DE102005055946A1

DE102005055946A1 - Cyclische Iminopeptid-Derivate

Info

Publication number: DE102005055946A1
Application number: DE102005055946A
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr. Lerchen; Guido Dr. Schiffer; Heike Dr. Brötz-Österhelt; Anke Dr. Mayer-Bartschmid; Stefan Dr. Eckermann; Christoph Dr. Freiberg; Rainer Dr. Endermann; Joachim Dr. Schuhmacher; Heinrich Dr. Meier; Niels Dr. Svenstrup; Stephan Dr. Seip; Matthias Dr. Gehling; Dieter Dr. Häbich
Original assignee: Aicuris GmbH and Co KG
Current assignee: Aicuris GmbH and Co KG
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-11-24
Publication date: 2006-11-23
Also published as: JP2008534538A; EP1866312A1; WO2006103010A1

Abstract

Die Erfindung betrifft antibakterielle cyclische Iminopeptid-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.

Description

In JP 43010998 , JP 47010036 , US 3650904 , JP 49116297 und HU 52165 wird die Fermentation von Bottromycin beschrieben. US 3380885 beschreibt Bottromycin als Antibiotikum zur Behandlung von Hühnern und Puten und JP 61165332 zur Behandlung von Mycoplasmose in Haustieren und Dysenterie bei Schweinen. Die von Bottromycin im Stand der Technik beschriebenen Strukturen zeigen eine falsche Stereochemie.

Amid- und Hydrazin-Derivate des Bottromycins sind unter Annahme eines falschen Bottromycin-Grundgerüstes in JP 42006905 , DE 1620027 , J. Antibiotics 19, 1966, 149, J. Antibiotics 20, 1967, 162 und J. Med. Chem. 11, 1968, 746 als Antibiotikum veröffentlicht.

Die Naturstoffe entsprechen hinsichtlich ihrer Eigenschaften nicht den Anforderungen, die an antibakterielle Arzneimittel gestellt werden. Auf dem Markt sind zwar strukturell andersartige antibakteriell wirkende Mittel vorhanden, es kann aber regelmäßig zu einer Resistenzentwicklung kommen. Neue Mittel für eine gute und wirksamere Therapie sind daher wünschenswert.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative Verbindungen mit gleicher oder verbesserter antibakterieller Wirkung zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass bestimmte Derivate dieser Naturstoffe, worin die Estergruppe der Naturstoffe gegen substituierte Hydroxamate ausgetauscht wird, antibakteriell wirksam sind und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften gegenüber den Naturstoffen aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

in welcher
R¹ und R² für Wasserstoff stehen,
oder
R¹ und R² für Methyl stehen,
oder
R¹ für Methyl und
R² für Wasserstoff steht,
und
R³ und R⁴ unabhängig voneinander für C₁-C₄-Alkyl,
welches substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl, C₃-C₆-Cycloalkyl, C₆-C₁₀-Aryl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl
und, sofern es sich bei C₁-C₄-Alkyl nicht um Methyl handelt, alternativ oder zusätzlich substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₆-Alkylamino,
oder für C₃-C₆-Cycloalkyl stehen,
welches substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl und C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl,
oder
R³ und R⁴ zusammen für (CH₂)₃ oder (CH₂)₄ stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl und C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl,
oder
R³ und R⁴ zusammen mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Gruppe der Formel

bilden,
wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und (Ia) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, sowie die von Formel (I) und (Ia) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) und (Ia) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich durch bekannte Verfahren wie Chromatographie an chiraler Phase oder Kristallisation mit chiralen Aminen oder chiralen Säuren die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.

Die Erfindung betrifft in Abhängigkeit von der Struktur der Verbindungen auch Tautomere der Verbindungen.

Als Salze sind im Rahmen der Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt.

Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Trifluoressigsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Dihydroabietylamin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und Methylpiperidin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkoxy, Alkylamino, Alkoxycarbonyl und Alkylaminocarbonyl stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.

Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy und tert.-Butoxy.

Alkylamino steht für einen Alkylaminorest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, Isopropylamino, tert.-Butylamino, n-Pentylamino, n-Hexylamino, N,N-Dimethylamino, N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino, N-Isopropyl-N-n-propylamino, N-tert.-Buty1-N-methylamino, N-Ethyl-N-n-pentylamino und N-n-Hexyl-N-methyl-amino. C₁-C₃-Alkylamino steht beispielsweise für einen Monoalkylaminorest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.

Alkoxycarbonyl steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.

Alkylaminocarbonyl steht für einen Alkylaminocarbonylrest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten, wobei die Alkylsubstituenten unabhängig voneinander in der Regel 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen, beispielhaft und vorzugsweise für Methylaminocarbonyl, Ethylaminocarbonyl, n-Propylaminocarbonyl, Isopropylaminocarbonyl, tert.-Butylaminocarbonyl, n-Pentylaminocarbonyl, n-Hexylaminocarbonyl, N,N-Dimethylaminocarbonyl, N,N-Diethylaminocarbonyl, N-Ethyl-N-methylaminocarbonyl, N-Methyl-N-n-propylaminocarbonyl, N-Isopropyl-N-n-propylaminocarbonyl, N-tert.-Butyl-N-methylaminocarbonyl, N-Ethyl-N-n-pentylaminocarbonyl und N-n-Hexyl-N-methylaminocarbonyl. C₁-C₃-Alkylaminocarbonyl steht beispielsweise für einen Monoalkylaminocarbonylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminocarbonylrest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.

Cycloalkyl steht für eine Cycloalkylgruppe mit in der Regel 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkyl sind genannt Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.

Aryl steht für einen mono- oder bicyclischen aromatischen Rest mit in der Regel 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Aryl sind genannt Phenyl und Naphthyl.

Heteroaryl steht für einen aromatischen, monocyclischen Rest mit in der Regel 5 bis 6 Ringatomen und bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann, beispielhaft und vorzugsweise für Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Oxadiazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod, vorzugsweise für Fluor und Chlor.

Wenn Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert sind, können die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach gleich oder verschieden substituiert sein. Eine Substitution mit bis zu drei gleichen oder verschiedenen Substituenten ist bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem Substituenten.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
R¹ und R² für Wasserstoff stehen,
oder
R¹ und R² für Methyl stehen,
oder
R¹ für Methyl und
R² für Wasserstoff steht,
und
R³ und R⁴ unabhängig voneinander für Methyl oder Ethyl stehen,
oder
R³ und R⁴ zusammen für (CH₂)₃ oder (CH₂)₄ stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Ethoxycarbonyl,
oder
R³ und R⁴ zusammen mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Gruppe der Formel

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R¹ für Methyl und
R² für Wasserstoff steht,
und
R³ und R⁴ unabhängig voneinander für Methyl oder Ethyl stehen,
oder
R³ und R⁴ zusammen für (CH₂)₃ oder (CH₂)₄ stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Ethoxycarbonyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), welche der Formel

entsprechen,
in welcher
R¹, R², R³ und R⁴ die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei

[A] Verbindungen der Formel
in welcher R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben, in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel
worin R³ und R⁴ die oben angegebene Bedeutung haben, umgesetzt werden, oder
[B] Verbindungen der Formel (II) in der ersten Stufe in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel
worin R³ die oben angegebene Bedeutung hat, und in der zweiten Stufe mit Verbindungen der Formel
worin R⁴ die oben angegebene Bedeutung hat, und X¹ für Halogen, bevorzugt Brom oder Iod, steht, in Gegenwart einer Base umgesetzt werden.

Die Umsetzung nach Verfahren [A] und die 1. Stufe nach Verfahren [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodümid-N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert.-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluoro-phosphat (BOP), oder Mischungen aus diesen, oder Mischung aus diesen zusammen mit Basen.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.

Vorzugsweise wird die Kondensation mit 1-Hydroxybenztriazol in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethylamin, durchgeführt.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, oder Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dimethylformamid.

Die Umsetzung der 2. Stufe nach Verfahren [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Caesium-, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, bevorzugt ist Caesiumcarbonat.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan oder 1,2-Dichlorethan, oder Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, oder andere Lösemittel wie Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, 2-Butanon oder Acetonitril, oder Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser, bevorzugt ist Dioxan, Dioxan/Wasser oder Dimethylformamid.

Die Verbindungen der Formeln (III), (IIIa) und (IIIb) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem die Verbindungen der Formel

R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben,
mit einer Base umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, bevorzugt Lithiumhydroxid. Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan, 1,2-Dichlorethan oder Trichlorethylen, Ether wie Diethylether, Methyl-tert.-butylether, 1,2-Dimethoxyethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethylether, Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol, oder andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril oder Pyridin, oder Gemischen von Lösungsmitteln, als Lösungsmittel sind bevorzugt Tetrahydrofuran und/oder Methanol.

Die Verbindungen der Formel (IV) können durch Fermentation hergestellt werden. Sie werden beispielsweise produziert, wenn ein Stamm aus der Art Streptomyces bottropensis (DSM 16814) oder der Art Streptomyces spec. (DSM 17025) in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert wird. Typischerweise wird der Mikroorganismus in einem Nährmedium, welches eine Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls ein proteinartiges Material enthält, fermentiert. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin und Melasse. Bevorzugte Stickstoffquellen sind beispielsweise Baumwollsaatmehl, Hefe, autolysierte Bäckerhefe, feste Milchbestandteile, Sojabohnenmehl, Maismehl, pankreatische oder papainisch verdaute Spaltprodukte von Kasein, feste Destillationsbestandteile, Brühen aus tierischem Pepton und Fleisch- und Knochenstücke. Vorzugsweise werden Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet. Spurenelemente, wie beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt und Eisen müssen dem Fermentationsmedium nicht zugefügt werden, solange Leitungswasser und nicht-gereinigte Bestandteile als Mediumkomponenten verwendet werden.

Die Herstellung kann bei jeder Temperatur induziert werden, die ein ausreichendes Wachstum der Mikroorganismen gewährleistet. Vorzugsweise beträgt die Temperatur zwischen 21°C und 32°C, besonders bevorzugt ungefähr 28°C.

Im allgemeinen wird eine optimale Produktion innerhalb von 4 bis 8 Tagen, vorzugsweise in ungefähr 7 Tagen erhalten. Die Fermentationsbrühe bleibt normalerweise während der Fermentation schwach basisch (pH 7.2 bis pH 8.4). Der End-pH ist teilweise abhängig von dem gegebenenfalls verwendeten Puffer und teilweise vom anfänglichen pH des Kulturmediums. Vorzugsweise wird der pH auf ungefähr 6.5 bis 7.5 vor der Sterilisierung eingestellt, besonders bevorzugt auf pH 7.2.

Die Produktion findet sowohl in Schüttelflaschen als auch in Rühr-Fermentern statt. Wenn die Kultivierung in Schüttelflaschen oder großen Kesseln und Tanks durchgeführt wird, wird vorzugsweise die vegetative Form anstatt der Sporen-Form der Mikroorganismen zum Animpfen verwendet, um eine deutliche lag-Phase bei der Produktion der Metabolite und damit eine ineffiziente Ausnutzung der Gerätschaften zu vermeiden. Demnach ist es vorteilhaft, ein vegetatives Inokulum in einem wässrigen Nährmedium durch Animpfen dieses Mediums mit einem Aliquot einer Boden- oder Schrägröhrchen-Kultur herzustellen. Nachdem ein frisches, aktives, vegetatives Inokulum auf diese Weise vorbereitet worden ist, wird dieses aseptisch in weitere Schüttelflaschen oder weitere geeignete Gerätschaften für die Fermentation der Mikroorganismen überführt. Das Medium, in welchem das vegetative Inokulum hergestellt wird, kann identisch oder unterschiedlich zu demjenigen Medium sein, das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet wird, solange es ein ausreichendes Mikroorganismenwachstum gewährleistet.

Im allgemeinen wird die Herstellung unter Verwendung der oben genannten Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in Rühr-Fermentern bewerkstelligt. Die Herstellung ist jedoch unabhängig von den verwendeten Fermentern und Starterkulturen. Die Vorstufen können auch über Schüttelkulturen erhalten werden. Für großvolumige Fermentationen wird vorzugsweise ein vegetatives Inokulum verwendet. Das vegetative Inokulum wird durch Animpfen eines kleinen Volumens des Kulturmediums mit der Sporenform, Myzelfragmenten oder einem lyophilisierten Pellet des Mikroorganismus hergestellt. Das vegetative Inokulum wird dann in einen Fermentationskessel überführt, worin nach einer geeigneten Inkubationszeit die Verbindungen der Formel (IV) in einer optimalen Ausbeute produziert werden. Gewöhnlich wird bei einem aeroben Submers-Fermentationsverfahren sterile Luft durch das Kulturmedium geleitet. Für ein effizientes Wachstum der Mikroorganismen liegt das verwendete Luftvolumen im Bereich von ungefähr 0.25 bis ungefähr 0.5 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute (vvm). Ein optimales Verhältnis in einem 30 l Kessel ist ungefähr 0.3 vvm mit Bewegung, die durch einen konventionellen mit ungefähr 200–500 U/min, vorzugsweise mit 240 U/min rotierenden Propeller erzeugt wird. Die Zugabe einer kleinen Menge, wie beispielsweise 1 ml/l, eines schaumverhindernden Mittels, wie Silikon zum Fermentationsmedium ist notwendig, falls die Schaumbildung ein Problem darstellt.

Die Produktion beginnt im allgemeinen nach ungefähr 96 Stunden und findet für mindestens 3 Tage während der Fermentationsperiode statt. Die Peak-Produktion wird zwischen ungefähr 6 bis 7 Tagen Fermentationszeit erreicht.

Die Verbindungen der Formel (IV) können aus dem Fermentationsmedium durch übliche Verfahren isoliert werden.

Die Verbindungen der Formel (IV) sind vor allem im Kulturfiltrat der fermentierten Mikroorganismen vorhanden, sie können jedoch auch in geringen Mengen im Myzel der Mikroorganismen vorkommen. Die Kulturbrühe kann auf einfache Weise durch Separation durch einen Separator erhalten werden.

Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um die Verbindungen der Formel (IV) aus der Fermentationsbrühe zu isolieren und zu reinigen, wie durch chromatographische Adsorptionsverfahren (beispielsweise durch Säulenchromatographie, Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie, Gelpermeationschromatographie) gefolgt von Elution mit einem geeigneten Lösungsmittel, Kristallisation aus Lösungsmitteln, sowie Kombinationen davon. In einem bevorzugten Reinigungsverfahren werden die Verbindungen der Formel (IV) aus den Myzelien oder aus Extrakten des Überstands extrahiert. Letztere können unter Verwendung von Adsorptionsharzen, wie beispielsweise XAD, HP20 oder Lewapol hergestellt werden. Säulenchromatographie-Methoden, vorzugsweise Biotage C18 KP werden verwendet, um eine Anfangs-Reinigung durchzuführen. Die endgültige Reinigung der Verbindungen wird vorzugsweise durch präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) mit C18 Säulenmaterialien erreicht.

Bevorzugte Fermentationsbedingungen und Medien sind in den Beispielen 1A bis 3A beschrieben.

Die genannten Stämme Streptomyces bottropensis DSM 16814 und Streptomyces spec. DSM 17025 sind bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen nicht vorhersehbare, wertvolle antibakterielle und pharmakokinetische Eigenschaften.

Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von. Krankheiten bei Menschen und Tieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen, eingesetzt werden.

Beispielsweise können lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden, die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger verursacht werden:
Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (Staph. aureus, Staph. epidermidis) und Streptokokken (Strept. agalactiae, Strept. faecalis, Strept. pneumoniae, Strept. pyogenes); gram-negative Kokken (neisseria gonorrhoeae) sowie gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Citrobacter (Citrob. freundii, Citrob. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Klebsiellen (Klebs. pneumoniae, Klebs. oxytocy), Enterobacter (Ent. aerogenes, Ent. agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr. marcescens), Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providencia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter. Darüber hinaus umfaßt das antibakterielle Spektrum die Gattung Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia) sowie strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner Mykoplasmen (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum) sowie Mykobakterien, z.B. Mycobacterium tuberculosis.

Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzufassen.

Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen anwendbaren Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:
Infektionskrankheiten beim Menschen wie z. B. septische Infektionen, Knochen- und Gelenkinfektionen, Hautinfektionen, postoperative Wundinfektionen, Abszesse, Phlegmone, Wundinfektionen, infizierte Verbrennungen, Brandwunden, Infektionen im Mundbereich, Infektionen nach Zahnoperationen, septische Arthritis, Mastitis, Tonsillitis, Genital-Infektionen und Augeninfektionen.

Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:
Schwein: Coli-diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Agalaktiae-Syndrom, Mastitis;
Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Mykoplasmose, Genitalinfektionen;
Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;
Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;

Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): Mycoplasmose, E. coli-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.

Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsie, Yersinia, erweitert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von bakteriellen Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, puimonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eigen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg/kg Körpergewicht je 24 h zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 h.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.

A. Beispiele

Verwendete Abkürzungen:

abs.: absolut
aq.: wässrig
CDCl₃: Chloroform
CH: Cyclohexan
d: dublett (im ¹H-NMR)
dd: dublett von dublett (im ¹H-NMR)
DC: Dünnschichtchromatographie
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
DIC: Diisopropylcarbodiimid
DIEA: Diisopropylethylamin (Hünig-Base)
DMSO: Dimethylsulfoxid
DMAP: 4-N,N-Dimethylaminopyridin
DMF: Dimethylformamid
d. Th.: der Theorie
EDC: N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid × HCl
EE: Ethylacetat (Essigsäureethylester)
ESI: Elektrospray-Ionisation (bei MS)
ges.: gesättigt
HATU: O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
HBTU: O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat
HOBt: 1-Hydroxy-1H-benzotriazol × H₂O
h: Stunde(n)
HPLC: Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC-MS: Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
m: multiplett (im ¹H-NMR)
min: Minute
MS: Massenspektroskopie
NMR: Kernresonanzspektroskopie
proz.: Prozent
q: quartett (im ¹H-NMR)
R_f: Retentionsindex (bei DC)
RP: Reverse Phase (bei HPLC)
RT: Raumtemperatur
R_t: Retentionszeit (bei HPLC)
s: singulett (im ¹H-NMR)
t: triplett (im ¹H-NMR)
THF: Tetrahydrofuran
TPTU: 2-(2-Oxo-1(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat

LC-MS- und HPLC-Methoden:

Methode 1 (Standard-Bedingungen für die präparative HPLC zur Aufreinigung von Bottromycin-Derivaten): Säule: VP 250/21 Nukleodur 100–5, C18 ec, Macherey&Nagel: 762002; Eluent A: 0.01% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril/0.01% Trifluoressigsäure; Gradient: 0 min 0%B, 20 min 20%B, 40 min 20%B, 60 min 30%B, 100 min 30%B, 110 min 100%B, 132 min 100%B; Fluss: 5 ml/min; Ofen: 30°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 2 (Standard-Bedingungen für die analytische HPLC von Bottromycin-Derivaten): Säule: XTerra 3.9 × 150 WAT 186000478; Temperatur: 40°C; Fluss: 1 ml/min; Eluent A: 0.01% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril + 0.01 % Trifluoressigsäure, Gradient: 0.0 min 20%B → 1 min 20%B → 4 min 90%B → 6 min 90%B → 6.2 min 20%B.
Methode 3 (Standard-Bedingungen für die analytische LC-MS Messung von Bottromycin-Derivaten): Instrument: Micromass LCT mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Waters Symmetry C18; 3.5 μm; 50 mm × 2.1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 1 ml 98–100 %ige Ameisensäure; Eluent B: 1 l Acetonitril + 1 ml 98–100ige Ameisensäure; Gradient: 0 min 100%A → 1 min 100%A → 6 min 10%A → 8 min 0%A → 10 min 0%A → 10.1 min 100%A → 12 min 100%A; Fluss 0 min bis 10 min 0.5 ml/min → 10.1 min 1 ml/min → 12 min 0.5 ml/min; Ofen: 40°C; UV-Detektion DAD: 208–500 nm.
NMR-Messungen: NMR-Messungen wurden durchgeführt an einem Bruker DMX500 mit der Protonenfrequenz 500.13 MHz. Lösemittel war DMSO-d₆, Temperatur 302K. Die Kalibrierung erfolgte auf das DMSO-Signal bei 2.5 ppm.

Ausgangsverbindungen

Die Struktur des Bottromycin A2 (Beispiel 1A) ist durch eine Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Es wird davon ausgegangen, dass die weiterhin erwähnten Bottromycine (Beispiele 2A bis 5A) dieselbe Stereochemie aufweisen, da sie ähnliche NMR-Spektren zeigen. Diese Strukturen weisen damit eine andere Stereochemie auf als der Stand der Technik.

Die bei der Fermentation entstandenen Verbindung 1A bis 5A werden in weiteren Reaktionen eingesetzt (siehe Beispiel 1). Sollte die Zuordnung der Stereochemie in den Verbindung 1A bis 5A tatsächlich anders sein, so ist auch die Stereochemie der Folgeprodukte dementsprechend anders.

Beispiele 1A
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid (Bottromycin A2)
Beispiel 2A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid (Bottromycin B2)
Beispiel 3A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14,14-dimethyl-1,4,10-trioxododecahydropynolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-methoxy-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid (Bottromycin C2)
Beispiel 4A
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-2-carboxy-1-(1,3-thiazol-2-yl)ethyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid (Bomomycin A2 als Säure)
Beispiel 5A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14,14-dimethyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-2-carboxy-1-(1,3-thiazol-2-yl)ethyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid (Bottromycin C2 als Säure)
Synthese der Verbindungen 1A, 2A, 3A, 4A und 5A
Verwendete Stämme
Tabelle 1: Stämme, die zur Produktion der Vorstufen Bottromycin A und B befähigt sind:

ATCC = American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, U.S.A.
DSM = Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkuluren, Braunschweig, Deutschland.
CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands

Streptomyces bottropensis wurde von der Koninklijke Nederlandsche Gisten Spiritusfabriek, N.V. isoliert, identifiziert und unter der Stammhinterlegungsnummer CBS 163.64 bei der CBS, Baarn, Niederlande, hinterlegt (BP 762736, 1954). Zum Zweck der Überprüfung des Vorliegenden Patentes wurde der Stamm erneut bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkuluren, Braunschweig, Deutschland unter der Eingangsnummer DSM 16814 hinterlegt.
Streptomyces spec. DSM 17025 wurde aus einer Bodenprobe aus der Eifel/Deutschland isoliert und unter der Stammnummer BC 16019 in die Stammsammlung der Bayer Healthcare AG aufgenommen.
Produktion der Beispiele 1A, 2A und 3A
Herstellung der Vorkultur von S. bottropensis DSM 16814
Zur Herstellung der Vorkultur wurde der Stamm S. bottropensis DSM 16814 in folgendem Medium angezogen: Medium 1: Hefe-Malz Medium: D-Glucose 0.4 %, Hefeextrakt 0.4 %, Malzextrakt 1.0 %, ad 1 Liter Leitungswasser. Der pH-Wert des Mediums wurde mit wässriger Natronlauge auf 7.2 eingestellt. Das Medium wurde jeweils bei 121 °C und 1.1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Je 2 ml einer Myzelsuspension in 50 % Glycerin wurden als Inokulum für 15 × 150 ml Medium 1 in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben angesetzt und 96 Stunden bei 240 Umdrehungen pro Minute (U/min) und 28°C auf einer Rundschüttelmaschine inkubiert. Diese Kulturen wurden entweder benutzt, um neue Glycerinkonserven herzustellen, die bei –20°C aufbewahrt wurden, oder sie dienten als Inokulum für die Produktionskulturen.
Produktionskultur (30 Liter Maßstab) von S. bottropensis DSM 16814
Zur Herstellung der Produktionskultur wurde 15 × 150 ml einer wie oben beschriebenen Vorkultur als Inokulum für 22 Liter des folgenden Mediums 2 eingesetzt: Glucose (1 %), Stärke (1.5 %), Hefeextrakt (0.5 %), Sojamehl entfettet (1.0 %), Natriumchlorid (0.5 %), Calciumcarbonat (0.3 %). Vor dem Beimpfen wurde dem Medium 1 ml Entschäumer SAG 5693 (Union Carbide, USA) pro Liter zugesetzt, und für 60 Minuten bei 1.1 bar mit Dampf sterilisiert. Diese Produktionskultur wurde 120–160 Stunden bei 28°C bei einer Rührgeschwindigkeit von 240 U/min und mit einer Belüftungsrate von 0.3 vvm in einem 30 l Bioengineering (Schweiz) Rührfermenter (Blattrührer) inkubiert. Zur Verfolgung des Produktions-Prozesses dienten tägliche Proben von 20 ml, die steril entnommen und mit Hilfe der analytischen HPLC untersucht wurden. Unter diesen Bedingungen wurden Ausbeuten an Bottromycin A (Beispiel 1A) von 20 mg/l erhalten.
Herstellung der Vorkultur von S. spec. DSM 17025
Zur Herstellung der Vorkultur wurde der Stamm S. spec. DSM 17025 in folgendem Medium angezogen: Medium 1: Hefe-Malz Medium: D-Glucose 0.4 %, Hefeextrakt 0.4 %, Malzextrakt 1.0 %, ad 1 Liter Leitungswasser. Der pH-Wert des Mediums wurde mit wässriger Natronlauge auf 7.2 eingestellt. Das Medium wurde jeweils bei 121 °C und 1.1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Je 2 ml einer Myzelsuspension in 50 % Glycerin wurden als Inokulum für 2 × 150 ml Medium 1 in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben angesetzt und 96 Stunden bei 240 Umdrehungen pro Minute (U/min) und 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine inkubiert. Diese Kulturen wurden entweder benutzt, um neue Glycerinkonserven herzustellen, die bei –20 °C aufbewahrt wurden, oder sie dienten als Inokulum für die Produktionskulturen.
Produktionskultur (30 Liter Maßstab) von S. spec DSM 17025
Zur Herstellung der Produktionskultur wurden 2 × 150 ml einer wie oben beschriebenen Vorkultur als Inokulum für 30 Liter des folgenden Mediums 2 eingesetzt: Glucose (1 %), Stärke (1.5 %), Hefeextrakt (0.5 %), Sojamehl entfettet (1.0 %), Natriumchlorid (0.5 %), Calciumcarbonat (0.3 %). Vor dem Beimpfen wurde dem Medium 1 ml Entschäumer SAG 5693 (Union Carbide, USA) pro Liter zugesetzt, und für 60 Minuten bei 1.1 bar mit Dampf sterilisiert. Diese Produktionskultur wurde 90–140 Stunden bei 28°C bei einer Rührgeschwindigkeit von 240 U/min und mit einer Belüftungsrate von 0.3 vvm in einem 40 l Bioengineering (Schweiz) Rührfermenter (Blattrührer) inkubiert. Zur Verfolgung des Produktions-Prozesses dienten tägliche Proben von 20 ml, die steril entnommen und mit Hilfe der analytischen HPLC untersucht wurden. Unter diesen Bedingungen wurden Ausbeuten an Bottromycin A (Beispiel 1A) von 20 mg/l erhalten.
Analytische HPLC
Zur Detektion während der Biosynthese wurden analytische HPLC-Methoden mit UV/visueller (HPLC-UV/Vis) und mit massenspektrometrischer Detektion eingesetzt.
Vor der HPLC-Analyse wurden die wässrigen Fermentationsproben in Myzel und Kulturüberstand getrennt und beide erhaltene Produkte mit Methanol versetzt: Das Kulturfiltrat wurde 1:4 mit Methanol verdünnt, das abzentrifugierte Myzel 15 min lang mit dem Ursprungsvolumen Methanol im Ultraschallbad extrahiert. Die methanolischen Proben wurden mit einem 0.45μm-Filter filtriert und an der analytische HPLC bzw. LC-MS injiziert.
Analysen mittels HPLC-MS wurden an einem HP1100 HPLC-System, gekoppelt mit einem Micromass-LCT Massenspektrometer (Micromass, Manchester, Großbritannien), im ESI⁺ und ESI^– Modus durchgeführt. Massenspektren wurden im Bereich zwischen m/z = 100 und 1650 aufgezeichnet. Die einzelnen Bottromycine haben folgende Retentionszeiten:
Bottromycin A2 (Beispiel 1A): R_t = 4.54 min.
Bottromycin B2 (Beispiel 2A): R_t = 4.51 min.
Bottromycin C2 (Beispiel 3A): R_t = 4.61 min.
Bottromycin A2 freie Säure (Beispiel 4A): R_t = 4.51 min.
Bottromycin C2 freie Säure (Beispiel 5A): R_t = 4.48 min.
Das verwendete HPLC-MS-System operierte mit folgenden Parametern: Stationäre Phase: Waters Symmetry C18, 3.5 μm 2.1 × 50 mm; Mobile Phase: Gradient Wasser mit 0.1 % Ameisensäure (A) und Acetonitril mit 0.1 % Ameisensäure (B): 0–1 Minuten 100 % A; 1–6 Minuten linearer Gradient auf 90 % B; 6–8 Minuten 90 %B–100 % B; 8–10 min 100% B; Flussrate 0.5 ml/min; Säulenofen 40°C, UV-Detektion: DAD 208–700 nm. Der Nachweis der Bottromycine erfolgte anhand der protonierten Molekülionen (M+H)⁺ und der deprotonierten Molekülion (M–H)^–, der doppelt geladenen Moleküle (M+2H)⁺⁺ und den Ameisensäureaddukten (M+AS)^–.
Bottromycin A2 (Beispiel 1A): (M+H)⁺ = 823.8; (M+2H)⁺⁺ = 412.5; (M–H)^– = 821.6; (M+AS)^– = 867.7
Bottromycin B2 (Beispiel 2A): (M+H)⁺ = 809.8; (M+2H)⁺⁺ = 405.5; (M–H)^– = 807.6; (M+AS)^– = 853.6
Bottromycin C2 (Beispiel 3A): (M+H)⁺ = 837.7; (M+2H)⁺⁺ = 419.5; (M–H)^– = 835.6; (M+AS)^– = 881.6
Bottromycin A2 freie Säure (Beispiel 4A): (M+H)⁺ = 809.6; (M+2H)⁺⁺ = 405.5; (M–H)^– = 807.5
Bottromycin C2 freie Säure (Beispiel 5A): (M+H)⁺ = 823.7; (M+2H)⁺⁺ = 412.5; (M–H)^– = 821.5; (M+AS)^– = 867.5
HPLC-UV/Vis Analysen wurden mit Hilfe eines Hewlett Packard Series 1100 analytical HPLC system (HP, Waldbronn, Deutschland), bestehend aus einem G 1312A binären Pumpensystem, einem G 1315A Diodenarray-Detektor, einem G 1316A Säulentemperiersystem, einem G 1322A Entgasersystem und einem G 1313A Autoinjektor durchgeführt. Als mobile Phase wurde Wasser mit 0.05 % Trifluoressigsäure (A) und Acetonitril mit 0.05 % Trifluoressigsäure (B) bei einem Fluss von 0.4 ml/min verwendet, während eine Waters Symmetry C 18, 3.5 μm 2.1 × 50 mm -Säule mit 10mm-Vorsäule als stationäre Phase diente. Die Proben wurden mit einem Stufengradienten 0–100 % B aufgetrennt (25-25-45-45-65-100-25 % B in 0-1-2-3.5-6.7-6.8-7.8-8.4 min). HPLC-UV Chromatogramme wurden bei 210 nm (Detektion von Verunreinigungen), 225 nm sowie 254 nm aufgezeichnet. Die Diodenarray-Detektion im Bereich von 200–600 nm lieferte die HPLC-UV/Vis Spektren. Der Säulenofen wurde auf 45°C eingestellt.
Die beschriebenen Verbindungen haben folgendes UV-Spektrum: UV_max bei 206–207nm sowie eine schwache Schulter bei 230nm und folgende Retentionszeiten:
Bottromycin A2 (Beispiel 1A): R_t = 4.68 min.
Bottromycin B2 (Beispiel 2A): R_t = 4.54 min.
Bottromycin C2 (Beispiel 3A): R_t = 4.88 min.
Bottromycin A2 freie Säure (Beispiel 4A): R_t = 3.44 min.
Bottromycin C2 freie Säure (Beispiel 5A): R_t = 4.22 min.
Isolierung der Verbindungen der Beispiele 1A, 2A, 3A, 4A und 5A aus Rührfermenter-Kulturen (30 Liter Maßstab)
Die Myzelien aus Fermentationen des Stammes Streptomyces bottropensis DSM 16814 im 30 Liter Maßstab wurden durch Zentrifugation (15 Minuten bei 2300 U/min) vom Überstand abgetrennt.
Der nach Zentrifugation erhaltene Kulturüberstand wurde auf eine 2500 ml Lewapolsäule (Adsorberharz, OC 1064, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) aufgetragen. Der Durchlauf wurde ebenso wie das Waschwasser (ca. 30 l) verworfen. Danach wurde mit 6 Säulenvolumen 60% Methanol und 3 Säulenvolumen 80% Methanol nachgewaschen. Die resultierenden Fraktionen wurden verworfen und die an das Adsorberharz gebundenen Bottromycine mit mindestens 10 Säulenvolumen 100% Methanol eluiert. Das Eluat wurde danach im Vakuum getrocknet.
Das nach der Zentrifugation erhaltene Myzel wurde mit zweimal mit je 5 l Methanol im Ultra-Turrax P50 DPX (Janke&Kunkel Labortechnik) aufgeschlossen, anschließend abgetrennt und verworfen. Der vom Aufschluss des Myzels erhaltene methanolische Extrakt wurde einrotiert und der wässrige Rückstand (ca. 2.6 l) wurde viermal mit jeweils 2 l Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum getrocknet.
Die Rückstände aus der Aufarbeitung des Myzels (ca. 11 g, Gehalt an Bottromycin A2 → Hauptmetabolit, ca. 3%) und des Kulturüberstands (ca. 5g, Gehalt an Bottromycin A2 ca. 10%) wurden vereinigt, in Methanol angelöst und über eine Biotage Chromatographiesäule (Flash 75, 75 × 300 mm, Biotage C18 KP-WP, 15-20μM) weiter aufgereinigt. Verwendung fand ein Stufengradient mit den Laufmitteln Wasser mit 0.05% Trifluoressigsäure (A) und Acetonitril mit 0.05% Trifluoressigsäure (B) bei einer Flussrate von 80 ml/min mit den Stufen 12, 16, 20, 25, 28, 31, 31, 35 und 50% B. Die Bottromycine eluierten bei 31 % B, wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt (Rückstand ca. 0.9 g, Ausbeute ca. 61 % Bottromycin A2) und in Methanol gelöst. Die Gesamtmenge wurde gedrittelt und in drei einzelnen Läufen mittels einem präparativen HPLC-System aufgetrennt: Hardware Gilson Abimed HPLC (UV Detektor 210 nm, binäres Pumpensystem, Fraktionssammler); Feste Phase: Inertsil ODS-3 C18, 5μm; 30 × 250 mm mit Vorsäule Nucleosil C18, 7μm, 20 × 30 mm; Flussrate: 41.2 ml/min; Fraktionsgröße 20.6ml/0.5min ab 50 min); Stufengradient von Wasser mit 0.05% Trifluoressigsäure (A) nach Acetonitril mit 0.05% Trifluoressigsäure (B): 0-15-75-105-115-125 min mit 10-10-30-30-100-100 % B.
Die Bottromycine eluierten im Gradientenbereich 31–35% B. Die einzelnen Fraktionen wurden nach HPLC und HPLC-MS-Analytiken entsprechend den Zielsubstanzen vereinigt und im Vakuum getrocknet.
Vom Hauptmetaboliten Bottromycin A2 (Beispiel 1A) konnte eine Ausbeute von 320 mg mit >97% Reinheit erzielt werden. Von den Nebenmetaboliten Bottromycin B2 (Beispiel 2A) und Bottromycin C2 (Beispiel 3A) wurden 12 mg mit >98% Reinheit und ca. 15 mg mit >90% Reinheit gewonnen. Die freien Säuren von Bottromycin A2 (Beispiel 4A) und Bottromycin C2 (Beispiel 5A) liegen als Minoritätskomponenten in Mengen <5 mg vor. Der Nebenmetabolit (Beispiel 3A) und die Minoritätskomponenten (Beispiel 4A), (Beispiel 5A) wurden mit der gleichen präparativen HPLC-Methode in einem weiteren Trennschritt auf >98% Reinheit nachgereinigt.
Nach der Reinigung liegen die Bottromycine als Salze der Trifluoressigsäure vor, eine Umsalzung zu Mesyl- und Formiatsalzen ist gut möglich.
Beispiel 4A
Alternative Synthese:
265 mg (322μmol) Bottromycin A2 werden in 125 ml Methanol gelöst und mit 2.4 ml einer wässrigen 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Die Lösung wird 1h unter Rückfluss erhitzt, anschließend auf RT abgekühlt und mit 5.4 ml 1M Salzsäure auf pH 1-2 gebracht. Man engt ein und verteilt den Rückstand zwischen 300 ml Essigsäureethylester und 100 ml Wasser. Die Wasserphase wird abgetrennt, mit Ammoniumchlorid gesättigt und nochmals mit 100 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten Essigsäureethylesterphasen werden eingeengt und der Rückstand in Dichlormethan/Methanol 1:1 aufgenommen. In der Kälte wird durch Zusatz von Diethylether und Petrolether das Zielprodukt ausgefällt. Nach Absaugen und Trocknen erhält man 199 mg (76% d. Th.) der Säure.
HPLC (Methode 2): R_t = 4.14 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.34 min; m/z = 809 (M+H)⁺
Beispiel 5A
Alternative Synthese:
Analog zur alternativen Synthese von Beispiel 4A wird die Titelverbindung aus 28 mg (33.45 μM) Bottromycin C2 hergestellt.
Ausbeute: 20 mg (73% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.16 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.47 min; m/z = 821 (M–H)^–
Beispiel 6A
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraaza-cyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-2-carboxy-1-(1,3-thiazol-2-yl)ethyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur alternativen Synthese von Beispiel 4A wird die Titelverbindung aus 22 mg (27 μM) Bottromycin B2 hergestellt.
Ausbeute: 21 mg (97% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.01 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.34 min; m/z = 793 (M–H)^–
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[methoxy(methyl)amino]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
75 mg (92.7 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A werden in 3 ml DMF gelöst und mit 18.8 mg (139 μmol) 1-Hydroxy-1H-benzotriazol, 21.3 mg (111.2 μmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid und anschließend mit 28.3 mg (463.5 μmol) N,O-Dimethylhydroxylamin versetzt. Man rührt 16h bei Raumtemperatur. Dann wird eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird in 300 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 5%-iger Zitronensäure ausgeschüttelt. Die Wasserphase wird abgetrennt, mit Ammoniumchlorid gesättigt und nochmals mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC (Methode 1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, das Lösungsmittel abgedampft und der verbleibende Rückstand aus Dioxan/Wasser 1:1 lyophilisiert. Man erhält 55 mg (70% d. Th.) der Zielverbindung.
HPLC (Methode 2): R_t = 4.31 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.59 min; m/z = 852 (M+H)⁺
¹H-NMR (500MHz, DMSO-d₆): δ = 0.8 und 0.89 (2d, 6H), 0.84 (s, 9H), 0.9 (s, 9H), 0.97 (d, 3H), 1.12 (d, 3H), 1.68 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 2.2 (m, 1H), 2.55 (m, 1H), 2.9–3.3 (m, 6H), 3.65–3.8 (m, 5H), 3.4 und 3.9 (2m, 2H), 3.95 (d, 1 H), 4.12 (d, 1H), 4.2 (dd, 1H), 4.7 (t, 1 H), 5.0 (d, 1H), 5.63 (m, 1H), 6.7 (d, 1H), 7.1–7.3 (m, 5H), 7.45 (m, 1H), 7.63 und 7.73 (2d, 2H), 7.8–8.0 (m, 2H), 8.95 (d, 1H), 9.22 (d, 1H).
Beispiel 2
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-isoxazolidin-2-yl-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 5 mg (6.2 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A, 1.35 mg (12.4 μM) Isoxazolidin-Hydrochlorid (Herstellung analog Perkin 2, 2000, 1435 bzw. J. Chem. Soc. 1942, 432), 1.25 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol, 1.4 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodümid Hydrochlorid und 3 μl Ethyl-diisopropylamin hergestellt.
Ausbeute: 2.1 mg (40% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.26 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.0 min; m/z = 864 (M+H)⁺
Beispiel 3
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-beta-methyl-N-[(1R)-3-(1,2-oxazinan-2-yl)-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 10 mg (12.4 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A, 3.1 mg (24.7 μM) 1,2-Oxazinan-Hydrochlorid (Herstellung analog Perkin 2, 2000, 1435 bzw. J. Chem. Soc. 1942, 432), 2.5 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol, 2.9 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid und 6.5 μl Ethyl-diisopropylamin hergestellt.
Ausbeute: 3.8 mg (35% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.36 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.6 min; m/z = 878 (M+H)⁺
Beispiel 4
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraaza-cyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-beta-methyl-N-[(1R)-3-(1,2-oxazinan-2-yl)-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 11 mg (13.85 μM) der Verbindung aus Beispiel 6A, 5.1 mg (41.5 μM) 1,2-Oxazinan-Hydrochlorid (Herstellung analog Perkin 2, 2000, 1435 bzw. J. Chem. Soc. 1942, 432), 2.8 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol, 3.2 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid und 7 μl Ethyl-diisopropylamin hergestellt.
Ausbeute: 1.7 mg (14% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.26 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.60 min; m/z = 864 (M+H)⁺
Beispiel 5
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraaza-cyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[methoxy(methyl)amino]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 11 mg (13.9 μM) der Verbindung aus Beispiel 6A, 4.2 mg (69 μM) N,O-Dimethylhydroxylamin, 2.8 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol und 3.2 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid hergestellt.
Ausbeute: 8.8 mg (76% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.17 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.49 min; m/z = 838 (M+H)⁺
Beispiel 6
N-[(3S,6S,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14,14-dimethyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[methoxy(methyl)amino]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 10 mg (12 μM) der Verbindung aus Beispiel 5A, 3.7 mg (61 μM) N,O-Dimethylhydroxylamin, 2.5 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol und 2.8 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid hergestellt.
Ausbeute: 1.7 mg (16% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.31 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.54 min; m/z = 866 (M+H)⁺
Beispiel 7
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[ethoxy(ethyl) amino]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 10 mg (12.4 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A, 5.5 mg (62 μM) N,O-Diethylhydroxylamin (Herstellung analog DE 2113355 (1971)), 3.3 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol und 3.6 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid hergestellt.
Ausbeute: 5.4 mg (50% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.35 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.78 min; m/z = 880 (M+H)⁺
Beispiel 8
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[ethoxy(methyl)amino]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 10 mg (12.4 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A, 4.6 mg (62 μM) N-Methyl-O-ethylhydroxylamin (Herstellung analog DE 2113355 (1971)), 3.3 mg 1-Hydroxy-1H-benzotriazol und 3.6 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid hergestellt.
Ausbeute: 5 mg (47% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.23 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.63 min; m/z = 866 (M+H)⁺
Beispiel 9
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-(4-hydroxyisoxazolidin-2-yl)-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 10 mg (12.4 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A und 2.2 mg (25 μM) Isoxazolidin-4-ol (Herstellung analog Synthesis 1982, 5, 426) hergestellt. Als Kupplungsreagens werden hier anstelle von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid/1-Hydroxy-1H-benzotriazol 7.1 mg (18.6 μM) [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat] (HATU) in Gegenwart von 3.2 mg Ethyldiisopropylamin verwendet. Nach 16 h Rühren bei RT wird eingeengt, der Rückstand direkt durch präparative HPLC (Methode 1) gereinigt und die Titelverbindung analog zu Beispiel 1 isoliert.
Ausbeute: 6.8 mg (63% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 3.86 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 4.7 min; m/z = 880 (M+H)⁺
Beispiel 10
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[5 (ethoxycarbonyl)isoxazolidin-2-yl]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 10 mg (12.4 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A und 3.6 mg (25 μM) Ethylisoxazolidin-5-carboxylat (Herstellung analog J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1984, 9, 606) hergestellt. Als Kupplungsreagens werden hier anstelle von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid/1-Hydroxy-1H-benzotriazol 9.4 mg (24.7 μM) [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat] (HATU) in Gegenwart von 3.2 mg Ethyldiisopropylamin verwendet. Nach 16 h Rühren bei RT wird eingeengt, der Rückstand direkt durch präparative HPLC (Methode 1) gereinigt und die Titelverbindung analog zu Beispiel 1 isoliert.
Ausbeute: 6 mg (52% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.3 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 5.1 min; m/z = 936 (M+H)⁺
Beispiel 11
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-[6 (ethoxycarbonyl)-1,2-oxazinan-2-yl]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 17 mg (21 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A und 6.7 mg (42 μM) Ethyl-1,2-oxazinan-6-carboxylat (Herstellung analog zu J. Org. Chem. 2000, 65, 7667) hergestellt. Als Kupplungsreagens werden hier anstelle von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid/1-Hydroxy-1H-benzotriazol 16 mg (42 μM) [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat] (HATU) in Gegenwart von 5.4 mg Ethyldiisopropylamin verwendet. Nach 16 h Rühren bei RT wird eingeengt, der Rückstand direkt durch präparative HPLC (Methode 1) gereinigt und die Titelverbindung analog zu Beispiel 1 isoliert.
Ausbeute: 16.7 mg (84% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.5 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 5.3 min; m/z = 948 (M–H)^–
Beispiel 12
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-beta-methyl-N-[(1R)-3-(2-oxa-3-azabicyclo[2.2.2]oct-5-en-3-yl)-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-L-phenylalaninamid
Analog zur Synthese von Beispiel 1 wird die Titelverbindung aus 5 mg (6.2 μM) der Verbindung aus Beispiel 4A und 4.2 mg (19 μM) 2-Oxa-3-azabicyclo[2.2.2]oct-5-en Triflouracetat (Herstellung analog Organic Letters 2004, 11, 1805) hergestellt. Als Kupplungsreagens werden hier anstelle von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid/1-Hydroxy-1H-benzotriazol 3.5 mg (9.5 μM) [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat] (HATU) in Gegenwart von 1.6 mg Ethyldiisopropylamin verwendet. Nach 16 h Rühren bei RT wird eingeengt, der Rückstand direkt durch präparative HPLC (Methode 1) gereinigt und die Titelverbindung analog zu Beispiel 1 isoliert.
Ausbeute: 5 mg (90% d. Th.)
HPLC (Methode 2): R_t = 4.3 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 5.0 und 5.1 min; m/z = 902 (M+H)⁺
Beispiel 13
N-[(3S,6S,14R,14aS)-6-tert-Butyl-3-isopropyl-14-methyl-1,4,10-trioxododecahydropyrrolo[1,2-a][1,4,7,10]tetraazacyclododecin-7(8H)-yliden]-3-methyl-L-valyl-(betaS)-N-[(1R)-3-benzyl(methoxy)amino]-3-oxo-1-(1,3-thiazol-2-yl)propyl]-beta-methyl-L-phenylalaninamid
40 mg (49.4 μmol) der Verbindung aus Beispiel 4A werden in 20 ml DMF gelöst und mit 11.8 mg (74.2 μmol) N-Benzylhydroxylamin Hydrochlorid, 37.6 mg (98.8 μmol) [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat] (HATU) und 12.8 mg Ethyldiisopropylamin versetzt. Nach 16 h Rühren bei RT wird eingeengt, der Rückstand in Acetonitril/Wasser 1:2 aufgenommen und durch präparative HPLC (Methode 1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, das Lösungsmittel abgedampft und der verbleibende Rückstand aus Dioxan lyophilisiert. Man erhält 44.8 mg (99% d. Th.) der Zielverbindung.
HPLC (Methode 2): R_t = 4.38 min.
25 mg (27.3 μmol) dieses Intermediats werden in 10 ml Dioxan/Wasser 1:1 gelöst und mit 26.7 mg (82 μmol) Caesiumcarbonat versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wird der Ansatz lyophilisiert. Der Rückstand wird in 10 ml DMF aufgenomen und bei RT mit 85 μl (1.4 mmol) Methyliodid vesetzt. Nach 30 min ist die Reaktion abgeschlossen. Man engt ein und reinigt den Rückstand durch präparative HPLC (Methode 1). Man erhält 8.4 mg (33% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 2): R_t = 4.3 min;
LC-MS (Methode 3): R_t = 5.65 min; m/z = 928 (M+H)⁺
B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
Verwendete Abkürzungen:

BHI: Medium Brain heart infusion medium
DMS: O Dimethylsulfoxid
HTM: Haemophilus Test Medium
i.p.: intraperitoneal
i.v.: intravenös
MHK: Minimale Hemmkonzentration
MTP: Mikrotiterplatte
PBS: Phosphat Buffered Saline
PEG: Polyethylenglykol

Die in vitro- und in vivo-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:
Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK)
Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums, mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18–24 h inhibiert wird. Die Hemmstoffkonzentration kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren bestimmt werden (siehe z.B. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-fifth edition. NCCLS document M7-A5 [ISBN 1-56238-394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2000). Die MHK der erfindungsgemäßen Verbindungen wird im Flüssigdilutionstest im 96er-Mikrotiter-Platten-Maßstab bestimmt. Frische Bakterienausstriche auf Columbia-Blutagarplatten mit 5% Schafsblut (Becton Dickinson) [Schokoladen-Agarplatten (Becton Dickinson) für Haemophilus influenzae] werden in physiologischer Kochsalzlösung auf OD₅₇₈ von 0.1 eingestellt. Die zu 10 mM in DMSO gelösten Testsubstanzen werden in 1:2 Verdünnungsstufen mit DMSO weiter verdünnt. Je 1 μl der verdünnten Testsubstanzen wird in einer 96er-Mikrotiterplatte vorgelegt und mit 100 μl der 1:300 in Mueller-Hinton Bouillon (HTM für Haemophilus influenzae) verdünnten Keimsuspension versetzt. Für S. pneumoniae und S. pyogenes beträgt die Keimverdünnung 1:100 in Mueller-Hinton Bouillon, die mit 2% lysiertem Pferdeblut supplementiert ist. Die Mikrotiterplatten werden für 18–24 h bei 37°C aerob inkubiert; Streptokokken und Haemophilus influenzae werden mikroaerophil in Gegenwart von 5% CO₂ inkubiert.
Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert.
Tabelle A
Systemische Infektion mit S. aureus 133
Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden. Dazu werden die Tiere im allgemeinen mit einem geeigneten virulenten Keim infiziert und anschließend mit der zu testenden Verbindung, die in einer an das jeweilige Therapiemodell angepassten Formulierung vorliegt, behandelt. Speziell kann die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen in einem Sepsismodell an Mäusen nach Infektion mit S. aureus demonstriert werden.
Dazu werden S. aureus 133 Zellen über Nacht in BH-Bouillon (Oxoid, Deutschland) angezüchtet. Die Übernachtkultur wurde 1:100 in frische BH-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden hochgedreht. Die in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterien werden abzentrifugiert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird am Photometer (Dr. Lange LP 2W) eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension 1:1 mit einer 10%-igen Mucinsuspension gemischt. Von dieser Infektionslösung wird 0.2 ml/20 g Maus i.p. appliziert. Dies entspricht einer Zellzahl von etwa 1-2 × 10⁶ Keimen/Maus. Die i.v.-Therapie erfolgt 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFW1-Mäuse verwendet. Das Überleben der Tiere wird über 5 Tage protokolliert. Das Tiermodell ist so eingestellt, daß unbehandelte Tiere innerhalb von 24 h nach der Infektion versterben. Die ED₁₀₀ entspricht der minimalen Dosis, bei der alle Tiere im Beobachtungszeitraum die Infektion überleben.
Lungeninfektion mit S. pneumoniae L3TV
Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann auch in einem Lungeninfektionsmodell an Mäusen nach Infektion mit S. pneumoniae demonstriert werden.
Dabei werden weibliche CFW1 Mäuse mit 8×10⁵ Keimen von S. pneumoniae L3TV intranasal infiziert. Das Inokulum wird durch das Verdünnen einer eingefrorenen Stammkultur eingestellt. Am ersten und zweiten Tag nach der Infektion wird jeweils zweimal täglich i.v. therapiert. Am dritten Tag nach der Infektion wird die Lunge entnommen, das Gewebe homogenisiert und eine Keimzahlbestimmung durchgeführt.
Bestimmung von pharmakokinetischen Eigenschaften in vivo
In der Regel werden die pharmakokinetischen Eigenschaften einer Verbindung (z.B: Clearance, Verteilungsvolumen...) durch Messung der Verbindungskonzentrationen in Plasma der jeweiligen Spezies ermittelt. Dazu wird Blut zu verschiedenen Zeitpunkten (z.B: 2, 5, 10, 20, 40 Minuten, 1, 2, 4, 6, 8, 24 Stunden) nach z.B. intravenöser Applikation der Verbindung entnommen und zentrifugiert. Die Verbindungskonzentrationen in Plasma werden dann mit einer geeigneten analytischen Methode mittels LC/MSMS bestimmt.
In der Maus wird für jeden Entnahmezeitpunkt ein Tier benötigt. Blut wird aus der vena cava caudalis entnommen. In der Ratte wird Blut aus katheterisierten Tieren gewonnen: ein Siliconkatheter wird über die rechte Vena jugularis externa bis zum Herzen bzw. in die Vena cava caudalis vorgeschoben und eingebunden, in der Halsmukulatur fixiert, subcutan bis zum Rücken verlegt, durch die Haut geführt und mit einem Kunststoffmandrin verschlossen. Der Katheder ermöglicht einen ständigen venösen Zugriff, so dass es möglich ist, eine komplette Kinetik in einem Tier zu erhalten.
Bei Hunden wird Blut aus der vena jugularis entnommen. Auch hier erhält man eine komplette Kinetik in einem Tier.
Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
Intravenös applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.
Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.

Claims

Verbindung der Formel
in welcher R¹ und R² für Wasserstoff stehen, oder R¹ und R² für Methyl stehen, oder R¹ für Methyl und R² für Wasserstoff steht, und R³ und R⁴ unabhängig voneinander für C₁-C₄-Alkyl, welches substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl, C₃-C₆-Cycloalkyl, C₆-C₁₀-Aryl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl und, sofern es sich bei C₁-C₄-Alkyl nicht um Methyl handelt, alternativ oder zusätzlich substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₆-Alkylamino, oder für C₃-C₆-Cycloalkyl stehen, welches substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl und C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl, oder R³ und R⁴ zusammen für (CH₂)₃ oder (CH₂)₄ stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, Cyano, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl und C₁-C₆-Alkylaminocarbonyl, oder R³ und R⁴ zusammen mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Gruppe der Formel
bilden, wobei * die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ und R² für Wasserstoff stehen, oder R¹ und R² für Methyl stehen, oder R¹ für Methyl und R² für Wasserstoff steht, und R³ und R⁴ unabhängig voneinander für Methyl oder Ethyl stehen, oder R³ und R⁴ zusammen für (CH₂)₃ oder (CH₂)₄ stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Ethoxycarbonyl, oder R³ und R⁴ zusammen mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, eine Gruppe der Formel
bilden, wobei * die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ für Methyl und R² für Wasserstoff steht, und R³ und R⁴ unabhängig voneinander für Methyl oder Ethyl stehen, oder R³ und R⁴ zusammen für (CH₂)₃ oder (CH₂)₄ stehen und mit dem Stickstoff- bzw. Sauerstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-Ring bilden, wobei der Ring substituiert sein kann mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Ethoxycarbonyl, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie der Formel
entspricht, in welcher R¹, R², R³ und R⁴ die in Anspruch 1, 2 oder 3 angegebene Bedeutung aufweisen, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (n nach Anspruch 1 oder eines ihrer Salze, Solvate oder der Solvate ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass [A] eine Verbindung der Formel
in welcher R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit einer Verbindung der Formel
worin R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, umgesetzt wird, oder [B] eine Verbindung der Formel (II) in der ersten Stufe in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien mit einer Verbindung der Formel
worin R³ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, und in der zweiten Stufe mit einer Verbindung der Formel
worin R⁴ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, und X¹ für Halogen, bevorzugt Brom oder Iod, steht, in Gegenwart einer Base umgesetzt wird.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Erkrankungen.
Arzneimittel enthaltend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit mindestens einem inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
Arzneimittel nach Anspruch 9 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen.
Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren durch Verabreichung einer antibakteriell wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Arzneimittels nach Anspruch 9 oder 10.