DE102004018405A1 - Antibakterielle Amid-Makrozyklen II - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft antibakterielle Amid-Makrozyklen und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.

Description

• Die Erfindung betrifft antibakterielle Amid-Makrozyklen und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
• In WO 03/106480 und WO 04/012816 werden antibakteriell wirkende Makrozyklen vom Biphenomycin B Typ mit Amid- bzw. Estersubstituenten beschrieben.
• In US 3,452,136 , Dissertation R. U. Meyer, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Dissertation V. Leitenberger, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Synthesis (1992), (10), 1025-30, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (1992), (1), 123-30, J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1991), (10), 744, Synthesis (1991), (5), 409-13, J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1991), (5), 275-7, J. Antibiot. (1985), 38(11), 1462-8, J. Antibiot. (1985), 38(11), 1453-61, wird der Naturstoff Biphenomycin B als antibakteriell wirksam beschrieben. Teilschritte der Synthese von Biphenomycin B werden in Synlett (2003), 4, 522-526 beschrieben.
• Chirality (1995), 7(4), 181-92, J. Antibiot. (1991), 44(6), 674-7, J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7323-7, J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7328-33, J. Org. Chem. (1987), 52(24), 5435-7, Anal. Biochem. (1987), 165(1), 108-13, J. Org. Chem. (1985), 50(8), 1341-2, J. Antibiot. (1993), 46(3), C-2, J. Antibiot. (1993), 46(1), 135-40, Synthesis (1992), (12), 1248-54, Appl. Environ. Microbiol. (1992), 58(12), 3879-82, J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1992), (13), 951-3 beschreiben einen strukturell verwandten Naturstoff, Biphenomycin A, der am Makrozyklus eine weitere Substitution mit einer Hydroxygruppe aufweist.
• Die Naturstoffe entsprechen hinsichtlich ihrer Eigenschaften nicht den Anforderungen, die an antibakterielle Arzneimittel gestellt werden. Auf dem Markt sind zwar strukturell andersartige antibakteriell wirkende Mittel vorhanden, es kann aber regelmäßig zu einer Resistenzentwicklung kommen. Neue Mittel für eine gute und wirksamere Therapie sind daher wünschenswert.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative Verbindungen mit gleicher oder verbesserter antibakterieller Wirkung zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
• Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

  

  in welcher
  R¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
  R² gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
  R³ gleich C₁-C₆-Alkyl bedeutet,
  wobei Alkyl substituiert ist mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl und C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl,
  worin Alkylaminocarbonyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxycarbonyl, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl und Aminocarbonyl,
  und
  wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem oder zwei weiteren Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl, Aminocarbonyl, Guanidino und Hydroxy substituiertes Phenyl,
  oder
  R³ gleich eine Gruppe der Formel

  

  ist
  und
  R⁴ gleich Wasserstoff ist
  oder
  R³ und R⁴ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Gruppe der Formel

  

  bilden,
  und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
• Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, nachfolgend als Ausführungsbeispiel(e) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
• Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.
• Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
• Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäu re, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
• Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
• Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
• Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
  Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkylaminocarbonyl und Alkoxycarbonyl stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
• Alkylaminocarbonyl steht für einen Alkylaminocarbonylrest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylaminocarbonyl, Ethylaminocarbonyl, n-Propylaminocarbonyl, Isopropylaminocarbonyl, tert-Butylaminocarbonyl, n-Pentylaminocarbonyl, n-Hexylaminocarbonyl, N,N-Dimethylaminocarbonyl, N,N-Diethylaminocarbonyl, N-Ethyl-N-methylaminocarbonyl, N-Methyl-N-n-propylaminocarbonyl, N-Isopropyl-N-n-propylaminocarbonyl, N-tert-Butyl-N-methylaminocarbonyl, N-Ethyl-N-n-pentylaminocarbonyl und N-n-Hexyl-N-methylaminocarbonyl. C₁-C₃-Alkylaminocarbonyl steht beispielsweise für einen Monoalkylaminocarbonylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminocarbonylrest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.
• Alkoxycarbonyl steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.
• Ein Symbol * an einer Bindung bedeutet die Verknüpfungsstelle im Molekül.
• Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
  R¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
  R² gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
  R³ gleich C₂-C₄-Alkyl bedeutet,
  wobei Alkyl substituiert ist mit einem Substituenten Aminocarbonyl und einem weiteren Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend Aminocarbonyl und Guanidino,
  oder
  wobei Alkyl substituiert ist mit einem Substituenten Hydroxycarbonyl und einem weiteren Substituenten Hydroxy,
  und
  R⁴ gleich Wasserstoff ist,
  und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
• Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei nach Verfahren
• [A] Verbindungen der Formel
  
  worin R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben und boc gleich tert-Butoxycarbonyl ist, in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel HNR³R⁴ (III),worin R³ und R⁴ die oben angegebene Bedeutung haben, und anschließend mit einer Säure umgesetzt werden, oder
• [B] Verbindungen der Formel
  
  worin R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben und Z gleich Benzyloxycarbonyl ist, in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel HNR³R⁴ (III), worin R³ und R⁴ die oben angegebene Bedeutung haben, und anschließend mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden.
• Die freie Base der Salze kann zum Beispiel durch Chromatographie an einer Reversed Phase Säule mit einem Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz einer Base erhalten werden, insbesondere durch Verwendung einer RP18 Phenomenex Luna C18(2) Säule und Diethylamin als Base.
• Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Solvate nach Anspruch 1, bei dem Salze der Verbindungen oder Solvate der Salze der Verbindungen durch Chromatographie unter Zusatz einer Base in die Verbindungen überführt werden.
• Die Hydroxygruppe an R¹ ist gegebenenfalls während der Umsetzung mit Verbindungen der Formel (III) mit einer tert-Butyldimethylsilyl-Gruppe geschützt, die im zweiten Reaktionsschritt abgespalten wird.
• Reaktive Funktionalitäten in dem Rest R³ von Verbindungen der Formel (III) werden bereits geschützt mit in die Synthese eingebracht, bevorzugt sind säurelabile Schutzgruppen (z.B. boc). Nach erfolgter Umsetzung zu Verbindungen der Formel (I) können die Schutzgruppen durch Entschützungsreaktion abgespalten werden. Dies geschieht nach Standardverfahren der Schutzgruppenchemie. Bevorzugt sind Entschützungsreaktionen unter sauren Bedingungen oder durch Hydrogenolyse.
• Die Umsetzung der ersten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert.-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N';N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N;N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluoro-phosphat (BOP), oder Mischungen aus diesen, oder Mischung aus diesen zusammen mit Basen.
• Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.
• Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethylamin, durchgeführt.
• Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, oder Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dimethylformamid.
• Die Umsetzung mit einer Säure in der zweiten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Als Säuren eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Essigsäure oder Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.
• Die Hydrogenolyse in der zweiten Stufe des Verfahrens [B] erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel in Gegenwart von Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder iso-Propanol, in einem Gemisch mit Wasser und Eisessig, bevorzugt ist ein Gemisch aus Ethanol, Wasser und Eisessig.
• Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren hergestellt werden.
• Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

  

  worin R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben,
  mit Di-(tert-butyl)-dicarbonat in Gegenwart einer Base umgesetzt werden.
• Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen wie DBU, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat. Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder 1,2-Dichlorethan, Alkohole wie Methanol, Ethanol oder iso-Propanol, oder Wasser.
• Vorzugsweise wird die Umsetzung mit Natriumhydroxid in Wasser oder Natriumcarbonat in Methanol durchgeführt.
• Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

  

  worin R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben, und
  R⁵ gleich Benzyl, Methyl oder Ethyl ist,
  mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse, wie für die zweite Stufe des Verfahrens [B] beschrieben, gegebenenfalls durch anschließende Umsetzung mit einer Base zur Verseifung des Methyl- oder Ethylesters, umgesetzt werden.
• Die Verseifung kann zum Beispiel erfolgen, wie bei der Umsetzung von Verbindungen der Formel (VI) zu Verbindungen der Formel (IV) beschrieben.
• Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem in Verbindungen der Formel (VI) der Benzyl-, Methyl- oder Ethylester verseift wird.
• Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid, bevorzugt ist Lithiumhydroxid.
• Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösungsmittel oder Gemische der Lösungsmittel mit Wasser einzusetzen. Besonders bevorzugt sind Tetrahydrofuran oder ein Gemisch aus Methanol und Wasser.
• Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

  

  worin R¹, R² und R⁵ die oben angegebene Bedeutung haben,
  in der ersten Stufe mit Säuren, wie für die zweite Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, und in der zweiten Stufe mit Basen umgesetzt werden.
• In der zweiten Stufe erfolgt die Umsetzung mit Basen im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen wie DBU, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Triethylamin.
• Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Chloroform, Methylenchlorid oder 1,2-Dichlorethan, oder Tetrahydrofuran, oder Gemische der Lösungsmittel, bevorzugt ist Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran.
• Die Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

  

  worin R¹, R² und R⁵ die oben angegebene Bedeutung haben,
  mit Pentafluorphenol in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.
• Die Umsetzung erfolgt bevorzugt mit DMAP und EDC in Dichlormethan in einem Temperaturbereich von –40°C bis 40°C bei Normaldruck.
• Die Verbindungen der Formel (VIII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

  

  worin R¹, R² und R⁵ die oben angegebene Bedeutung haben,
  mit Fluorid, insbesondere mit Tetrabutylammoniumfluorid, umgesetzt werden.
• Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –10°C bis 30°C bei Normaldruck.
• Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, oder Kohlenwasserstoffe wie Benzol oder Toluol, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Bevorzugte Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran und Dimethylformamid.
• Die Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

  

  worin R² und R⁵ die oben angegebene Bedeutung haben,
  mit Verbindungen der Formel

  

  worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat,
  in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.
• Die Verbindungen der Formel (X) sind bekannt oder können analog den im Beispielteil beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
• Die Verbindungen der Formel (XI) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren hergestellt werden.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches und pharmakokinetisches Wirkspektrum.
• Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen, eingesetzt werden.
• Beispielsweise können lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden, die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger verursacht werden:
  Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (Staph. aureus, Staph. epidermidis) und Streptokokken (Strept. agalactiae, Strept. faecalis, Strept. pneumoniae, Strept. pyogenes); gram-negative Kokken (neisseria gononhoeae) sowie gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Citrobacter (Citrob. freundii, Citrob. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Klebsiellen (Klebs. pneumoniae, Klebs. oxytocy), Enterobacter (Ent. aerogenes, Ent. agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr. marcescens), Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providencia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter. Darüber hinaus umfaßt das antibakterielle Spektrum die Gattung Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia) sowie strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner Mykoplasmen (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum) sowie Mykobakterien, z.B. Mycobacterium tuberculosis.
• Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzufassen. Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen topisch anwendbaren Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:
  Infektionskrankheiten beim Menschen wie z. B. septische Infektionen, Knochen- und Gelenkinfektionen, Hautinfektionen, postoperative Wundinfektionen, Abszesse, Phlegmone, Wundinfektionen, infizierte Verbrennungen, Brandwunden, Infektionen im Mundbereich, Infektionen nach Zahnoperationen, septische Arthritis, Mastitis, Tonsillitis, Genital-Infektionen und Augeninfektionen.
• Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:
  Schwein: Coli-diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Agalaktiae-Syndrom, Mastitis;
  Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Mykoplasmose, Genitalinfektionen;
  Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;
  Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;
  Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): Mycoplasmose, E. coli-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.
• Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsie, Yersinia, erweitert.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von bakteriellen Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
• Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
• Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
• Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
• Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -löungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginal kapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
• Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
• Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg/kg Körpergewicht je 24 h zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 h.
• Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
• Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
• A. Beispiele
• Verwendete Abkürzungen:

abs.

absolut

aq.

wässrig

Bn

Benzyl

boc

tert-Butoxycarbonyl

CDCl₃

Chloroform

CH

Cyclohexan

d

dublett (im ¹H-NMR)

dd

dublett von dublett (im ¹H-NMR)

DCC

Dicyclohexylcarbodiimid

DIC

Diisopropylcarbodiimid

DIEA

Diisopropylethylamin (Hünig-Base)

DMS

O Dimethylsulfoxid

DMAP

4-N,N-Dimethylaminopyridin

DMF

Dimethylformamid

d.Th.

der Theorie

EDC

N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid × HCl

EE

Ethylacetat (Essigsäureethylester)

ESI

Elektrospray-Ionisation (bei MS)

ges.

gesättigt

HATU

O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N;N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat

HBTU

O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N;N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat

HOBt

1-Hydroxy-1H-benzotriazol × H₂O

h

Stunde(n)

HPLC

Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

LC-MS

Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie

m

multiplett (im ¹H-NMR)

min

Minute

MS

Massenspektroskopie

NMR

Kernresonanzspektroskopie

MTBE

Methyl-tert-butylether

Pd/C

Palladium/Kohle

proz.

Prozent

q

quartett (im ¹H-NMR)

R_f

Retentionsindex (bei DC)

RP

Reverse Phase (bei HPLC)

RT

Raumtemperatur

R_t

Retentionszeit (bei HPLC)

s

singulett (im ¹H-NMR)

t

triplett (im ¹H-NMR)

TBS

tert-Butyldimethylsilyl

TFA

Trifluoressigsäure

THF

Tetrahydrofuran

TMSE

2-(Trimethylsilyl)-ethyl

TPTU

2-(2-Oxo-1(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat

Z

Benzyloxycarbonyl

• LC-MS- und HPLC-Methoden:
• Methode 1 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e 50 mm × 4.6 mm; Eluent A: Wasser + 500 μl 50%ige Ameisensäure/l; Eluent B: Acetonitril + 500 μl 50%ige Ameisensäure×1; Gradient: 0.0 min 10%B → 3.0 min 95%B → 4.0 min 95%B; Ofen: 35°C; Fluss: 0.0 min 1.0 ml/min → 3.0 min 3.0 ml/min → 4.0 min 3.0 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 2 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 3 (HPLC): Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm × 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 15 min 90%B; Fluss: 0.75ml/min; Ofen: 30°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 4 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 5 (LC-MS): Instrument: Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 208 – 400 nm.
• Methode 6 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Grom-Sil 120 ODS-4 HE 50 mm × 2 mm, 3.0 μm; Eluent A: Wasser + 500 μl 50%ige Ameisensäure/l, Eluent B: Acetonitril + 500 μl 50%ige Ameisensäure/l; Gradient: 0.0 min 70%B → 4.5 min 90%B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
• Methode 7 (HPLC): Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm × 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 6.5 min 90%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 30°C; UV-Detektion: 210 nm.
• Ausgangsverbindungen
• Beispiel 1A
• 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2-(benzyloxy)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-L-phenylalaninat

  
• Zu einer Lösung von 2.0 g (3.17 mmol) 2(S)-Benzyloxycarbonylamino-3-(2-benzyloxy-5-iodphenyl)-propionsäure-(2-trimethylsilyl)-ethylester (Beispiel 11A aus WO03/106480) in 30 ml DMSO werden 0.923 g (9.5 mmol) Kaliumacetat zugegeben. Die Mischung wird deoxygeniert, indem durch die kräftig gerührte Lösung 15 min lang Argon durchgeleitet wird. Dann werden 0.924 g (3.64 mmol) 4,4,4',4',5,5,5',5'-Octamethyl-2,2'-bi-1,3,2-dioxaborolan und 0.116 g (0.160 mmol, 0.05 Äquivalente) Bis-(diphenylphosphino)ferrocenpalladium(II)chlorid zugegeben. Unter leichtem Argonstrom wird auf 80°C erhitzt und nach 6 h wieder abgekühlt. Die Mischung wird über Silicagel (Laufmittel: Dichlormethan) filtriert. Der Rückstand wird säulenchromatographisch an Silicagel (Laufmittel: Cyclohexan:Ethylacetat 4:1) gereinigt.
  Ausbeute: 1.12 g (56% d. Th.)
  LC-MS (Methode 6): R_t = 4.50 min.
  MS (EI): m/z = 632 [M+H]^{+
  1}H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 0.92 (dd, 2H), 1.31 (s, 12H), 2.95-3.95 (m, 2H), 4.11 (m_c, 2H), 4.55 (11 (m_c, 1H), 4.99 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 5.53 (d, 1H), 6.90 (d, 1H), 7.15-7.47 (m, 10H), 7.58 (d, 1H), 7.67 (dd, 1H).
• Beispiel 2A
• Benzyl-(85,11S,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-11-((2R)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}propyl)-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carboxylat

  
• 200 mg (0.20 mmol) 5,17-Bis-benzyloxy-14(S)-benzyloxycarbonylamino-11(S)-(3-benzyloxycarbonylamino-2(R)-hydroxy-propyl)-10,13-dioxo-9,12-diaza-tricyclo-[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(19),2,4,6(21),16(20),17-hexaen-8(S)-carbonsäurebenzylester (Beispiel 19A aus WO03/106480) werden in 50 ml absolutem DMF gelöst und bei 0°C mit 210 mg (0.79 mmol) Trifluormethansulfonsäure-tert-butyldimethylsilylester, 0.11 ml (0.79 mmol) Triethylamin und 20 mg (0.20 mmol) DMAP versetzt. Es wird 2 d bei RT gerührt. Nach Zugabe von 20 ml Methylenchlorid wäscht man die Lösung vorsichtig mit 10 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 10 ml Wasser. Die organische Phase wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.
  Ausbeute: 215 mg (96% d. Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 3.43 min.
  MS (EI): m/z = 1125 [M+H]⁺
• Beispiel 3A
• (8S,11S,14S)-5,17-Bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-11-((2R)-3-{[(benzyloxy)-carbonyl]amino}-2-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}propyl)-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo-[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure

  
• 210 mg (0.19 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2A werden in 2 ml THF gelöst und mit je 1 ml Wasser und Methanol versetzt. Nach Zugabe von 13 mg (0.56 mmol) Lithiumhydroxid wird 12 h bei RT gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung mit 30 ml Wasser verdünnt und durch Zugabe von 1N Salzsäure auf pH = 3 gestellt. Der Niederschlag wird abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.
  Ausbeute: 192 mg (99% d. Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 3.24 min.
  MS (EI): m/z = 1135 [M+H]⁺
• Beispiel 4A
• (8S,11S,14S)-14-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-11-{(2R)-3-[(tert-butoxy-carbonyl)amino]-2-hydroxypropyl}-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure

  
• 90 mg (0.16 mmol) (8S,11S,14S)-14-Amino-11-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaencarbonsäure-Dihydrotrifluoracetat (Beispiel 120A aus WO03/106480) werden in 2.5 ml Wasser gelöst, mit 85.3 mg (0.8 mmol) Natriumcarbonat versetzt, im Eisbad gekühlt und mit 105.3 mg (0.48 mmol) Di-(tert-butyl)-dicarbonat in 1.2 ml Methanol versetzt. Man lässt über Nacht bei Raumtemperatur rühren, engt im Vakuum auf ein kleines Volumen ein und säuert mit 1N Salzsäure bis pH = 2 an. Der anfallende Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet.
  Ausbeute: 89 mg (73% d.Th.)
  LC-MS (Methode 12): R_t = 1.80 min.
  MS (EI): m/z = 687 [M+H]⁺
• Beispiel 5A
• tert-Butyl {(2R)-3-[(8S,11S,14S)-8-({[(1S)-4-amino-1-(aminocarbonyl)-4-oxobutyl]amino}-carbonyl)-14-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-11-yl]-2-hydroxypropyl}carbamat

  
• Unter Argonatmosphäre werden 20 mg (0.03 mmol) (8S,11S,14S)-14-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-11-{(2R)-3-[(tert-butoxy-carbonyl)amino]-2-hydroxypropyl}-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 4A) und 10.58 mg (0.06 mmol) L-Glutamamid-Hydrochlorid in 1 ml DMF suspendiert, unter Rühren im Eisbad gekühlt und mit 14.4 mg (0.04 mmol) HATU und 5.02 mg (0.04 mmol) Hünig-Base versetzt. Man lässt 30 min bei 0°C reagieren, versetzt mit weiteren 10.04 mg (0.08 mmol) Hünig-Base und lässt alles bei langsamem Temperaturanstieg (RT) über Nacht rühren. Anschließend engt man im Vakuum zur Trockne ein und trennt den Rückstand mittels HPLC (Acetonitril/Wasser).
  Ausbeute: 3 mg (13% d.Th.)
  LC-MS (Methode 4): R_t = 1.90 min.
  MS (EI): m/z = 814 [M+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 5A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 6A bis 11A hergestellt.
• 
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• Beispiel 12A
• N-{[(8S,11S,14S)-14-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-11-{(2R)-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-2-hydroxypropyl}-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-serin

  
• 14 mg (0.02 mmol) der Verbindung aus Beispiel 9A werden in 14 ml Eisessig/Wasser/Ethanol (4/1/1) suspendiert, mit 7 mg Pd/C (10%-ig)-Katalysator versetzt und über Nacht bei Normalbedingungen hydriert. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz ein.
  Ausbeute: 12 mg (quantitativ)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 1.73 min.
  MS (EI): m/z = 774 [M+H]⁺
• Beispiel 13A
• tert-Butyl-{3-[(85,11S,14S)-14-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-8-{[(2-oxazepan-3-yl)amino]carbonyl}-9,12-diazatricyclo-[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-11-yl]-propylcarbamat

  
• Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 5A aus 25 mg (0.04 mmol) (8S,11S,14S)-14-[(tert-Butoxycarbonyl)-amino-11-[3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo- 9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]-henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 83A aus WO03/106480) und 5.86 mg (0.05 mmol) 3-Aminoazepan-2-on mit 17.39 mg (0.05 mmol) HATU und insgesamt 16 mg (0.12 mmol) Hünig-Base in 3 ml abs. DMF.
  Ausbeute: 11.2 mg (38% d. Th.)
  LC-MS (Methode 4): R_t = 2.64 min.
  MS (EI): m/z = 767 [M+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 13A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 14A bis 18A hergestellt.
• 
• 
• Beispiel 19A
• N-{[(85,11S,14S)-5,17-Bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-11-((2R)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}propyl)-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-leucyl-L-leucinamid

  
• Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 5A aus 40 mg (0.039 mmol) (8S,11S,14S)-5,17-Bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-11-((2R)-3-{[(benzyloxy)carbonyl)amino}-2-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}propyl)-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 3A) und 11.9 mg (0.043 mmol) L-Leucyl-L-leucinamid-Hydrochlorid mit 18.36 mg (0.048 mmol) HATU und insgesamt 22 mg (0.17 mmol) Hünig-Base in 2 ml abs. DMF.
  Ausbeute: 29 mg (58% d. Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 3.35 min.
  MS (EI): m/z = 1260 [M+H]⁺
• Beispiel 20A
• Benzyl-2-(benzyloxy)-N-(tert-butoxycarbonyl)-5-iod-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-tyrosinat

  
• Unter Argonatmosphäre werden 400 mg (0.80 mmol) 3-(2-Benzyloxy-5-iod-phenyl)-2(S)-tert-butoxycarbonylamino-propionsäure (Beispiel (-)-6A aus WO03/106480) und 400 mg (1.01 mmol) Benzyl-O-benzyl-L-tyrosinat-Hydrochlorid in 6 ml DMF suspendiert und mit 382 mg (1.01 mmol) HATU und 364 mg (2.82 mmol) Hünig-Base versetzt. Man lässt über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Anschließend versetzt man mit 150 ml Wasser und filtriert das ausgefallene Produkt ab. Das Rohprodukt wird in 20 ml Diisopropylether ausgerührt und am Hochvakuum getrocknet.
  Ausbeute: 650 mg (96% d.Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 3.30 min.
  MS (EI): m/z = 841 [M+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 20A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 21A und 22A hergestellt.
• 
• 
• Beispiel 23A
• 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-(4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-3-({(1S)-2-(benzyloxy)-1-[4-(benzyloxy)benzyl]-2-oxoethyl}amino)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-oxopropyl}biphenyl-3-yl)propanoat

  
• Unter Argonatmosphäre werden 446 mg (0.60 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2-(benzyloxy)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-5-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-L-phenylalaninat (Beispiel 1A) und 639 mg (0.60 mmol) Beispiel 20A in 6 ml DMSO gelöst und 30 min mit Argon gespült. Man versetzt mit 44 mg (0.06 mmol) Bis(diphenylphosphino)ferrocen-palladium(II)chlorid und 391 mg (1.20 mmol) Cäsiumcarbonat und erhitzt für 8 h bei 80°C unter einem konstanten Argon-Strom. Anschließend wird über einen Spritzenfilter filtriert und per RP-HPLC (Wasser/Acetonitril) gereinigt. Das Rohprodukt wird in Diethylether ausgerührt und am Hochvakuum getrocknet.
  Ausbeute: 219 mg (30% d.Th.)
  LC-MS (Methode 4): R_t = 3.69 min.
  MS (EI): m/z = 1218 [M+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 23A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 24A und 25A hergestellt.
• 
• Beispiel 26A
• 2-(Trimethylsilyl)ethyl-3-[3'-[(2S)-2-amino-3-({(1S)-2-(benzyloxy)-1-[4-(benzyloxy)benzyl]-2-oxoethyl}amino)-3-oxopropyl]-4,4'-bis(benzyloxy)biphenyl-3-yl]-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}propanoat Hydrochlorid

  
• Unter Argonatmosphäre werden 163 mg (0.13 mmol) Beispiel 23A in 6 ml Dioxan/Chlorwasserstoff-Lösung (4M Lösung) gelöst und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wir am Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 26A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 27A und 28A hergestellt.
• 
• Beispiel 29A
• Benzyl(6R,8S,11S,14S)-14-[4-(benzyloxy)benzyl]-11-[(4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{2-{[(benzyloxy)-carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl}biphenyl-3-yl)methyl]-8-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-6-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}-3,9,12-trioxo-1-phenyl-2-oxa-4,10,13-triazapentadecan-15-oat

  
• Unter Argonatmosphäre werden 150 mg (0.13 mmol) Beispiel 26A und 80 mg (0.16 mmol) 5-Benzyloxycarbonylamino-2(S)-tert-butoxycarbonylamino-4(R)-(tert-butyl-dimethylsilanyloxy)-pentansäure (Beispiel 14A aus WO03/106480) in 5 ml DMF gelöst und nacheinander mit 64 mg (0.17 mmol) HATU und 61 mg (0.47 mmol) Hünig-Base versetzt. Man rührt 4 d bei Raumtemp. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung direkt über RP-HPLC HPLC (Wasser/Acetonitril) gereinigt. Das so erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
  Ausbeute: 152 mg (70% d.Th.)
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 29A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 30A und 31A hergestellt.
• 
• Beispiel 32A
• 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-3-{4,4'-bis(benzyloxy)-3'-[(2S)-3-({(1S)-2-(benzyloxy)-1-[4-(benzyloxy)benzyl]-2-oxoethyl}amino)-2-({(2S,4R)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-hydroxypentanoyl}amino)-3-oxopropyl]biphenyl-3-yl}propanäure

  
• Unter Argonatmosphäre werden 152 mg (0.09 mmol) Beispiel 29A in 5 ml DMF gelöst und mit 0.50 ml Tetrabutylammoniumfluorid (1M Lösung) versetzt. Man rührt 5 h bei Raumtemperatur und versetzt anschließend mit 15 ml Wasser. Das ausgefallene Produkt wird abgesaugt, mit 100 ml Wasser gewaschen und am Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 32A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 33A und 34A hergestellt.
• 
• 
• Beispiel 35A
• Benzyl(6R,8S,11S,14S)-14-[4-(benzyloxy)benzyl]-11-({4,4'-bis(benzyloxy)-3'-[2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-(pentafluorphenoxy)propyl]biphenyl-3-yl}methyl)-8-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-6-hydroxy-3,9,12-trioxo-1-phenyl-2-oxa-4,10,13-triazapentadecan-15-oat

  
• Unter Argonatmosphäre werden 131 mg (0.09 mmol) Beispiel 32A in 3 ml DMF gelöst und mit 87 mg (0.47 mmol) Pentafluorphenol und 2 mg DMAP versetzt. Man kühlt auf –25°C und versetzt mit 23 mg (0.12 mmol) EDC. Man lässt auf Raumtemperatur erwärmen und rührt über Nacht. Zur Aufarbeitung wird am Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 35A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 36A und 37A hergestellt.
• 
• Beispiel 38A
• Benzyl(6R,8S,11S,14S)-8-amino-14-[4-(benzyloxy)benzyl]-11-({4,4'-bis(benzyloxy)-3'-[2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-(pentafluorphenoxy)propyl]biphenyl-3-yl}methyl)-6-hydroxy-3,9,12-trioxo-1-phenyl-2-oxa-4,10,13-triazapentadecan-15-oat Hydrochlorid

  
• Unter Argonatmosphäre werden 141 mg (0.09 mmol) Beispiel 35A in 5 ml Dioxan/Chlorwasserstoff-Lösung (4M Lösung) gelöst. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur wird am Rotationsverdampfer eingeengt und zweimal mit Methylenchlorid codestilliert. Das so erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 38A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 39A und 40A hergestellt.
• 
• 
• Beispiel 41A
• Benzyl-O-benzyl-N-{[(85,11 S,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-11-((2R)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-hydroxypropyl)-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-tyrosinat

  
• Unter Argonatmosphäre werden 141 mg (0.09 mmol) Beispiel 38A in 5 ml Dioxan/Chlorwasserstoff-Lösung (4M Lösung) gelöst. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur wird am Rotationsverdampfer eingeengt und zweimal mit Methylenchlorid codestilliert.
  Ausbeute: 35 mg (31% d.Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 3.30 min.
  MS (EI): m/z = 1281 [M+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 41A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 42A und 43A hergestellt.
• 
• Herstellungsbeispiele
• Beispiel 1
• N²-{[(8S,11S,14S)-14-Amino-11-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-glutamamid-Dihydrochlorid

  
• 3.7 mg (0.0045 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A werden unter Rühren mit 1 ml 4N Dioxan/Chlorwasserstoff-Lösung übergossen und 1 h bei RT gerührt. Man dampft anschließend alles im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz ein.
  Ausbeute: 3 mg (96% d. Th.)
  LC-MS (Methode 4): R_t = 0.31 min.
  MS (EI): m/z = 614 [M-2HCl+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 1 werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 2 bis 7 hergestellt.
• 
• 
• Beispiel 8
• Methyl-N²-{[(8S,11S,14S)-14-amino-11-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-glutaminat-Dihydrochlorid

  
• 6 mg der Verbindung aus Beispiel 2 werden in 2 ml Methanol suspendiert, mit 10 Tropfen 4N Dioxan/Chlorwasserstoff-Lösung versetzt und zwei Tage bei RT gerührt. Man engt alles im Vakuum ein und trennt den Rückstand mittels Dickschichtchromatographie (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol/wässrige Ammoniak-Lösung = 70/25/7). Die das Produkt enthaltende Zone wird abgekratzt, mit Methanol eluiert, mit Dioxan/Chlorwasserstoff-Lösung versetzt und mit Acetonitril gefällt.
  Ausbeute: 1.2 mg (21% d.Th.)
  LC-MS (Methode 4): R_t = 0.39 min.
  MS (EI): m/z = 629 [M-2HCl+H]⁺
• Beispiel 9
• Methyl-N-{[(8S,11S,14S)-14-amino-14-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,17-dihydroxy-9-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-leucylglycinat-Dihydrochlorid

  
• Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 8 aus 4 mg (0.01 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3.
  Ausbeute: 4 mg (82% d.Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 0.96 min.
  MS (EI): m/z = 671 [M-2HCl+H]⁺
• Die in der folgenden Tabelle aufgeführten L-Ornithin-Derivate (Beispiele 10 bis 15) werden analog Beispiel 1 hergestellt.
• 
• 
• Beispiel 16
• N-{[(85,11S,14S)-14-Amino-11-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-leucyl-L-leucinamid-Bis(hydrotrifluoracetat)

  
• 29 mg (0.023 mmol) der Verbindung aus Beispiel 19A werden in 12 ml Eisessig/Wasser/Ethanol = 4/1/1 suspendiert, mit 8 mg Pd/C-Katalysator (10%ig) versetzt und 24 h bei RT hydriert. Der Ka talysator wird abfiltriert, das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, und das Rohprodukt wird durch HPLC (Kromasil 100018, Laufmittel Acetonitril/0.2% wässrige TFA, Gradient) gereinigt.
  Ausbeute: 2.6 mg (12% d. Th.)
  LC-MS (Methode 2): R_t = 1.04 min.
  MS (EI): m/z = 698 [M-2TFA+H]^{+
  1}H-NMR (400 MHz, D₂O): δ = 0.84 (m_c, 12H), 1.25 (m_c, 2H), 1.45-1.7 (m, 6H), 1.84 (m_c, 1H), 1.95 (m_c, 1H), 2.83 (m_c, 2H), 2.92-3.22 (m, 4H), 3.5 (m_c, 1H), 3.8 (m_c, 1H), 4.28 (m_c, 1H), 4.33-4.4 (m, 2H), 4.78 (m_c, 1H), 4.87 (m_c, 1H), 6.80 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.88 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.27 (d, 1H), 7.47 (d, 1H).
• Beispiel 17
• N-{[(85,11S,14S)-14-Amino-11-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1^2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-tyrosin-Dihydrochlorid

  
• Bei Raumtemperatur werden 35 mg (0.03 mmol) Beispiel 41A in 6 ml Eisessig/Wasser/Ethanol = 4/1/1 suspendiert. Nach Zugabe von 16 mg (0.15 mmol) Pd/C-Katalysator (10%ig) wird 2 d bei Raumtemperatur unter Normaldruck hydriert. Die Reaktionslösung wird über einen Spritzenfilter filtriert und mit 560 μg 0.1M Salzsäure versetzt. Es wird am Rotationsverdampfer eingeengt und am Hochvakuum getrocknet.
  Ausbeute: 12 mg (69% d.Th.)
  LC-MS (Methode 4): R_t = 1.04 min.
  MS (EI): m/z = 636 [M-2HCl+H]⁺
• Analog zur Vorschrift des Beispiels 17 werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 18 und 19 hergestellt.
• 
• B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
• Verwendete Abkürzungen:

AMP

Adenosinmonophosphat

ATP

Adenosintriphosphat

BHI Medium

Brain heart infusion medium

CoA

Coenzym A

DMS

O Dimethylsulfoxid

DTT

Dithiothreitol

EDTA

Ethylendiamintetraessigsäure

KCl

Kaliumchlorid

KH₂PO₄

Kaliumdihydrogenphosphat

MgSO₄

Magnesiumsulfat

MHK

Minimale Hemmkonzentration

MTP

Mikrotiterplatte

NaCl

Natriumchlorid

Na₂HPO₄

Dinatriumhydrogenphosphat

NH₄Cl

Ammoniumchlorid

NTP

Nukleotidtriphosphat

PBS

Phosphat Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PEG

Polyethylenglykol

PEP

Phosphoenolpyruvat

Tris

Tris[hydroxymethyl]aminomethan

• Die in vitro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:
• In vitro Transkription-Translation mit E. coli Extrakten
• Zur Herstellung eines S30-Extraktes werden logarithmisch wachsende Escherichia coli MRE 600 (M. Müller; University Freiburg) geerntet, gewaschen und wie beschrieben für den in vitro Transkriptions-Translations-Test eingesetzt (Müller, M. and Blobel, G., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1984, 81, 7421-7425).
• Dem Reaktionsmix des in vitro Transkriptions-Translations-Tests werden zusätzlich 1 μl cAMP (11.25 mg/ml) je 50 μl Reaktionsmix zugegeben. Der Testansatz beträgt 105 μl, wobei 5 μl der zu testenden Substanz in 5%igem DMSO vorgelegt werden. Als Transkriptionsmatrize werden 1 μg/100μl Ansatz des Plasmides pBESTLuc (Promega, Deutschland) verwendet. Nach Inkubation für 60 min bei 30°C werden 50 μl Luziferinlösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO₄, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 μM CoA, 470 μM Luziferin, 530 μM ATP) zugegeben und die entstehende Biolumineszenz für 1 Minute in einem Luminometer gemessen. Als IC₅₀ wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition der Translation von Firefly Luziferase führt.
• In vitro Transkription-Translation mit S. aureus Extrakten
• Konstruktion eines S. aureus Luziferase Renorterplasmids
• Zur Konstruktion eines Reporterplasmids, welches in einem in vitro Transkriptions-Translations-Assay aus S. aureus verwendet werden kann, wird das Plasmid pBESTluc (Promega Corporation, USA) verwendet. Der in diesem Plasmid vor der Firefly Luziferase vorhandene E. coli tac Promoter wird gegen den capA1 Promoter mit entsprechender Shine-Dalgarno Sequence aus S. aureus ausgetauscht. Dazu werden die Primer CAPFor 5'-CGGCCAAGCTTACTCGGATCCAGAGTTTGCAAAATATACAGGGGATTATATATAATGGAAAACAAGAAAGGAAAATAGGAGGTTTATATGGAAGACGCCA-3' und CAPRev 5'-GTCATCGTCGGGAAGACCTG-3' verwendet. Der Primer CAPFor enthält den capA1 Promotor, die Ribosomenbindestelle und die 5'-Region des Luziferase Gens. Nach PCR unter Verwendung von pBESTluc als Template kann ein PCR-Produkt isoliert werden, welches das Firefly Luziferase Gen mit dem fusionierten capA1 Promotor enthält. Dieses wird nach einer Restriktion mit ClaI und HindIII in den ebenfalls mit ClaI und HindIII verdauten Vektor pBESTluc ligiert. Das entstandene Plasmid pla kann in E. coli repliziert werden und als Template im S. aureus in vitro Transkriptions-Translations-Test verwendet werden.
• Herstellung von S30 Extrakten aus S. aureus Sechs Liter BHI Medium werden mit einer 250 ml Übernachtkultur eines S. aureus Stammes inokuliert und bei 37°C bis zu einer OD600nm von 2-4 wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in 500 ml kaltem Puffer A (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 1 M KCl) gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren werden die Zellen in 250 ml kaltem Puffer A mit 50 mM KCl gewaschen und die erhaltenen Pellets bei –20°C für 60 min eingefroren. Die Pellets werden in 30 bis 60 min auf Eis aufgetaut und bis zu einem Gesamtvolumen von 99 ml in Puffer B (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 20 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 50 mM KCl) aufgenommen. Je 1.5 ml Lysostaphin (0.8 mg/ml) in Puffer B werden in 3 vorgekühlte Zentrifugenbecher vorgelegt und mit je 33 ml der Zellsuspension vermischt. Die Proben werden für 45 bis 60 min bei 37°C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert, bevor 150 μl einer 0.5 M DTT Lösung zugesetzt werden. Die lysierten Zellen werden bei 30.000 × g 30 min bei 4°C abzentrifugiert. Das Zellpellet wird nach Aufnahme in Puffer B unter den gleichen Bedingungen nochmals zentrifugiert und die gesammelten Überstände werden vereinigt. Die Überstände werden nochmals unter gleichen Bedingungen zentrifugiert und zu den oberen 2/3 des Überstandes werden 0.25 Volumen Puffer C (670 mM Tris-acetat, pH 8.0, 20 mM Magnesiumacetat, 7 mM Na₃-Phosphoenolpyruvat, 7 mM DTT, 5.5 mM ATP, 70 μM Aminosäuren (complete von Fromega), 75 μg Pyruvatkinase (Sigma, Deutschland))/ml gegeben. Die Proben werden für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Überstände werden über Nacht bei 4°C gegen 2 l Dialysepuffer (10 mM Trisacetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 60 mM Kaliumacetat) mit einem Pufferwechsel in einem Dialyseschlauch mit 3500 Da Ausschluss dialysiert. Das Dialysat wird auf eine Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml konzentriert, indem der Dialyseschlauch mit kaltem PEG 8000 Pulver (Sigma, Deutschland) bei 4°C bedeckt wird. Die S30 Extrakte können aliquotiert bei –70°C gelagert werden.
• Bestimmung der IC₅₀ im S. aureus in vitro Transcriptions-Translations-Assay
• Die Inhibition der Proteinbiosynthese der Verbindungen kann in einem in vitro Transkriptions-Translations-Assay gezeigt werden. Der Assay beruht auf der zellfreien Transkription und Translation von Firefly Luziferase unter Verwendung des Reporterplasmids pla als Template und aus S. aureus gewonnenen zellfreien S30 Extrakten. Die Aktivität der entstandenen Luziferase kann durch Lumineszenzmessung nachgewiesen werden.
• Die Menge an einzusetzenden S30 Extrakt bzw. Plasmid pla muss für jede Präparation erneut ausgetestet werden, um eine optimale Konzentration im Test zu gewährleisten. 3 μl der zu testenden Substanz gelöst in 5% DMSO werden in eine MTP vorgelegt. Anschließend werden 10 μl einer geeignet konzentrierten Plasmidlösung pla zugegeben. Anschließend werden 46 μl eines Gemisches aus 23 μl Premix (500 mM Kaliumacetat, 87.5 mM Tris-acetat, pH 8.0, 67.5 mM Ammoniumacetat, 5 mM DTT, 50 μg Folsäure/ml, 87.5 mg PEG 8000/ml, 5 mM ATP, 1.25 mM je NTP, 20 μM je Aminosäure, 50 mM PEP (Na₃-Salz), 2.5 mM cAMP, 250 μg je E. coli tRNA/ml) und 23 μl einer geeigneten Menge S. aureus S30 Extrakt zugegeben und vermischt. Nach Inkubation für 60 min bei 30°C werden 50 μl Luziferinlösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO₄, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 μM CoA, 470 μM Luziferin, 530 μM ATP) und die entstehende Biolumineszenz für 1 min in einem Luminometer gemessen. Als IC₅₀ wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition der Translation von Firefly Luziferase führt.
• Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK)
• Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums, mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18-24 h inhibiert wird. Die Hemmstoffkonzentration kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren bestimmt werden (siehe z.B. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-fifth edition. NCCLS document M7-A5 [ISBN 1-56238-394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2000). Die MHK der erfindungsgemäßen Verbindungen wird im Flüssigdilutionstest im 96er-Mikrotiter-Platten-Maßstab bestimmt. Die Bakterienkeime werden in einem Minimalmedium (18.5 mM Na₂HPO₄, 5.7 mM KH₂PO₄, 9.3 mM NH₄Cl, 2.8 mM MgSO₄, 17.1 mM NaCl, 0.033 μg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 μg/ml Nicotinsäure, 0.003 μg/ml Biotin, 1% Glucose, 25 μg/m1 von jeder proteinogenen Aminosäure mit Ausnahme von Phenylalanin; [H.-P. Kroll; unveröffentlicht]) unter Zusatz von 0.4% BH-Bouillon kultiviert (Testmedium). Im Fall von Enterococcus faecium L4001 wird dem Testmedium hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS; GibcoBRL, Deutschland) in einer Endkonzentration von 10% zugesetzt. Übernachtkulturen der Testkeime werden auf eine OD₅₇₈ von 0.001 (im Falle der Enterokokken auf 0.01) in frisches Testmedium verdünnt und 1:1 mit Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungsstufen 1:2) in Testmedium inkubiert (200 μl Endvolumen). Die Kulturen werden bei 37°C für 18-24 Stunden inkubiert; Enterokokken in Gegenwart von 5% CO₂.
• Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftrat, wird als MHK definiert. Die MHK-Werte in μM einiger erfindungsgemäßer Verbindungen gegenüber einer Reihe von Testkeimen sind in der nachstehenden Tabelle beispielhaft aufgeführt. Die Verbindungen zeigen eine abgestufte antibakterielle Wirkung gegen die meisten der Testkeime.
• Tabelle A

  
• 
• Systemische Infektion mit S. aureus 133
• Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden. Dazu werden die Tiere im allgemeinen mit einem geeigneten virulenten Keim infiziert und anschließend mit der zu testenden Verbindung, die in einer an das jeweilige Therapiemodell angepassten Formulierung vorliegt, behandelt. Speziell kann die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen in einem Sepsismodell an Mäusen nach Infektion mit S. aureus demonstriert werden.
• Dazu werden S. aureus 133 Zellen über Nacht in BH-Bouillon (Oxoid, Deutschland) angezüchtet. Die Übernachtkultur wurde 1:100 in frische BH-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden hochgedreht. Die in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterien werden abzentrifugiert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird am Photometer (Dr. Lange LP 2W) eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension 1:1 mit einer 10%-igen Mucinsuspension gemischt. Von dieser Infektionslösung wird 0.2 ml/20 g Maus i.p. appliziert. Dies entspricht einer Zellzahl von etwa 1-2 × 10⁶ Keimen/Maus. Die i.v.-Therapie erfolgt 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFW1-Mäuse verwendet. Das Überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert. Das Tiermodell ist so eingestellt, dass unbehandelte Tiere innerhalb von 24 h nach der Infektion versterben. Für die Beispielverbindung 2 konnte in diesem Modell eine therapeutische Wirkung von ED₁₀₀ = 1.25 mg/kg demonstriert werden.
• C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
• Intravenös applizierbare Lösung:
• Zusammensetzung:
• 1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.
• Herstellung:
• Die erfindungsgemäße Verbindung wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.

Claims (10)

1. Verbindung der Formel

   

   in welcher R¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist, R² gleich Wasserstoff oder Methyl ist, R³ gleich C₁-C₆-Alkyl bedeutet, wobei Alkyl substituiert ist mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl und C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl, worin Alkylaminocarbonyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxycarbonyl, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl und Aminocarbonyl, und wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem oder zwei weiteren Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, C₁-C₆-Alkoxycarbonyl, Aminocarbonyl, Guanidino und Hydroxy substituiertes Phenyl, oder R³ gleich eine Gruppe der Formel

   

   ist, und R⁴ gleich Wasserstoff ist oder R³ und R⁴ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Gruppe der Formel

   

   bilden, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist, R² gleich Wasserstoff oder Methyl ist, R³ gleich C₂-C₄-Alkyl bedeutet, wobei Alkyl substituiert ist mit einem Substituenten Aminocarbonyl und einem weiteren Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend Aminocarbonyl und Guanidino, oder wobei Alkyl substituiert ist mit einem Substituenten Hydroxycarbonyl und einem weiteren Substituenten Hydroxy, und R⁴ gleich Wasserstoff ist, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 oder eines ihrer Salze, Solvate oder der Solvate ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass nach Verfahren [A] eine Verbindung der Formel

   

   worin R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und boc gleich tert-Butoxycarbonyl ist, in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit einer Verbindung der Formel HNR³R⁴ (III),worin R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und anschließend mit einer Säure umgesetzt wird, oder [B] eine Verbindung der Formel

   

   worin R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und Z gleich Benzyloxycarbonyl ist, in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit einer Verbindung der Formel HNR³R⁴ (III),worin R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und anschließend mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse umgesetzt wird.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 oder eines ihrer Solvate, dadurch gekennzeichnet, dass ein Salz der Verbindung oder ein Solvat eines Salzes der Verbindung durch Chromatographie unter Zusatz einer Base in die Verbindung überführt wird.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
6. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in Kombination mit mindestens einem inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
7. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Erkrankungen.
9. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen.
10. Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren durch Verabreichung einer antibakteriell wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, eines Arzneimittels nach Anspruch 6 oder eines nach Anspruch 7 oder 8 erhaltenen Arzneimittels.