR-Spektrum
aufweist und das in Fig. 5 gezeigte 400 MHz ¹H-NMR-Spektrum
aufweist.
2. Verfahren zur Herstellung eines Salzes von EM5587
gemäß Anspruch 1, umfassend die Züchtung von Lysobacter sp.
SC 14,067 A.T.C.C. Nr. 53042 in einem Kulturmedium mit einem
Gehalt an assimilierbaren Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen
und die anschließende Gewinnung von EM5587 aus dem Medium in
Form eines Salzes.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Organismus bei
etwa 25ºC gezüchtet wird.
4. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus
Lysobacter sp. SC 53042, wobei diese Kultur in der Lage ist, EM5587
gemäß Anspruch 1 in einer gewinnbaren Menge bei Fermentation
in einem wässrigen Nährmedium mit einem Gehalt an
assimilierbaren Quellen für Stickstoff und Kohlenhydraten zu bilden.
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