Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative
Verbindungen mit gleicher oder verbesserter antibakterieller Wirkung
zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren
sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen und alternativen
Verbindungen zur Verfügung
zu stellen.
Überraschenderweise
wurde gefunden, dass bestimmte Derivate des Bottromycins, in denen
das Methyl-Prolin im Ring-Gerüst
des Bottromycins gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, antibakteriell wirksam
sind und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften gegenüber Bottromycin
aufweisen.
Gegenstand
der Erfindung sind Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 für
Wasserstoff oder C
1-C
6-Alkyl
steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl,
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
Guanidino, Phenyl, tert-Butyloxycarbonylamino, Benzyloxy und Benryloxycarbonylamino,
R
2 für
C
1-C
4-Alkoxy oder
eine Gruppe der Formel
wobei
* die Anknüpfstelle
an die Carbonylgruppe ist,
R
3 und R
4 unabhängig
voneinander für
Wasserstoff oder C
1-C
4-Alkyl,
wobei
Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl,
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
C
3-C
6-Cycloalkyl, C
6-C
10-Aryl und 5-
oder 6-gliedriges Heteroaryl,
und, sofern es sich bei C
1-C
4-Alkyl nicht
um Methyl handelt, alternativ oder zusätzlich substituiert sein kann
mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig
voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C
1-C
4-Alkoxy
und C
1-C
6-Alkylamino,
oder
für C
3-C
6-Cycloalkyl stehen,
wobei
Cycloalkyl substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig voneinander
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl,
Trifluormethoxy, Cyano, C
1-C
4-Alkyl, C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino, Hydroxycarbonyl,
Aminocarbonyl, C
1-C
4Alkoxycarbonyl
und C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
oder
R
3 und R
4 zusammen
für (CH
2)
3 oder (CH
2)
4 stehen und mit
dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen
5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit
1 bis 2 Substituenten unabhängig
voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Trifluormethoxy,
C
1-C
4-Alkyl, C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino,
Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C
1-C
4-Alkoxycarbonyl und C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
oder
R
3 und R
4 zusammen
mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind,
eine Gruppe der Formel
bilden,
wobei
*
die Anknüpfstelle
an die Carbonylgruppe ist,
R
5 für Wasserstoff
oder C
1-C
6-Alkyl,
wobei
Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl,
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
C
3-C
6-Cycloalkyl, C
6-C
10-Aryl und 5-
oder 6-gliedriges Heteroaryl,
und, sofern es sich bei C
1-C
4-Alkyl nicht
um Methyl handelt, alternativ oder zusätzlich substituiert sein kann
mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig
voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C
1-C
4-Alkoxy
und C
1-C
6-Alkylamino,
oder
für C
3-C
6-Cycloalkyl,
C
6-C
10-Aryl oder
5- oder 6-gliedriges Heteroaryl steht,
wobei Cycloalkyl, Aryl
und Heteroaryl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten
unabhängig
voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl,
Trifluormethoxy, C
1-C
4-Alkyl,
C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino,
Cyano, Nitro, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C
1-C
4-Alkoxycarbonyl
und C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
R
6 für
Wasserstoff, Amino, C
1-C
6-Alkylamino
oder C
1-C
6-Alkyl,
wobei
Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl,
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
C
3-C
6-Cycloalkyl, C
6-C
10-Aryl und 5-
oder 6-gliedriges Heteroaryl,
und, sofern es sich bei C
1-C
4-Alkyl nicht
um Methyl handelt, alternativ oder zusätzlich substituiert sein kann
mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig
voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C
1-C
4-Alkoxy
und C
1-C
6-Alkylamino,
oder
für C
3-C
6-Cycloalkyl,
C
6-C
10-Aryl oder
5- oder 6-gliedriges Heteroaryl steht,
wobei Cycloalkyl, Aryl
und Heteroaryl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten
unabhängig
voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl,
Trifluormethoxy, C
1-C
4-Alkyl,
C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino,
Cyano, Nitro, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C
1-C
4-Alkoxycarbonyl
und C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
oder
R
5 und R
6 zusammen
für (CH
2)
4 oder (CH
2)
5 stehen und mit
dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring
bilden, wobei der Ring weitere 1 bis 2 Heteroatome ausgwählt aus
der Gruppe N, S und O enthalten kann und/oder substituiert sein
kann mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl,
Trifluormethoxy, C
1-C
4-Alkyl, C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino,
Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C
1-C
4-Alkoxycarbonyl und C
1-C
6-Alkylaminocarbonyl,
und ihre Salze,
ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Erfindungsgemäße Verbindungen
sind die Verbindungen der Formel (I) und (Ia) und deren Salze, Solvate
und Solvate der Salze, sowie die von Formel (I) und (Ia) umfassten,
nachfolgend als Ausführungsbeispiel(e)
genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der
Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) und (Ia) umfassten,
nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate
und Solvate der Salze handelt.
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in Abhängigkeit
von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere)
existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder
Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen
von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich durch bekannte
Verfahren wie Chromatographie an chiraler Phase oder Kristallisation
mit chiralen Aminen oder chiralen Säuren die stereoisomer einheitlichen
Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
Die
Erfindung betrifft in Abhängigkeit
von der Struktur der Verbindungen auch Tautomere der Verbindungen.
Als
Salze sind im Rahmen der Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze
der erfindungsgemäßen Verbindungen
bevorzugt.
Physiologisch
unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen Säureadditionssalze
von Mineralsäuren,
Carbonsäuren
und Sulfonsäuren,
z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Trifluoressigsäure und
Benzoesäure.
Physiologisch
unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen auch Salze üblicher
Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B.
Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze)
und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder orga nischen Aminen
mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin,
Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin,
Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol,
Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Dihydroabietylamin, Arginin,
Lysin, Ethylendiamin und Methylpiperidin.
Als
Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der Verbindungen
bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination
mit Lösungsmitteimolekülen einen
Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei
denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit
nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Alkyl per
se und "Alk" und "Alkyl" in Alkoxy, Alkylamino,
Alkoxycarbonyl und Alkylaminocarbonyl stehen für einen linearen oder verzweigten
Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
beispielhaft und vorzugsweise für
Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkoxy
steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy,
Isopropoxy und tert.-Butoxy.
Alkylamino
steht für
einen Alkylaminorest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten,
beispielhaft und vorzugsweise für
Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino,
Isopropylamino, tert.-Butylamino, n-Pentylamino, n-Hexylamino, N,N-Dimethylamino,
N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino,
N-Isopropyl-N-n-propylamino, N-tert.-Butyl-N-methylamino, N-Ethyl-N-n-pentylamino
und N-n-Hexyl-N-methyl-amino. C1-C3-Alkylamino steht beispielsweise für einen
Monoalkylaminorest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen
Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.
Alkoxycarbonyl
steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl,
n-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl
und n-Hexoxycarbonyl.
Alkylaminocarbonyl
steht für
einen Alkylaminocarbonylrest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander
gewählten)
Alkylsubstituenten, wobei die Alkylsubstituenten unabhängig voneinander
in der Regel 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis
3 Kohlenstoffatome aufweisen, beispielhaft und vorzugsweise für Methylaminocarbonyl,
Ethylaminocarbonyl, n-Propylaminocarbonyl, Isopropylaminocarbonyl,
tert.-Butylaminocarbonyl, n-Pentylaminocarbonyl, n-Hexylaminocarbonyl,
N,N-Dimethylaminocarbonyl, N,N-Diethylaminocarbonyl, N-Ethyl-N-methylaminocarbonyl,
N-Methyl-N-n-propylaminocarbonyl, N-Isopropyl-N-n-propylaminocarbonyl,
N-tert.-Butyl-N-methylaminocarbonyl,
N-Ethyl-N-n-pentylaminocarbonyl und N-n-Hexyl-N-methylaminocarbonyl.
C1-C3-Alkylaminocarbonyl
steht beispielsweise für
einen Monoalkylaminocarbonylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder
für einen
Dialkylaminocarbonylrest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro
Alkylsubstituent.
Cycloalkyl
steht für
eine Cycloalkylgruppe mit in der Regel 3 bis 6 Kohlenstoffatomen,
beispielhaft und vorzugsweise für
Cycloalkyl sind genannt Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und
Cyclohexyl.
Aryl
steht für
einen mono- oder bicyclischen aromatischen Rest mit in der Regel
6 bis 10 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Aryl sind
genannt Phenyl und Naphthyl.
Heteroaryl
steht für
einen aromatischen, monocyclischen Rest mit in der Regel 5 bis 6
Ringatomen und bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, wobei
ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann, beispielhaft und
vorzugsweise für
Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Oxadiazolyl, Pyrazolyl,
Imidazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl.
Halogen
steht für
Fluor, Chlor, Brom und Jod, vorzugsweise für Fluor und Chlor.
Wenn
Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen
substituiert sind, können
die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach
gleich oder verschieden substituiert sein. Eine Substitution mit
bis zu drei gleichen oder verschiedenen Substituenten ist bevorzugt.
Ganz besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem Substituenten.
Bevorzugt
im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel
(I), in welcher
R
1 für Wasserstoff
oder C
1-C
4-Alkyl
steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Benzyloxy und Benzyloxycarbonylamino,
R
2 für
Methoxy, Ethoxy oder eine Gruppe der Formel
wobei
* die Anknüpfstelle
an die Carbonylgruppe ist,
R
3 und R
4 unabhängig
voneinander für
Wasserstoff oder C
1-C
4-Alkyl
stehen,
oder
R
3 und R
4 zusammen
für (CH
2)
3 oder (CH
2)
4 stehen und mit
dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen
5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit
einem Substituenten ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Ethoxycarbonyl,
R
5 für
Wasserstoff steht,
R
6 für Wasserstoff,
Amino, C
1-C
6-Alkylamino
oder C
1-C
6-Alkyl
steht,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt
im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der
Formel (I), in welcher
R
1 für Wasserstoff
oder C
1-C
4-Alkyl
steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Amino, Benzyloxy und Benryloxycarbonylamino,
R
2 für
Methoxy oder eine Gruppe der Formel
wobei
* die Anknüpfstelle
an die Carbonylgruppe ist,
R
3 und R
4 unabhängig
voneinander für
Methyl oder Ethyl stehen,
oder
R
3 und
R
4 zusammen für (CH
2)
3 oder (CH
2)
4 stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom,
an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der
Ring substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Ethoxycarbonyl,
und ihre
Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt
im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der
Formel (I), welche der Formel
entsprechen,
in
welcher
R
1 und R
2 die
oben angegebene Bedeutung aufweisen,
und ihre Salze, ihre Solvate
und die Solvate ihrer Salze.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen
der Formel (I) oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate
ihrer Salze, wobei
[A] Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 die oben angegebene Bedeutung hat,
in
Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit
Verbindungen der Formel
in welcher
R
2 die oben angegebene Bedeutung hat,
umgesetzt
werden,
oder
[B] Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 die oben angegebene Bedeutung hat,
in
Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien umgesetzt
werden.
Reaktive
Funktionalitäten
in dem Rest R1 von Verbindungen der Formeln
(II) und (IV) werden bereits geschützt mit in die Synthese eingebracht,
bevorzugt sind säurelabile
Schutzgruppen (z.B. boc oder z). Nach erfolgter Umsetzung zu Verbindungen
der Formel (I) können
die Schutzgruppen durch Entschützungsreaktion abgespalten
werden. Dies geschieht nach Standardverfahren der Schutzgruppenchemie.
Bevorzugt sind Entschützungsreaktionen
unter sauren Bedingungen oder durch Hydrogenolyse.
Die
Umsetzung nach Verfahren [A] und [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten
Lösungsmitteln,
gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich
von 0°C
bis 40°C
bei Normaldruck.
Als
Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide
wie z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid,
N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid
(EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'-propyloxymethyl-Polystyrol
(PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol,
oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat
oder 2-tert.-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat,
oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin,
oder Propanphosphonsäureanhydrid,
oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder
Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat,
oder O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU),
2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
(TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluoro-phosphat
(BOP), oder Mischungen aus diesen, oder Mischung aus diesen zusammen
mit Basen.
Basen
sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat,
oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine
z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin
oder Diisopropylethylamin.
Vorzugsweise
wird die Kondensation mit O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
(HATU) in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethylamin,
durchgeführt.
Inerte
Lösungsmittel
sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan
oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, oder Nitromethan,
Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische
der Lösemittel
einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dimethylformamid.
Die
Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder können analog
bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die
Verbindungen der Formel (II) können
hergestellt werden, indem die Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit
einer Base umgesetzt werden.
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in
einem Temperaturbereich von 0°C
bis 40°C
bei Normaldruck.
Basen
sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder
Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder
Kaliumcarbonat, bevorzugt Lithiumhydroxid.
Inerte
Lösungsmittel
sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid,
Trichlormethan, Tetrachlormethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan,
1,2-Dichlorethan oder Trichlorethylen, Ether wie Diethylether, Methyl-tert.-butylether,
1,2-Dimethoxyethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether
oder Diethylenglykoldimethylether, Alkohole wie Methanol, Ethanol,
n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol, oder andere
Lösungsmittel
wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril
oder Pyridin, oder Gemischen von Lösungsmitteln, als Lösungsmittel
sind bevorzugt Tetrahydrofuran und/oder Methanol.
Die
Verbindungen der Formel (Ib) können
nach Verfahren [B] hergestellt werden.
Die
Verbindungen der Formel (IV) können
hergestellt werden, indem die Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit
Oxidationsmitteln umgesetzt werden.
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in
einem Temperaturbereich von 0°C
bis 40°C
bei Normaldruck.
Oxidationsmittel
sind beispielsweise Chromtrioxid in wässriger Schwefelsäure (Jones-Reagens),
Kaliumpermanganat, Braunstein/Kaliumcyanid, Natriumchlorit, Dess-Martin-Reagens,
aktiviertes Dimethylsulfoxid, 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy
(TEMPO), [Bis(acetoxy)iod]benzol oder Tetrapropylammonium-perruthenat/N-Methyl-morpholinoxid,
bevorzugt ist Chromtrioxid in wässriger
Schwefelsäure
(Jones-Reagens).
Inerte
Lösungsmittel
sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid,
Trichlormethan, Tetrachlormethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan,
1,2-Dichlorethan oder Trichlorethylen, Ether wie Diethylether, Methyl-tert.-butylether,
1,2-Dimethoxyethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether
oder Diethylenglykoldimethylether, Alkohole wie Methanol, Ethanol,
n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol, oder andere
Lösungsmittel
wie Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid,
Acetonitril oder Pyridin, oder Gemischen von Lösungsmitteln, als Lösungsmittel
sind bevorzugt Aceton, Tetrahydrofuran und/oder Methanol.
Die
Verbindungen der Formel (V) können
hergestellt werden, indem die Verbindung der Formel
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 die oben angegebene Bedeutung hat, und
SG
eine säurelabile
Schutzgruppe, bevorzugt tert.-Butoxycarbonyl, ist,
in Gegenwart
von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien und anschließend mit
einer Säure
umgesetzt werden.
Die
Verbindungen werden in der ersten Stufe nach den für Verfahren
[A] und [B] angegebenen Reaktionsbedingungen hergestellt. Die Umsetzung
mit einer Säure
in der zweiten Stufe des Verfahrens erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich
von 0°C
bis 40°C
bei Normaldruck. Als Säuren
eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff
in Essigsäure
oder Trifluoressigsäure
in Methylenchlorid.
Die
Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder können analog
bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die
Verbindung der Formel (VI) kann hergestellt werden, indem die Verbindung
der Formel
unter
den Reaktionsbedingungen des Edman-Abbaus in einer zweistufigen
Synthese umgesetzt wird.
Die
erste Stufe wird in Dimethylformamid unter Zugabe von Phenylisothiocyanat
und Ethyldiisopropylamin durchgeführt, bevorzugt in einem Temperaturbereich
von 0°C
bis 40°C
bei Normaldruck.
In
der zweiten Stufe wird mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan umgesetzt,
bevorzugt in einem Temperaturbereich von 20°C bis 60°C bei Normaldruck.
Die
Verbindung der Formel (VIII) kann hergestellt werden, indem die
Verbindung der Formel
mit Reduktionsmitteln umgesetzt
wird.
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in
einem Temperaturbereich von –50°C bis zum
Siedepunkt der Lösungsmittel,
bevorzugt bei 20 bis 30°C
bei Normaldruck.
Reduktionsmittel
sind beispielsweise komplexe Borhydride oder Aluminiumhydride sowie
Borane wie Natriumborhydrid, Lithiumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid,
Lithiumaluminiumhydrid, Natrium-bis-(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid
oder Boran-Tetrahydrofuran, bevorzugt ist Natriumborhydrid.
Inerte
Lösungsmittel
sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Methyl-tert.-butylether,
1,2-Dimethoxyethan,
Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether oder Diethylenglykoldi-methylether,
Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol
oder tert.-Butanol, oder andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid,
Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder Acetonitril, oder Gemischen
von Lösungsmitteln,
als Lösungsmittel
ist bevorzugt Methanol.
Die
Verbindung der Formel (IX) kann durch Fermentation hergestellt werden.
Sie wird beispielsweise produziert, wenn ein Stamm aus der Art Streptomyces
bottropensis (DSM 16814) oder der Art Streptomyces spec. (DSM 17025)
in einem wässrigen
Nährmedium
unter aeroben Bedingungen fermentiert wird. Typischerweise wird
der Mikroorganismus in einem Nährmedium,
welches eine Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls ein proteinartiges
Material enthält,
fermentiert. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, brauner
Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke,
Maisstärke,
Lactose, Dextrin und Melasse. Bevorzugte Stickstoffquellen sind
beispielsweise Baumwollsaatmehl, Hefe, autolysierte Bäckerhefe,
feste Milchbestandteile, Sojabohnenmehl, Maismehl, pankreatische
oder papainisch verdaute Spaltprodukte von Kasein, feste Destillationsbestandteile,
Brühen
aus tierischem Pepton und Fleisch- und Knochenstücke. Vorzugsweise werden Kombinationen
dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet. Spurenelemente,
wie beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt und Eisen müssen dem
Fermentationsmedium nicht zugefügt
werden, solange Leitungswasser und nicht-gereinigte Bestandteile
als Mediumkomponenten verwendet werden.
Die
Herstellung kann bei jeder Temperatur induziert werden, die ein
ausreichendes Wachstum der Mikroorganismen gewährleistet. Vorzugsweise beträgt die Temperatur
zwischen 21°C
und 32°C,
besonders bevorzugt ungefähr
28°C.
Im
Allgemeinen wird eine optimale Produktion innerhalb von 4 bis 8
Tagen, vorzugsweise in ungefähr 7
Tagen erhalten. Die Fermentationsbrühe bleibt normalerweise während der
Fermentation schwach basisch (pH 7.2 bis pH 8.4). Der End-pH ist
teilweise abhängig
von dem gegebenenfalls verwendeten Puffer und teilweise vom anfänglichen
pH des Kulturmediums.
Vorzugsweise
wird der pH auf ungefähr
6.5 bis 7.5 vor der Sterilisierung eingestellt, besonders bevorzugt
auf pH 7.2.
Die
Produktion findet sowohl in Schüttelflaschen
als auch in Rühr-Fermentern
statt. Wenn die Kultivierung in Schüttelflaschen oder großen Kesseln
und Tanks durchgeführt
wird, wird vorzugsweise die vegetative Form anstatt der Sporen-Form
der Mikroorganismen zum Animpfen verwendet, um eine deutliche lag-Phase bei
der Produktion der Metabolite und damit eine ineffiziente Ausnutzung
der Gerätschaften
zu vermeiden. Demnach ist es vorteilhaft, ein vegetatives Inokulum
in einem wässrigen
Nährmedium
durch Animpfen dieses Mediums mit einem Aliquot einer Boden- oder Schrägröhrchen-Kultur
herzustellen. Nachdem ein frisches, aktives, vegetatives Inokulum
auf diese Weise vorbereitet worden ist, wird dieses aseptisch in
weitere Schüttelflaschen
oder weitere geeignete Gerätschaften
für die
Fermentation der Mikroorganismen überfährt. Das Medium, in welchem
das vegetative Inokulum hergestellt wird, kann identisch oder unterschiedlich
zu demjenigen Medium sein, das für
die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet
wird, solange es ein ausreichendes Mikroorganismenwachstum gewährleistet.
Im
Allgemeinen wird die Herstellung unter Verwendung der oben genannten
Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in Rühr-Fermentern bewerkstelligt.
Die Herstellung ist jedoch unabhängig
von den verwendeten Fermentern und Starterkulturen. Die Vorstufen
können
auch über
Schüttelkulturen
erhalten werden. Für
großvolumige
Fermentationen wird vorzugsweise ein vegetatives Inokulum verwendet.
Das vegetative Inokulum wird durch Animpfen eines kleinen Volumens
des Kulturmediums mit der Sporenform, Myzelfragmenten oder einem
lyophilisierten Pellet des Mikroorganismus hergestellt. Das vegetative
Inokulum wird dann in einen Fermentationskessel überführt, worin nach einer geeigneten
Inkubationszeit die Verbindung der Formel (IV) in einer optimalen
Ausbeute produziert wird. Gewöhnlich
wird bei einem aeroben Submers-Fermentationsverfahren
sterile Luft durch das Kulturmedium geleitet. Für ein effizientes Wachstum
der Mikroorganismen liegt das verwendete Luftvolumen im Bereich
von ungefähr
0.25 bis ungefähr
0.5 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute (vvm). Ein
optimales Verhältnis
in einem 30 l Kessel ist ungefähr
0.3 vvm mit Bewegung, die durch einen konventionellen mit ungefähr 200–500 U/min,
vorzugsweise mit 240 U/min rotierenden Propeller erzeugt wird. Die
Zugabe einer kleinen Menge, wie beispielsweise 1 ml/l, eines schaumverhindernden
Mittels, wie Silikon zum Fermentationsmedium ist notwendig, falls
die Schaumbildung ein Problem darstellt.
Die
Produktion beginnt im Allgemeinen nach ungefähr 96 Stunden und findet für mindestens
3 Tage während
der Fermentationsperiode statt. Die Peak-Produktion wird zwischen
ungefähr
6 bis 7 Tagen Fermentationszeit erreicht.
Die
Verbindung der Formel (IX) kann aus dem Fermentationsmedium durch übliche Verfahren
isoliert werden.
Die
Verbindung der Formel (IX) ist vor allem im Kulturfiltrat der fermentierten
Mikroorganismen vorhanden, sie kann jedoch auch in geringen Mengen
im Myzel der Mikroorganismen vorkommen. Die Kulturbrühe kann
auf einfache Weise durch Separation durch einen Separator erhalten
werden.
Verschiedene
Verfahren können
verwendet werden, um die Verbindung der Formel (IX) aus der Fermentationsbrühe zu isolieren
und zu reinigen, wie durch chromatographische Adsorptionsverfahren
(beispielsweise durch Säulenchromatographie,
Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie,
Gelpermeationschromatographie) gefolgt von Elution mit einem geeigneten
Lösungsmittel,
Kristallisation aus Lösungsmitteln,
sowie Kombinationen davon. In einem bevorzugten Reinigungsverfahren
wird die Verbindung der Formel (IX) aus den Myzelien oder aus Extrakten
des Überstands
extrahiert. Letztere können
unter Verwendung von Adsorptionsharzen, wie beispielsweise XAD,
HP20 oder Lewapol hergestellt werden. Säulenchromatographie-Methoden,
vorzugsweise Biotage C18 KP werden verwendet, um eine Anfangs-Reinigung
durchzuführen.
Die endgültige
Reinigung der Verbindung wird vorzugsweise durch präparative
Hochleistungs-Flüssigchromatographie
(HPLC) mit C18 Säulenmaterialien
erreicht.
Bevorzugte
Fermentationsbedingungen und Medien sind in den Beispielen 1A bis
3A beschrieben.
Die
genannten Stämme
Streptomyces bottropensis DSM 16814 und Streptomyces spec. DSM 17025 sind
bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland
nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
In
einem alternativen Verfahren kann die C-terminale Funktionalisierung,
z.B. zu Amiden, nach der Verseifung des Esters im Bottromycin A2
zuerst durchgeführt
und anschließend
der Ring geöffnet
und nach Edmann-Abbau eine andere Aminosäure in den Ring eingebaut werden.
Die
Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
kann durch das folgende Syntheseschema verdeutlicht werden.
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
zeigen nicht vorhersehbare, wertvolle antibakterielle und pharmakokinetische
Eigenschaften.
Sie
eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung
und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften allein oder in Kombination
mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten,
insbesondere von bakteriellen Infektionen, eingesetzt werden.
Beispielsweise
können
lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden,
die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden
Erreger verursacht werden:
Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken
(Staph. aureus, Staph. epidermidis) und Streptokokken (Strept. agalactiae,
Strept. faecalis, Strept. pneumoniae, Strept. pyogenes); gram-negative
Kokken (neisseria gonorrhoeae) sowie gram-negative Stäbchen wie
Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Citrobacter
(Citrob. freundii, Citrob. divernis), Salmonella und Shigella; ferner
Klebsiellen (Klebs. pneumoniae, Klebs. oxytocy), Enterobacter (Ent.
aerogenes, Ent. agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr. marcescens),
Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providencia,
Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter. Darüber hinaus umfaßt das antibakterielle
Spektrum die Gattung Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia)
sowie strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter
der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium;
ferner Mykoplasmen (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum) sowie
Mykobakterien, z.B. Mycobacterium tuberculosis.
Die
obige Aufzählung
von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzufassen.
Als
Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen
verursacht und durch die erfindungsgemäßen anwendbaren Zubereitungen
verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise
genannt:
Infektionskrankheiten beim Menschen wie z.B. septische
Infektionen, Knochen- und Gelenkinfektionen, Hautinfektionen, postoperative
Wundinfektionen, Abszesse, Phlegmone, Wundinfektionen, infizierte
Verbrennungen, Brandwunden, Infektionen im Mundbereich, Infektionen
nach Zahnoperationen, septische Arthritis, Mastitis, Tonsillitis,
Genital-Infektionen und Augeninfektionen.
Außer beim
Menschen können
bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft
seien genannt:
Schwein: Coli-diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis,
Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Agalaktiae-Syndrom,
Mastitis;
Wiederkäuer
(Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose,
Pasteurellose, Mykoplasmose, Genitalinfektionen;
Pferd: Bronchopneumonien,
Fohlenlähme,
puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;
Hund
und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte,
Prostatitis;
Geflügel
(Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): Mycoplasmose,
E. coli-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose,
Pasteurellose, Psittakose.
Ebenso
können
bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz-
und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle
Spektrum über
die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B.
Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris,
Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsie, Yersinia,
erweitert.
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise
von bakteriellen Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere
der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe
von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung
und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten
Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge
der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie
auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral,
pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal,
conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese
Applikationswege können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale
Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende
schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende
Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner
und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B.
Tabletten (nichtüberzogene
oder überzogene
Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder
unlöslichen Überzügen, die
die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren),
in der Mundhöhle
schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate,
Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees,
Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder
Lösungen.
Die
parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes
geschehen (z.B. intravenös,
intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder
unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan,
intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation
eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen
in Form von Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen
Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.
Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual
oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln,
Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln,
wässrige
Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen),
lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische
Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder,
Implantate oder Stents.
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in die angeführten
Applikationsformen überführt werden.
Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten,
nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen.
Zu diesen Hilfsstoffen zählen
u.a. Trägerstoffe
(beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol),
Lösungsmittel
(z.B. flüssige
Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel
(beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel
(beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere
(beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie
beispielsweise Ascorbinsäure),
Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide)
und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens
eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise
zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch
geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den
zuvor genannten Zwecken.
Im
Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler
Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg/kg Körpergewicht je 24 h zur Erzielung
wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge
etwa 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht
je 24 h.
Trotzdem
kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen
abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit
von Körpergewicht,
Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der
Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation
erfolgt. So kann es in einigen Fällen
ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge
auszukommen, während
in anderen Fällen
die genannte obere Grenze überschritten
werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert
sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die
Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern
nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile.
Lösungsmittelverhältnisse,
Verdünnungsverhältnisse
und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen
sich jeweils auf das Volumen.
A. Beispiele
Verwendete Abkürzungen:
- abs.
- absolut
- aq.
- wässrig
- CDCl3
- Chloroform
- CH
- Cyclohexan
- d
- dublett (im 1H-NMR)
- dd
- dublett von dublett
(im 1H-NMR)
- DC
- Dünnschichtchromatographie
- DCC
- Dicyclohexylcarbodiimid
- DIC
- Diisopropylcarbodiimid
- DIEA
- Diisopropylethylamin
(Hünig-Base)
- DMS
- O Dimethylsulfoxid
- DMAP
- 4-N,N-Dimethylaminopyridin
- DMF
- Dimethylformamid
- d. Th.
- der Theorie
- EDC
- N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid × HCl
- EE
- Ethylacetat (Essigsäureethylester)
- ESI
- Elektrospray-Ionisation
(bei MS)
- ges.
- gesättigt
- HATU
- O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
- HBTU
- O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat
- HOBt
- 1-Hydroxy-1H-benzotriazol × H2O
- h
- Stunde(n)
- HPLC
- Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
- LC-MS
- Flüssigchromatographie-gekoppelte
Massenspektroskopie
- m
- multiplett (im 1H-NMR)
- min
- Minute
- MS
- Massenspektroskopie
- NMR
- Kernresonanzspektroskopie
- proz.
- Prozent
- q
- quartett (im 1H-NMR)
- Rf
- Retentionsindex (bei
DC)
- RP
- Reverse Phase (bei
HPLC)
- RT
- Raumtemperatur
- Rt
- Retentionszeit (bei
HPLC)
- s
- singulett (im 1H-NMR)
- t
- triplett (im 1H-NMR)
- THF
- Tetrahydrofuran
- TPTU
- 2-(2-Oxo-1(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
LC-MS- und HPLC-Methoden:
Methode
1 (Standard-Bedingungen für
die präparative
HPLC zur Aufreinigung von Bottromycin-Derivaten): Säule: VP
250/21 Nukleodur 100-5, C18 ec, Macherey&Nagel: 762002; Eluent A: 0.01% Trifluoressigsäure in Wasser,
Eluent B: Acetonitril/0.01% Trifluoressigsäure; Gradient: 0 min 0%B, 20
min 20%B, 40 min 20%B, 60 min 30%B, 100 min 30%B, 110 min 100%B,
132 min 100%B; Fluss: 5 ml/min; Ofen: 30°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode
2 (Standard-Bedingungen für
die analytische HPLC von Bottromycin-Derivaten): Säule: XTerra
3.9 × 150
WAT 186000478; Temperatur: 40°C;
Fluss: 1 ml/min; Eluent A: 0.01% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril
+ 0.01% Trifluoressigsäure,
Gradient: 0.0 min 20%B → 1
min 20%B → 4
min 90%B → 6
min 90%B → 6.2
min 20%B.
Methode
3 (Standard-Bedingungen für
die analytische LC-MS Messung von Bottromycin-Derivaten): Instrument: Micromass LCT
mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule:
Waters Symmetry C18; 3.5 μm;
50 mm × 2.1 mm;
Eluent A: 1 l Wasser + 1 ml 98–100
%ige Ameisensäure;
Eluent B: 1 l Acetonitril + 1 ml 98–100ige Ameisensäure; Gradient:
0 min 100%A → 1
min 100%A → 6
min 10%A → 8
min 0%A → 10
min 0%A → 10.1
min 100%A → 12
min 100%A; Fluss 0 min bis 10 min 0.5 ml/min → 10.1 min 1 ml/min → 12 min
0.5 ml/min; Ofen: 40°C;
UV-Detektion DAD: 208–500
nm.
NMR-Messungen:
NMR-Messungen wurden durchgeführt
an einem Bruker DMX500 mit der Protonenfrequenz 500.13 MHz. Lösemittel
war DMSO-d6, Temperatur 302K. Die Kalibrierung
erfolgte auf das DMSO-Signal bei 2.5 ppm.
Ausgangsverbindungen
Die
Struktur des Bottromycin A2 (Beispiel 1A) ist durch eine Röntgenstrukturanalyse
bestätigt.
Es wird davon ausgegangen, dass die weiterhin erwähnten Bottromycine
(Beispiele 2A bis 5A) dieselbe Stereochemie aufweisen, da sie ähnliche
NMR-Spektren zeigen. Diese Strukturen weisen damit eine andere Stereochemie auf
als der Stand der Technik.
Die
bei der Fermentation entstandenen Verbindung 1A bis 5A werden in
weiteren Reaktionen eingesetzt (siehe Beispiel 6A). Sollte die Zuordnung
der Stereochemie in den Verbindung 1A bis 5A tatsächlich anders
sein, so ist auch die Stereochemie der Folgeprodukte dementsprechend
anders.
Beispiele 1A
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[ 1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
(Bottromycin A2)
Beispiel 2A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-((1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
(Bottromycin B2)
Beispiel 3A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14,14-dimethyl-1,4,10-trioxododecahydropynolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
(Bottromycin C2)
Beispiel 4A
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[ 1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-2-carboxy-1-(1,3-thiazol-2-yl)ethyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
(Bottromycin A2 als Säure)
Beispiel 5A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14,14-dimethyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-2-carboxy-1-(1,3-thiazol-2-yl)ethyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
(Bottromycin C2 als Säure)
Synthese der Verbindungen
1A, 2A, 3A, 4A und 5A
Verwendete Stämme
Tabelle
1: Stämme,
die zur Produktion der Vorstufen Bottromycin A und B befähigt sind:
- ATCC = American Type Culture Collection, Manassas, Virginia,
U.S.A.
- DSM = Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkuluren, Braunschweig, Deutschland.
- CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands
Streptomyces
bottropensis wurde von der Koninklijke Nederlandsche Gisten Spiritusfabriek,
N.V. isoliert, identifiziert und unter der Stammhinterlegungsnummer
CBS 163.64 bei der CBS, Baarn, Niederlande, hinterlegt (BP 762736,
1954). Zum Zweck der Überprüfung des
Vorliegenden Patentes wurde der Stamm erneut bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen
und Zellkuluren, Braunschweig, Deutschland unter der Eingangsnummer
DSM 16814 hinterlegt.
Streptomyces
spec. DSM 17025 wurde aus einer Bodenprobe aus der Eifel/Deutschland
isoliert und unter der Stammnummer BC 16019 in die Stammsammlung
der Bayer Healthcare AG aufgenommen.
Produktion der Beispiele
1A, 2A und 3A
Herstellung der Vorkultur
von S. bottropensis DSM 16814
Zur
Herstellung der Vorkultur wurde der Stamm S. bottropensis DSM 16814
in folgendem Medium angezogen: Medium 1: Hefe-Malz Medium: D-Glucose
0.4 %, Hefeextrakt 0.4 %, Malzextrakt 1.0 %, ad 1 Liter Leitungswasser.
Der pH-Wert des Mediums wurde mit wässriger Natronlauge auf 7.2
eingestellt. Das Medium wurde jeweils bei 121 °C und 1.1 bar Überdruck
für 20
Minuten sterilisiert.
Je
2 ml einer Myzelsuspension in 50 % Glycerin wurden als Inokulum
für 15 × 150 ml
Medium 1 in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben angesetzt und 96 Stunden
bei 240 Umdrehungen pro Minute (U/min) und 28°C auf einer Rundschüttelmaschine
inkubiert. Diese Kulturen wurden entweder benutzt, um neue Glycerinkonserven
herzustellen, die bei –20°C aufbewahrt
wurden, oder sie dienten als Inokulum für die Produktionskulturen.
Produktionskultur (30
Liter Maßstab)
von S. bottropensis DSM 16814
Zur
Herstellung der Produktionskultur wurde 15 × 150 ml einer wie oben beschriebenen
Vorkultur als Inokulum für
22 Liter des folgenden Mediums 2 eingesetzt: Glucose (1 %), Stärke (1.5
%), Hefeextrakt (0.5 %), Sojamehl entfettet (1.0 %), Natriumchlorid
(0.5 %), Calciumcarbonat (0.3 %). Vor dem Beimpfen wurde dem Medium
1 ml Entschäumer
SAG 5693 (Union Carbide, USA) pro Liter zugesetzt, und für 60 Minuten
bei 1.1 bar mit Dampf sterilisiert. Diese Produktionskultur wurde
120–160
Stunden bei 28°C
bei einer Rührgeschwindigkeit
von 240 U/min und mit einer Belüftungsrate
von 0.3 vvm in einem 30 l Bioengineering (Schweiz) Rührfermenter
(Blattrührer)
inkubiert. Zur Verfolgung des Produktions-Prozesses dienten tägliche Proben
von 20 ml, die steril entnommen und mit Hilfe der analytischen HPLC
untersucht wurden. Unter diesen Bedingungen wurden Ausbeuten an
Bottromycin A (Beispiel 1A) von 20 mg/l erhalten.
Herstellung der Vorkultur
von 5. spec. DSM 17025
Zur
Herstellung der Vorkultur wurde der Stamm S. spec. DSM 17025 in
folgendem Medium angezogen: Medium 1: Hefe-Malz Medium: D-Glucose
0.4 %, Hefeextrakt 0.4 %, Malzextrakt 1.0 %, ad 1 Liter Leitungswasser.
Der pH-Wert des Mediums wurde mit wässriger Natronlauge auf 7.2
eingestellt. Das Medium wurde jeweils bei 121 °C und 1.1 bar Überdruck
für 20
Minuten sterilisiert.
Je
2 ml einer Myzelsuspension in 50 % Glycerin wurden als Inokulum
für 2 × 150 ml
Medium 1 in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben angesetzt und 96 Stunden
bei 240 Umdrehungen pro Minute (U/min) und 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine
inkubiert. Diese Kulturen wurden entweder benutzt, um neue Glycerinkonserven herzustellen,
die bei –20 °C aufbewahrt
wurden, oder sie dienten als Inokulum für die Produktionskulturen.
Produktionskultur (30
Liter Maßstab)
von S. spec DSM 17025
Zur
Herstellung der Produktionskultur wurden 2 × 150 ml einer wie oben beschriebenen
Vorkultur als Inokulum für
30 Liter des folgenden Mediums 2 eingesetzt: Glucose (1 %), Stärke (1.5
%), Hefeextrakt (0.5 %), Sojamehl entfettet (1.0 %), Natriumchlorid
(0.5 %), Calciumcarbonat (0.3 %). Vor dem Beimpfen wurde dem Medium
1 ml Entschäumer
SAG 5693 (Union Carbide, USA) pro Liter zugesetzt, und für 60 Minuten
bei 1.1 bar mit Dampf sterilisiert. Diese Produktionskultur wurde
90–140
Stunden bei 28°C
bei einer Rührgeschwindigkeit
von 240 U/min und mit einer Belüftungsrate
von 0.3 vvm in einem 40 l Bioengineering (Schweiz) Rührfermenter
(Blattrührer)
inkubiert. Zur Verfolgung des Produktions-Prozesses dienten tägliche Proben
von 20 ml, die steril entnommen und mit Hilfe der analytischen HPLC
untersucht wurden. Unter diesen Bedingungen wurden Ausbeuten an
Bottromycin A (Beispiel 1A) von 20 mg/l erhalten.
Analytische
HPLC
Zur
Detektion während
der Biosynthese wurden analytische HPLC-Methoden mit UV/visueller (HPLC-UV/Vis)
und mit massenspektrometrischer Detektion eingesetzt.
Vor
der HPLC-Analyse wurden die wässrigen
Fermentationsproben in Myzel und Kulturüberstand getrennt und beide
erhaltene Produkte mit Methanol versetzt: Das Kulturfiltrat wurde
1:4 mit Methanol verdünnt, das
abzentrifugierte Myzel 15 min lang mit dem Ursprungsvolumen Methanol
im Ultraschallbad extrahiert. Die methanolischen Proben wurden mit
einem 0.45 μm-Filter
filtriert und an der analytische HPLC bzw. LC-MS injiziert.
Analysen
mittels HPLC-MS wurden an einem HP1100 HPLC-System, gekoppelt mit
einem Micromass-LCT Massenspektrometer (Micromass, Manchester, Großbritannien),
im ESI+ und ESI– Modus
durchgeführt.
Massenspektren wurden im Bereich zwischen m/z = 100 und 1650 aufgezeichnet.
Die einzelnen Bottromycine haben folgende Retentionszeiten:
Bottromycin
A2 (Beispiel 1A): Rt = 4.54 min.
Bottromycin
B2 (Beispiel 2A): Rt = 4.51 min.
Bottromycin
C2 (Beispiel 3A): Rt = 4.61 min.
Bottromycin
A2 freie Säure
(Beispiel 4A): Rt = 4.51 min.
Bottromycin
C2 freie Säure
(Beispiel 5A): Rt = 4.48 min.
Das
verwendete HPLC-MS-System operierte mit folgenden Parametern: Stationäre Phase:
Waters Symmetry C18, 3.5 μm
2.1 × 50
mm; Mobile Phase: Gradient Wasser mit 0.1 % Ameisensäure (A)
und Acetonitril mit 0.1 % Ameisensäure (B): 0–1 Minuten 100 %A; 1–6 Minuten
linearer Gradient auf 90%B; 6–8
Minuten 90%B–100%B;
8–10 min
100%B; Flussrate 0.5 ml/min; Säulenofen
40°C, UV-Detektion:
DAD 208–700
nm. Der Nachweis der Bottromycine erfolgte anhand der protonierten
Molekülionen
(M+H)+ und der deprotonierten Molekülion (M-H)–,
der doppelt geladenen Moleküle
(M+2H)++ und den Ameisensäureaddukten
(M+AS)–.
Bottromycin
A2 (Beispiel 1A): (M+H)+ = 823.8; (M+2H)++ = 412.5; (M-H)– =
821.6; (M+AS)– =
867.7
Bottromycin B2 (Beispiel 2A): (M+H)+ =
809.8; (M+2H)++ = 405.5; (M-H)– =
807.6; (M+AS)– =
853.6
Bottromycin C2 (Beispiel 3A): (M+H)+ =
837.7; (M+2H)++ = 419.5; (M-H)– =
835.6; (M+AS)– =
881.6
Bottromycin A2 freie Säure (Beispiel 4A): (M+H)+ = 809.6; (M+2H)++ =
405.5; (M-H)– =
807.5
Bottromycin C2 freie Säure (Beispiel 5A): (M+H)+ = 823.7; (M+2H)++ =
412.5; (M-H)– =
821.5; (M+AS)– =
867.5
HPLC-UV/Vis
Analysen wurden mit Hilfe eines Hewlett Packard Series 1100 analytical
HPLC System (HP, Waldbronn, Deutschland),
bestehend aus einem G 1312A binären
Pumpensystem, einem G 1315A Diodenarray-Detektor, einem G 1316A
Säulentemperiersystem,
einem G 1322A Entgasersystem und einem G 1313A Autoinjektor durchgeführt. Als
mobile Phase wurde Wasser mit 0.05 % Trifluoressigsäure (A)
und Acetonitril mit 0.05 % Trifluoressigsäure (B) bei einem Fluss von
0.4 ml/min verwendet, während
eine Waters Symmetry C18, 3.5 μm
2.1 × 50
mm -Säule
mit 10 mm-Vorsäule
als stationäre
Phase diente. Die Proben wurden mit einem Stufengradienten 0-100%B aufgetrennt
(25-25-45-45-65-100-25%B in 0-1-2-3.5-6.7-6.8-7.8-8.4 min). HPLC-UV
Chromatogramme wurden bei 210 nm (Detektion von Verunreinigungen),
225 nm sowie 254 nm aufgezeichnet. Die Diodenarray-Detektion im
Bereich von 200–600
nm lieferte die HPLC-UV/Vis Spektren. Der Säulenofen wurde auf 45°C eingestellt.
Die
beschriebenen Verbindungen haben folgendes UV-Spektrum: UVmax bei 206–207 nm sowie eine schwache
Schulter bei 230 nm und folgende Retentionszeiten:
Bottromycin
A2 (Beispiel 1A): Rt = 4.68 min.
Bottromycin
B2 (Beispiel 2A): Rt = 4.54 min.
Bottromycin
C2 (Beispiel 3A): Rt = 4.88 min.
Bottromycin
A2 freie Säure
(Beispiel 4A): Rt = 3.44 min.
Bottromycin
C2 freie Säure
(Beispiel 5A): Rt = 4.22 min.
Isolierung der Verbindungen
der Beispiele 1A, 2A, 3A, 4A und 5A aus Rührfermenter-Kulturen (30 Liter Maßstab)
Die
Myzelien aus Fermentationen des Stammes Streptomyces bottropensis
DSM 16814 im 30 Liter Maßstab
wurden durch Zentrifugation (15 Minuten bei 2300 U/min) vom Überstand
abgetrennt.
Der
nach Zentrifugation erhaltene Kulturüberstand wurde auf eine 2500
ml Lewapolsäule
(Adsorberharz, OC 1064, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) aufgetragen.
Der Durchlauf wurde ebenso wie das Waschwasser (ca. 30 l) verworfen.
Danach wurde mit 6 Säulenvolumen
60% Methanol und 3 Säulenvolumen 80%
Methanol nachgewaschen. Die resultierenden Fraktionen wurden verworfen
und die an das Adsorberharz gebundenen Bottromycine mit mindestens
10 Säulenvolumen
100% Methanol eluiert. Das Eluat wurde danach im Vakuum getrocknet.
Das
nach der Zentrifugation erhaltene Myzel wurde mit zweimal mit je
5 l Methanol im Ultra-Turrax
P50 DPX (Janke&Kunkel
Labortechnik) aufgeschlossen, anschließend abgetrennt und verworfen.
Der vom Aufschluss des Myzels erhaltene methanolische Extrakt wurde
einrotiert und der wässrige
Rückstand
(ca. 2.6 l) wurde viermal mit jeweils 2 l Ethylacetat extrahiert.
Die Ethylacetatphase wurde über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum getrocknet.
Die
Rückstände aus
der Aufarbeitung des Myzels (ca. 11g, Gehalt an Bottromycin A2 → Hauptmetabolit,
ca. 3%) und des Kulturüberstands
(ca. 5g, Gehalt an Bottromycin A2 ca. 10%) wurden vereinigt, in
Methanol angelöst
und über
eine Biotage Chromatographiesäule
(Flash 75, 75 × 300
mm, Biotage C18 KP-WP, 15–20 μM) weiter
aufgereinigt. Verwendung fand ein Stufengradient mit den Laufmitteln
Wasser mit 0.05% Trifluoressigsäure
(A) und Acetonitril mit 0.05% Trifluoressigsäure (B) bei einer Flussrate
von 80 ml/min mit den Stufen 12, 16, 20, 25, 28, 31, 31, 35 und
50%B. Die Bottromycine eluierten bei 31 %B, wurden im Vakuum zur
Trockene eingeengt (Rückstand
ca. 0.9 g, Ausbeute ca. 61% Bottromycin A2) und in Methanol gelöst. Die Gesamtmenge
wurde gedrittelt und in drei einzelnen Läufen mittels einem präparativen
HPLC-System aufgetrennt:
Hardware Gilson Abimed HPLC (UV Detektor 210 nm, binäres Pumpensystem,
Fraktionssammler); Feste Phase: Inertsil ODS-3 C18, 5 μm; 30 × 250 mm
mit Vorsäule
Nucleosil C18, 7 μm,
20 × 30
mm; Flussrate: 41.2 ml/min; Fraktionsgröße 20.6 ml/0.5 min ab 50 min);
Stufengradient von Wasser mit 0.05% Trifluoressigsäure (A)
nach Acetonitril mit 0.05% Trifluoressigsäure (B): 0-15-75-105-115-125
min mit 10-10-30-30-100-100 %B.
Die
Bottromycine eluierten im Gradientenbereich 31–35%B. Die einzelnen Fraktionen
wurden nach HPLC und HPLC-MS-Analytiken entsprechend den Zielsubstanzen
vereinigt und im Vakuum getrocknet.
Vom
Hauptmetaboliten Bottromycin A2 (Beispiel 1A) konnte eine Ausbeute
von 320 mg mit > 97% Reinheit
erzielt werden. Von den Nebenmetaboliten Bottromycin B2 (Beispiel
2A) und Bottromycin C2 (Beispiel 3A) wurden 12 mg mit > 98% Reinheit und ca.
15 mg mit > 90% Reinheit
gewonnen. Die freien Säuren
von Bottromycin A2 (Beispiel 4A) und Bottromycin C2 (Beispiel 5A)
liegen als Minoritätskomponenten
in Mengen < 5 mg
vor. Der Nebenmetabolit (Beispiel 3A) und die Minoritätskomponenten
(Beispiel 4A), (Beispiel 5A) wurden mit der gleichen präparativen
HPLC-Methode in einem weiteren Trennschritt auf > 98% Reinheit nachgereinigt.
Nach
der Reinigung liegen die Bottromycine als Salze der Trifluoressigsäure vor,
eine Umsalzung zu Mesyl- und Formiatsalzen ist gut möglich.
Beispiel 6A
N-{(2S)-1-[(2-Hydroxyethyl)amino]-3,3-dimethyl-2-[(3-methyl-L-prolyl-L-valyl)amino]butyliden}-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-betamethyl-L-phenylalaninamid
300
mg (360 μmol)
Bottromycin A2 (Beispiel 1A) werden in 80 ml Methanol gelöst. Innerhalb
von 1 h gibt man bei RT portionsweise insgesamt 2 g Natriumborhydrid
zu. Anschließend
werden ca. 4.5 ml Trifluoressigsäure
zugesetzt bis ein pH von ca. 2–3
erreicht ist. Man engt ein und nimmt den Rückstand in 30 ml Acetonitril/Wasser
1:1 auf. Das Produkt wird durch präparative HPLC nach der Methode
1 gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, das
Lösungsmittel
abgezogen und der verbleibende Rückstand
aus Dioxan lyophilisiert. Man erhält 220 mg (73% d. Th.) der
ringgeöffneten
Verbindung.
HPLC (Methode 2): Rt =
4.0 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 4.02
min; m/z = 827 (M+H)+
Beispiel 7A
N-{(2S)-2-{[1-(Anilinocarbonothioyl)-3-methyl-L-prolyl-L-valyl]amino}-1-[(2-hydroxyethyl)amino]-3,3-dimethylbutyliden}-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
204
mg (247 μmol)
der Verbindung aus Beispiel 6A werden in 120 ml DMF gelöst. Man
gibt 50 mg (370 μmol)
Phenylisothiocyanat und 96 mg Ethyldiisopropylamin zu. Nach 1 h
Rühren
bei RT ist die Reaktion abgeschlossen. Man engt ein und reinigt
den verbleibenden Rückstand
durch präparative
HPLC nach der Methode 1. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt,
das Lösungsmittel
abgezogen und der Rückstand
aus Dioxan lyophilisiert. Man erhält 183 mg (77% d. Th.) der
Zielverbindung.
HPLC (Methode 2): Rt =
4.5 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 5.0
min; m/z = 962 (M+H)+
BeisPiel 8A
N-[(2S)-1-[(2-Hydroxyethyl)amino]-3,3-dimethyl-2-(L-valylamino)butyliden]-3-methyl-L-valyl(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
183
mg (190 μmol)
der Verbindung aus Beispiel 7A werden in 30 ml Dichlormethan gelöst und mit
50 ml Trifluoressigsäure
versetzt. Man rührt über Nacht
bei 40°C.
Man engt ein und reinigt den verbleibenden Rückstand durch präparative
HPLC nach der Methode 1. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, das
Lösungsmittel
abgezogen und der Rückstand
aus Dioxan/Wasser lyophilisiert. Man erhält 88 mg (65% d. Th.) der Zielverbindung.
HPLC
(Methode 2): Rt = 3.5 min;
LC-MS (Methode
3): Rt = 4.09 min; m/z = 716 (M+H)+