DE102004053407A1 - Acylierte Nonadepsipeptide II - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Nonadepsipeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere bakteriellen Infektionskrankheiten.

Description

• Die Erfindung betrifft Nonadepsipeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere bakteriellen Infektionskrankheiten.
• Die bakterielle Zellwand wird durch eine Reihe von Enzymen synthetisiert (Zellwandbiosynthese) und ist essentiell für das Überleben bzw. die Vermehrung von Mikroorganismen. Die Struktur dieses Makromoleküls ebenso wie die an ihrer Synthese beteiligten Proteine sind innerhalb der Bakterien stark konserviert. Aufgrund ihrer essentiellen Natur und Einheitlichkeit ist die Zellwandbiosynthese ein idealer Angriffspunkt für neue Antibiotika (D.W.Green, The bacterial cell wall as a source of antibacterial targets, Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 1 – 19).
• Vancomycin und Penicilline sind Inhibitoren der bakteriellen Zellwandbiosynthese und stellen erfolgreiche Beispiele für die antibiotische Potenz dieses Wirkprinzips dar. Sie werden seit mehreren Jahrzehnten in der Klinik zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, vor allem mit Grampositiven Erregern eingesetzt. Durch das wachsende Auftreten von resistenten Keimen, z.B. Methicillin-resistenten Staphylokokken, Penicillin-resistenten Pneumokokken und Vancomycinresistenten Enterokokken (F. Baquero, Gram-positive resistance: challenge for the development of new antibiotics, J. Antimicrob. Chemother., 1997, 39, Suppl A:1 – 6; A.P. Johnson, D.M. Livermore, G.S. Tillotson, Antimicrobial susceptibility of Gram-positive bacteria: what's current, what's anticipated ?, J. Hosp. Infect., 2001, (49), Suppl A: 3 – 11) sowie jüngst auch erstmals Vancomycinresistenten Staphylokokken (B. Goldrick, First reported case of VRSA in the United States, Am. J. Nurs., 2002, 102, 17) verlieren diese Substanzen zunehmend ihre therapeutische Wirksamkeit.
• Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Klasse von Zellwandbiosynthese-Inhibitoren ohne Kreuzresistenzen zu bekannten Antibiotika-Klassen.
• Der Naturstoff Lysobactin und einige Derivate sind als antibakteriell wirksam beschrieben in US 4,754,018 . Die Isolierung und antibakterielle Wirksamkeit von Lysobactin ist auch in EP-A-196 042 und JP 01132600 beschrieben.
• Die antibakterielle Wirkung von Lysobactin und Katanosin A wird weiterhin beschrieben in O'Sullivan, J. et al., J. Antibiot. 1988, 41, 1740 – 1744, Bonner, D. P. et al., J. Antibiot. 1988, 41, 1745 – 1751, Shoji, J. et al., J. Antibiot. 1988, 41, 713 – 718 und Tymiak, A. A. et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 1149 – 1157.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, alternative Verbindungen mit vergleichbarer oder verbesserter antibakterieller Wirkung, besserer Verträglichkeit, z. B. geringerer Nephrotoxizität, und besserer Verteilung im Körper, d. h. besseren pharmakokinetischen Eigenschaften, wie z. B. Erhöhung der freien Fraktion (f_u), zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
• Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

  

  in welcher
  R¹ Wasserstoff bedeutet und
  R² 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl, 2,2-Dimethylpent-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet,
  oder
  R¹ Trifluormethyl bedeutet und
  R² 2,2-Dimethylprop-1-yl, 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl, 2,2-Dimethylpent-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet,
  und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
• Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs handelt.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
• Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung sämtliche tautomere Formen.
• Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können oder Mischsalze.
• Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
• Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
• Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
• Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
  R¹ Wasserstoff bedeutet und
  R² 2,2-Dimethylbut-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet,
  oder
  R¹ Trifluormethyl bedeutet und
  R² 2,2-Dimethylprop-1-yl, 2,2-Dimethylbut-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet,
  und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
• Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
  R¹ Wasserstoff bedeutet und
  R² 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet,
  und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
• Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
  R¹ Wasserstoff bedeutet und
  R² 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl, 2,2-Dimethylpent-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet.
• Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formeln (I), wobei die Verbindung der Formel

  

  mit Verbindungen der Formel

  

  in welcher
  R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben, und
  X¹ Halogen, bevorzugt Brom, Chlor oder Fluor, oder Hydroxy bedeutet,
  umgesetzt werden.
• Falls X¹ für Halogen steht, erfolgt die Umsetzung im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C bis 50°C bei Normaldruck.
• Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Pyridin, Dioxan oder Dimethylformamid, bevorzugt ist Methylenchlorid oder Dimethylformamid.
• Als inerte Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid bevorzugt.
• Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, bevorzugt ist Diisopropylethylamin.
• Falls X¹ für Hydroxy steht, erfolgt die Umsetzung im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C bis 50°C bei Normaldruck.
• Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.
• Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N,N'-Diethyl-, N,N,'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxy-carbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.
• Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.
• Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt.
• Die Verbindungen der Formel (III) tragen gegebenenfalls Schutzgruppen, so dass sich in diesen Fällen der Umsetzung der Verbindung der Formel (II) mit Verbindungen der Formel (III) eine Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure nach dem Fachmann bekannten Methoden an schließt.
• Die Verbindung der Formel (II) lässt sich durch doppelten Edmann-Abbau aus Lysobactin (Beispiel 1A) synthetisieren, wie im experimentellen Teil unter Beispiel 2A beschrieben.
• Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren.
• Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch folgendes Syntheseschema verdeutlicht werden. Syntheseschema:

  
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches und pharmakokinetisches Wirkspektrum. Sie zeigen eine antibakterielle Wirkung.
• Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine geringere Nephrotoxizität gegenüber Lysobactin aus.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine bessere Pharmakokinetik gegenüber Lysobactin aus. Sie zeigen bei gleicher oder verbesserter pharmakologischer Wirkung eine bessere Verteilung im Körper, was eine geringere therapeutische Dosis sowie ein breiteres therapeutisches Behandlungsfenster zur Folge hat.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine höhere freie Fraktion (f_u) im Plasma als Lysobactin.
• Die beschriebenen Nonadepsipeptide wirken als Inhibitoren der bakteriellen Zellwandbiosynthese.
• Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Zubereitungen gegen Bakterien und bakterienähnliche Mikroorganismen. Sie sind daher besonders gut zur Prophylaxe und Chemotherapie von lokalen und systemischen Infektionen in der Human- und Tiermedizin geeignet, die durch diese Erreger hervorgerufen werden.
• Grundsätzlich können die erfindungsgemäßen Zubereitungen gegen alle Bakterien und bakterienähnlichen Mikroorganismen verwendet werden, die im Besitz einer bakteriellen Zellwand (Murein sacculus) bzw. den dazugehörigen Enzymsystemen sind, beispielsweise durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger:
  Gram-negative Kokken (Neisseria gonorrhoeae) sowie Gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter (C. freundii, C. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans), Hafnia, Serratia (S. marcescens), Providencia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter, Branhamella und Chlamydia. Darüber hinaus umfasst das antibakterielle Spektrum strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner Mykobakterien, z.B. M. tuberculosus. Besonders ausgeprägte Wirkung zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen gegen Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. carnosus), Enterokokken (E. faecalis, E. faecium) und Streptokokken (S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes).
• Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzufassen. Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:
  Infektionskrankheiten beim Menschen wie z.B. unkomplizierte und komplizierte Harnwegsinfekte, unkomplizierte Haut- und Oberflächeninfektionen, komplizierte Haut- und Weichteilinfektionen, im Hospital und ambulant erworbene Lungenentzündung, nosokomiale Pneumonien, akute Exa zerbationen und sekundäre bakterielle Infektionen der chronischen Bronchitis, akute Otitis media, akute Sinusitis, streptokokkale Pharyngitis, bakterielle Meningitis, unkomplizierte gonokokkale und nicht-gonokokkale Urethritis/Cervizitis, akute Prostatitis, Endocarditis, unkomplizierte und komplizierte intra-abdominale Infektionen, gynäkologische Infektionen, pelvische Entzündungskrankheit, bakterielle Vaginose, akute und chronische Osteomyelitis, akute bakterielle Arthritis, empirische Therapie in febrilen neutropenischen Patienten, desweiteren Bakterämien, MRSA Infektionen, akute infektiöse Diarrhoe, Helicobacter pylori Infektionen, postoperative Infektionen, odontogene Infektionen, ophthalmologische Infektionen, postoperative Infektionen (inkl. periproktaler Abszess, Wundinfektionen, Galleninfektionen, Mastitis und akute Appendizitis), zystische Fibrose und Bronchiectasis.
• Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:
  Schwein: Diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Agalaktiae-Syndrom, Mastitis;
  Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Genitalinfektionen;
  Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;
  Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;
  Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): E. coli-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.
• Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsia, Yersinia, erweitert.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere von bakteriellen Infektionskrankheiten.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor ge nannten Erkrankungen.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
• Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung von bakteriellen Erkrankungen geeignet sind.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arrneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Bevorzugte Kombinationswirkstoffe sind antibakteriell wirkende Verbindungen, die ein anderes Wirkspektrum, insbesondere ergänzendes Wirkspektrum, haben und/oder synergistisch zu den erfindungsgemäßen Verbindungen sind.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
• Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
• Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
• Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
• Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augen-präparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arrneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
• Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei intravenöser Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen, und bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 50 mg/kg, vorzugsweise 0.5 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
• Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
• Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
• A. Beispiele
• Abkürzungen

• Allg.

  Allgemein(e)

  Area

  (Peak)fläche

  ber.

  berechnet

  BHI

  Brain Heart Infusion

  Boc

  tert-Butyloxycarbonyl

  br.

  breites Signal (bei NMR-Spektren)

  Bsp.

  Beispiel

  d

  Dublett (bei NMR-Spektren)

  DC

  Dünnschichtchromatographie

  DCI

  direkte chemische Ionisation (bei MS)

  DCM

  Dichlormethan

  DIEA

  N,N-Diisopropylethylamin

  DMAP

  4-N,N-Dimethylaminopyridin

  DMSO

  Dimethylsulfoxid

  DMF

  N,N-Dimethylformamid

  d. Th.

  der Theorie

  EDC

  1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (auch EDCI)

  EDC × HCl

  1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide-hydrochlorid

  EE

  Ethylacetat (Essigsäureethylester)

  EI

  Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)

  ESI

  Elektrospray-Ionisation (bei MS)

  Fp.

  Schmelzpunkt

  gef.

  gefunden

  ges.

  gesättigt

  h

  Stunde

  HATU

  O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat

  HOBt

  1-Hydroxybenzotriazol

  HPLC

  Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

  HR

  High Resolution (Hochauflösung)

  i. V.

  im Vakuum

  konz.

  Konzentriert

  LC-MS

  Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie

  LDA

  Lithium-Diisopropylamid

  m

  middle (mittel) (bei UV- und IR-Spektren)

  m

  Multiplett (bei NMR-Spektren)

  MALDI

  Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

  MHK

  Minimale Hemmkonzentration

  min

  Minute/Minuten

  MRSA

  Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus

  MS

  Massenspektroskopie

  NCCLS

  National Committee for Clinical Laboratory Standards

  neg.

  negativ

  NMM

  N-Methylmorpholin

  NMR

  Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance)

  p.a.

  pro analysi

  Pd

  Palladium

  Pd-C

  Palladium auf Kohle

  pos.

  positiv

  proz.

  Prozentig

  PTFE

  Polytetrafluorethylen

  quant.

  quantitativ

  RP-HPLC

  Reverse Phase HPLC

  RT

  Raumtemperatur

  R_t

  Retentionszeit (bei HPLC)

  s

  strong (stark) (bei UV- und IR-Spektren)

  s

  Singulett (bei NMR-Spektren)

  TBTU

  O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Tetrafluoroborat

  TCTU

  O-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Tetrafluoroborat

  TFA

  Trifluoressigsäure

  TFE

  2,2,2-Trifluorethanol

  THF

  Tetrahydrofuran

  TOF

  Flugzeit (time of flight)

  UV

  Ultraviolett

  Vis

  sichtbar (visible)

  VRSA

  Vancomycin-resistenter Stapylococcus aureus

  w

  weak (schwach) (bei UV- und IR-Spektren)

  wässr.

  wässrige(r)

  Z, Cbz

  Benzyloxycarbonyl

• Literatur
• Zur Nomenklatur der Peptide und Cyclodepsipeptide vergleiche:
• 1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientific publications.
• 2. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219, 345 – 373. Sowie zitierte Literatur.
• Allgemeine Methoden GC-MS, LC-MS, HR-MS, HPLC und Gelchromatographie
• Methode 1 (TOF-HR-MS): TOF-HR-MS-ESI+ Spektren werden mit einem Micromass LCT Gerät (Kapillarspannung: 3.2 KV, Cone-Spannung: 42 V, Quellentemperatur: 120°C, Desolvations-Temperatur: 280°C) aufgenommen. Hierzu wird eine Spritzenpumpe (Fa. Harvard Apparatus) für die Probenzuführung verwendet. Als Standart dient Leucin-Enkephalin (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu).
• Methode 2 (präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV-Detektor 210 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Waters Symmetry-Prep^TM C₁₈, 7 μm, 300 × 19 mm; Eluent A: 0.2% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril; Flussrate: 25 ml/min; Säulentemperatur RT; 0 min 20% B, Rampe 0 – 10 min 70% B, Rampe 10 – 10.1 min 20% B, 15 min 20% B.
• Methode 3 (Gelchromatographie an Sephadex LH-20): Gelchromatographie wird ohne Druck an Sephadex LH-20 (Fa. Pharmacia) durchgeführt. Es wird nach UV-Aktivität (UV Detektor für 254 nm, Fa. Knauer) fraktioniert (Fraktionssammler ISCO Foxy 200). Säulendimensionen: 32 × 7 cm (1000-100 μmol Maßstab); 30 × 4 cm (100-10 μmol Maßstaab); 25 × 2 cm (10-1 μmol Maßstaab).
• Methode 4 (präparative HPLC; Kromasil, Essigsäure): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV Detektor 210 nm; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-100A C₁₈, 5 μm; 250 × 20 mm; Fluss: 25 ml/min; Eluent A: Wasser/0.25 – 0.5% Essigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 3 min 5% B, 3 – 30 min 5 – 100% B, 30 – 38 min 100% B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule.
• Methode 5 (LC-MS): Instrument: Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 208 – 400 nm.
• Methode 6 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 7 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 8 (analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD 1100 Series; Säule: Kromasil C₁₈, 60 × 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: Wasser/0.5% Perchlorsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 0.5 min 2%B, 0.5 – 4.5 min 2 – 90%B, 4.5 – 9.0 min 90%B, 9.0 – 9.2 min 90 – 2%B, 9.2 – 10.0 min 2%B; Fluss: 0.75 ml/min, Ofen: 30°C, UV-Detektion 210 nm.
• Methode 9 (analytische HPLC, Lybquick, Agilent Zorbax C₈): Gerät: Agilent 1100 mit DAD (G1315B), binärer Pumpe (G1312A), Autosampler (G1313A), Lösemittel-Entgaser (G1379A) und Säulenthermostat (G1316A); Säule: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6 × 150 × 5 mm; Eluent A: 0.05% 70%ige Perchlorsäure in Wasser; Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 1 min 10%B, Rampe, 4 – 5 min 90%B, Rampe, 5.5 min 10%B; Fluss: 2.00 ml/min; Säulentemperatur: 30°C.
• Methode 10 (Gelchromatographie an Sephadex LH-20): Gelchromatographie wird ohne Druck an Sephadex LH-20 (Fa. Pharmacia) durchgeführt. Es wird nach UV-Aktivität (UV Detektor für 254 nm, Fa. Knauer) fraktioniert (Fraktionssammler ISCO Foxy 200). Säulendimensionen: 32 × 7 cm (1000-100 μmol Maßstab); 30 × 4 cm (100-10 μmol Maßstab); 25 × 2 cm (10-1 μmol Maßstab).
• Methode 11 (präparative HPLC Symmetry): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: SymmetryPrep^TMC₁₈, Fa. Waters, 7 μm; 300 mm × 19 mm; Eluent A: Wasser/0.2% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 10 min 15 – 65%B, anschließend Regenera tion der Chromatographiesäule; Fluss: 25 ml/min; UV-Detektion 210 nm.
• Methode 12 (präparative HPLC Kromasil): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil C₁₈, 5 μm, 100 Å, 250 × 20 mm; Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoressigsäure in Acetonitril; Gradient: 0 – 3 min 10%B; Rampe, 30 – 38 min 90%B, 38 – 45 min 10%B; Fluss: 20 ml/min; UV-Detektion 210 nm.
• Methode 13 (präparative HPLC Waters Symmetry): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Waters Symmetry-Prep^TM C₁₈, 7 μm, 300 × 19 mm; Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoressigsäure in Acetonitril; Gradient: 0 – 3 min 10%B, Rampe, 30 – 38 min 90%B, 38 – 45 min 10%B; Fluss: 20 ml/min; UV-Detektion 210 nm.
• Methode 14 (präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Waters Symmetry-Prep^TM C₁₈, 7 μm, 300 × 19 mm; Eluent A: Wasser/0.2% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 10 min 25 – 65%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 25 ml/min; UV-Detektion 210 nm.
• Methode 15 (Chirale HPLC Daicel Chiralpak): Gilson Abimed HPLC; Säule: Daicel Chiralpak AD-H 5 μm; 250 × 20 mm; Eluent A: iso-Hexan, Eluent B: 0.2% Essigsäure/1% Wasser/2-Propanol; isokratisch; Fluss: 15 ml/min; UV-Detektor 212 nm.
• Methode 16 (präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: YMC ODS-AQ 5 μm, 250 × 30 mm; Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoressigsäure in Acetonitril; Gradient: 0 – 3 min 10%B, Rampe, 30 – 38 min 90%B, 38 – 45 min 10%B; Fluss: 50 ml/min; UV-Detektor 210 nm.
• Methode 17 (GC-MS): Instrument: Micromass GCT, GC6890; Säule: Restek RTX-35MS, 30 m × 250 μm × 0.25 μm; Gradient: 60°C (0.30 min halten), 50°C/min → 120°C, 16°C/min → 250°C, 30°C/min → 300°C (1.7 min halten); konstanter Fluss mit Helium: 0.88 ml/min; Ofen: 60°C; Inlet: 250°C.
• Methode 18 (HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD Säule: Zorbax Eclipse XBD-C8 (Agilent), 150 mm × 4.6 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HClO₄/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 1 min 10%B, 1 – 4 min 10 – 90%B, 4 – 5 min 90%B; Fluss: 2.0 ml/min; Ofen: 30°C; UV-Detektion: 210 und 254 nm.
• Methode 19 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 60 mm × 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HClO₄/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 9 min 90%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 30°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 20 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm × 4 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HClO₄/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 5%B, 10 min 95%B; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 21 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm × 4 mm, 5 μm; Eluent A: 2 ml HClO₄/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Isokratisch: 45%B, 55%A; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 22 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Grom-Sil 120 ODS-4 HE 50 × 2 mm, 3.0 μm; Eluent A: Wasser/0.025% Ameisensäure/1, Eluent B: Acetonitril/0.025% Ameisensäure; Gradient: 0 – 2.9 min 0 – 70%B, 2.9 – 3.1 min 70 – 90%B, 3.1 – 4.5 min 70 – 90%B; Ofen: 50°C, Fluss: 0.8 ml/min, UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 23 (HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD 1100 Series; Säule Symmetry-Prep^TM C₁₈, Firma Waters, 50 × 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: Wasser/0.05% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 – 9 min 0 – 100%B, 9 – 11 min 100%B, 11 – 12 min 100-0%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Ofen: 40°C, Fluss: 0.4 ml/min, UV-Detektion: 210 nm.
• Ausgangsverbindungen
• Beispiel 1A
• D-Leucyl-N¹-{(3S,6S,12S,15S,18R,21S,24S,27S,28R)-6-[(1S)-2-amino-1-hydroxy-2-oxoethyl]-18-(3-{[amino(imino)methyl]amino}propyl)-12-[(1S)-1-hydroxyethyl]-3-(hydroxymethyl)-24-[(1R)-1-hydroxy-2-methylpropyl]-21-isobutyl-15-[(1S)-1-methylpropyl]-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxo-28-phenyl-1-oxa-4,7,10,13,16,19,22,25-octaazacyclooctacosan-27-yl}-L-leucinamid-bistrifluoracetat (Lysobactin)

  
• Fermentation:
• Kultur Medium:
• YM: Hefe-Malz Agar: D-Glucose (4 g/l), Hefe Extrakt (4 g/l), Malz Extrakt (10 g/l), 1 Liter Lewatit Wasser. Vor dem Sterilisieren (20 Minuten bei 121°C) wird der pH auf 7.2 eingestellt.
• HPM: Mannit (5.4 g/l), Hefe Extrakt (5 g/l), Fleischpepton (3 g/l).
• Arbeitskonserve: Der lyophilisierte Stamm (ATCC 53042) wird in 50 ml YM Medium angezogen.
• Kolbenfermentation: 150 ml YM Medium oder 100 ml HPM Medium in einem 1 l Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Arbeitskonsere beimpft und für 30 – 48 Stunden bei 28°C auf einem Schüttler bei 240 Upm wachsen gelassen.
• 30 l Fermentation: 300 ml der Kolbenfermentation (HPM Medium) werden zum Animpfen einer sterilen 30 l Nährmedienlösung verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1). Diese Kultur wird für 21 Stunden bei 28°C, 300 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 vvm wachsen gelassen. Der pH wird mit 1 M Salzsäure auf pH = 7.2 konstant gehalten. Insgesamt werden während der Kultivierungszeit 880 ml 1 M Salzsäure zugeführt.
• Hauptkultur (200 l): 15 × 150 ml YM Medium in 1 l Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Arbeitskonserve beimpft und bei 28°C für 48 Stunden und 240 Upm auf dem Schüttler wachsen gelassen. 2250 ml dieser Kultur werden zum Beimpfen einer sterilen 200 1 Nährmedienlösung (YM) verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1) und für 18.5 Stunden bei 28°C, 150 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 vvm wachsen gelassen.
• Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufs werden stündlich Proben (50 ml) entnommen. 2 ml dieser Kulturbrühe werden mit 1 ml Methanol (0.5% Trifluoressigsäure) versetzt und über einen 0.45 μm Filter filtriert. 30 μl dieser Suspension werden mittels HPLC analysiert (Methode 18 und Methode 19).
• Nach 18.5 Stunden wird die Kulturbrühe der Hauptkultur bei 17000 Upm in Überstand und Sediment getrennt.
• Isolierung:
• Der Überstand (183 l) wird mit konzentrierter Trifluoressigsäure bzw. Natronlauge auf pH 6.5 – 7 eingestellt und auf eine Lewapolsäule (OC 1064, 60 l Inhalt) aufgetragen. Anschließend wird mit reinem Wasser, Wasser/Methanol 1:1 und anschließend mit reinem Methanol (mit 0.1% Trifluoressigsäure) eluiert. Diese organische Phase wird im Vakuum bis zu einem verbleibenden wässrigen Rest von 11.5 l eingeengt.
• Die verbleibende wässrige Phase wird an Kieselgel C₁₈ gebunden und aufgetrennt (MPLC, Biotage Flash 75, 75 × 30 cm, KP-C18-WP, 15 – 20 μm, Fluss: 30 ml; Eluent: Acetonitril/Wasser mit 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 10%, 15% and 40% Acetonitril). Die 40% Acetonitril Phase, die die Hauptmenge von Beispiel 1A enthält, wird im Vakuum eingeengt und anschließend lyophilisiert (~13 g). Dieses Feststoffgemisch wird in 1.2 g Portionen zunächst an einer präparativen HPLC (Methode 7), anschließend durch Gelfiltration an Sephadex LH-20 (5 × 70 cm, Acetonitril/Wasser 1:1, jeweils mit 0.05% Trifluoressigsäure) und einer weiteren präparativen HPLC (Methode 20) getrennt.
• Dieser Prozess liefert 2250 mg Beispiel 1A.
• Das Sediment wird in 4 l Aceton/Wasser 4:1 aufgenommen, mit 2 kg Celite versetzt, mit Trifluoressigsäure auf pH = 6 eingestellt, ausgerührt und zentrifugiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand gefriergetrocknet. Das erhaltene Lyophilisat (89.9 g) wird in Methanol aufgenommen, abfiltriert, eingeengt und an Kieselgel (Methode 21) getrennt. Beispiel 1A wird danach per Gelfiltration (Sephadex LH-20, 5 × 68 cm, Wasser/Acetonitril 9:1 (mit 0.05% Trifluoressigsäure), Fluss: 2.7 ml/min, Fraktionsgröße 13.5 ml) zur Reinsubstanz aufgereinigt.
• Dieser Prozess liefert 447 mg Beispiel 1A.
  HPLC (Methode 18): R_t = 6.19 min
  MS (ESIpos): m/z = 1277 (M+H)^{+
  1}H NMR (500.13 MHz, d₆-DMSO): δ = 0.75 (d, 3H), 0.78 (d, 6H), 0.80 (t, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.91 (d, 3H), 0.92 (d, 3H), 0.95 (d, 3H), 0.96 (d, 3H), 1.05 (m, 1H), 1.19 (d, 3H), 1.25 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.55 (m, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.65 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.86 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.75 (m, 2H), 3.40 (m, 1H), 3.52 (m, 2H), 3.53 (dd, 1H), 3.64 (m, 2H), 3.66 (m, 1H), 3.68 (dd, 1H), 3.73 (m, 2H), 4.00 (dd, 1H), 4.02 (br., 1H), 4.13 (br., 1H), 4.32 (dd, 1H), 4.39 (t, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.75 (dd, 1H), 5.19 (t, 1H), 5.29 (d, 1H), 5.30 (br., 1H), 5.58 (m, 2H), 6.68 (m, 3H), 6.89 (d, 1H), 6.93 (m, 3H), 6.94 (br., 1H), 6.98 (d, 1H), 7.12 (br., 1H), 7.20 (br., 2H), 7.23 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 8.32 (br., 1H), 9.18 (br., 1H), 9.20 (m, 2H), 9.50 (br., 1H).
  ¹³C-NMR (125.77 MHz, d₆-DMSO): δ = 10.3, 15.3, 19.0, 19.2, 19.6, 20.0, 20.9, 22.0, 22.4, 23.0, 23.2, 24.3, 24.4, 25.0, 25.4, 26.0, 27.8, 30.9, 35.4, 39.5, 40.8, 40.9, 41.6, 44.1, 51.5, 52.7, 55.9, 56.2, 56.4, 57.9, 58.8, 60.2, 61.1, 62.6, 70.1, 71.6, 71.7, 75.5, 128.1, 128.6, 136.7, 156.8, 168.2, 170.1, 170.4, 171.2, 171.5, 171.9, 172.2, 172.4, 173.7.
• Die Zuordnung der Signale erfolgte nach der in der Literatur beschriebenen Zuordnung (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui, J. Antibiot., 1988, 61, 719 – 725).
• Beispiel 2A
• Des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat (Edman^2.0-Abbauprodukt)

  
• Lysobactin-bistrifluoracetat (60.0 g, 39.88 mmol) wird unter Argonatmosphäre in Pyridin (840 ml) gelöst. Dann wird Phenylisothiocyanat (32.35 g, 239.28 mmol, 6 Äquivalente) zugegeben und die Reaktionsmischung bei 37°C für 7 h gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 40°C Badtemperatur abdestilliert. Der Rückstand wird mit Methyl-tert-butylether (1400 ml) versetzt und 30 min kräftig gerührt. Dann wird über eine Glasfritte (Porenweite 3, 13 cm Durchmesser) abgesaugt. Das Zwischenprodukt (Edman^0.5-Abbauprodukt) wird in einer Rohausbeute von 72 g isoliert und ohne Aufarbeitung weiter umgesetzt.
• Dazu wird das Rohprodukt unter Argonatmosphäre in Trifluoressigsäure (1026 ml) gelöst und 30 min bei RT gerührt. Dann wird die Lösung am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 20°C Badtemperatur eingeengt. Der Rückstand wird in Methyl-tert-butylether (1400 ml) aufgenommen und so lange kräftig gerührt, bis ein pulvriger amorpher Feststoff entstanden ist. Dieser wird mit Vakuum über eine Fritte (Porenweite 3, 18 cm Durchmesser) abfiltriert. Der Feststoff wird nun mit Diethylether (1400 ml) gerührt und erneut abfiltriert. Dieselbe Prozedur wird mit 2 Portionen Dichlormethan (je 900 ml) wiederholt. Man erhält 58 g rohes Des(1-D-leucyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat (Edman^1.0-Abbauprodukt).
• Das Rohprodukt wird ohne weitere Aufreinigung unter Argonatmosphäre in Pyridin (1080 ml) gelöst. Dann wird Phenylisothiocyanat (107 g, 0.80 mol, 20 Äquivalente) zugegeben und die Reaktionsmischung wird bei 37 bis 40°C für 7 h gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 40°C Badtemperatur abdestilliert. Der Rückstand wird mit Methyl-tert-butylether (1400 ml) versetzt und kräftig gerührt. Dann wird über eine Glasfritte (Porenweite 3, 13 cm Durchmesser) abgesaugt. Das Zwischenprodukt (Edman^1.5-Abbauprodukt) wird in einer Rohausbeute von 65 g isoliert und direkt unter Argonatmosphäre in Trifluoressigsäure (1240 ml) gelöst und 30 min bei RT gerührt. Dann wird die Lösung am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 20°C Badtemperatur eingeengt. Der Rückstand wird in Methyl-tert-butylether (1400 ml) aufgenommen und so lange kräftig gerührt, bis ein pulvriger amorpher Feststoff entstanden ist. Dieser wird mit Vakuum über eine Fritte (Porenweite 3, 18 cm Durchmesser) abfiltriert. Der Feststoff wird nun zunächst mit Diethylether (1400 ml), dann mit Dichlormethan (1400 ml) gerührt und jeweils abfiltriert. Man erhält 55 g des rohen Produktes. Dieses wird durch präparative HPLC (Methode 14) gereinigt. Man erhält 28.55 g (56% d. Th.) der Titelverbindung.
  HPLC/UV-Vis (Methode 23): R_t = 4.71 min,
  λ_max (qualitativ) = 220 nm (s), 255 – 270 (w).
  LC-MS (Methode 22): R_t = 1.65 min;
  MS (ESIpos.): m/z (%) = 526 (100) [M + 2H]²⁺, 1051 (15) [M + H]⁺.
• Beispiel 3A
• (2Z)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-acrylsäuremethylester

  
• 6-Trifluormethyl-pyridin-3-carbaldehyde (4.85 g, 27.70 mmol) und Methyl-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}(dimethoxyphosphoryl)acetat (9.17 g, 27.70 mmol, 1.0 Äquivalente) werden in THF (70 ml) gelöst und auf –70°C gekühlt. Bei –70°C wird N,N,N,N-Tetramethylguanidin (6.38 g, 55.39 mmol, 6.95 ml, 2.0 Äquivalente) langsam zugetropft und dann 4 h bei –70°C, anschließend 12 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt, dann wird mit Ethylacetat (2 × 100 ml) gegen Wasser ausgeschüttelt, die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen im Vakuum wird das Rohprodukt chromatographiert (Kieselgel, Eluent: Toluol, dann Toluol/Ethylacetat 10:1). Es werden 6.93 g (66% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 4.60 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 4.54 min.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 3.74 (s, 3H, OMe), 5.10 (s, 2H, CH₂), 7.27 (s, 1H, PyrH), 7.33-7.38 (m, 5H, ArH), 7.94 (d, J=8.5 Hz, 1H, PyrH), 8.27 (d, J=8.5 Hz, 1H, PyrH), 8.93 (s, 1H, β-CH), 9.51 (s, 1H, NH).
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.44 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 381 (100) [M + H]⁺; MS (ESIneg.): m/z (%) = 379 (100) [M – H]^–.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₁₈H₁₆N₂O₄F₃ [M + H]⁺ ber. 381.1062, gef. 381.1065.
• Beispiel 4A
• N-[(Benzyloxy)carbonyl]-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alanin-methylester

  
• Die Verbindung aus Beispiel 3A (10.15 g, 26.69 mmol) wird in Methanol p.a. (100 ml) gelöst. Mit einer Kanüle wird etwa 5 min Argon hindurchgeleitet, dann wird (+)-1,2-Bis-[(2S,5S)diethylphospholano]benzen(cyclooctadien)rhodium(I)-Triflat (289 mg, 400 μmol, 0.015 Äquivalente) zugegeben. Es wird über 12 h bei 4 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert. Dann wird es über Kieselgur filtriert (Methanol) und das Eluat eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographiert (Kieselgel, Eluent: Toluol/Ethylacetat 5:1). Es werden 9.9 g (97% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
  [α]²⁰ _Na = –24° (c = 0.093 in Methanol).
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 4.50 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 4.49 min.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 2.99 (dd, J=3.5, 11.0 Hz, 1H, β-CH), 3.22 (dd, J=3.5, 11.0 Hz, 1H, β-CH), 3.66 (s, 3H, OMe), 4.40 (m, 1H, α-CH), 4.97 (s, 2H, CH₂), 7.23 (m, 2H), 7.29-7.33 (m, 3H), 7.83 (d, J=6.5 Hz, 1H), 7.93-7.98 (m, 2H), 8.65 (s, 1H, NH).
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.40 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 383 (100) [M + H]⁺; MS (ESIneg.): m/z (%) = 273 (100), 381 (50) [M – H]^–.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₁₈H₁₈N₂O₄F₃ [M + H]⁺ ber. 383.1219, gef. 383.1223.
• Beispiel 5A
• 3-(6-Trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alanin-methylester

  
• Die Verbindung aus Beispiel 4A (9.90 g, 25.89 mmol) wird in Methanol (100 ml) gelöst. Mit einer Kanüle wird etwa 5 min Argon hindurchgeleitet, dann wird Pd auf Kohle (10%, 990 mg) zugegeben. Es wird über 12 h bei 4 bar Wasserstoffdruck und RT hydriert. Dann wird über Kieselgur filtriert, eingeengt und unter hoch Vakuum getrocknet. Ausbeute: 5.8 g (90% d. Th.) der Titelverbindung.
  [α]^19.9 _Na = +3° (c = 0.186 in Methanol).
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 3.34 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 3.22 min.
  IR ν_max (NaCl, cm^–1): 3415, 1734, 1339, 1136, 1087.
  ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 2.85 (dd, J=5.5, 13.5 Hz, 1H, β-CH), 3.01 (dd, J=5.5, 13.5 Hz, 1H, β-CH), 3.61 (s, 3H, OMe), 3.63-3.69 (m, 1H, α-CH), 7.82 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.93 (d, J=7.5 Hz, 1H), 8.61 (s, 1H).
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.74 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 249 (100) [M + H]⁺.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₁₂H₁₅N₃O₂F₃ [M + CH₃CN + H]⁺ ber. 290.1116, gef. 290.1122.
• Beispiel 6A
• N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(tert-butyl)-D-alanyl-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alaninmethylester

  
• Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 5A (6.34 g, 25.54 mmol) und N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-tert-butyl-D-alanin (6.27 g, 25.54 mmol, 1.0 Äquivalente) in trockenem DMF (240 ml) werden bei –30°C langsam N-Methylmorpholin (12.92 g, 127.72 mmol, 14.04 ml, 5 Äquivalente) und HATU (9.71 g, 25.54 mmol, 1 Äquivalente) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 3 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 9) beobachtet wird. Kaliumdihydrogenphosphat (34.76 g, 255.44 mmol, 10 Äquivalente) wird zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 20 min gerührt, anschließend wird es filtriert, mit Ethylacetat verdünnt und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (10 ml) gewaschen. Die organische Phase wird mittels Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels Flash-chromatographie (Kieselgel, Gradient Cyclohexan/Ethylacetat 10:1 bis 2:1) aufgereinigt, wobei man 9.74 g (73% d. Th.) der Titelverbindung erhält.
  [α]^19.9 _Na = +7.0° (c = 0.044 in Methanol).
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 4.89 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 4.75 min.
  IR ν_max (NaCl, cm^–1): 2959, 1742, 1655, 1520, 1336, 1160, 1136, 1087, 1050, 1027.
  ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 0.74 (s, 9H, tBu), 0.97-1.00 (m, 1H, β-CH2), 1.20-1.25 (m, 1H, β-CH2), 1.35 (s, 9H, OtBu), 2.99-3.05 (m, 1H, β-CH2), 3.23-3.26 (m, 1H, β-CH2), 3.66 (s, 3H, OMe), 3.94 (m, 1H, α-CH), 4.60 (m, 1H, α-CH), 6.82 (d, J=8.5 Hz, 1H, NH), 7.78 (d, J=8.0 Hz, 1H, PyrH), 7.94 (d, J=8.0 Hz, 1H, PyrH), 8.34 (d, J=8.5 Hz, 1H, NH), 8.64 (s, 1H, PyrH).
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.67 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 476 (100), [M + H]⁺; MS (ESIneg.): m/z (%) = 400 (80), 474 (40) [M – H]^–.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₂₂H₃₃N₃O₅F₃ [M + H]⁺ ber. 476.2372, gef. 476.2364.
• Beispiel 7A
• N-tert-Butoxycarbonyl-3-tert-butyl-D-alanyl-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alanin

  
• Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 6A (9.2 g, 1.0 Äquivalente, 19.35 mmol) in THF (360 ml) und Wasser (100 ml) wird bei –20°C eine Lösung von Lithiumhydroxid-hydrat (1.16 g, 2.5 Äquivalente, 48.37 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich (ca. 1.5 h) auf +15°C, wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 9) beobachtet wird. Zur Aufarbeitung wird Kaliumdihydrogenphosphat (26.33 g, 10 Äquivalente, 193.5 mmol) zugegeben (~ pH 7). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Das Rohprodukt wird mittels Gelchromatographie (Methode 10, Laufmittel Methanol/Aceton 4:1) aufgereinigt, wobei man 4.72 g (53% d. Th.) Produkt erhält.
  [α]²⁰ _Na = +51.3° (c = 0.402 in Methanol).
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 4.63 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 4.55 min.
  IR ν_max (NaCl, cm^–1): 3305, 2959, 1663, 1519, 1336, 1173, 1134, 1086.
  ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 0.77 (s, 9H, tBu), 1.06-1.13 (m, 1H, β-CH2), 1.23-1.26 (m, 1H, β-CH2), 1.34 (s, 9H, OtBu), 3.01 (t_app, J=11.0 Hz, 1H, β-CH2), 3.23 (br d, J=11.0 Hz, 1H, β-CH2), 3.94 (t, J=8.0 Hz, 1H, α-CH), 4.42 (br s, 1H, α-CH), 6.90 (d, J=8.5 Hz, 1H, NH), 7.74 (d, J=7.5 Hz, 1H, PyrH), 7.86 (d, J=7.5 Hz, 1H, PyrH), 8.00 (br s, 1H, NH), 8.56 (s, 1H, PyrH).
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.42 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 406 (100), 462 (85) [M + H]⁺; MS (ESIneg.): m/z (%) = 460 (100) [M – H]^–.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₂₁H₃₁N₃O₅F₃ [M + H]⁺ ber. 462.2216, gef. 462.2203.
• Beispiel 8A
• N-tert-Butoxycarbonyl-3-tert-butyl-D-alanyl-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alanyldes(1-D-leucyl-2-L-leucyl)lysobactin-trifluoracetat

  
• Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 2A (7.00 g, 1.0 Äquivalente, 5.48 mmol) und Beispiel 7A (3.03 g, 1.2 Äquivalente, 6.57 mmol) in trockenem DMF (119 ml) werden bei –30°C langsam N-Methylmorpholin (2.77 g, 3.01 ml, 5 Äquivalente, 27.38 mmol) und HATU (4.37 g, 2.1 Äquivalente, 11.50 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich langsam (ca. 1 h) auf RT, wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC/UV-Vis (Methode 9) beobachtet wird. Die Reaktion wird mit Kaliumdihydrogenphosphat (7.45 g, 10.0 Äquivalente, 54.76 mmol) gequencht. Das Reaktionsgemisch wird mittels Gelchromatographie (Methode 10, Laufmittel Methanol/Aceton 4:1) aufgereinigt, wobei man 12.63 g (quant.) Produkt erhält.
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 4.78 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 4.35 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.28 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 697 (100) [M + 2H]²⁺, 1493 (15) [M + H]⁺; MS (ESIneg.): m/z (%) = 745 (100) [M – 2H]^2–, 1491 (5) [M – H]^–.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₆₇H₁₀₄N₁₆O₁₉F₃ [M + H]⁺ ber. 1493.7616, gef. 1493.7594.
• Beispiel 9A und Beispiel 10A
• (2S)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)alanin und (2R)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)alanin
• Die Synthese erfolgt nach M. Merget, K. Günther, M. Bernd, E. Günther, R. Tacke, J. Organomet. Chem. 2001 628, 183 – 194. Die Trennung der Enantiomere erfolgt durch präparative HPLC an chiraler Phase (Methode 15).
• Beispiel 9A
• N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-3-trimethylsilylalanin (2S Verbindung)

  
• Präparative HPLC (Methode 15): R_t = 4.16 min
• [α]_D ²⁰ = +1.1 (c = 0.83, Methanol)
• Beispiel 10A
• N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-3-trimethylsilylalanin (2R Verbindung)

  
• Präparative HPLC (Methode 15): R_t = 9.27 min
• [α]_D20 = –1.6 (c = 0.66, Methanol)
• Beispiel 11A
• Methyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-3-(pyridin-3-yl)-L-alaninat

  
• Die Herstellung erfolgt analog B. Neises, W. Steglich, Org. Synth. 1985, 63, 183 – 187. (2S)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(pyridin-3-yl)alanin (25.00 g, 93.88 mmol) wird unter Argon in 300 ml Dichlormethan gelöst. Methanol (11.4 ml, 9.02 g, 281 mmol, 3 Äquivalente) und ein Körnchen DMAP werden hinzugefügt. Dann wird die Mischung auf 0°C gekühlt. EDC (19.80 g, 103 mmol, 1.1 Äquivalente) wird zugesetzt. Nach 5 min. entfernt man das Eisbad und lässt über 1 h bei RT rühren. Dann engt man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit Ethylacetat und schüttelt gegen gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung aus. Die wässrige Phase wird einmal mit Ethylacetat nachextrahiert, dann werden die vereinigten organischen Phasen mit 0.5 M Citronensäure und anschließend nochmals mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Es verbleibt ein klares Öl, das beim Trocknen im Ölpumpenvakuum kristallisiert. Ausbeute: 23.60 g (90% d. Th.).
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 3.28 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.21 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 281 (100) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 1.30 (s, 9H), 2.86 (m, 1H), 3.04 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.22 (m, 1H), 7.28-7.39 (m, 2H), 7.69 (d, 1H), 8.43 (m, 2H).
• Beispiel 12A
• 3-(Pyridin-3-yl)-L-alanin-methylester-bistrifluoracetat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 11A (11.8 g, 42.09 mmol) wird in Trifluoressigsäure in Dichlormethan (160 ml; 30%ige Lösung) gelöst und 30 min. bei RT gerührt. Dann engt man im Vakuum ein. Der Rückstand wird in etwas Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Dann wird das Lyophilisat mit Toluol versetzt und im Vakuum eingeengt. Schließlich wird bis zur Gewichtskonstanz im Ölpumpenvakuum getrocknet. Ausbeute: 17.15 g (quant.).
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 0.88 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 0.46 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 181 (100) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 2.79 (dd, 1H), 2.92 (dd, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.63 (m, 1H), 7.30 (m, 1H), 7.62 (d, 1H), 8.41 (m, 2H).
• Beispiel 13A
• Methyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alaninat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 9A (10.31 g, 39.4 mmol) und die Verbindung aus Beispiel 12A (16.10 g, 39.4 mmol, 1 Äquivalent) werden bei 0°C in DMF (186 ml) gelöst. Dann werden N-Methylmorpholin (17.34 ml, 16.00 g, 4 Äquivalente) und HATU (22.49 g, 59.16 mmol, 1.5 Äquivalente) zugesetzt. Der Ansatz wird zwei Stunden bei RT gerührt. Man versetzt mit tert-Butylmethylether und wäscht mit gesättigter Natriumcarbonatlösung. Die wässrige Phase wird einmal mit tert-Butylmethylether nachextrahiert, dann werden die vereinigten organischen Phasen mit 1 M wässriger Citronensäure sowie abermals mit gesättigter Natriumcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Es wird über Kieselgel filtriert (Cyclohexan/Ethylacetat 2:1). Ausbeute: 14.1 g (84% d. Th.).
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 3.91 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.90 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 424 (100) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ –0.09 (s, 9H), 0.56-0.75 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 2.90 (dd, 1H), 3.09 (dd, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.98 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 6.68 (d, 1H), 7.26 (dd, 1H), 7.61 (m, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.40 (m, 2H).
• Beispiel 14A
• N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanin

  
• Die Verbindung aus Beispiel 13A (7.4 g, 17.56 mmol) wird in THF/Wasser (6:4) aufgenommen, auf 0°C gekühlt und mit Lithiumhydroxid-Monohydrat (1.47 g, 35.13 mmol, 2 Äquivalente) versetzt. Man lässt bei 0°C rühren. Nach einer Stunde wird ein weiteres Äquivalent (0.74 g) Lithiumhydroxid-Monohydrat zugesetzt und eine weitere Stunde gerührt. Man dampft den Großteil des THF im Vakuum ab und stellt dann durch Zusatz von Citronensäure auf pH 4. Ein Feststoff fällt aus. Es wird mit drei Portionen Ethylacetat extrahiert, wobei sich der Feststoff löst. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Gelchromatographie (Methode 3) gereinigt. Ausbeute: 6.67 g (93% d. Th.).
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 3.73 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.68 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 410 (40) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (300 MHz, d₆-DMSO) δ –0.090 (s, 9H), 0.56-0.75 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 2.90 (dd, 1H), 3.09 (dd, 1H), 3.98 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 6.70 (d, 1H), 7.26 (dd, 1H), 7.60 (m, 1H), 8.00 (d, 1H), 8.37 (m, 2H).
• Beispiel 15A
• N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-(trimethylsilyl)-D-alanyl-3-pyridin-3-yl-L-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)-lysobactin-trifluoracetat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 2A (3.00 g, 2.35 mmol) und die Verbindung aus Beispiel 14A (1.44 g, 3.52 mmol, 1.5 Äquivalente) werden in DMF (50 ml) gelöst und auf 0°C gekühlt. Dann werden zunächst 4.7 ml (4.7 mmol, 2 Äquivalente) einer 1 M Lösung von 4-Methylmorpholin in DMF zugegeben. Anschließend wird sofort HATU (1.52 g, 3.99 mmol, 1.7 Äquivalente) zugegeben und 15 min bei 0°C gerührt. Dann werden weitere 4.7 ml (4.7 mmol, 2 Äquivalente) der 1 M Lösung von 4-Methylmorpholin in DMF zugetropft. Der Ansatz wird dann 2 h bei RT gerührt. Das Rohprodukt wird gelchromatographiert (Methode 3). Das Produkt wird ohne Feinreinigung weiter umgesetzt. Ausbeute: 3.6 g (82% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.90 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.00 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 721.8 (100) [M + 2H]²⁺; 1442.1 (5) [M + H)⁺.
• Beispiel 16A
• 2,2-Dimethyl-1-butanal

  
• 2,2-Dimethyl-1-butanol (4.0 g, 39 mmol) wird in Dichlormethan (136 ml) gelöst und mit Aluminiumoxid (7.98 g, 78 mmol, 2 Äquivalente) und mit Pyridiniumchlorochromat (16.88 g, 78 mmol, 2 Äquivalente) versetzt. Der Ansatz wird bei RT 1 h gerührt und dann über eine Schicht Kieselgel filtriert. Das Filtrat wird vorsichtig eingeengt, und der Rückstand wird bei Normaldruck destilliert (Siedepunkt: 102°C (990 mbar)). Ausbeute: 2.97 g (75% d. Th.).
  GC-MS (Methode 17): R_t = 2.21 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 99.9 (5) [M]⁺;
  ¹H NMR (400 MHz, CDCL₃) δ 0.83 (t, 3H), 1.03 (s, 6H), 1.51 (q, 2H), 9.42 (s, 1H).
• Beispiel 17A
• Methyl-(2Z-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4,4-dimethylhex-2-enoat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 16A (2.55 g, 25.46 mmol) und Methyl-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}(dimethoxyphosphoryl)-acetat (8.43 g, 25.46 mmol) werden in 50 ml THF gelöst und auf 0°C gekühlt. N,N,N',N'-Tetramethylguanidin wird zugetropft, dann wird erst 15 min. bei 0°C und anschließend 5 Tage bei RT gerührt. Der Ansatz wird mit etwa 20 g Kieselgel versetzt, eingeengt und chromatographiert (Biotage 40M, ZIF-SIM, Cyclohexan/Ethylacetat 87:13). Ausbeute: 1.20 g (13% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.71 min.
  MS (DCI): m/z (%) = 323.3 (100) [M + NH₄].
  ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.83 (m, 3H), 1.13 (s, 6H), 1.49 (q, 2H), 3.75 (br s, 3H), 5.72 (br s, 1H), 6.58 (br s, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.36 (m, 5H).
• Beispiel 18A
• Methyl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-4,4-dimethyl-D-norleucinat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 17A (1.2 g, Rohprodukt, 3.26 mmol) wird in Ethanol p.a. (60 ml) gelöst. Mit einer Kanüle wird etwa 5 min Argon hindurchgeleitet, dann wird (+)-1,2-Bis-[(2R,SR)diethylphospholano]benzen(cyclooctadien)rhodium(I)-Triflat (28 mg, 0.04 mmol, 0.012 Äquivalente) zugegeben und im Ultraschallbad gelöst. Es wird über 24 h bei 3 bar Wasserstoff-druck und RT hydriert. Der Ansatz wird eingeengt und chromatographiert (Biotage 25M, Cyclohexan/Ethylacetat 9:1). Ausbeute: 920 mg (92% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 4.96 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.76 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 308 (25) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.80 (t, 3H), 0.86 (s, 6H), 1.29 (q, 2H), 1.41 (dd, 1H), 1.73 (dd, 1H), 3.72 (s, 3H), 4.40 (m, 1H), 5.02 (d, 1H), 5.11 (m, 2H), 7.35 (m, 5H).
• Beispiel 19A
• N-[(Benzyloxy)carbonyl]-4,4-dimethyl-D-norleucin

  
• In THF (12 ml) wird die Verbindung aus Beispiel 18A (915 mg, 2.98 mmol) gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt, dann werden 3.7 ml (7.4 mmol, 2.5 Äquivalente) einer 2 M Lösung von Lithiumhydroxid-Monohydrat in Wasser zugegeben und 1 h kräftig gerührt. Anschließend wird Citronensäure (1 M) bis zur sauren Reaktion zugetropft und das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und chromatographiert (Methode 16). Ausbeute: 434 mg (50% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 4.54 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.44 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 294 (20) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0.80 (t, 3H), 0.83 (s, 6H), 1.21 (q, 2H), 1.53 (dd, 1H), 1.60 (dd, 1H), 3.99 (m, 1H), 5.02 (s, 2H), 7.35 (m, 5H), 7.58 (d, 2H), 12.52 (br s, 1H).
• Beispiel 20A
• Methyl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-4,4-dimethyl-D-norleucyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alaninat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 19A (430 mg, 1.47 mmol) und die Verbindung aus Beispiel 12A (809 mg, 1.47 mmol, 1 Äquivalent) werden bei 0°C in DMF (5 ml) gelöst, dann werden 4-Methylmorpholin (644 μl, 5.86 mmol, 4 Äquivalente) und HATU (836 mg, 2.20 mmol, 1.5 Äquivalente) zugesetzt. Der Ansatz wird drei Stunden bei RT gerührt. Man versetzt mit Ethylacetat und wäscht mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung. Die wässrige Phase wird einmal mit Ethylacetat extrahiert, dann werden die vereinigten organischen Phasen mit 1 M wässriger Citronensäure sowie abermals mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird chromatographiert (Methode 16). Ausbeute: 496 mg (74% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.94 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.85 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 456 (100) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (300 MHz, d₆-DMSO) δ 0.80 (m, 9H), 1.10 (m, 3H), 1.30 (dd, 1H), 2.91 (dd, 1H), 3.12 (dd, 1H), 3.30 (s, 3H), 4.02 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 5.01 (d, 1H), 5.06 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.30 (m, 5H), 7.63 (m, 1H), 8.40 (m, 2H).
• Beispiel 21A
• N-[(Benzyloxy)carbonyl]-4,4-dimethyl-D-norleucyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanin

  
• In THF (5 ml) wird die Verbindung aus Beispiel 20A (490 mg, 1.08 mmol) gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt, dann werden 1.35 ml (2.7 mmol, 2.5 Äquivalente) einer 2 M Lösung von Lithiumhydroxid-Monohydrat in Wasser zugegeben und 1 h kräftig gerührt. Dann wird Citronensäure (1 M in Wasser) bis zur sauren Reaktion zugetropft und das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ausbeute: 484 mg (quant.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.76 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.88 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 442 (100) [M + H]⁺.
  ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0.70 (m, 9H), 1.14 (m, 3H), 1.30 (dd, 1H), 2.64 (d, 1H), 2.75 (d, 1H), 2.89 (dd, 1H), 3.11 (dd, 1H), 4.03 (m, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.98 (d, 1H), 5.05 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.30 (m, 5H), 7.61 (m, 1H), 8.40 (m, 2H).
• Beispiel 22A
• N-[(Benzyloxy)carbonyl]-4,4-dimethyl-D-norleucyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)-lysobactin-trifluoracetat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 2A (0.28 g, 0.22 mmol) und die Verbindung aus Beispiel 21A (148 mg, 0.33 mmol, 1.5 Äquivalente) werden in DMF (4 ml) gelöst und auf 0°C gekühlt. Dann werden zunächst 0.47 ml (0.44 mmol, 2 Äquivalente) einer 1 M Lösung von N-Methylmorpholin in DMF zugegeben. Anschließend wird sofort HATU (141 mg, 0.37 mmol, 1.7 Äquivalente) zugegeben und 15 min bei 0°C gerührt. Dann werden weitere 0.44 ml (0.47 mmol, 2 Äquivalente) der 1 M Lösung von 4-Methylmorpholin in DMF zugetropft. Der Ansatz wird dann über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wird an Sephadex LH 20 gereinigt (Methode 3). Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC (Methode 13) aufgereinigt. Ausbeute: 149 mg (43% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.93 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 2.13 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 737.4 (100) [M + 2H]²⁺, 1473 (2) [M + H]⁺.
• Ausführungsbeispiele
• Beispiel 1
• 3-tert-Butyl-D-alanyl-3-(6-trifluormethyl-pyridin-3-yl)-L-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)lysobactin-bistrifluoracetat

  
• Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 8A (10.3 g, 1.0 Äquivalente, 4.48 mmol, Rohprodukt) in Dichlormethan (150 ml) wird bei RT langsam Trifluoressigsäure (150 ml) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt (10 min), wobei vollständiger Umsatz mittels HPLC (Methode 9) beobachtet wird. Das Reaktionsgemisch wird einrotiert und mittels präparativer HPLC (Methode 11) aufgereinigt, wobei man 3.48 g (48% d. Th.) Produkt erhält.
  HPLC/UV-Vis (Methode 8): R_t = 4.03 min.
  HPLC/UV-Vis (Methode 9): R_t = 3.64 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.69 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 697 (100) [M + 2H]²⁺, 1393 (5) [M + H]⁺; MS (ESIneg.): m/z (%) = 695 (100) [M – 2H]^2–, 1391 (20) [M – H]^–.
  ¹⁹F-NMR (400 MHz, d₅-Pyridin) δ –67 (Ar-CF₃), –74 (CF₃COOH), –132 (1,4-Dibromtetrafluorbenzol als Referenz). Gehalt TFA: 14.3 Gew.-%.
  HR-MS (Methode 1): C₆₂H₉₆N₁₆O₁₇F₃ [M + H]⁺ ber. 1393.7091, gef. 1393.7119.
• Beispiel 2
• 3-(Trimethylsilyl)-D-alanyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 15A (9.12 g, 4.93 mmol, Rohprodukt) wird in Trifluoressigsäure in Dichlormethan (65 ml; 30%ige Lösung) aufgenommen. Der Ansatz wird bei RT für 20 min gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert. Der Rückstand wird im Ölpumpenvakuum getrocknet und dann chromatographisch gereinigt (Methode 14). Ausbeute: 5.54 g (67% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.32 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.41 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 671.7 (100) [M + 2H]²⁺.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₆₀H₉₇N₁₆0₁₇Si [M + H]⁺ ber. 1341.6987, gef. 1341.7019.
  ¹H NMR (500 MHz, d₅-Pyridin) δ –0.09 (s, 9H), 0.70 (d, 3H), 1.00 (d, 3H), 1.04-1.05 (m, 9H), 1.22 (d, 3H), 1.32-1.68 (m, 7H), 2.01-2.49 (m, 7H), 3.19 (br s, 1H), 3.37 (br s, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.93 (d, 1H), 4.08 (m, 1H), 4.22-4.77 (m, 9H), 4.87 (d, 1H), 5,16 (m, 1H), 5.25 (m, 1H), 5.36 (m, 1H), 5.45 (m, 1H), 6.07 (d, 1H), 6.44 (m, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.32 (m, 1H), 7.46 (d, 1H), 7.51-7.85 (m, 7H), 7.98 (d, 1H), 8.20 (m, 3H), 8.42 (s, 1H), 8.65-8.91 (m, 3H), 9.23 (br s, 1H), 9.80 (br s, 1H), 11.04 (br s, 1H), 11.35 (br s, 1H).
• Beispiel 4
• 4,4-Dimethyl-D-norleucyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 22A (149 mg, 0.09 mmol) wird in Methanol/enthaltend 0.05% Trifluoressigsäure (10 ml) gelöst. Palladium auf Aktivkohle (10%ig; 20 mg) wird zugegeben, dann wird insgesamt 2.5 h bei RT und Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Das Rohprodukt wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt (Methode 13). Ausbeute: 68 mg (46% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.29 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.49 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 671.0 (100) [M + 2H]²⁺, 1340 (5) [M + H]⁺.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₆₂H₉₈N₁₆O₁₇ [M + H]⁺ ber. 1339.7369, gef. 1339.7368.
• Beispiel 4
• 4,4-Dimethyl-D-norleucyl-3-(pyridin-3-yl)-t-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat

  
• Die Verbindung aus Beispiel 22A (149 mg, 0.09 mmol) wird in Methanol/enthaltend 0.05% Trifluoressigsäure (10 ml) gelöst. Palladium auf Aktivkohle (10%ig; 20 mg) wird zugegeben, dann wird insgesamt 2.5 h bei RT und Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Das Rohprodukt wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt (Methode 13). Ausbeute: 68 mg (46% d. Th.).
  HPLC (Methode 9): R_t = 3.29 min.
  LC-MS (Methode 7): R_t = 1.49 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 671.0 (100) [M + 2H]²⁺, 1340 (5) [M + H]⁺.
  HR-TOF-MS (Methode 1): C₆₂H₉₈N₁₆O₁₇ [M + H]⁺ ber. 1339.7369, gef. 1339.7368.
• Beispiel 5 (Vergleichsbeispiel)
• 3-tert-Butyl-D-alanyl-3-(pyridin-3-yl)-L-alanyl-des(1-D-leucyl-2-L-leucyl)lysobactin-tristrifluoracetat

  
• B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
• Die in vitro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:
• Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK):
• Die MHK wird im Flüssigdilutionstest gemäß der NCCLS-Richtlinien bestimmt. Übernachtkulturen von Staphylococcus aureus 133, Entercococcus faecalis 27159, E. faecium 4147 und Streptococcus pneumoniae G9a werden mit den beschriebenen Testsubstanzen in einer 1:2 Verdünnungsreihe inkubiert. Die MHK-Bestimmung wird mit einer Zellzahl von 10⁵ Keimen pro 1 ml in Isosensitest-Medium (Fa. Difco, Irvine/USA) durchgeführt, mit Ausnahme von S. pneumoniae, der in BHI-Bouillon (Fa. Difco, Irvine/USA) mit 10% Rinderserum bei einer Zellzahl von 10⁶ Keimen pro ml getestet wird. Die Kulturen werden bei 37°C für 18 – 24 Stunden inkubiert, S. pneumoniae in Gegenwart von 10% CO₂.
• Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert. Die MHK-Werte werden in μg/ml angegeben.
• Repräsentative in-vitro-Wirkdaten und f_u-Daten für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle A wiedergegeben: Tabelle A

  
• Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann im folgenden Tiermodell gezeigt werden:
• Systemische Infektion mit Staphylococcus aureus 133:
• Zellen von S. aureus 133 werden über Nacht in BHI-Bouillon (Fa. Oxoid, New York/USA) angezüchtet. Die Übernachtkultur wird 1:100 in frische BHI-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden inkubiert. Die dann in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Zellen werden abzentrifugiert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird photometrisch eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension 1:1 mit einer 10%igen Mucinlösung gemischt. Von dieser Infektionslösung werden 0.25 ml/20 g Maus intraperitoneal (entsprechend 1 × 10⁶ Keimen/Maus) appliziert. Die Therapie erfolgt intraperitoneal oder intravenös 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFW1-Mäuse verwendet. Das Überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert.
• Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen im Hinblick auf die Nierenverträglichkeit können im folgenden Tiermodell gezeigt werden:
• Maus-Modell zur Bestimmung nephrotoxischer Effekte:
• Nephrotoxische Nebenwirkungen der Nonadepsipeptide werden durch histopathologische Untersuchungen der Nieren in Mäusen nach mehrfacher Gabe einer bestimmten Dosierung analysiert. Dafür werden 5-6 Tiere täglich entweder intravenös (i.v.) oder intraperitoneal (i.p.) mit Substanzen behandelt, die in wässriger Lösung oder unter Zusatz von Solutol gelöst werden. Nierentoxische Effekte werden durch lichtmikroskopische Auswertung Hämatoxilin und Eosin (H&E) gefärbter Paraffinschnitte der Nieren bestimmt. Eine 'Periodic-Acid Schiff' (PAS)-Reaktion wird wahlweise zur besseren Darstellung von Glykoproteinen durchgeführt. Nephrotoxische Effekte werden semi-quantitativ für jedes Tier als Schweregrade der auftretenden tubulären Basophilie und Degeneration/Regeneration festgelegt (Schweregrade: 0 = kein Effekt; 1 = minimaler Effekt; 2 = leichter Effekt; 3 = moderater Effekt; 4 = schwere Läsionen). Der durchschnittliche Schweregrad der tubulären Degeneration/Regeneration sowie die Inzidenz (Anzahl der betroffenen Tiere) wird pro Tiergruppe oder Derivat berechnet. Darüber hinausgehende Nierenveränderungen wie tubuläre Dilatation sowie Nekrosen und Ansammlung nekrotischen Materials werden ebenfalls aufgeführt.
• Prinzip der Bestimmung der freien Fraktion via Transil:
• Die hier beschriebene Methode zur Bestimmung der freien Fraktion (f_u) einer Prüfsubstanz gliedert sich in 2 Teile:
• a) Bestimmung des Transil^®/Puffer-Verteilungsverhältnisses (MA_buffer) durch Inkubation der Prüfsubstanz in einer Transil^®-Puffer (pH 7.4)-Dispersion und anschließende Bestimmung der Konzentration in der Dispersion und im Puffer-Überstand.
• b) Bestimmung des Transil^®/Plasma-Verteilungsverhältnisses (MA_plasma) durch Inkubation der Prüfsubstanz in einer Transil^®-Plasma-Dispersion und anschließende Bestimmung der Konzentration in der Dispersion und im Plasma.
• Der Quotient der beiden Verteilungsverhältnisse ergibt f_u.
• Bei hochproteingebundenen Substanzen wird das Plasma in der Regel mit isotonischem Phosphatpuffer (pH 7.4) verdünnt und anschließend mit Transil^® suspendiert. Die Bestimmung von f_u' (freie Fraktion in verdünntem Plasma) in dieser verdünnten Proteinlösung erfolgt analog zur Bestimmung von f_u. Die freie Fraktion in unverdünntem Plasma wird aus f_u' und dem Verdünnungsfaktor berechnet.
• Vergleich zu dieser Methode auch: Schuhmacher, Joachim; Kohlsdorfer, Christian; Buehner, Klaus; Brandenburger, Tim; Kruk, Renate, "High-throughput determination of the free fraction of drugs strongly bound to plasma proteins." Journal of Pharmaceutical Sciences 2004, 93, 816 – 830.
• Bestimmung der Membranaffinität einer Prüfsubstanz nach Verteilung zwischen Transil^® und Puffer (MA_buffer):
• Alle Inkubationen werden in geeigneten Glasgefäßen, z. B. Glasvials, Schliffreagenzgläsern, durchgeführt. In der Regel beträgt das Gesamtvolumen 0.5 – 5 ml, das Transil^® Volumen 10 – 100 μl. Im Falle von hohen erwarteten Membranaffinitäten kann die Transil^® Dispersion mit Phosphatpuffer pH 7.4 z.B. Dulbeccos PBS bis zu 20fach verdünnt werden. Phosphatpuffer pH 7.4 wird in die Inkubationsgefäße vorgelegt und das Transil^® nach gründlichem Mischen zupipettiert. Die Prüfsubstanz wird in einer Konzentration von z.B. 200 ng/ml, n = 6, zupipettiert. Der Anteil an organischem Lösungsmittel sollte ≤ 2% sein. Die Ansätze werden 30 min bei Raumtemperatur z.B. auf einem Mini-Shaker im Winkel von ca. 45° bei ca. 400 UPM inkubiert. Zur Bestimmung des 100% Wertes wird mindestens ein Aliquot von z.B. 100 μl entnommen, der restliche Ansatz wird ca. 10 min bei ca. 1800 g zentrifugiert. Von jeder Probe werden mindestens 2 Aliquote (z.B. 100 μl) des Überstandes für die Konzentrationsbestimmung entnommen.
• Bestimmung von MA_plasma in unverdünntem oder verdünntem Plasma:
• Das Gesamtinkubationsvolumen und das zugesetzte Transil^® Volumen hängen von der erwarteten freien Fraktion ab. In der Regel beträgt das Gesamtvolumen 0.5 – 1 ml, das Transil^® Volumen 10 – 100 μl. Im Falle von sehr niedrigen freien Fraktionen wird das Plasma der zu untersuchenden Spezies mit isotonischer Pufferlösung, pH 7.4 z.B. 10 – 400fach verdünnt und anschließend mit Transil^® versetzt. Das weitere Vorgehen erfolgt wie oben für die Bestimmung der MA_buffer Werte beschrieben.
• Prinzip der Bestimmung der freien Fraktion via Ultrafiltration:
• Das Plasma der zu untersuchenden Spezies wird über eine semipermeable Membran filtriert. Die Substanzkonzentration im Filtrat wird gemessen und daraus die freie Fraktion f_U berechnet. Das Centrifree micropartition system von Millipore/Amicon wird verwendet. Die Ultrafiltrationsmembranen haben eine Ausschlussgröße von 30 000 Da. Die Substanz wird zu 1 ml Plasma in einer Konzentration von ca. 1 μg/ml zudotiert. Der Lösungsmittelanteil sollte < 2 % sein. Nach 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird das Plasma in das Ultrafiltrationssystem pipettiert und 10 Minuten bei 1800 g zentrifugiert. Die Substanzkonzentration im Ultrafiltrat (C_u; ungebundene Substanzkonzentration) und im Plasma vor der Zentrifugation (C; Gesamtsubstanzkonzentration) wird gemessen. Die freie Fraktion errechnet sich nach der Formel: f_u (%) = C_u/C·100.
• C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
• Tablette:
• Zusammensetzung:
• 100 mg der Verbindung von Beispiel 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
• Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
• Herstellung:
• Die Mischung aus Wirkstoff, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
• Oral applizierbare Suspension:
• Zusammensetzung:
• 1000 mg der Verbindung von Beispiel 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel (Xanthan gum der Fa. FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
• Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
• Herstellung:
• Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, der Wirkstoff wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6h gerührt.
• Intravenös applizierbare Lösung:
• Zusammensetzung:
• 100 – 200 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.
• Herstellung:
• Die Verbindung von Beispiel 1 wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.

Claims (10)

1. Verbindung der Formel

   

   in welcher R¹ Wasserstoff bedeutet und R² 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl, 2,2-Dimethylpent-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet, oder R¹ Trifluormethyl bedeutet und R² 2,2-Dimethylprop-1-yl, 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl, 2,2-Dimethylpent-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ Wasserstoff bedeutet und R² 2,2-Dimethylbut-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet, oder R¹ Trifluormethyl bedeutet und R² 2,2-Dimethylprop-1-yl, 2,2-Dimethylbut-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet.
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ Wasserstoff bedeutet und R² 2,2-Dimethylbut-1-yl, 2-Ethyl-2-methylbut-1-yl, 2,2-Diethyl-but-1-yl oder Trimethylsilylmethyl bedeutet.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel

   

   mit einer Verbindung der Formel

   

   in welcher R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und X¹ Halogen, bevorzugt Brom, Chlor oder Fluor, oder Hydroxy bedeutet, umgesetzt wird.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
6. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
7. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen.
8. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kombination mit einem inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
9. Arzneimittel nach Anspruch 8 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen.
10. Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren durch Verabreichung einer antibakteriell wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Arzneimittels nach Anspruch 8 oder eines nach Anspruch 6 oder 7 erhaltenen Arzneimittels.