CH643262A5 - Antibioticum mit betalactamasehemmender wirksamkeit sowie verfahren zu ihrer herstellung. - Google Patents

Description

Vorliegende Erfindung betrifft ein Antibioticum PS-5 und dessen Derivate mit betalactamasehemmender Wirksamkeit sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Antibiotica mit betalactamasehemmender Wirksamkeit oder Betalactamasehemmittel sind bereits bekannt. Beispiele für solche Mittel sind MC696-S Y2-A und B isoliert aus dem Kulturbouillon des das MC696-SY2 produzierenden, zur Gattung Streptomyces gehörenden Stammes (USA-Patentschrift Nr. 3 928 569 : Derwent CPI15 846V, MM4550 oder MM13 902 isoliert aus den kultivierten Materialien des das MM4550 oder MM13 902 produzierenden, zur Gattung Streptomyces gehörenden Stammes (Deutsches Patentgesuch DOS 21513 855 : Derwent CPI 67721W; Deutsches Patentgesuch DOS 2513 854: Derwent CPI 67721W; Deutsches Patentgesuch DOS 2513854: Derwent CPI 67720W;, Clavulansäure isoliert aus den Kultur-5 materialien von Streptomyces clavuligerus (Deutsches Patentgesuch DOS 2 517 316: Derwent CPI 72840W), usw. Das Antibioticum Thienamycin mit einem penicillinähnlichen chemischen Skelett und dessen Derivate sind gleichwohl vorgeschlagen worden (USA-Patentschrift Nr. 3 950357: Derwent CPI 31696X; io Deutsches Patentgesuch DOS 2652677: Derwent CPI 40282Y; Belgische Patentschrift Nr. 848346: Derwent CPI34505Y ; Belgische Patentschrift Nr. 848349: Derwent CPI 34507; Deutsches Patentgesuch DOS 2 652680: Derwent CPI 40283Y ; Deutsches Patentgesuch DOS 2652675: Derwent CPI40280Y; Deutsches 15 Patentgesuch DOS 2652674: Derwent CPI 40279Y; Deutsches Patentgesuch DOS 2652676: Derwent CPI 4081Y).

Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Antibioticum PS-5 der vorstehend genannten Art zu schaffen, das und seine Derivate unter Vermeidung der Nachteile und Beibehaltung der Vorteile 20'bekannter Antibiotica ähnlicher Art einfach und kostenarm herstellbar und als Infektionsbekämpfungsmittel verwendbar ist.

Das Antibioticum PS-5 ist erfindungsgemäss eine Verbindung der Formel

25

CH3"CH2

A/

S-CH„-CH„-NH-C0-CH,

C00R.

1

35

worin Rj Wasserstoff, Niederalkyl oder Triphenylmethyl bedeutet, und seine erfindungsgemässen Salze sind solche jener dieser Verbindungen, in deren Formel A Ri Wasserstoff bedeutet.

Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Anti-bioticums PS-5 der Formel (A) oder eines der erfindungsgemässen Salze umfasst die Verfahrensschritte, dass ein zum Produzieren der antibiotischen Wirksamkeit der Verbindung der Formel (A), wobei Rj Wasserstoff bedeutet, fähiger Mikroorganismus in einem Nährmedium aerobisch kultiviert und die antibiotisch aktive Verbindung von den kultivierten Materialien, isoliert wird, wobei die Verbindung der Formel (A), worin Ri Wasserstoffbedeutet, oder deren ein Salz durch Reaktion mit einem Niederdiazoalkan oder einer Verbindung der Formel RY, worin R Niederalkyl oder Triphenylmethyl und Y ein Atom oder eine Gruppe bedeuten, die durch Spaltung leicht entfernbar sind, wahlweise in eine Verbindung der Formel (A) umgewandelt wird, wobei Rj Niederalkyl oder Triphenylmethyl bedeutet.

Die nachfolgende Beschreibung betrifft beispielsweise Ausführungsformen des erfindungsgemässen Antibioticums PS-5, seiner erfindungsgemässen Salze und seiner Herstellung, die teils anhand der Zeichnung näher erläutert werden. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm, das das Ultraviolettabsorptionsspektrum eines gemäss Beispiel 9 der nachfolgenden Beschreibung hergestellten Natriumsalzes des Antibioticum PS-5 darstellt, wobei A Absorbenz und L Wellenlänge in nm bedeuten;

Fig. 2 ein Diagramm, das das Infrarot Absorptionsspektrum dieses Natriumsalzes des Antibioticum PS-5 darstellt, wobei T Transmission in % und N Wellenzahl in cm"1 bedeuten;

Fig. 3 ein Diagramm, das das magnetische Protonresonanzspektrum dieses gemäss Beispiel 9 hergestellten Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 darstellt;

Fig. 4 ein Diagramm, das Zeitfunktionen der Degradation von

Penicillin G durch Betalactamase von proteus Vulgaris PS-5 darstellt und dabei die Hemmwirksamkeit des gemäss Beispiel 9 der nachfolgenden Beschreibung hergestellten Antibioticums PS-5 illustriert, wobei D Absorbenzunterschied bei 240 nm undT 40 Zeit in Minuten bedeuten;

Fig. 5 ein Diagramm, das das Ultraviolettabsorptionsspektrum des gemäss Beispiel 10 der nachfolgenden Beschreibung hergestellten Tritylesters des Antibioticums PS-5 darstellt, wobei A Absorbenz und L Wellenlänge in nm bedeuten;

45 Fig. 6 ein Diagramm, das das Infrarotabsorptionsspektrum dieses Tritylesters des Antibioticums PS-5 illustriert, wobei T Transmission in % und N Wellenzahl in cm"1 bedeuten, und

Fig. 7 ein Diagramm, das das magnetische Protonenresonanz-spektrum dieses Tritylesters des Antibioticums PS-5 darstellt, 50 wobei IS Innenstandard bedeutet.

Das beschriebene Antibioticum PS-5 und seine Derivate haben starke antibiotische und betalactamasehemmende Aktivitäten oder Wirkungen sowie die Fähigkeit zur synergetischen Steigerung der antibiotischen Aktivität von Penicillinen, Cepha-55 losporinen oder anderen ähnlichen Antibioticis gegen betalakta-maseproduzierende Mikroorganismen, wobei insbesondere das Tritylderivat, aber auch gewisse andere Derivate des Antibioticums PS-5 ähnliche Eigenschaften aufweisen.

Das beschriebene Antibioticum PS-5 kann in einem Fermen-60 tationsverf ahren durch eine Reinkultur eines Mikroorganmis-mus erhalten werden. Verfahren zur Herstellung der Derivate und insbesondere des Tritylderivats des Antibioticums PS-5 werden weiter unten beschrieben.

Das beschriebene Antibioticum PS-5 und dessen Tritylderivat 55 können in vorbeugenden und therapeutischen Behandlungsverfahren und Kompositionen einschliesslich synergetischer Kombinationen mit Penicillinen, Cephalosporinen und anderen betalactamaseempfindlichen Antibioticis gegen durch grampositive

643262 4

und gramnegative Bakterien erregte Infektionskrankheiten ver- Dies wird als zur Sektion Retinaculum-Apertum gehörend wendet werden. betrachtet. Diese Formen werden insbesondere in Hafermehl-

Gemäss dem vorstehend genannten Gärungsverfahren wird Agarmediumkulturen und Glycerin-Asparagin-Agarmedium-ein zum Produzieren des Antibioticums PS-5 fähiger Mikroorga- kulturen beobachtet, während die gerade oder gebogene Form nismus in einem Nährmedium kultiviert und das Antibioticum s gelegentlich in Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedien beobaçh-PS-5 wird isoliert. Typische, das Antibioticum PS-5 produzieren- tet wird. Sporenform und -anzahl in Sporenketten: ovale oder de Mikroorganismenstämme gehören zur Gattung Streptomy- zylindrische Sporen bilden eine Kette von mehr als 10, öfters ces, deren bevorzugtes Beispiel der hier beschriebene Strepto- 10-50, Sporen. Grösse und Oberflächenstruktur der Sporen: mycesstammist, der aus einem in der Nähe desEiheijitempelsim 0,8-1,0x1,0-0,8 [x, glatte Oberfläche. Weder Flagella noch Joshidabezirk der Fukuipräfektur in Japan gesammelten Boden- 10 Sporangium wurden beobachtet. Hyphae sind am Luftmycel muster isoliert und mit der Stammnummer A271 bezeichnet gebildet.

wurde.

Taxonomische Eigenschaften von Stamm A271 2. Kultureigenschaften

Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes Streptomyces 15 Diese Eigenschaften des Stammes A271 sind in Tabelle 1 A271 sind die Folgenden: zusammengestellt, die, wenn nicht anders angegeben, nach zwei

Wochen Kultivierung bei 28° C erhaltene Beobachtungsresultate 1. Morphologische Eigenschaften zeigt. Die Beschreibung der Farbtöne beruht vor allem an H. D.

Verzweigung des sporenbildenden Luftmycels: einfach ver- ^ Tresner' und E. J. Backus' Verfahren «System of color wheels for zweigt. Form des sporenbildenden Luftmycels: der Oberteil oder " Streptomycete Taxonomy» (s. Appi. Microbiol. 11,335,1963) Wipfel des Luftmycels weist Haken, Schleifen und unvollständi- und am Farbtonschlüssel des durch die Japan Color Institute ge Spiralen auf. Foundation veröffentlichten «Guide to Color Standard».

Tabelle 1

Media

Wachstum

Luftmycelfarbe

Vegetativmycelfarbe

Lösliches Pigment

Sucrosenitrat-

reichlich hellorangegelb (3ea)

hellgelb (2fb) bis hell kein

Agarmedium

orangegelb (3ea)

Glucose-Asparagin-

reichlich bleichorangegelb (3ca) bis hellgelb (lMb-2fb)

kein

Agarmedium

hellorangegelb

Glycerin-Asparagin- "

reichlich bleichorangegelb (3ca) bis hellgelb (2fb) bis ewas kein

Agarmedium

hellorangegelb (3ea)

gelblich rosa (4gc)

Stärke-Anorganischsalz-

reichlich bleichorangegelb (3ca) bis hellorangegelb (3ea) bis kein

Agarmedium

hellorangegelb (3ea)

hellgelb (2fb)

Tyrosin-Agarmedium reichlich bleichorangegelb (3ca) bis hellorangegelb (3ea) bis kein

hellorangegelb (3ea)

braungelb

N ähragarmedium reichlich kaum geformt; wenn hellgelb (2db)

kein

geformt, eher dunkel

Hefeextrakt-Malzextrakt-

reichlich bleichorangegelb (3ca) bis hellorangeelb (3ea) bis kein

Agarmedium

hellorangegelb (3ea)

bleichbraun (4ie)

Hafermehl-Agarmedium reichlich bleichorange (3ca) bis hellgelb (2fb)

kein

hellorangegelb (3ea)

3. Physiologische Eigenschaften

1. Wachstumstemperaturbereich: 10-40°C, Optimum 20-30°C

2. Gelatinverflüssigung (auf Glucose-Pepton-Gelatin-Me-dium): verflüssigt (kultiviert bei 20° C)

3. Stärkehydrolyse (auf Stärke-Anorganischsalz-Agarme-dium): hydrolysiert

4. Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch: pepto-nisiert, jedoch keine Koagulation beobachtet

5. Bildung von Melanoidpigment: auf Tyrosinagarmedium, Pepton-Hefe-Eisenagar-Medium und in Trypton-Hefeextrakt-Bouillon kein Melanoidpigment gebildet.

6. Verwendung von Kohlenstoffquellen (Pridham und Gott-

lieb's-Agarmedium)

55

60

65

L-Arabinose

D-Xylose

D-Glucose

D-Fructose

Sucrose

Inositol

L-Rhamnose

Raffinose

D-Mannitol

+ +

+

(+ : zufriedenstellende Verwendung, ± : geringfügige Verwendung,

■ : sehr schwache oder gar keine Verwendung)

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Gemäss den vorstehend erläuterten Eigenschaften gehört der Stamm A271 zur Gattung Streptomyces und hat mit der Sektion RA angehörenden Mikroorganismen gemeinsame Eigenschaften, da der Farbton der Myceliumoberfäche gelb oder rot ist, die Sporenfläche glatt ist und kein wasserlösliches Pigment wie Melanoidpigment, gebildet wird. Kulturen solcher taxonomi-scher* wurden in Waksman's «The Actinomycetes» Band 2 (1961), E. B. ShirlingundD. Gottliebs Aufsätzen im International Journal of Systematic Bacteriology, Band 18, Seiten 69-189 (1968), ibid., Seite 279-892 (1968), ibid., Band 19, Seiten 391-512 (1969), ibid., Band 22, Seiten 265-394 (1972), undin Bergey's Manual of determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974) beschrieben. Ähnliche, zur Sektion RA gehörende Kulturen sind Actinomyces cremeus, Actinomyces flavidovirens, Acti-nomyces albohelvatus, Actinomyces flavescens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces chryseus, Streptomyces helvaticus. Eine aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften ähnliche,

aber der Sektion RF angehörende Kultur ist Streptomyces pluricolorescens. Die vorstehend genannten acht Kulturen produzieren, mit Ausnahme der Streptomyces pluricolorescens, gerade oder schleifenförmige Luftmycele, wobei die Formände-5 rung von den Kultivierbedingungen abhängig ist. Typische Kulturen der vorstehend genannten acht Spezies wurden mit jenen des Stammes A271 nach Kultivierung unter den gleichen Bedingungen verglichen. Aufgrund der dabei erhaltenen Vergleichsre-sultate unterscheidet sich der Stamm A271 von den vorstehend io genannten acht Kulturen sowohl infolge Wachstums-, Luftmy-celfarben- und Vegetativmycelfarbenunterschieden als auch zufolge Kohlenstoffverwendungsunterschieden.

Die Tabellen 2,3 und 4 zeigen die Resultate des Vergleichs von Stamm A271 mit den zwei ihm ähnlichsten Kulturen.

15

Eigenschaften

Tabelle 2 Vergleich mit ähnlichen Kulturen Luftmycelfarbe

Media

Stamm A271

Actinomyces cremeus ISP 5147 Actinomyces flavidovirens

ISP 5150

Sucrosenitrat-Agarmedium

Glucose-Asparagin-

Agarmedium

Glycerin-Aspargin-

Agarmedium

Stärke-Anorganischsalz-

Agarmedium

Nähragarmedium

Hefeextrakt-Malzextrakt-

Agarmedium

Hafermehl-Agarmedium hellorangegelb (3ea) bleichorangegelb (3ca) bis hellorangegelb (3ea) bleichorangegelb (3ca) bis hellorangegelb (3ea) bleichorangegelb (3ca) bis hellorange (3ea)

kaum geformt; wenn leicht geformt, dunkel bleichorangegelb (3ca) bis hellorangegelb (3ea) bleichorangegelb (3ca) bis hellorangegelb (3ea)

kaum geformt bleichorangegelb (3ca)

bleichorangegelb (3ca)

bleichorangegelb (3ca)

weiss (a) bis bleichorangegelb (3ca)

bleichgelb (2db)

weiss (b) bis bleichorangegelb (3ca)

nicht geformt weiss (b)

kaum geformt; wenn leicht geformt, weiss (a)

dünn geformt; weiss (a) bis bleichgelb (2db)

weiss weiss (b) bis bleichgelbgrün (leb)

weiss (b) bis bleichgelbgrün (lbd)

Tabelle 3 Vergleich mit ähnlichen Kulturen Vegetativmycelfarbe

Media

Stamm A271

Actinomyces cremeus ISP 5147

Actinomyces flavidovirens

ISP 5150

Sucrosenitrat-Agarmedium hellgelb (2fb) bis dürftiges Wachstum, farblos dürftiges Wachstum, farblos

hellorangegelb (3ea)

bis weiss (b)

bis weiss (a)

Glucose-Asparagin-

hellgelb (lî4fb-2fb)

gelb (3ea)

bleichgelb (2db)

Agarmedium

Glycerin-Asparagin-

hellgelb (2fb) bis etwas hellorangegelb (3ea)

graugelb (3ec)

Agarmedium gelblichrosa (4gc)

Stärke- Anorganischsalz-

hellorangegelb (3ea) bis mässig gelblichrosa (4ea)

hellgelb (2fb)

Agarmedium hellgelb (2fb)

Tyrosin-Agarmedium hellorangegelb (3ea) bis bleichbraun (4ie)

graugelb (3ec)

braunlichgelb

N ähragarmedium bleichgelb (2db)

hellorangegelb (3ea)

bleichgelb (2db)

Hefeextrakt-Malzextrakt-

hellorangegelb (3ea) bis hellorangegelb (3ea) bis mattgelb

Agarmedium bleichbraun (4ie)

dunkelgelb

Hafermehl-Agarmedium hellgelb (2fb)

etwas gelblichrosa (4gc)

bleichgelb (2db) bis bleich

orangegelb (3ca)

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Tabelle 4 Vergleich mit ähnlichen Kulturen Verwendung von Kohlenstoffquellen

Kohlenstoff

Stamm A271

Actinomyces

Actinomyces quelle

cremeus flavidovirens

ISP 5157

ISP 5150

L-Arabinose

+

+

+

D-Xylose

+

+

+

D-Glucose

+

+

+

D-Fructose

-

+

+

Sucrose

+

—

—

Inositol

-

—

+

L-Rhamnose

+

—

+

Raffinose

—

—

—

D-Mannitol

-

-

-

10

Die nachfolgenden Betrachtungen beruhen auf den Resultaten der vorstehenden Tabellen 1-4:

Luftmycelfarbe: Actinomyces flavidovirens ist im allgemeinen weiss, aber wenn sie gelb ist, ist sie grünlichgelb, wobei sie sich vom beschriebenen Stamm A271 klar unterscheidet; Actinomyces cremeus hat im allgemeinen einen weniger rötlichen Bleichorangegelbfarbton als jener des Stammes A271, wodurch sie sich von diesem Stamm klar unterscheidet.

Vegetativmycelfarbe: in vielen Fällen hat Actinomyces flavidovirens eine bleichgelbe Farbe und Actinomyces cremeus eine hellorangegelbe Farbe, während der Stamm A271 im allgemeinen eine hellgelbe Farbe aufweist. Ein Vergleich der in verschiedenen Medien erhaltenen Versuchsresultate zeigt ferner, dass der Stamm A271 von den anderen Kulturen unterschiedlich ist. Andererseits unterscheidet sich dieser Stamm von Actinomyces cremeus in der Verwendung von D-Fructose und L-Rhamnose und von Actinomyces flavidovirens in der Verwendung von D-Fructose und von Inositol.

Der beschriebene Stamm A271 ist folglich von den beiden ihm ähnlichsten Kulturen klar unterscheidbar.

Der Stamm A271 ist aber auch von allen bekannten Strepto-mycetenspecies unterschiedlich und wird als neue Species anerkannt, die als Streptomyces sp. A271 bezeichnet wird. Diese Kultur wurde bei dem Fermentation Research Institute des Agency of Industriai Science and Technology hinterlegt, wo sie die Kulturnummer FERM-P Nr. 3984 erhielt. Ein Muster des Streptomyces sp. A271 wurde auch am 20. Dezember 1977 bei der ATCC hinterlegt, wo es die Kollektionsnummer 31358 erhielt.

Zur Herstellung des beschriebenen Antibioticums PS-5 können nun sowohl der Stamm A271 selbst als auch seine natürlichen und künstlichen Mutanten verwendet werden, die durch chemische und/oder physikalische Behandlung erhalten werden können.

Die PS-5-produzierenden Mikroorganismen sind keineswegs auf eine besondere Gattung beschränkt, sondern sie können aus einer breiten Vielfalt von Mikroorganismen gewählt werden.

Die Wahl der PS-5-produzierenden Mikroorganismen kann gemäss folgendem Verfahren erfolgen: Kulturbouillonfiltrate von vom Boden isolierten Mikroorganismen werden unter Ver- ' wendung einer mit einem betalactamempfindlichen Mikroorganismus inokulierten ersten Bioversuchsagarplatte und einer zweiten Bioversuchsagarplatte analysiert, die Betalactamase enthält und mit dem gleichen Organismus inokuliert ist. Die an der zweiten Agarplatte Bouillonfiltrate mit kleineren Hemmzonen als an der ersten Platte ergebenden Mikroorganismen werden für Weiterbehandlung ausgewählt. Dann werden die aktiven Bestandteile der Bouillons der ausgewähltem Mikroorganismen an aktivem Kohlenstoff adsorbiert und eluiert. Die konzentrierten

Eluate werden durch Papierchromatographie oder Dünnschichtchromatographie entwickelt und eine Bioautographie wird mit einem dem Versuchsorganismus ähnlichen betalactamempfindlichen Mikroorganismus durchgeführt. Das Screeningverfahren wird im nachfolgenden Beispiel näher erläutert. Die weiter unten beschriebene Comamonas-Bioversuchsplatte wird als die mit dem betalactamempfindlichen Versuchsorganismus inokulierte Bioversuchsagarplatte verwendet. Die Comamonas CV-Biover-suchsplatte und die Comamonas CM-B io versuchsplatte werden durch Zugabe an die vorstehend genannte Comamonas-Bioversuchsplatte von durch Proteus vulgaris PS-5 bzw. von Citrobacter freundii E-9 produzierter Betalactamase erhalten.

Mit den Bouillonfiltraten der vom Boden isolierten Mikroorganismen dotierte Pulpscheiben von 8 mm betragendem Durch-15 messer werden an die vorstehend genannten Bioversuchsplatten gelegt und die Platten werden bei 35°C während 20 h gebrütet.

Zur Weiterbehandlung werden nach erfolgter Bebrütung oder Inkubation, die Mikroorganismen ausgewählt, deren Bouillonfil-trat an der Comamonas-Bioversuchsplatte eine grössere Hemm-20 zone und an der Comamonas CV- oder der Comamonas CM-Bioversuchsplatte eine kleinere Hemmzone ergab.

In die Bouillonfiltrate dieser Mikroorganismen werden 2 Gew./Vol.-% aktivierter Kohlenstoff («Tokusei Shirasagi», Ta-keda Chemical Industries, Ltd.) eingegeben und das unlösliche Material wird nach Rühren während 15 min durch Zentrifugieren gesammelt. Das unlösliche Material wird nun mit einem jenem des verwendeten Bouillons gleichen Volumen von destilliertem Wasser gewaschen und erneut durch Zentrifugieren gesammelt. Das gewaschene Material wird dann eluiert, wobei eine die Hälfte des verwendeten Bouillonfiltratvolumens betragende Menge von 50 Vol./Vol.-% wässrigem Aceton eingegeben und die Mischung bei Raumtemperatur während 30 min gerührt wird. Nach erfolgtem Zentrifugieren wird das Supernatant unter Verwendung eines Drehverdampfers bei 30-35° C verdampft, wobei eine in Vergleich zum Bouillonfiltrat 20-f ach konzentrierte Lösung erhalten wird. Diese Lösung wird mit Filtrierpapier (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.) chromatographiert, das während 16 h bei 80 % Acetonitril/Tris EDTA-Lösungsmittel (120 ml Acetonitril, 80 ml pH 7.51/10 MTris-(hydroxymethyl)-40 aminomethan-HCl Puffer und 1 ml wässerige Äthylendiaminte-traessigsäurenatriumsalzlösung) entwickelt wird. Darauffolgend wird Bioautographie mit Comamonas terrigena B-996 als Versuchsorganismus durchgeführt.

Jene vom Boden isolierten Mikroorganismen, deren biolo-43 gisch aktives Produkt eine Hemmzone mit einer Wanderungsdistanz oder einem Rf-Wert ergibt, die jenen des Antibiotikums PS-5 gleich sind, werden als Kandidate für die Produktion dieses Antibioticums gewählt. Die PS-5-Produktionsfähigkeit der so ausgewählten Mikroorganismen wird durch weitere Papier- und 50 Dünnschichtchromatographiestudien näher ermittelt.

Gemäss den vorstehend beschriebenen Verfahren kann der gut ausgebildete Fachmann nebst dem Stamm Streptomyces sp. A271 noch andere PS-5-produzierende Mikroorganismen finden.

55 Gemäss einer Ausführungsform des beschriebenen Verfahrens kann das Antibioticum PS-5 dadurch hergestellt werden, dass Sporen des Mycels eines zur Produktion dieses Antibioticums fähigen Mikrobenstammes wie Streptomyces sp. A271 in ein Nährmedium inokuliert und aerobisch kultiviert werden. 60 Dabei kann eine breite Vielfalt von für Streptomycetes üblichen Nährstoffen wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze usw., verwendet werden. Beispiele für als Nährstoff verwendbare Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate wie Glucose, Glycerin, Maltose, Sucrose. Melasse, Dextrin, 65 Stärke oder andere ähnliche Kohlehydrate; Öle und Fette wie Soyabohnenöl, Erdnussöl, Schmalz oder andere ähnliche Öle und Fette. Beispiele für als Nährstoff verwendbare Stickstoffquellen sind Pepton, Fleischextrakt, Soyabohnenmehl, Baum-

25

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35

wollsamenöl, getrocknete Hefe, Getreidetränkflüssigkeit, Hefeextrakt, Magermilchcasein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, oder andere ähnliche Stickstoffquellen. Beispiele für als Nährstoff verwendbare anorganische Salze sind Dikaliumphosphat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat o.der andere ähnliche anorganische Salze. Spurenmetalle wie Kobalt, Mangan oder andere ähnliche Spurenmetalle können erwünschtenfalls eingegeben werden. Alle andere zur Herstellung des Antibioticums PS-5 geeignete Nährstoffe können übrigens verwendet werden. Schaumhemmittel wie Silicon-öl, Pflanzenöl oder andere ähnliche Schaumhemmittel können zwecks Verhinderung der Schaumbildung während der Erwärmung zwecks Sterilisierung und der Gärung verwendet werden.

Der Nährstoffgehalt der Formulierung ist durch die vorangehende Beschreibung nicht beschränkt und kann in weiten Grenzen variieren.

Die bestgeeignete Nährstofformulierungund -komposition kann vom gut ausgebildeten Fachmann im Rahmen kleiner Experimente mühelos ermittelt werden.

Das Medium kann vor der Kultivierung sterilisiert werden.

Das pH des verwendeten Mediums wird vor oder nach der Sterilisierung, vorzugsweise im Bereich 4-9, mehr bevorzugt im Bereich 6-8, eingestellt.

Das Kultivieren des das Antibioticum PS-5 produzierenden Stammes kann gemäss einem Verfahren durchgeführt werden, das den herkömmlichen Antibioticumproduktionsverfahren durch Streptomycetes ähnlich ist, wobei hier jedoch unter aerobi-schen Bedingungen, d. h. unter Rühren und/oder Belüftung, kultiviert wird.

Obwohl beliebige Kultivierverfahren wie stationäre, Schüttel-und Tauchkulturen verwendet werden können, wird Tauchkultur meistbevorzugt. Die nicht besonders beschränkte Fermentie-rungstemperatur sollte allgemein in einem Bereich gehalten werden, in welchem das Wachstum des PS-5-produzierenden Organismus nicht gehemmt wird. Die Fermentationstemperatur ist von dem jeweils verwendeten Produzentstamm abhängig, wobei geeignete Temperaturen 20-40° C, vorzugsweise 25-35° C, betragen können.

Das pH der Bouillon kann während der Fermentation im Bereich 4-9, vorzugsweise im Bereich 6-8, eingestellt werden.

Bei Fermentierung auf industriellem Massstab wird vorzugsweise zunächst eine geeignete Keimkultur kultiviert und dann der Nährstoff für die Tauchkultur mit dieser Keimkultur inokuliert.

Die Fermentation wird solange fortgesetzt, bis die erwünschte Menge von Antibioticum PS-5 erhalten worden ist. Die üblicherweise 30-90 h betragende Fermentationsdauer ist von der Zusammensetzung des Kulturmediums, der Fermentationstemperatur, dem verwendeten Produzentenstamm und von anderen ähnlichen Parametern des Systems abhängig. Die optimalen Fermentationsbedingungen können vom gut ausgebildeten Fachmann im Rahmen kleiner Experimente mühelos ermittelt werden.

Die in der Bouillon akkumulierte Menge von Antibioticum PS-5 kann durch die weiter unten beschriebenen Bioversuche und Bioautographie ermittelt werden.

Da das im Fermentationsmaterial sich anhäufende Antibioticum PS-5 wasserlöslich ist und sich ausserhalb des Mycels befindet, wird das Mycel nach der Gärung gemäss herkömmlichen Trennverfahren wie Filtrieren, Zentrifugieren, Extrahieren usw. entfernt und das Antibioticum PS-5 aus dem Filtrat, Super-natant bzw. Extrakt usw. wiedergewonnen.

Das Antibioticum PS-5 kann dabei gemäss verschiedenen herkömmlichen Verfahren wiedergewonnen werden, wobei die zur Wiedergewinnung der Antibiotica vom Carbonsäuretyp verwendeten Verfahren bevorzugt werden.

Beispiele für dabei unabhängig, kombiniert oder wiederholt zwecks Wiedergewinnung und Isolierung des Antibioticums PS-5

643262

anwendbare Verfahren sind die folgenden: (a) Extrahierung bei niedrigem pH mit einem Lösungsmittel wie Äthylacetat, n-Butanol oder ein anderes ähnliches Lösungsmittel, und Rückex-trahierung aus der Lösungsmittelschicht in eine wässerige Schicht bei einem höheren pH; (b) Extrahierung bei neutralem pH mit Lösungsmitteln wie Methylenchlorid, Chloroform, oder ein anderes ähnliches Lösungsmittel, in Gegenwart eines lipophilen quaternären Ammoniumsalzes wie Benzalkoniumchlorid, Tetra-n-butylammoniumwasserstoffsulfat, oder ein anderes ähnliches Salz, oder einer Kronverbindung wie DicycIohexyl-18-kron-6 und 15-Kron-5-NISSO Kronäther (Nippon Soda Co., Ltd.) und die Rückextrahierung aus der Lösungsmittelschicht in eine neutrale wässerige natriumjodidhaltige, kaliumjodidhaltige oder ein anderes ähnliches Salz enthaltende Schicht; (c) Adsorption an aktiviertem Kohlenstoff, an hochporösen Styrol/Divinylbenzol-Harzen wie Amberlit XAD (Rohm & Haas Co. ), Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oder an.einem anderen ähnlichen Aktivstoff und Eluieren mit wässrigem Methanol, wässerigem Aceton oder mit einem anderen ähnlichen Eluat; (d) Adsorption und Eluieren mit einem Ionenumtauscherharz wie Dowex 1-X2 (Dow Chemical Co. ), Q AE-Sephadex A-25 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oder mit einem anderen ähnlichen Material; (e) Gelfiltrieren mit Sephadex G-10 (PharmaciaFine Chemicals AB), Bio-Gel P-2 (Bio-Rad Laboratories), Bio-Perlen S-X3 (Bio-Rad Laboratories) oder einem ähnlichen Material; (f) Kolonnen- oder Dünnschichtchromatographie mit Cellulose, Avicel SF (American Viscose Corp.), DEAE-Cellulose What-man DE-32 (Whatman Ltd. ), DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia Fine Chemicals AB), Silicagel, Tonerde, oder einem anderen ähnlichen Material; und (g) Ausfällung durch Eingabe von Lösungsmittel wie Aceton usw. In den Wiedergewinnungs- und Isolierungsverfahren kann das Antibioticum PS-5 durch weiter unten beschriebene Bioversuchsverfahren und Bioautographie ermittelt werden. Das auf die vorstehend erläuterte Weise erhaltene Antibioticum PS-5 hat die im Folgenden beschriebenen Eigenschaften.

Physikalische Eigenschaften des Antibioticums PS-5 (1) Löslichkeit Das Antibioticum PS-5 ist bei pH 6-9 wasserlöslich. Es ist ferner löslich nicht nur in Wasser bei pH 7, sondern auch in einem leicht sauren wässrigen Medium, das beispielsweise durch Eingabe von Chlorwasserstoffsäure usw. zu pH 6 oder mehr eingestellt wurde, und auch in einem schwach alkalinen wässrigen Medium, das durch Eingabe beispielsweise von Natriumwasserstoffcarbo-nat, Natriumhydroxid usw. auf pH kleiner als 9 eingestellt wurde.

Das Antibioticum PS-5 ist in Äthylacetat und Benzol bei mehr als 4 betragendem pH unlöslich.

(2) Dünnschichtchromatographie (TLC) Das Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) ergibt bei Prüfung mit den im folgenden genannten TLC-Platten und Lösungsmittel die nachfolgend angeführten Werte. Die Lösungsmittelanteile der verwendeten Lösungsmittelmischungen sind dabei, wenn nicht anders angegeben, als V0I-/V0I.-Verhältnis ausgedrückt.

(a) Avicel® SF Cellulosedünnschichtplatte (Funakoshi Phar-maceutical Co., Ltd.)

n-Butanol/Äthanol/Wasser (7/7/6) Rf = 0,94

i-Propanol/Wasser (7/3) Rf = 0,96

(b) Vorverkleidete Silicagelplatten 60 F->54 (E. Merck) Äthanol/Wasser (7/3) " Rf = 0,82 n-Propanol/Wasser(7/3) Rf = 0,77

(3) Papierchromatographie Das Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) ergibt bei Verwendung von Toyo Filtrierpapier Nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) und der

7

5

10

15

20

25

30

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40

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60

65

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nachstehend angeführten Lösungsmittel bei fallender Papierchromatographie die folgenden Rf-Werte:

n-Propanol/Wasser (7/3) _ Rf = 0,68

n-Propanol/i-Propanol/Wasser (7/7/6) Rf = 0,70

Acetonitril/Wasser (8/2) Rf = 0,36

Acetonitril/Tris/EDTA (Bemerkg. 1) Rf = 0,34

Äthanol/Wasser (7/3) Rf = 0,63

Bemerkung 1: Gemischtes Lösungsmittel bestehend aus 120 ml Acetonitril, 30 ml pH 7,51/10 M Tris-(hydroxymethyl)-amino-methan-chlorwasserstoffsäure Puffer und 1 ml pH7,51/10 M Äthylendiamintetraessigsäurenatriumsalz.

(11) Farbenreaktion Ehrlichreagent-Reaktion: positiv

Jod-Chlorplatinsäure-Reaktion: positiv

Ninhydrinreaktion: negativ

Die vorstehend genannten physikalischmechanischen Eigenschaften zeigen, dass das Molekül des Antibioticums PS-5 (Natriumsalz) die Gruppen

N . .... .

-ilio CH3-CH2-, ch3co-,-ch2-, -ch-, -ch-,

coo0 enthält.

0^

, -nhco- und

(4) Hochspannungspapierelektrophorese Wenn mit dem Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) auf Toyo Filtrierpapier Nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) unter Verwendung eines Hochspannungspapierelektrophoresenapparates (Savant Instruments Inc., Hochspannungspeisung HV 3000A, Flachplattenelektrophoresekammer FP18A), wird folgendes Verhalten beobachtet: mindestens 5 mm, üblicherweise 10-40 mm, betragende Wanderung zur Anode unter einer 30 min dauernden Einwirkung eines 42 Volt/cm betragenden Potential-gradients in einem pH 8,6 Puffer bestehend aus 3000 ml Wasser, 3,3 g Barbital und 25,5 g Barbitalnatrium.

(5) Säurewertigkeit Das Antibioticum PS-5 ist eine monobasische Säure mit einer Carbonsäure im Molekül.

Die Elementaranalyse des Tritylesters des Antibioticums PS-5 15 (Beispiel 10) zeigt die Anwesenheit von Schwefel. Sowohl die Daten des UV-Absorptionsmaximums und -minimums als auch das Absorptionsverhältnis und der Extinktionskoeffizient deuten Thienamycinskelettanwesenheit im Molekül an. Dies ist ferner durch die Verschiebung des UV-Absorptionsmaximums von 301 20 nm auf 315 nm bei Veresterung der Carboxylhälfte bestätigt (16th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Chicago, 29.10.1976).

Aufgrund des vorstehend angeführten Beweismaterials dürfte das Antibioticum PS-5 eine Molekularstruktur folgender Formel 25 haben:

Tif

CH -CH-

(6) UV-Absorptionsspektrum

Das charakteristische UV-Absorptionsmaximum des Antibioticums PS-5 (Natriumsalz) ist wie folgt:

= 301nm

(7) IR-Absorptionsspektrum

Die gemäss dem KBr-Tablettverfahren ermittelten charakteristischen IR-Absorptionsmaxima des Antibioticums PS-5 (Natriumsalz) sind die Folgenden:

annähernd 1750 cm'1 (-CO- in Betalactamring)

annähernd 1650 cm"1 (-CO-vonAmid)

annähernd 1640-1540 cm"1 (-COO0)

30

S-CH -CH -NH-C0-CH3

^COOH

35

(8) Magnetisches Protonenresonanzspektrum NMR Das Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) ergibt im 100 MHz magnetischen Protonenresonanzspektrum NMR gemessen in D20 die folgenden charakteristischen Signale:

(i) ein annähernd bei 1,06 ppm zentriertes Triplett mit Kupplungskonstanten von annähernd 7,5 Hz (CH3-CH2-)

(ii) ein Multiplett annähernd bei 1,72-2,00 ppm (CH3-CH2-)

(iii) ein scharfes Singlett annähernd bei 2,05 ppm (CH3-CO-)

(iv) ein Multiplett annähernd bei 2,88-3,58 ppm (CHy-CH-)

N

!_ !

(v) ein Multiplett annähernd bei 3,92-4,20 ppm (-CH-)

(9) Spezifische Drehung [a] d + 77,3 (C, 1,59, 0,01M pH 8 Natriumphosphatpuffer)

(10) Molekulargewicht und Molekularformel Das aus den mit dem Methylester des Antibioticums PS-5 erhaltenen Hochauflösungsmassenspektrometrieresultaten errechnete Molekulargewicht beträgt annähernd 298. Die Molekularformel ist:

c13h18n2o4s

Dies wird auch dadurch bestätigt, dass, wie weiter unten in Beispiel 9 beschrieben, das Antibioticum PS-5 im 13C-NMR-Spektrum 13 Signale ergibt, wobei die chemischen Verschiebungen in Vergleich mit den entsprechenden Thienamycindaten mit 40 der vorstehend angeführten Molekularstruktur vereinbar sind.

D as Antibioticum PS-5 ist bei weniger als 0° C insbesondere bei weniger als —10°C, betragenden niedrigenTemperaturenziem-lich stabil, obwohl es unstabil zu sein erscheint, wenn beispielsweise die Isolierung bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Es 4S ist ziemlich stabil in wässrigen Lösungen bei etwa neutralem oder leicht alkalinem pH. Das Antibioticum PS-5 bewahrt mindestens 50 %, üblicherweise mehr als 70 %, seiner antibiotischen Wirksamkeit nach einer Erwärmung bei 60° C während einer mindestens 15 min betragenden Zeitdauer in einer wässrigen Lösung 50 bei etwa neutralem bis leicht alkalinem, weniger als 9 betragendem pH.

Biologische Eigenschaften des Antibioticums PS-5 (1) Antibiotisches Spektrum 55 Das beschriebene Antibioticum PS-5, das eine antibiotische Wirksamkeit von breitem Spektrum besitzt, hat eine besonders starke Wirkung gegen verschiedene Bakterien, beispielsweise grampositive Bakterien von Gattungen wie Staphylococcus, Di-plococcus, Streptococcus, Sarcina, Bacillus und andere ähnliche 60 Bakterien sowie gegen gramnegative Bakterien von Gattungen, oder Generibus, Alcaligenes, Comamonas und andere ähnliche gramnegative Bakterien. Das beschriebene Antibioticum PS-5 hat eine ziemlich gute Wirksamkeit gegen gramnegative Bakterien von Gattungen wie Escherichia, Klebsiella, Proteus und 65 andere ähnliche gramnegative Bakterien.

Das Antibioticum PS-5 hat eine starke Wirksamkeit gegen gramnegative Bakterien, die gegen betalactamringstrukturauf-weisende Antibiotica resistent sind, beispielsweise gegen Bakte-

643262

rien von Gattungen wie Citrobakter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Serratia und andere ähnliche Bakterien.

(2) Steigerung der antibiotischen Wirkung anderer Antibiotica gegen betalactamaseproduzierende Bakterien s Das beschriebene Antibioticum PS-5 besitzt die Fähigkeit zur Steigerung der antibiotischen Wirksamkeit anderer Antibiotica, insbesondere der Betalactamantibiotica wie Penicilline und Cephalosporine, gegen betalactamaseproduzierende Bakterien wie Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, 10 Serratia marcescens, und andere ähnliche Bakterien, wobei das Wirksamkeitsmodell meistens synergetisch ist.

pen sind Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, n-Pentyl, Isopentyl, n-Hexyl und andere ähnliche Gruppen.

Die Ester der Formel (II) können durch Reaktion des Äntibio-• ticums PS-5 der Formel (I) oder eines deren Salze mit einer Verbindung der Formel

(II)

OL-CH,

(Iii)

RY

(3) Antimikrobielle Wirksamkeit in vivo Bei Verabreichung an mit photogenen grampositiven Bakterien infizierte Mäuse hat das Antibioticum PS-5 eine starke therapeutische Wirkung.

(4) Giftigkeit

Bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse in 500 mg/kg betragenden Dosen verursacht das beschriebene Antibioticum PS-5 unter den Prüfungstieren keine Todesfälle.

Derivate des Antibioticums PS-5 Da das beschriebene Antibioticum PS-5, wie vorstehend beschrieben, etwas labil ist, müssen die Wiedergewinnungs- und Isolierverfahren sorgfältig durchgeführt werden. Da das Antibioticum PS-5 in der Salzform in allgemeinen stabiler als im Freisäu-rezustandist, wird bei pharmazeutischer Verwendung, bei Verwendung als Zwischenprodukt zur Derivatensynthese und im Isolierverfahren die Salzform bevorzugt. Beispiele für die Salzform des Antibioticums PS-5 sind Alkalimetalsalze wie Natriumsalz, Kaliumsalz, Lithiumsalz oder ein anderes ähnliches Salz; Alkalierdmetallsalze wie Calciumsalz, Magnesiumsalz oder ein anderes ähnliches Salz; andere Metallsalze wie Aluminiumsalz oder ein anderes ähnliches Metallsalz; Ammoniumsalz; Salze mit primärem, sekundärem und tertiärem Amin wie Monoäthyl-amin, Dimethylamin, Triäthylamin, Monoäthanolamin, Diätha-nolamin oder ein anderes ähnliches Amin; und Salze mit organischen Basen wie Benzathin, Procain oder ein anderes ähnliches Salz. Geeignete Salze sind pharmazeutisch annehmbare Salze, d.h. Salze mit Katinen, die die pharmazeutischen und toxicologi-schen Eigenschaften der freien Säure nicht beeinträchtigen. Mit besonders gutem Erfolg verwendbare Salze sind jene von Alkalimetallen wie Natrium, Kalium usw.

Das beschriebene Antibioticum PS-5 ist, wie vorstehend erwähnt, eine monobasische Säure mit einer Carboxylgruppe im Molekül. Verschiedene Ester können deshalb vom Antibioticum PS-5 mit verschiedenen Alkoholen, Mercaptanen oder deren esterproduzierenden Derivaten auf eine beispielsweise jener der herkömmlichen Antibiotica Clavulansäure oder Thienamycin ähnliche Weise erhalten werden.

Ein geeigneter Ester des Antibioticums PS-5 hat die Formel

15

20

25

30

35

40

45

50

55

S-CH0-CH -NH-C0-CH, ci :

vr~H

60

X0ÛR

worin R Niederalkyl oder Triphenylmethyl bedeutet. In Formel (II) bedeutet die Niederalkylgruppe eine Gruppe mit gerader oder verzweigter Kette, insbesondere eine weniger als 6 Kohlenstoffatome aufweisende Alkylgruppe, mehr bevorzugt eine 1-4 Kohlenstoffatome aufweisende Gruppe. Beispiele solcher Grup65

worin R die vorstehend genannte Bedeutung hat und Y ein Atom oder eine Gruppe bedeutet, die abtrennbar sind, oder mit einem Niederdiazoalkan erhalten werden.

Als Atome oder Gruppen Y der Formel (III) können bei Berührung mit der Carboxylgruppe des Antibioticums PS-5 abtrennbare Atome, beispielsweise Halogenatome wie Chlor, Brom oder Jod, oder Gruppen, beispielsweise Sulfonyloxygrup-pen, reaktive Carbonyloxygruppen wie -O-CO-cf3, vewendet werden. Die Halogenatome werden dabei besonders bevorzugt.

Beispiele für die Verbindung der Formel (III) sind: Methylalkohol, Methyljodid, Dimethylsulfat, Methylmercaptan, Äthanol, Äthylbromid, Äthyljodid, Äthylmercaptan, n-Propylchlo-rid, n-Propyljodid, Propylalkohol, Isopropylalkohol, Isopropyl-bromid, n-Butylalkohol, n-Butylbromid, n-Butyljodid, n-Pentyl-alkohol, n-Pentylchlorid, n-Pentylbromid, n-Pentyljodid, n-He-xylalkohol, n-Hexylbromid, n-Hexyljodid, Tritylalkohol, Trityl-mercaptan, Tritylchlorid, Tritylbromid und andere ähnliche Verbindungen.

Ein Beispiel für ein zur Herstellung der Ester des beschriebenen Antibioticums PS-5 besonders geeignetes Niederdiazoalkan ist Diazomethan.

Die Reaktion des Antibioticums PS-5 mit den Verbindungen der Formel (III) oder mit den Niederdiazoalkanen kann gemäss herkömmlichen Veresterungsverfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann diese Reaktion in einem inerten wässerigen Medium durchgeführt werden, obwohl sie auch in Abwesenheit eines solchen Mediums durchgeführt werden kann. Beispiele für ein solches inertes Medium sind: (a) Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, n-Hexan, Cyclohexan oder ein anderer ähnlicher Kohlenwasserstoff, (b) Halokohlenwasserstoffe wie Chloroform, Methylenchlorid oder eine andere ähnliche Verbindung, (c) Amide wie Dimethylformamid, Hexamethyl-phosphotriamid oder eine andere ähnliche Verbindung, (d) Dimtethylsulfoxid, (e) Äther wie Diäthyläther, Diisopropyläther, Di-n-butyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan oder ein anderer ähnlicher Äther, (f) Ester wie Äthylacetat, n-Butylacetat oder ein anderer ähnlicher Ester, und (g) Ketone wie Aceton, Methyläthylketon oder ein anderes ähnliches Keton. Diese Lösungsmittel können einzeln oder als Mischung von deren zwei oder mehreren verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und kann in Abhängigkeit vom jeweils verwendeten Verbindungstyp der Formel (III), Niederdiazoalkantyp, Reaktionsmediumtyp oder in Abhängigkeit von einem anderen ähnlichen Parameter in breiten Grenzen variieren. Die Reaktionstemperatur kann in einem Bereich gewählt werden, in welchem das Antibioticum PS-5 sich nicht erheblich zersetzt, wobei eine geeignete Temperatur im allgemeinen weniger als 60° C, vorzugsweise 0-40° C, meistbevorzugt von 5° C bis Raumtemperatur beträgt. Bei Durchführung der vorstehend genannten Reaktion kann nötigenfalls ein Stimu-lator, wie Trimethylamin, Triäthylamin, Pyridin, Dicyclohexyl-carbodiimid oder eine andere ähnliche Verbindung eingegeben werden. Unter diesen Bedingungen kann die Reaktion in 1-24 h, üblicherweise 3-12 h, durchgeführt werden.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des beschriebenen Verfahrens braucht das in der Reaktion mit der Verbindung der Formel (III), worin R Triphenylmethyl bedeutet, verwendete Antibioticums PS-5 keine isolierte gereinigte Verbindung zu sein. Sowohl das kultivierte Material als auch die nach Entfernung der Mycele aus dem kultivierten Material erhaltene Bouil-

643262

10

Ion oder das rohe, im Rahmen der Wiedergewinnungs- und Isolierverfahren zum Teil gereinigte Antibioticum PS-5 können in dieser Reaktion verwendet werden. Beispiele für dieses zum Teil gereinigte Produkt sind (a) ein konzentriertes Eluat vom aktivierten Kohlenstoff, mit welchem die filtrierte Bouillon behandelt wurde, (b) ein konzentriertes Eluat von einem Styrol/ Divinylbenzol-Harz wie Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), welchem die filtrierte Bouillon ausgesetzt wurde, (c) ein entsalztes Konzentrat mit aktiviertem Kohlenstoff von einem Eluat, das mit einer Gradientkonzentration von Natriumchlorid in Phosphatpuffer von einem Umtauscherharz wie beispielsweise QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals) erhalten wurde, an welchem das vorerwähnte konzentrierte Eluat vom Diaion HP-20 adsorbiert wurde, (d) ein konzentriertes Methylenchloridextrakt in Gegenwart von Benzalkoniumchlo-rid, (e) ein konzentriertes Extrakt vom Chloroform in Gegenwart von Kronverbindungen, und (f) ein konzentriertes Butanol-extrakt mit pH 3,5 bei niedriger Temperatur.

Das so erhaltene Tritylester des Antibioticums PS-5 kann gemäss verschiedenen Verfahren aus der Reaktionsmischung isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise wird nach erfolgter Reaktion die Reaktionsmischung in ein wässriges Medium geschüttet, wobei die wässrigen Verunreinigungen wie die Nebenprodukte oder andere allfällige Verunreinigungen entfernt werden. Die Verwendung eines neutralen Puffers als wässeriges Medium wird bevorzugt, wobei das pH in Neutralitätsnähe gehalten wird. Der in dieser Mischung enthaltene Tritylester des Antibioticums PS-5 wird dann mit einem weniger polaren, mit Wasser kaum mischbaren Lösungsmittel wie Äthylacetat, Benzol, Chloroform oder ein anderes ähnliches Lösungsmittel extrahiert. Während der Extraktion kann zwecks Verbesserung ihrer Wirksamkeit ein Salz wie Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder ein anderes ähnliches Salz eingegeben werden. Nach erfolgter Trocknung des organischen Extraktes über wasserfreiem Natriumsulfat, kann der Tritylester aus der Lösungsmittelschicht gemäss bekannten Verfahren isoliert werden, die erwünschten-falls kombiniert werden können. Beispiele für solche Verfahren sind Gelfiltrieren unter Verwendung von Bio-Perlen S-X3 (Bio-Rad Laboratories), Cephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB), oder eines anderen ähnlichen Mittels; oder Adsorptionschromatographie unter Verwendung eines Trägers wie Sili-cagel, Tonerde, Fuller's Erde (Floridin Co.) oder ein anderer ähnlicher Träger.

Der Tritylester kann ferner durch Kristallisation aus einem Lösungsmittel oder aus einer Mischung von Lösungsmitteln wie Benzol, Toluol, Xylol, Äthylacetat, Diäthyläther, Methylenchlorid, Chloroform, Hexan, bei 30-60° C siedender Petroläther oder aus einem anderen ähnlichen Lösungsmittel gereinigt werden. Unter den gemäss dem beschriebenen Verfahren herstellbaren Estern der Formel (II) hat der PS-5-Tritylester der Formel

10

15

20

25

30

35

ten, während beispielsweise derTritylester von bekannten Penicillinen praktisch keine antibiotische Wirksamkeit besitzt. Der aktive Tritylester der Formel (Il-a) ist ferner ein sehr wichtiges Zwischenprodukt für die Synthese von anderen erwünschten pharmazeutischen Produkten, da die Tritylgruppe leicht abgespaltet werden kann.

Im folgenden werden die physikalischchemischen und biologischen Eigenschaften des vorstehend genannten Tritylesters des Antibioticums PS-5 in ihren Einzelheiten angeführt.

Physikalischchemische Eigenschaften Tritylesters des Antibioticums PS-5

(A) Schmelzpunkt Der Tritylester schmilzt zwischen 83 und 88° C. Der Schmelzpunkt wurde gemäss dem Verfahren von Kofier bei einer 1° C in der Minute betragenden Temperatursteiggeschwindigkeit (Apparat: SchmelzpunktprüfapparatBY-1, Yazawa Scientific Manufacturing Co. Ltd.).

(B) Ultraviolettabsorptionsspektrum l®,™ = 315,5 nm

(C) Infrarotabsorptionsspektrum Die am meisten charakteristischen Absorptionsmaxima kommen bei den folgenden Wellenzahlen vor: 3430,3100-3000,2990, 2950,1770,1695,1665,1445,1340,1275 und 1139 cm"1.

(D) Löslichkeit DerTritylester ist in Wasser, Hexan und Petroläther unlöslich (Siedepunkt: 30-60°C), in Benzol, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Dimethylsulfoxid ist er jedoch löslich.

(E) Farbenreaktion

40

45

(H-a)

Ehrlichreagens-Reaktion positiv

Triphenyltetrazoliumchloridreaktion negativ

Eisenchloridreaktion negativ

J odoplatinatreaktion positiv

Hydroxylamin-Eisenchlorid-Reaktion positiv

Chlor-Tolidinreagens-Reaktion positiv

Ninhydrinreaktion negativ

(F) Substanzfarbe

Farblos

3

die folgenden Eigenschaften: er ist stabiler als das Antibioticum PS-5 der Formel (I), seine Isolierung ist leichter und er bewahrt starke antibiotische und betalactamasehemmende Wirksamkei-

(G) Dünnschichtchromatographie (TLC) so Bei Verwendung der nachfolgend genannten Platten und Lösungsmittel sind die Rf-Werte die folgenden:

(a) «Chromogrammblatt Nr. 6065» (Eastman Kodak Co.) Oberschicht von n-Butanol/Äthanol/Wasser (4/1/5) Rf=0,56

55 i-Propanol/Wasser (8/7) Rf=0,91

n-Butanol Rf=l,0

i-Propanol/Wasser (1/4) Rf=l,0

(b) Vorverkleidete -Silicagelplatten 60 F^ (E. Merck)

60 Benzol/Aceton (2/1) Rf=0,29

(H) Magnetisches Protonenresonanzspektrum NMR Das NMR-Spektrum bei 100 MHz des Tritylesters in CDC13 ergibt die folgenden charakteristischen Signale:

65 (i) ein annähernd bei 1,10 ppm zentriertes Triplett mit Kupplungskonstanten von annähernd 7,0 Hz

(ii) ein Singlett nahe bei 1,86 ppm

(iii) ein Multiplett bei annähernd 7,0 bis 7,67 ppm

11

643262

Die vorstehend angeführten physikalischchemischen Eigenschaften sind mit der Struktur der Formel (Il-a) vereinbar.

Insbesondere bestätigen die folgenden Tatsachen, dass das Tritylprodukt des Antibioticums PS-5 ein Ester ist:

(i) eine breite IR-Absorption von -COO® bei etwa 1640-1540 cm"1, die im IR-Spektrum des Antibioticums PS-5 erscheint, kann im IR-Spektrum seines Tritylesters nicht beobachtet werden. Statt dem ergibt derTritylester eine scharfe Absorption von einer Gruppe -CO- in einer Esterhälfte bei etwa 1695 cm"1.

(ii) das Antibioticum PS-5 kann nicht mit Lösungsmittel aus neutraler oder leicht alkaliner wässeriger Lösung extrahiert werden, aber sein Tritylester kann unter solchen Bedingungen leicht extrahiert werden.

(iii) das UV-Absorptionsmaximum des Antibioticums PS-5 ist 301 nm, während jenes seines Tritylesters 315,5 nmist. Diese Verschiebung ist jener des N-Acetyl-thienamycinmethylesters ähnlich.

Biologische Eigenschaften des Tritylesters des Antibioticums PS-5

(1) Antibiotisches Spektrum DerTritylester des Antibioticums PS-5 hat eine antibiotische Wirksamkeit von breitem Spektrum und eine sehr starke Wirkung gegen grampositive Bakterien von Gattungen wie Staphilo-coccus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina, Bacillus oder von anderen ähnlichen Gattungen, und gegen gramnegative Bakterien von Gattungen wie Alcaligenes, Comamonas und andere ähnliche Bakterien.

Der Tritylester des Antibioticums PS-5 hat eine gute Wirksamkeit gegen gramnegative Bakterien von Gattungen wie Escherichia, Klebsiella, Proteus und andere ähnliche Bakterien.

Eine wichtige Eigenschaft des Tritylesters des Antibioticums PS-5 ist seine starke Wirksamkeit gegen Bakterien, beispielsweise der Genera Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, und andere ähnliche Bacterien, die gegen betalactam-ringstrukturenaufweisende Antibiotica resistent sind.

(2) Steigerung der antibiotischen Wirkung von anderen Antibioticis gegen betalactamaseproduzierenden Bakterien Der Tritylester des Antibioticums PS-5 hat die Fähigkeit zur Steigerung der antibiotischen Wirksamkeit von andern Antibioticis, insbesondere von Betalactamantibioticis wie Penicilline und Cephalosporine, gegen betalactamaseproduzierende Bakterien wie Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens und andere ähnliche Bakterien.

(3) Wirksamkeit in vivo Der Tritylester des Antibioticums PS-5 hat bei Verabreichung an durch pathogene grampositive Bakterien infizierte Mäuse eine starke therapeutische Wirkung.

(4) Giftigkeit

Bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse in 500 mg/kg betragenden Dosen verursacht derTritylester des Antibioticums PS-5 keine Todesfälle unter den Prüfungstieren,

Pharmazeutische Formulierungen des Antibioticums PS-5 und seiner Derivate Das Antibioticum PS-5 und seine vorangehend beschriebenen Derivate haben die Formel

(A)

ch -ch,

s-ch2-ch2-nh-co-ch

<T

c00r

1.

worin Rx Wasserstoff, Niederalkyl oder Triphenylmethyl bedeute tet, einschliesslich der Salze der Verbindung der Formel (A), wobei R; Wasserstoff bedeutet.

In der Formel (A) ist die Definition der Bedeutung des Ausdrucks «Niederalkyl» jener des Symbols R, der die Ester des Antibioticums PS-5 darstellenden Formel (II) gleich. Die Bedeu-15 tung des Ausdrucks «die Salze der Verbindung der Formel (A), wobei Rj Wasserstoff bedeutet» umfasst die vorstehend im Paragraph der Derivate des Antibioticums PS-5 angeführten Salze und offenbar auch die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieses Antibioticums.

20 Das Antibioticum PS-5 und seine Derivate, insbesondere das Tritylesterderivat, sind in vitro und in vivo wirksam gegen gramnegative und grampositive Mikroorganismen und sind deshalb nützlich zur Behandlung und Verhinderung von bakteriellen Infektionen in Test- oder Prüfungstieren.

25 Das Antibioticum PS-5 oder sein Tritylester und die sie enthaltenden Kompositionen können peroral, lokal oder parenteral (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal usw.) verabreicht und in Abhängigkeit vom Verabreichungsverfahren in einer breiten Vielzahl von herkömmlichen pharmazeutischen 30 Formulierungen verwendet werden. Beispielsweise kann das Antibioticum PS-5 oder sein Tritylester mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, einem Verdünnungsmittel oder einem anderen ähnlichen Mittel in Feststofform (beispielsweise Tabletten, Kapseln, Pulver, Körnchen, zuckerverkleidete Ta-35 bletten, Trochäus, Sprühpulver, Stuhlzäpfchen usw.) in halbfester Form (beispielsweise Salben, Cremen, halbfeste Kapseln usw.), oder in flüssiger Form (beispielsweise flüssige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Lotionen, Sirupe, Spritzenlösungen, Sprühflüssigkeiten usw.) pharmazeutisch vermengt werden. 40 Die das Antibioticum PS-5 oder seinen Tritylester enthaltende Einheitsdosisformulierung enthält im allgemeinen 0,1-99 Gew.-% flüssigen, halbfesten oder festen Wirkstoff.

Beispiele für Träger, Füllstoffe, Verdünnungsmittel und andere ähnliche Mittel, die in den vorstehend erwähnten Formulie-45 rungen verwendet werden können sowie für Verfahren zur Herstellung dieser Formulierungen, oder Zubereitungen, werden im Folgenden beschrieben.

In Einheitsdosisform hergestellte Tabletten und Kapseln für perorale Verabreichung können beispielsweise enthalten: Binde-50 mittel wie Sirup, Acacia, Gelatine, Sorbitol, Tragant, Polyvinyl-pyrrolidon oder ein anderes ähnliches Material; Füllstoffe wie Lactose, Sucrose, Stärke, Calciumphosphat, Sorbitol, Glycin oder ein anderes ähnliches Material; Schmiermittel wie Magne-siumstearat, Talk, Polyäthylenglycol, Siliciumdioxid oder ein 53 anderes ähnliches Mittel ; Desintegratoren wie Kartoffelstärke oder eine andere ähnliche Substanz; und/oder Benetzungsmittel wie Natriumlaurylsulfat oder eine andere ähnliche Verbindung.

Flüssige Zubereitungen für perorale Verwendung können die Form von öligen oder wässerigen Suspensionen, Lösungen, 60 Emulsionen, Sirupen usw., haben oder als trockene Produkte hergestellt werden, die vor ihrer Verwendung mit Wasser oder mit einer anderen Flüssigkeit vermengt werden. Diese flüssigen Zubereitungen für perorale Verwendung können die folgenden pharmazeutisch annehmbaren Bestandteile enthalten: Suspen-65 diermittel (beispielsweise Methylcellulose, Sorbitolsirup, Zuk-kersirup, Hydroxyäthylcellulose, Gelatine, Carboxymethylcellu-lose, Aluminiumstearatgel, hydrierte essbare Fette und Öle) ; Emulgiermittel (beispielsweise Acacianlecithin, Sorbitanmo-

643262 12

nooleat): nicht wässrige Träger (beispielsweise Äthylalkohol, der Verabreichungen usw., variieren. Für übliche perorale oder

Propylenglycol, ölige Ester, fraktioniertes Kokosnussöl, parenterale Verabreichungen können 0,05-500 mg/kg, vorzugs-

Mandelöl) ; Konservierungsmittel (beispielsweise Methyl-p-hy- weise 0,5-200 mg/kg, betragende Dosen oder meistbevorzugt in droxybenzoat, Propyl-p-hydroxybenzoat, Sorbinsäure). mehrere Teile aufgeteilte Dosen verwendet werden.

Stuhlzäpfchen können herkömmliche Basisstoffe wie Kakao- 5 Auch die vorstehend empfohlenen Dosen übertreffende Do-

butter und verschiedene Glycerine enthalten. sen können selbstverständlich bei entsprechendem Zustand des

Einspritzkompositionen können in Einheitsdosisform in Am- zu behandelnden Tieres verwendet werden.

pullen oder Multidosenbehältern mit einem Konservierungsmit- Das Antibioticum PS-5 und/oder dessen Tritylester können tel hergestellt werden. Sie können die Form von Suspensionen, jedoch nicht nur in den vorstehend erläuterten pharmazeutischen Lösungen und Emulsionen in öligen oder wässerigen Trägern 10 Kompositionen verwendet werden, sondern sie können gleichhaben und nötigenfalls Formuliermittel wie Suspendiermittel, wohl direkt oder als Futterzusatzkonzentrat in Tierfutter einge-Dispergiermittel und Stabilisiermittel enthalten. Wahlweise geben werden oder als Wirkstoff in Futterkonservierungs- oder kann das beschriebene Antibioticum in Form eines Pulvers Desinfektionsmitteln verwendet werden.

hergestellt werden, das vor Gebrauch mit pyrogenfreiem steri- Die nachfolgenden Beispiele betreffen konkrete bevorzugte lem Wasser vermengt wird. 15 Ausführungsformen des erfindungsgemässen Antibioticums, des

Das Antibioticum PS-5 und/oder seinen Tritylester enthalten- Verfahrens zu seiner Herstellung und seiner Verwendung, die in de Kompositionen können in verschiedenen, zur Absorption ihren Einzelheiten behandelt werden. In allen Beispielen sind die durch die Schleimhaut der Nase, der Kehle und der Luftröhre quantitativen und qualitativen Versuche zur Prüfung der antimi-

geeigneten Formen hergestellt werden. Vorteilhafte Beispiele krobiellen Wirksamkeit gemäss folgenden Verfahren durchge-für solche Formen sind Sprühpulver oder-flüssigkeiten, Inhalier-20 führt worden:

stoffe, Trochäus, Kehlenanstriche usw. Zur Behandlung der —-—

Ohren und der Augen kann das beschriebene Antibiotikum in

FormvonindividuellenKapseln,in Tropfenform,inflüssiger (-0 Bioversuch zur Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit oder in halbfester Form usw., verabreicht werden. Zwecks Die Übernachtkultur von Comamonas terrigena B-996 an lokaler Anbringung können die beschriebenen Antibiotica in 25 einem Nährschrägagar wurde in Nährbouillon suspendiert, wo-

hydrophilen oder hydrophoben Basisstoffen wie Pulver, Lotio- bei bei 610 nm eine 0,040 betragende optische Zellendichte nen oder Abwaschungen, Crème, Salben oder in anderen ähnli- erhalten wurde.

chen Basisstoffen formuliert werden. In ein 0,8 % Kyokuto Nährbouillonpulver (Kyokuto Pharma-

Erwünschtenfalls kann die beschriebene Komposition nebst ceutical Industries Co.) und 1,0 % Bacto-Agar (Difco Laborato-

einem vorstehend beschriebenen Träger Bestandteile wie Kon- 30 ries) enthaltendes geschmolzenes Agarmedium wurde ein dessen servierungsmittel, Antioxydationsmittel, Schmiermittel, Visko- 1 % betragender Keimsuspensionsanteil gegeben. 7 ml des ino-

sitätseinstellmittel, Geschmack- oder Wohlgeruchsmittel, Su- kulierten geschmolzenen Agarmediums wurden in einer Petri-

spendiermittel, Bindemittel, Stabilisiermittel oder andere ähnli- schale von 9 cm betragendem Durchmesser verteilt und verfe-

che Mittel enthalten. stigt, die im folgenden als eine Comamonas-Versuchsplatte

Bei Verabreichung an Schweine, Rinder, Schafe, Hühner usw. 35 bezeichnet wird.

kann das beschriebene Antibioticum PS-5 und/oder sein Trityl- Staphilococcus aureus FDA 209P wurde über Nacht zwecks ester als intramammär zu verabreichende Formulierung in Lang- Erhaltung einer Keimsuspension in Nährbouillon unter Schüt-

dauer- oder Raschwirkungsbasisstoffen oder als Futterzusatz- teln kultiviert und in Nährbouillon 50-fach verdünnt. In ein 1 %

konzentrat hergestellt werden. Kyokuto Nährbouillonpulver (Kyokuto Pharmaceutical Indu-

Die vorstehend beschriebenen pharmazeutischen Kompositio-40 stries Co.) und 1 % Bacto-Agar (Difco Laboratories) enthaltenen können das Antibioticum PS-5 und/oder sein Tritylester des geschmolzenes Agarmedium wurde ein dessen 1 % (Vol./ allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Wirk- Vol.) betragender Anteil Keimsuspension eingegeben und kräf-stoffen enthalten. tig vermischt. 7 ml des verimpften geschmolzenen Agarmediums Da, wie vorstehend erläutert, das Antibioticum PS-5 und sein wurden in eine Petrischale von 9 cm betragendem Durchmesser Tritylester gegen verschiedene betalactamaseherstellende Bäk- 45 gegeben und vergelt, die im folgenden als Staphilococcus-Ver-terien in Kombination mit Betalactamverbindungen eine syner- suchsplatte bezeichnet wird.

getische Wirkung haben, ist ihre Kombination mit solchen Auf ähnliche Weise wurde eine Alcaligenes-Versuchsplatte,

Betalactamverbindungen in pharmazeutischen Kompositionen oder -plättchen, hergestellt. Eine Übernachtschrägagarkultur besonders vorteilhaft. Beispiele für geeignete Betalactamverbin- von Alcaligenes faecalis B-326 wurde zwecks Erhaltung der düngen sind Penicillinderivate wie Benzylpenicillin, Phenoxyme- 50 Keimsuspension in Nährbouillon suspendiert, deren Zellenkon-

thylpenicillin, Carbenicillin, Ampicillin und Amoxicillin; und zentration zu einer bei 610 nm 0,020 betragenden optischen

Cephalosporinderivate wie Cephalorodin, Cephalotin, Cefazo- Dichte eingestellt wurde. Ein 0,5 % Kyokuto Nährbouillonpul-lin, Cephalexin, Cefoxitin, Cephacetril, Cephamandol, Cephapi- ver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) und 1,1 % Bacto-

rin, Cephadrin und Cephaloglycin. Agar (Difco Laboratories) enthaltendes Agarmedium wurde bei

Bei Kombination des Antibioticums PS-5 und/oder seines 55 einer zulässigen Temperatur geschmolzen und mit dessen 1,0%

Tritylesters mit einem oder mehreren der vorstehend angeführ- betragendem Inoculum der Keimsuspension verimpft. 7 ml des ten herkömmlichen Betalactamverbindungen, ist das Verhältnis verimpften geschmolzenen Agarmediums wurden in eine Petri-

des beschriebenen Antibioticumanteiles zum herkömmlichen schale von 9 cm betragendem Durchmesser verteilt und vergelen

Antibioticumanteil nicht kritisch, sondern kann in weiten Gren- lassen, dië im folgenden als einne Alcaligenes-Versuchsplatte zen variieren, wobei jedoch praktischerweise von 20:1 bis 1:150, 60 bezeichnet wird.

vorzugsweise von 10:1 bis 1:100, betragende Verhältnisse des Eine Pulpscheibe von 8 mm betragendem Durchmesser wurde beschriebenen Antibioticumanteils zum herkömmlichen Anti- mit einer zu prüfenden Probelösung durchtränkt, für eine zur bioticumanteil verwendet werden. Entfernung des Lösungsüberschusses ausreichende Zeitdauer an

Bei Behandlung von bakteriellen Infektionen in Säugetieren, einem reinen Filtrierpapierblatt liegen lassen und dann an eine kann die Dosis vom Antibioticum PS-5 und/oder seinem Trityl- 65 Versuchsplatte übertragen. Nach Inkubation bei 35° C während ester in Abhängigkeit von zahlreichen Parametern wie das zu 20 h wurde der Durchmesser der beobachteten inhibitorischen behandelnde Tier, das Körpergewicht, der Typ, die Gravität und oder Hemmzone gemessen und mit jenen von Cephaloridinstan-die Symptome der jeweiligen Infektion sowie der Art und Anzahl dardlösungen verglichen. Die antimikrobielle Wirksamkeit des

13

643262

Antibioticums PS-5 und der verwendeten Verbindungen wird in Cephaloridinäquivalenzeinheiten/ml bewertet.

Dabei wird die antimikrobielle Wirksamkeit einer Lösung des Antibioticums PS-5 und seiner verwandten Verbindungen, die einen jenem von 100 (ig/ml Cephaloridin gleichen Hemmzonendurchmesser ergibt, als eine 100 Cephaloridineinheiten/ml betragende antimikrobielle Wirksamkeit bezeichnet. Wenn ein Feststoffmuster des Antibioticums PS-5 und seiner benachbarten Verbindungen bei einer 1 mg/ml betragenden Konzentration einen jenem von 1 jxg /ml Cephaloridin gleichen Hemmzonendurchmesser ergibt, wird sie als eine Feststoffprobe mit einer 1 Cephaloridineinheit/mg betragenden antimikrobiellen Wirksamkeit bewertet. Da bekanntlich die Versuchsstandardkurve in Abhängigkeit von der Prüfungs- oder Testmikroorganismusspe-cies variiert, wurden die folgenden Antimikrobiellwirksamkeits-bewertungseinheiten verwendet: Comamonas-Cephaloridinein-heit (Abkürzung: CCU); Staphilococcus-Cephaloridineinheit (Abkürzung: SCU) ; und Alcaligenes-Cephaloridineinheit (Abkürzung: ACU).

(2) Bioautographie

Eine grosse Versuchsplatte wurde gemäss dem vorstehend erläuterten Verfahren (1) hergestellt, ausser dass 100 ml des beimpften geschmolzenen Agarmediums statt in eine Petrischale von 9 cm betragendem Durchmesser in eine rechteckige Schale von 32x24 cm betragenden Dimension geschüttet wurden. Ein zu prüfendes Papierchromatogramm wurde während 15 min auf die grosse Versuchsschale gelegt. Nach Entfernung des Papiers wurde die Versuchsschale zwecks Entwicklung der Hemmzo-ne(n) bei 35° C während 20 h inkubiert, oder bebrütet. Diese Technik erlaubt nicht nur die Berechnung des Rf-Wertes oder -Werte (qualitative Prüfung), sondern aufgrund der Hemmzo-nengrösse auch die Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit (halbquantitative Prüfung).

Bei Verwendung einer TLC-Platte wurde zwischen dieser und der Versuchsplattenfläche eine dünne Papierschicht eingelegt. Für die qualitative und halbquantitative Prüfung wurde ein ähnliches Vorgehen angewendet.

Beispiel 1

Ein das nachfolgend angeführte Kulturmedium (SE-4) enthaltende 500 ml Erlenmeyerkolben wurde bei 120° C während 15 min sterilisiert. In eine gut versporte Schrägagarkultur von Streptomyces sp A271 wurden 10 ml einer 0,02 % Lösung von Tween-80 (oberflächenaktives Mittel von Atlas Powder Corporation) eingegeben und die Mischung wurde zwecks Erhaltung der Sporensuspension leicht gerührt. Der 500 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 1 ml dieser Sporensuspension inokuliert und bei 28°C während 48 h unter Schütteln an einer Schüttelmaschine an einem 3,5 cm betragenden Radius bei 200 Umdrehungen in der Minute kultiviert. Dann wurden 2 ml der so erhaltenen Keimkultur in jeden von 6 je 100 ml der nachfolgend beschriebenen Produktionsmedia enthaltenden Erlenmeyerekolben inokuliert und bei 28° C während 48-96 h unter Schütteln an einer Dreh-schüttelmaschine kultiviert.

10

Produktionsmedia (1) AG-1 Medium

(Gew./Vol.)

Glucose 1,5%

Getreidestärke 2,5

Getreidetränkflüssigkeit 2,0

Trockene Hefe 1,0

D,L-Methionin 0,1

CoCl2-6H20 0,00013

pH 7,2 vor Sterilisierung; pH 6,1 nach Sterilisierung; pH 7,8 nach vier Tagen Fermentation.

(2) AGA-2 Medium

15

20

Glucose Kartoffelstärke Getreidetränkflüssigkeit Trockene Hefe CoCl2-6H20

pH 6,5 vor Sterilisierung; pH5,8 nach Sterilisierung; pH 7,8 nach vier Tagen Fermentation.

(Gew./Vol.)

1,5%

2,5

2,0

1,0

0,00013

(3) AGB-1 Medium

25

Maltose

Getreidetränkflüssigkeit Trockene Hefe CoCl2-6H20

30 pH 6,5 vor Sterilisierung; pH 5,8 nach Sterilisierung; pH 7,9 nach vier Tagen Fermentation.

(4) AGB-41 Medium

(Gew./Vol.)

3,0%

1,0

1,0

0,0001

(Gew./Vol.)

35 Maltose

5,0%

Lösliche Stärke

1,0

Glycerin

0,3

Trockene Hefe

2,5

NaCl

0,5

4o K,HP04

0,05

MgS04-7H20

0,05

CaCo3

0,3

CaCl2-6H20

0,00013

pH 7,0 vor Sterilisierung; pH 6,9 nach Sterilisierung; pH 7,9 nach

45 vier Tagen Fermentation.

(5) ML-19 Medium

(Gew./Vol.)

Glycerin

4,0%

50 Pepton

0,5

Glucose

0,5

Kartoffelstärke

0,2

Entfettetes Soyabohnenmehl

0,5

Trockene Hefe

0,5

55 NaCl

0,5

Ca Co3

0,2

Keimkulturmedium (SE-4)

(Gew./Vol.)

Rindextrakt (Difco Laboratories) 0,3 %

Bacto-trypton (Difco Laboratories) 0,5

Glucose 0,1

Lösliche Stärke 2,4

Hefeextrakt 0,5

Calciumcarbonat 0,4

entfettetes Soyabohnenmehl 0,5

pH 7,5 vor Sterilisierung; pH 7,1 nach Sterilisierung; pH 7,4 nach zwei Tagen Fermentation.

pH 6,4 vor Sterilisierung; pH 7,0 nach Sterilisierung; pH 7,0 nach vier Tagen Fermentation.

60

Soyabohnenöl Trockene Hefe NaCl 65 K2HP04 MgS04-7H20 CaCo3 CoCl2-6H20

(6) AGO-1 Medium

(Gew./Vol.)

3,0%

2,0

0,5

0,05

0,05

0,3

0,00013

643262

14

pH 7,0 vor Sterilisierung; pH 7,0 nach Sterilisierung; pH 7,2 nach vier Tagen Fermentation.

Die antibiotische Wirksamkeit des Bouillonfiltrats wurde gemäss dem vorstehend erläuterten Plattenverfahren bestimmt, wobei Comamonas terrigena B-996, Staphilococcus aureus 209P und Alcaligenes faecalis B-326 verwendet wurden. Die 72 h nach Inokulierung oder Beimpfung beobachteten Resultate sind die folgenden:

Tabelle 5

Antibiotische Wirksamkeit

Medium

CU/ml

SCU/ml

ACU/ml

AG-1

105

1,1

420

AGA-2

72

1,1

420

AGB-1

105

0,9

340

AGB-41

185

8,9

440

ML-19

60

1,4

122

AGO-1

67

0,9

340

Beispiel 2

100 ml der Keimkultur von Beispiel 1 wurden in das 151ML-19 Medium enthaltende Gef äss von 301 Rauminhalt einer Fermentiervorrichtung eingegeben und mit Zwangsbelüftung bei 28° C während 96 h unter Schütteln bei 200 Umdrehungen in der Minute kultiviert, wobei der sterile Speiseluftstrom 7,51/min betrug. Das Antischaum- oder Schaumhemmittel wurde ein Siliconöl (Silicone KM-75, Shin-Etsu Chemical Industries Co., Ltd.) bei einer 0,05 % betragenden Konzentration verwendet. Die Fermentationsbouillon wurde aufgefangen und gemäss dem angeführten Zeitplan zentrifugiert. Die antibiotische Wirksamkeit des Bouillonfiltrats war die folgende:

Tabelle 6

Zeit

Antibiotische pH-Werte

Wirksamkeit (CCU/ml)

24 h

19

7,0

48 h

48

7,2

72 h

72

7,1

96 h

59

7,0

Beispiel 3

Gemäss einem jenem des Beispiels 1 ähnlichen Verfahren wurde Streptomyces sp. A271 in einem 100 ml SE-4 Medium enthaltenden Erlenmeyerkolben von 500 ml Rauminhalt kultiviert und dann in eine 151 SE-4 Medium enthaltende Gefässfer-mentiervorrichtung von 301 Gefässrauminhalt inokuliert. Nach Kultivieren bei 28° C während 24 h unter Agitation bei 200 Umdrehungen in der min und 7,51/min betragender Zwangsbelüftung wurde 11 der enthaltenen Keimkultur in den 1001 ML-19 Medium enthaltenden Behälter von 2001 Rauminhalt einer Behälterfermentiervorrichtung eingegeben. Diese Vorrichtung wurde bei 28° C während 72 h unter Agitation bei 100 Umdrehungen in der min belüftet, wobei der Belüftungsstrom 501/min betrug. Das pH betrug am Anfang 7,0 und am Ende 7,1. Die Bouillon wurde mit 5 % (Gew./Vol.) Perlit (Topco Perlite,

Topco Nr. 34, Toko Perlite Kogyo K. K.) vermischt und mittels einer Filterpresse filtriert, wobei 801 Bouillonfil'trat erhalten wurde. Die antibiotische Wirksamkeit der klaren Flüssigkeit betrug 60 CCU/ml.

Beispiel 4

Herstellung des Aktivkohlenkonzentrates

Wie in Beispiel, wurden zehn je 100 ml ML-19 Medium enthaltende 500 ml Erlenmeyerkolben unter Schütteln während 72 h inkubiert, oder bebrütet. 2 % (Gew./Vol.) Perlitfiltrierhilfe (Topco Perlite, Topco Nr. 34, Toko Perlite Kogyo K. K.) wurden in die kombinierte Bouillons gegeben und durch einen Büchnertrichter filtriert, wobei 600 ml Bouillonfiltrat erhalten wurden. Nach erfolgter Kontrolle des 7-8 betragenden pH-Wertes wurden 16 g Aktivkohle (Charcoal Activated, ShirasagiTakeda Chemical Industries, Ltd.) eingegeben und während 15 min gerührt. Die Aktivkohle wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit 800 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann erneut zentrifugiert. Die so erhaltene Aktivkohle wurde unter Rühren bei Raumtemperatur während 30 min mit 400 ml 50 % (Vol./ Vol.) Aceton eluiert. Die so erhaltene Supernatantlösung, oder Eluat, von 52 CCU/ml betragender antibiotischer Wirksamkeit wurde bei 30-35° C in einem Drehverdampfer zu 50 ml konzentriert. Der antibiotische Titer des Konzentrates betrug 800 CCU/ ml.

Die nachfolgend beschriebenen Versuche wurden zwecks Bestätigung der Unterschiedlichkeit des beschriebenen Antibioticums PS-5 von herkömmlichen Antibioticum MM4550 (Komplex) durchgeführt, das als Betalactamasehemmittel in den Deutschen Patentgesuchen DOS 2513 855 und DOS 2513 854 beschrieben ist.

Die drei Stämme Streptomyces olivaceus ATCC 31126 (= ATCC 21379/M3) ATCC 21380 und ATCC21382 wurden bei 28° C während 72 h an einer Drehschüttelmaschine in einem Erlenmeyerkolben von 500 ml Rauminhalt kultiviert, der folgendes Medium enthielt:

Soyabohnenmehl (ESSAN-M Spezialität, 1,0 Ajinomoto Co. Ltd.)

Glucose 2,0

CaCo3 0,2

CoCl26H20 0,001 pH 7,0 vor Autoklavieren.

Der antibiotisch wirksame Bestandteil der filtrierten Bouillon wurde an Aktivkohle adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit 50 % Aceton eluiert. Das erhaltene Eluat wurde unter reduziertem Druck zu einem kleinen Volumen konzentriert und unter den nachstehend erläuterten Bedingungen abfallchromatogra-phiert.

Filterpapier: Toyo Filter Paper Nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)

Lösungsmittelsystem: (80% Acetonitril/Tris/EDTA-System) Acetonitril 120 ml

M/10 Tris(hydroxymethyl)aminomethan-CHl 30 ml (pH 7,5)

M/10 Tetranatriumäthylendiamintetra-acetat 1 ml (pH 7,5)

Die Rf-Werte wurden durch Bioautographie unter den vorerwähnten Bedingungen an Comamonas TerrigenaB-996 entwik-kelt.

Nebst den vorstehend genannten drei Streptomyces olivaceus-Stämmen wurde die beschriebene Streptomyces sp. A271 in einem Medium fermentiert, das 4,0 % Glycerin, 0,2 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,2 % Kartoffelstärke, 0,5 % entfettetes Soyabohnenmehl, 0,5 % trockene Hefe, 0,5 % NaCl und0,2 % CaC03 (pH 6,4 vor Autoklavieren) enthielt. Die nachfolgende Behandlung und der Versuch wurden gemäss dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die bioautographischen Prüfungen ergaben, dass das beschriebene Antibioticum PS-5 ein von dem in den vorstehend genannten Deutschen Patntgesuchen offenbarten Antibioticum MM4550 (Komplex) unterschiedliches Produkt ist.

5

IC

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15

643262

Beispiel 5

Herstellung des konzentrierten Diaion HP20 Eluates des Antibioticums PS-5

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden 151 ML-19 Medium während 72 h in 150 Erlenmeyerkolben fermentiert. In die gesammelte Bouillon wurden 100 mg Dinatriumäthylendiamin-tetraacetat und 2 % (Gew./Vol.) Topco Perlit, Topco Nr. 34, eingegeben und durch einen grossen Büchnerfilter filtriert, wobei 14,11 Bouillonfiltrat von 7,9 betragendem pH erhalten wurden. Das Filtrat wurde an einer 7 X50 cm Diaion HP20 Kolonne (ein perlenförmiges hochporöses Styrol-Divinylbenzol-Copolymer makroretikularer Struktur hergestellt durch Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) angebracht, mit 71 destilliertem Wasser gewaschen und mit 50 % (Vol./Vol.) Methanol eluiert. Die nachfolgende Tabelle 7 zeigt das dabei erhaltene Eluierungsmuster oder -bild des antibiotisch wirksamen Materials.

Die Eluate Nr. 8-14 der Tabelle 7 wurden kombiniert, bei einer weniger als 30° C betragenden Temperatur in einem Drehverdampfer zu 100 ml konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei 2,6 g gelblichbraunes Pulver von 54 CCU/mg betragender antibiotischer Wirksamkeit erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in destilliertem Wasser zu einer 500 CCU/ml betragenden Konzentration gelöst.

Phosaphatpufferlösungen mit den angegebenen pH-Werten wurden dadurch hergestellt, dass M/15 Dikaliumphosphat mit 5n NaOH oder mit 5n Phosphorsäure dem erwünschten pH eingestellt wurde. In 1 ml der Lösung des beschriebenen Antibioticums PS-5 wurde 1 ml Phosphatpuffer eingegeben und der pH-Wert wurde nötigenfalls wieder zum Ausgangswert eingestellt.

Tabelle 7

Chargierte Wirksamkeit: 40 CCU/ml X 14,000 ml

Eluat Nr.

Volumen (ml)

Antibiotische

Wirksamkeit (CCU/ml)

1

1000

0

2

500

0

3

500

0

4

50

19

5

50

37

6

50

72

7

50

150

8

50

270

9

50

850

10

50

870

11

50

300

12

50

270

13

50

230

14

50

200

15

50

170

16

50

125

17

50

105

18

50

87

19

50

75

20

50

60

21

50

48

22

50

38

23

50

27

24

50

18

25

50

14

26

50

10

27

50

0

28

50

0

29

50

0

Die verschiedene pH-Werte aufweisenden Lösungen des Antibioticums PS-5 wurden während 30 min in einem Wasserbad bei 60° C gehalten, in strömendem Wasser abgekühlt und mit einer kleinen Menge von 5n NaOH oder mit 5n Phosphorsäure zu pH 7,0 neutralisiert. Die die Lösung von 7,0 betragendem pH des beschriebenen Antibioticums PS-5 enthaltende Kontrollröhre wurde während 30 min in ein Eisbad gelegt. Die verbleibende antimikrobielle Wirksamkeit wurde gemäss dem vorstehend erläuterten Verfahren bestimmt, wobei Comamonas terrigena B 996 als Prüfungsmikroorganismus verwendet wurde. Die nachfolgende Tabelle zeigt die in % der ursprünglichen Wirksamkeit ausgedrückte verbleibende antimikrobielle Wirksamkeit:

pH 3,0 4,0

5,0

6,0

7,0

0° ©

VO o

Verbleibende 0 0

9,0

79,0

76,5

88,5 82,0

Wirksamkeit (%)

Diese Resultate zeigen, dass das in diesem Beispiel 5 erhaltene gelblichbraune Pulver bei 6,0-9,0 betragendem pH während 30 min bei 60° C ordentlich stabil ist. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt übrigens die Stabilität des Antibioticums PS-5 sogar im sauren pH-Bereich zu. Nach Behandlung des beschriebenen Antibioticums PS-5 bei pH 3,0 während 5 min bei —17° C wurde beispielsweise noch mindestens der ursprünglichen antibiotischen Wirksamkeit festgestellt.

Beispiel 6

Extrahierung mit n-Butanol bei niedriger Temperatur Eine grosse, 20 ml destilliertes Wasser enthaltende Prüfröhre, 12 ml n-Butanol und 7 g Natriumchlorid wurden ohne Gefrieren auf—17° C abgekühlt. Das in Beispiel 5 erhaltene gelblichbraune Antibioticum PS-5 Pulver wurde in destilliertem Wasser zu einer 200 mg/ml betragenden Konzentration gelöst und vorgekühlt. 1 ml der vorgekühlten Antibioticumlösung wurde in die Prüfröhre gegeben und mit Schwefelsäure rasch auf pH 2,75, pH 3,0 oder pH 3,25 eingestellt, während die Temperatur der Mischung unter —10° C gehalten wurde. Nach kräftiger Mischung wurde die n-Butanolschicht wiedergewonnen und mit 5 ml 0,5 M Phosphatpuffer von 6,8 betragendem pH gründlich gemischt, wobei der aktive oder wirksame Bestandteil in die wässrige Schicht überführt wurde. Der Bioversuch der wässrigen Lösung ergab folgende Extrahierbarkeit des Antibioticums PS-5 aus dem gelblichbraunen Pulver:

PH

Extrahierungsprozentsatz

2,75

35%

3,00

32

3,25

16

Beispiel 7

Herstellung des QAE-Sephadexpulvers Gemäss dem Verfahren von Beispiel 5 wurden 27,7 g gelblichbraunes Antibioticum PS-5 Pulver nach Gefriertrocknung aus 1001 Bouillonfiltrat erhalten. Dieses eine 13,2 CCU/mg betragende spezifische Wirksamkeit aufweisende Pulver wurde in 30 ml Phosphatpuffer von 6,8 betragendem pH gelöst und an einer 3,3 x25,0 cm Kolonne von QAE-Sephadex A-25 (ein volquater-niertes stark basisches, von Diäthyl-2-hydroxypropylammo-niumgruppen in Dextrangel erhaltenes Anionenumtauscher-harz, hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals AB), die mit dem gleichen Puffer abgeglichen wurde. Nach Waschen mit einer kleinen Menge vom gleichen Phosphatpuffer wurde der aktive Bestandteil mit dem gleichen, jedoch natriumchloridhaltigen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

SO

65

643262

16

io

Puffer eluiert, wobei die Natriumchloridkonzentration während der Eluierung linear von Null auf 0,5 M verändert wurde. 300 ml der aktiven Fraktion, oder des wirksamen Bestandteiles, wurden auf 0° C abgekühlt und mit 6 g Aktivkohle behandelt. Die Aktivkohle wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und mit 5 50 % (Vol./Vol.) Aceton eluiert. Nach Entfernung des Acetons durch Verdampfung bei einer weniger als 30° C betragenden Temperatur wurden durch Lyophilisierung 727 mg bräunlichgelbes Natriumsalzpulver des Antibioticums PS-5 mit 264 CCU/mg betragender spezifischer Wirksamkeit erhalten.

Beispiel 8

Herstellung des DEAE-Cellulosepulvers

727 mg des in Beispiel 7 erhaltenen bräunlichgelben Antibioti- 15 cum PS-5 Pulvers wuden in 1 ml 25 mM Phosphatpuffer von 6,8 betragendem pH gelöst und an einer 1,5 X 27,0 cm Kolonne von Bio-Gel P-2 (eine gelperlenförmige vernetzte methylen-bis-acry-lamidcopolymerbasierte synthetische Polymerkomposition, hergestellt durch BIO-RAD Laboratories) angebracht, die mittels 20 des gleichen Phosphatpuffers abgeglichen wurde. Entwicklung mit dem gleichen Phosphatpuffer ergab 15 ml der aktiven Fraktion.

Die so erhaltene aktive Fraktion, oder wirksamer Bestandteil, wurde dann an einer 2,5 x28,0 cm Kolonne von Diäthylaminoä- 25 thyl oder DEAE-Cellulose DE32 (Whatman Ltd.) angebracht, die mit dem gleichen Phosphatpuffer abgeglichen wurde. Das Eluieren erfolgte im gleichen Phosphatpuffer mit einem linearen Gradient von Natriumchlorid von Null bis 0,5 M. 240 mg der wiedergewonnenen aktiven Fraktion wurden bei einer 0° C betra- 30 genden Temperatur an 4,5 g Aktivkohle adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit 50 % (Vol./Vol) Aceton eluiert. Das Aceton-eluat wurde bei einer weniger als 30° C betragenden Temperatur verdampft, bis kein Aceton mehr festgestellt werden konnte, und dann lyophilisiert, wobei 120 mg des bräunlichweissen Natrium- 35 salzpulvers des Antibioticums PS-5 mit 600 CCU/mg betragender spezifischer antibakterieller Wirksamkeit oder Aktivität erhalten wurden.

Beispiel 9

40

45

50

Herstellung von Antibioticum PS-5 hohen Reinheitsgrades In je zwei Rostfreistahlfermentationsbehälter von je 2001 Rauminhalt wurden je 1001 von 2,5 % entfettetes Soyabohnenmehl enthaltendem ML-19 Medium eingegeben, autoklaviert, mit Streptomyces sp. A271 auf eine jener des Beispiels 3 gleiche Weise inokuliert und während 72 h unter B elüftung und Agitation fermentiert. Die zwei Fermentationsbehälterinhalte wurden kombiniert, mit 5 % (Gew./Vol.) Topco Perlit, Topco Nr. 34 (Topco Perlite Kogyo K. K.) gemischt und durch eine Filterpresse filtriert, wobei 1601 Bouillonfiltrat mit einem235 CCU/ml betragenden antibiotischen Titer erhalten wurden. Dieses Bouillonfiltrat wurde durch eine Ionenaustauscherharzkolonne DIAION PA-306 (ein stark basisches Anionumtauscherharz mit vernetztem Polystyrolmatrix und Trimethylammoniumchlorid-hälften, hergestellt durch Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) von 10 X52 cm betragenden Dimensionen und 4,51 Nassvolumen geführt, ohne zurückgehalten zu werden. Dann wurde das durch diese Kolonne geführte Material an einer DIAION HP-20 Kolonne (14x97 cm; 151) adsorbiert und mit 75 % Methanol eluiert. Das gesammelte aktive Eluat (21; 9,854 CCU/ml) wurde mit 41 Wasser dreifach verdünnt und an einer DIAION PA-306S Zweiliterkolonne (5,5x84 cm) angebracht. Nach Waschen mit 500 ml Wasser wurde das antibiotisch wirksame Material mit 81 Natriumchlorid bei linearem Gradient von 0 bis 3 % eluiert und in 200 ml betragenden Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktio- 65 nen Nr. 17-31 wurden kombiniert, wobei 2,81 aktives Eluat (4,120 CCU/ml) erhalten wurden. Dieses Eluat wurde an einer DIAION HP-20 Einliterkolonne (4,5 X 63 cm) angebracht und mit 31 Aceton bei linearem Gradient von 0 bis 25 % eluiert, wobei das Volumen jeder Fraktion 30 ml betrug. Die antimikrobiell wirksamen Fraktionen Nr. 54-66 wurden dann kombiniert, wobei 390 ml aktives Eluat von 27,220 CCU/ml betragender antimikrobieller Wirksamkeit erhalten wurden.

Nach Entfernung des Acetons durch Destillation unter reduziertem Druck wurde das DIAION HP-20 Eluat durch eine 200 ml Kolonne von QAE-Sephadex A-25 (2,5x41 cm) gefürt. Das antimikrobiell wirksame Material wurde durch Eluieren mit 21 Natriumchlorid bei linearem Gradient (0-1,5%) gesammelt, wobei die vereinigten Fraktionen 68-81140 ml aktives Eluat mit einer 42,120 CCU/ml betragenden antimikrobiellen Wirksamkeit ergaben.

Diese QAE-Sephadex A-25 Eluat wurde mit 1 % NaOH sorgfältig auf pH 8,3 eingestellt und an einer 200 ml Kolonne von DIAION HP-20AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd. ) von 2,5x41 cm betragenden Dimensionen angebracht und mit 11 wässrigem Aceton bei linearem Gradient von 0 bis 10 % eluiert, wobei das Volumen jeder Fraktion 10 ml betrug. Die Fraktionen Nr. 48-53 wurden kombiniert, wobei 60 ml aktives Eluat (45,000 CCU/ml) erhalten wurden, deren Gefriertrocknung 249 mg gelbes Pulver (8,000 CCU/mg) ergab.

Zwecks weiterer Reinigung wurden 150 mg dieses gelben Pulvers in einer Ideinen Menge von 0,01 M Natriumphosphatpulver (pH 8,0) gelöst und durch eine 130 ml Kolonne (1,5x73 cm) von Sephades G-10 (ein perlenförmiges, durch Vernetzung von Dextranfraktionen mit Epichlorohydrin erhaltenes Dextrangel, hergstellt durch PharmaciaFine Chemicals AB) geführt. Das Antibioticum PS-5 wurde mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer von 8,0 betragendem pH entwickelt. Das Eluat wurde in 2 ml betragenden Fraktionen gesammelt, wobei aus den kombinierten Fraktionen Nr. 38-55 36 ml aktives Eluat (65,800 CCU/ml) erhalten wurden.

Das Sephadex G-10 Eluat wurde dann an einer Q AE-Sephad-ex A-25 Kolonne (100 ml; 2,0x32 cm) chromatographiertund mit 11 Natriumchloridlösung bei linearem Gradient von 0 bis 1,5 % eluiert. Das Fraktionenvolumen betrug 10 ml. Die Kombination der fünf aktiven Fraktionen 48-52 ergab 50 ml aktives Eluat (22,000 CCU/ml).

Dieses aktive Eluat wurde mit 1 % NaOH sorgfältig auf pH 8,3 eingestellt und an einer 50 ml DIAION HP-20 Kolonne (1,2 x 44 cm) angebracht. Das antibiotische Natriumsalz des Antibioticums PS-5 wurde durch Eluieren mit 400 ml wässrigem Aceton bei linearem Gradient von 0 bis 10 % in 5 ml betragenden Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen Nr. 34—41 wurden dann kombiniert und lyophilisiert, wobei 51 mg weisses Pulver (21,000 CCU/mg) erhalten wurden.

Das so erhaltene Natriumsalz des Antibioticums PS-5 hatte die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften:

(1) Farbe

Weiss.

55

(2) Löslichkeit Wasserlöslich, jedoch in Aceton unlösbar.

60

(3) Zerstörungspunkt

Bei Messung mit einem Mikroschmelzpunktmessgerätmodell

Kofier BY-1 (Yazawa Scientific Manufacturing Co., Ltd.) und bei einer 1° Cin der Minute betragenden Temperaturerhöhungsgeschwindigkeit ergab diese Verbindung keinen gut ausgeprägten Schmelzpunkt. Bei etwa 148° C begann sie gelb zu werden und wurde oberhalb 160°C allmählich weich. Bei etwa 203°C ging der Farbton der Verbindung langsam von gelb in braun über und bei 220°C hat sich ein braunes Harz gebildet.

17

643262

(4) Ultraviolettabsorptionsspektrum 60 (ig des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 wurden in 3,0 ml Wasser gelöst und in einem Hitachi-Registrierspektrophoto-metermodell EPS-3T (Hitachi Ltd.) geprüft. Das registrierte Spektrophotogramm ist in Fig. 1 dargestellt, wobei die folgenden charakteristischen Werte errechnet wurden:

lu& = ca. 246 nm(Ei1cm = 82,0)

>.Hmfx = ca. 301 nm(Ei1cm = 267.5)

In eine wässerige Lösung dieser Verbindung (21,000 CCU/mg) in destilliertem Wasser wurde eine Hydroxylaminlösung (pH 7,5) eingegeben, wobei eine 21,3 (xg/ml Natriumsalz des Antibioticums PS-5 und 10 mM Hydroxylamin enthaltende Reaktionsmischung erhalten wurde. Nach 30 min bei 22°C verlor die Reaktionsmischung etwa 94 % ihrer anfänglichen optischen Dichte bei 301 nm.

(5) Infrarotabsorptionsspektrum Das in Fig. 2 gezeigte Infrarotabsorptionsspektrum des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 in KBr wurde an einem Hitachi-Infrarotspektrophotometermodell215 (Hitachi Ldt.) registriert. Die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima wurden bei den angegebenen Wellennummern registriert:

(i) etwa 1750 cm"1 (-CO- in Betalactamring)

(ii) etwa 1650 cm"1 (-CO- in der Amidbindung)

(iii) etwa 1640-1540 cm"1 (-COO0)

(6) Magnetisches Protonenresonanzspektrum Das in Fig. 3 gezeigte 10 MHz magnetische Protonenresonanzspektrum des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 in schwerem Wasser wurde in einem JEOL NME-Spektrometer JNM PS-100 (Japan Elektron Optics Laboratory Co., Ltd.) registriert, wobei die folgenden charakteristischen Signale erhalten wurden:

(i)Triplett bei Zentrum bei etwa 1,0 6 ppm (J = etwa7,5Hz) (CH3-CH2)

(ii) Multiplett im Bereich 1,72-2,00 ppm (CH3.-CH2)

(iii) Ausgeprägtes Singlett bei etwa 2,05 ppm (CH3-CO-)

(iv) Multiplett im Bereich 2,88-3,85 ppm (-CH-2-, -CH-)

(v) Multiplett im Bereich von 3,9-4,20 ppm (-CH-X

N

10

15

20

25

30

Ehrlichreagens:

Jodoplatinat:

Ninhydrin:

(7) Farbenreaktion

(8) Spezifische Drehung positiv positiv negativ

[a] d + 77,3 (c 1,59, 0,01 M, pH 8, Natriumphosphatpuffer)

(9) Dünnschichtchromatographie (TCL) Das Natriumsalz des Antibioticums PS-5 wurde unter den angegebenen Bedingungen dünnschichtchromatographiert. Die Rf-Werte wurden durch Bioautographie ermittelt.

(a) AVICEL/SF Cellulose TLC-Piatte (American Viscose Corp.)

Lösungsmittelsystem Rf n-Butanol/Äthanol/W asser = 7/7/6 (Vol./V ol./ 0,94 Vol.)

Isopropanol/Wasser = 7/3 (Vol./Vol.) 0,96

(b) Vorverkleidete Silicagel-TLC-platte 60 F254 (E. Merck, Darmstadt)

Äthanol/Wasser = 7/3 (Vol./Vol.) 0,82

n-Propanol/Wasser = 7/3 (Vol./Vol.) 0,77

(10) Papierchromatographie Das Natriumsalz des Antibioticums PS-5 ergab an Toyo Filter-

55

papier Nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) unter den angegebenen Bedingungen die folgenden Rf-Werte:

Lösungsmittelsystem Rf n-Propanol/Wasser = 7/3 (Vol./Vol.) 0,68

n-Propanol/Isopropanol/Wasser = 7/7/6 (Vol./ 0,70 Vol./Vol.)

Acetonitril/Wasser = 8/2 (Vol./Vol.) 0,36

Acetonitril/Trispuffer/EDTA*) 0,34

Äthanol/Wasser = 7/3 (Vol./Vol.) 0,63

* [120 ml Acetonitril, 30 ml M/10 Tris(hydroxymethyl) ,amino-methan-chlorwasserstoffsäurepuffer (pH 7,5) und 1 ml M/10 Äthylendiamintetraacetat (pH 7,5) enthaltende Lösungsmittelmischung]

(11) Hochspannungspapierelektrophorese Das Natriumsalz des Antibioticums PS-5 wurde unter den angegebenen Bedingungen durch Hochspannungspapierelektrophorese analysiert, wobei von Savant Instruments Inc. hergestellte Instrumente (HOchspannungsstromversorgrmodell Nr. HV3000V und Flachplattenelektrophoresegerätmodell Nr. EP 18A) und Toyo Filtrierpapier Nr. 50 verwendet wurden. Dabei wurden die folgenden Resultate erhalten:

Bei Durchführung der Elektrophorese während 30 min unter Kühlung auf eine weniger als 4° C betragende Temperatur bei einem 42 V/cm betragenden Potentialgradient in einem 3,3 g Barbital und 25,5 g Barbitalnatrium in 3000 ml Wasser enthaltenden Puffer (pH 8,6) hat sich das Antibioticum PS-5 um 28 mm gegen die Anode hin bewegt.

(12) 13C-Magnetisches Resonanzspektrum Unter Verwendung von Dioxan als Innenstandard wurde das 20 MHz 13C magnetische Resonanzspektrum des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 in schwerem Wasser in einem Varian 35 CFT-20 Spektrometer gemessen, wobei die folgenden charakteristischen Signale ermittelt wurden:

40

45

50

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

184,04 ppm

174,96

169,29

141,11

130,40

67,39 (Dioxan)

60,19

55,63

40,41

40,00

31,49

22,62

22,46

11,36

Die vorstehend beschriebenen physikalischchemischen Eigenschaften zeigen, dass das Antibioticum PS-5 eine Molekularstruktur folgender Formel aufweist:

(I) ~

"CH^-CH -

S-CH2-CH2-NH-C0-GH3

65

/

\

COOH

Die folgenden biologischen Eigenschaften des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 wurden ermittelt:

643262 18

(1) Antimikrobialspektrum Die Werte der minimalen inhibitorischen oder Hemmkonzentration (MIC) des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 wurden an verschiedenen pathogenen, oder krankheitserregenden, Mikroorganismen einschliesslich resistenter Stämme gemäss dem Bouillonverdünnungsverfahren unter Verwendung des Hirn-Herz-Bouillons «Eiken» (Eiken Chemical Co. Ltd.) ermittelt. Das Natriumsalz des Antibioticums PS-5 wurde bei 5-50 ug/ml betragenden Konzentrationen in der Hirnherzbouillon «Eiken» (pH 7,0) gelöst und im gleichen flüssigen Medium wurden 10

geeignete Verdünnungsreihen vorbereitet. Die in Tabelle 8 angeführten Mikroorganismen wurden während 18 h bei 28° C in der Hirnherzbouillon «Eiken» kultiviert und bei einer 1 x 103 Zellen/ml betragenden Endinoculumgrösse in die Verdünnungsreihe des Antibioticums PS-5 inokuliert. Die Kulturen wurden 15

bei 35° C während 20 h stehen gelassen und dann wurde das Mikroorganismenwachstum in jeder Verdünnung des Antibioticums PS-5 festgestellt. Die minimale inhibitorische oder Hemmkonzentration (MIC) bedeutet die kleinste Konzentration vom Natriumsalz des Antibioticums PS-5, bei welcher keine Vermehrung des jeweiligen Mikroorganismus visuell beobachtet werden kann. Als Kontrollproben wurden zwei herkömmliche betalacta-mantibiotica Cephaloridin und Cefoxitin in Hirnherzbouillon bei pH 7,0 und 1-100 [xg/ml betragenden Konzentrationen gelöst und mit der Lösung wurden im vorstehend genannten flüssigen Medium Verdünnungsreihen hergestellt. Die MIC der Proben-antibiotica wurden dann gemäss dem vorstehend erläuterten Verfahren ermittelt. Die Tabelle 8 zeigt sowohl die mit dem Antibioticum PS-5 als auch die mit Cephaloridin und Cefoxitin erhaltenen MIC-Werte.

Tabelle 8

Microorganismus

Minimale inhibitorische Konzentration (|ig/ml) Antibioticum Cephaloridin PS-5

Cefoxitin

Staphylococcus aureus FDA 209P

0,16

0,031

1,25

Smith

0,31

0,031

2,50

Russell

0,31

0,125

2,50

Bx-1633

0,16

0,031

1,25

Diplococcus pneumoniae Type III4*

0,02

0,031

1,25

Streptococcus pyogenes NY-54*

0,08

0,008

0,63

Bacillus subtilis ATCC 6633

0,16

0,031

1,25

Escherichia coli K12

2,5

2,5

2,5

Alcaligenes faecalis B-326

0,78

6,25

1,56

Citrobacter freundii E.9*

3,3

>100

>100

Serratia marcescens S-18*

6,25

>100

50

Klebsiella pneumoniae K-2*

3,13

6,25

6,25

Enterobacter sp. E-8*

3,13

3,13

12,5

Enterobacter cloacae E-16*

12,5

>100

>100

Enterobacter aerogenes E-19*

6.25

>100

>100

Proteus vulgaris PS-5*

12,5

>100

12,5

Proteus mirabilis P-62*

6,25

12,5

12,5

Proteus rettgeri P-73*

3,13

100

6,25

Proteus sp. P-22

6,25

>100

12,5

Providencia sp. P-82*

6,25

>100

25,0

N. B. : * Betalactamaseproduzent; 2* resistent g. Kanamycin, Gentamicin und Tobramycin; 3* resistent g. Gentamicin und Tobramycin; 4* 10% Pferdeblut in die Bouillon gegeben.

(2) Steigerung der antimikrobiellen Wirksamkeit von bekannten lin und Cefazolin als Referenzantibiotica durchgeführt. Die Betalactamverbindungen gegen betalactamresistente Mikroor- Tabellen 9 und 10 zeigen die dabei erhaltenen Resultate.

ganismen Wie die Resultate der Tabellen 9 und lOzeigen, konnteeine

(A) 10 ml von 50 ug/ml Penicillin G oder Cephaloridin, 0,8 % 55 Hemmzone beobachtet werden, wenn Penicillin G oder Cepha-Kyokuto Nährbouillonpulver und 1,0 % Difco Bacto-Agar (pH loridin bei einer jene der Beobachtbarkeitsgrenze unterscheiden-7,0) enthaltendem geschmolzenem Nähragar wurden mit den in den Konzentration mit dem Antibioticum PS-5 bei einer jene des Tabellen 9 und 10 angeführten betalactamresistenten betalacta- Plättchenversuchs unterschreitenden Konzentration kombiniert maseproduzierenden Mikroorganismen beimpft oder inokuliert, wurde, wodurch die Steigerung der Wirksamkeit von Penicillin G und zwecks Herstellung der Bioversuchsagarplatte in einer Petri- 60 und Cephaloridin durch das Antibioticum PS-5 erwiesen ist. In schale von 9 cm betragendem Durchmesser geschüttet. An diese Gegensatz zum Antibioticum PS-5 konnten Ampicillin, Oxacillin Versuchsplatte wurden je 25 fil Antibioticum PS-5 Lösung bei der und Cefazolin die antimikrobielle Wirksamkeit von Cephaloridin angegebenen Konzentration enthaltene Pulpscheiben von 8 mm nicht steigern.

betragendem Durchmesser gelegt und vor der Prüfung der Hemmzonen bei 35° C während 18 hbebrütet, oder inkubiert. 65

Die Kontrollversuchsplatten wurden auf ähnliche Weise ohne (B) Der im folgenden beschriebene Versuch zeigt, dass die

Penicillin G und Cephaloridin vorbereitet. Ferner wurden Plätt- Wirksamkeitssteigerungsfähigkeit oder -vermögen des Antibio-chen- oder Plattenversuche mit Penicillin G, Ampicillin, Oxacil- ticums PS-5 synergistisch ist.

19

643262

Tabelle 9

Heemmzone (mm)

Betalactamresistenter

Antibioticum

Ohne

Mit

Microorganismus

PS-5

Pen. G

Pen. G

(|xg/ml)

Proteus vulgaris P-5

318

16,0

26,6

159

14,0

24,5

100

10,3

22,2

79,5

0

18,3

Enterobacter sp. E-8

318

20,1

20,0

159

17,2

17,5

100

13,8

13,8

79,5

11,0

11,0

Citrobacter freundii E-9

318

20,8

23,0

159

17,2

19,2

100

13,2

15,2

79,5

10,4

13,1

Serratia marcescens S-18

318

21,3

22,1

159

17,8

22,0

100

13,0

16,1

79,5

0

13,8

Proteus sp. P-22

318

13,6

21,4

159

11,7

18,2

100

0

13,8

79,5

0

12,8

Tabelle 10

Heemmzone (mm)

Betalactamresistenter

Antibioticum

Ohne

Mit

Microorganismus

PS-5

CER*

CER*

((ig/ml)

Enterobacter sp. E-18

318

21,0

21,9

159

18,2

19,4

100

16,1

18,0

79,5

15,1

17,6 >

Citrobacter freundii E-9

318

22,5

24,6

159

17,4

22,3

100

17,4

21,6

79,5

16,0

19,4

Serratia marcescens

318

21,0

26,1

159

17,0

24,8

100

16,8

23,3

79,5

14,8

22,3

Proteus vulgaris P-5

318

18,5

25,2

159

15,2

24,0

100

13,7

22,0

79,5

12,5

21,8

Proteus vulgaris P-5

Penicillin

G ((ig/ml)

10,000

14,9

14,5

2,500

0

0

625

0

0

Proteus vulgaris P-5

Ampicillin

( (xg/ml)

10,000

14,7

12,9

2,500

0

0

625

0

0

Heemmzone (mm)

Betalactamresistenter

Antibioticum

Ohne

• Mit

Microorganismus

PS-5

CER*

CER*

Proteus vulgaris P-5

Oxacillin

( (xg/ml)

10,000

0

0

2,500

0

0

625

0

0

Proteus vulgaris P-5

Cefazolin

((xg/ml)

10,000

14,6

12,0

2,500

0

0

625

0

0

* CER = Cephaloridin

Zwei Penicillin G oder Cephaloridin enthaltende Filtrierpapierstreifen und zwei Antibioticum PS-5 enthaltende Filtrierpapierstreifen wurden derart auf einer Nähragarversuchsplatte angeordnet, dass ein Quadrat mit einer Ecke gebildet wurde, in welcher zwei das gleiche Antibioticum enthaltende Streifen einander berührten, wobei die antimikrobielle Wirksamkeit nach 18 h Inkubation bei 35° C festgestellt wurde. Bei geeigneter Wahl der Konzentrationen von Penicillin G oder Cephaloridin und Antibioticum PS-5 konnten Hemmzonen nur in den sowohl das Antibioticum PS-5 als auch Penicillin oder Cephaloridin aufweisenden Quadratsecken beobachtet werden, während in den nur Antibioticum PS-5, Penicillin g oder Cephaloridin allein aufweisenden Quadratsecken keine Hemmzone festgestellt werden konnte. diese Versuchsresultate können dadurch erklärt werden, dass das Antibioticum PS-5 und Penicillin G oder Cephaloridin synergistisch zusammenwirken. Wenn nämlich zwei Antibiotica bei zur Bewirkung einer Hemmzone mit bloss einem Antibioticum nicht ausreichenden Konzentrationen kombiniert werden, wird die bei dieser Kombination erhaltene grosse Hemmzone durch die synergistische Zusammenwirkung der zwei verschiedenen Antibiotica bewirkt.

(3) Wirksamkeit in vivo Zur Prüfung der therapeutischen Aktivität des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 wurden Mäuse intraperitoneal mit 5 X105 Zellen/Maus von Staphilococcus aureus Smith infiziert. Kurz nach der Infektion wurde eine wässrige Lösung des Natriumsalzes des Antibioticums PS-5 subkutan eingespritzt. In ddy Mausmännchen (Shizouka) betrug dabei die 50 % kurative Antibioti-cumdosis 2,45 mg/kg.

(4) Giftigkeit

Die wässrige Lösung des Natriumsaslzes des Antibioticums PS-5 wurde intraperitoneal an ddy Mausmännchen (Shizouka) in einer 500 mg/kg betragenden Dosis verabfolgt. Kein Todesfall wurde dabei konstatiert.

(5) Betalactamasehemmende Wirksamkeit die betalactamasehemmende Wirksamkeit des Antibioticums PS-5 anhand der Hydrolyse von Penicillin G durch Betalactamase von Proteus vulgaris P-5 auf folgende Weise untersucht:

(A) Reagens

(1) Substrat: Kaliumsalz von Penicillin G

1 (xmMol/ml (= 372,3 [xg/ml) in 25 mM Phosphatpuffer (pH 6,8)

(2) Betalactmase: induzierbare Betalactamase von Proteus vulgaris P-5 gereinigt durch CM-Cellulose Kolonnenchromatographie

(3) Hemmstoff, oder Inhibitor: das Natriumsalz des Antibioticums PS-5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

643262 ^ 20

0,6 (xMol/ml (= 192 [xg/ml) (C) Resultate

(4) 25 mM, pH 6,8 Phosphatpuffer Die Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Hydrolyse von

Penicillin G in Abwesenheit des Inhibitors (Antibioticum PS-5)

(B) Reaktionskomposition und Versuchsbedingungen unter den vorstehend erläuterten Bedingungen. Eine ausgepräg-

Das Substrat (= Penicillin G), der Inhibitor (= Antibioticum 5 te Hemmung der Proteus vulgaris-Penicillinase durch das Anti-

PS-5) und der Puffer wurden in den in der nachfolgenden Tabelle bioticum PS-5 wird durch die Resultate der Fig. 4 klar erwiesen.

11 angeführten Menge miteinander vermischt. Als nämlich Penicillin G als Substrat eine 1/42 der Äquivalenz-

Die Reaktion wurde durch Eingabe der angeführten Betalac- menge betragenden Menge von Antibioticum PS-5 enthielt,

tamasemengen bei 30° C sofort eingeleitet. Die Hydrolyse von wurden mehr als 50 % der Wirksamkeit der Betalactamase von

Penicillin G wurde durch Messung der Verminderung der opti- 10 Proteus vulgaris P-5 erfolgreich inhibiert.

sehen Dichte bei250 nm unter der Annahme verfolgt , dass die —

differentiale Molarextinktion von Penicillin G bei240 nm, wie zalhreiche frühere Versuche erwiesen haben, 556 beträgt.

Tabelle 11

(i) (ii) (in) (iv)

Enzym Standard (H)

Enzym Standard (L)

Hemmung durch

Antibioticum

PS-5ÇH)

Hemmung durch

Antibioticum

PS-5(L)

(1) Penicillin G (1 n Mol/ml)

2,5 Mol (2,5 ml)

2,5 Mol (2,5 ml)

2,5 Mol (2,5 ml)

2,5 Mol (2,5 ml)

(2) Antibioticum PS-5 (0,6 |x Mol/ml)

0

0

0,105 Mol* (0,175 ml)

0,06 Mol** (0,100 ml)

(3) Phosphatpuffer (25 mM, pH 6,8)

(0,5 ml)

(0,5 ml)

(0,325 ml)

(0,40 ml)

(4) Beta-lactamase

(0,040 ml)

(0,020 ml)

(0,040 ml)

(0,040 ml)

Molarverhältnis des Substrats zum Inhibitor: *24:1 ** 42:1

Beispiel io Nach erfolgtem WaschenmiteinerlO:l-Benzol-Äthylacetat-

Mischung zwecks Entfernung der Rückstandreagenzien wurde

Verfahren zum Herstellen des Tritylesters des 40 das aktiveMaterialmit einer l:2-Benzol-Äthylacetat-Mischung

Antibioticums PS-5 eluiert. Das aktive Eluat wurde unter reduziertem Druck bis zur

1601 des in Beispiel 3 erhaltenen Bouillonfiltrates wurden Trockne eingedampft und erneut in 0,5 ml Benzol gelöst. Die gemäss dem Beispiel 4 beschriebenen Verfahren behandelt, Benzollösung wurde an einer neutralen Aluminiumoxidkolonne wobei 30,0 g gelblichbraunes Lyophilisiertes Pulver des Natrium- (Aluminium Oxid Woelm Neutral; M. Woelm; 20 g, 0,9x22,0

salzes des Antibioticums PS-5 (spezifische antimikrobielle Wirk- 43 cm) angbracht und mit einer Benzol-Äthylacetat-Mischung bei samkeit 27 CCU/mg) erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in variierten Mischverhältnissen (10:1,6:1,4:1,3:1,2:1 und 1:1)

100 ml Dimethylformamid gelöst und 3,0 g Triäthylamin wurden entwickelt. Die aktiven Eluate wurden kombiniert und unter eingegeben. Nach Abkühlung mit Eis wurden 9,0 g Tritylchlorid reduziertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der Verdam-

in die Reaktionsmischung gegeben, während die Temperatur der pfungsrückstand wurde in 0,3 ml Benzol gelöst und an einer

Lösung unter 5° C gehalten wurde. Nach Rühren während 12 h 50 Silicagelkolonne (10 g; 0,9x22,0 cm; sonst wie vorstehend bei 5° C wurde das wirksame Material des Antibioticums PS-5 in beschrieben) angebracht. Nach Entfernung der Verunreinigun seiner Gesamtheit in das Tritylierungsprodukt umgewandelt. gen mit einer Benzol-Äthylacetat-Mischung (10:1), wurde das

Die Reaktionslösung wurde in 1000 ml 0,5 M Phosphatpuffer aktive Material mit einer Benzol-Äthylacetat-Mischung (1:2)

(pH 6,8) geschüttet und dann dreimal mit je 1000ml Äthylacetat eluiert und unter reduziertem Druck zu einem festen Pulver extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden kombiniert, über 55 konzentriert. Das erhalten Pulver wurde in 0,5 ml Benzol gelöst wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und unter reduziertem und an einer Bio-Beads S-X3 Kolonne (1,2x 96 cm) mit Benzol

Druck bis zur Trockne eingedampft. Der Verdampfungsriick- als Entwicklungsmittel gereinigt. Der aktive Ausfluss wurde in stand wurde in 20 ml Benzol gelöst und durch eine Kolonne Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Das erhaltene trockene

(4,5 x 60,0 cm) von Bio-Beads S-X3 (poröse Styroldivinylbenzol- Pulver wurde in 0,5 ml Aceton gelöst und mit einer Sephadex copolymerperlen zur Gelpermeabilisierung, Molekulargewichts- 60 LH-20 (ein perlenförmiges, durch Vernetzung von Dextranket-

ausschlussgrenze 2000, hergestellt durch BIO-RAD Laborato- ten durch Hydroxypropylierung erhaltenes Dextrangel, herge-ries) geführt, die mit Benzol vorabgeglichen wurde. Die Kolonne stellt durch Farmacia Fine Chemical AB) Kolonne (1,2x96,0 wurde mit Benzol entwickelt. Die aktive Fraktion, die an der cm) gefiltriert, die in Aceton anschwellen gelassen wurde. Die bis

Comamonas-Versuchsplatte eine antibiotische Wirksamkeit zur Trockne eingedampfte aktive Fraktion ergab 23 mg weisses zeigte, wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockne einge- 65 Pulver. Rekristallisierung dieses Pulvers in einer Benzol-Hexan-

dampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 1 ml Benzol gelöst Mischung ergab 12 mg Tritylester des Antibioticums PS-5 in und an einer Silicagelkolonne (Silicagel 60; 70-230 Maschen Form eines farblosen kristallinen Pulvers (10,800 CCU/mg).

ASTM; E. Merck, Darmstadt) (25 g; 1,5x24,0 cm) angebracht. Dieses Tritylesterpulver, das eine Ausführungsform der erfin-

21

643262

dungsgemässen Verbindung ist, hat die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften:

(1) Farbe erfindungsgemässen Verbindung ist, wurde in einem Registrier-spektrophotometermodell Hitachi EPS-3T (Hitachi, Ltd.) bei einer 128 |xg/3 ml betragenden Methanolkonzentration registriert (Fig. 5).

Farblos.

XMtm°a?= 315.5 nm (E

1% 1 cm '

156)

(2) Löslichkeit

Zwecks Bestimmung der Löslichkeit des Tritylierungsproduk-tes des Antibioticums PS-5 wurden jeweils 5 mg dieses Produktes in 0,1 ml des jeweiligen Prüf- oderTestlösungsmittels bei 20°C unter Schütteln gelöst, wobei die folgenden Resultate erhalten wurden:

Praktisch unlösbar in Wasser, n-Hexan und Petroläther (Siedepunkt 30-60° C).

Hochlöslich in Benzol, Äthylacetat, Chloroform, Methanol, Äthanol, Aceton, Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsul-foxid (DMSO).

(3) Stabilität

Der Tritylester des Antibioticums PS-5 wurde in einem Volumen von Methanol gelöst und dann sobald möglich mit 9 Volumen von destilliertem Wasser verdünnt, wobei eine Lösung mit einer 125 CCU/ml betragenden antimikrobiellen Wirksamkeit erhalten wurde. Eine Zehntelmolardikaliumphosphatlösung wurde mit 5n Phosphorsäure oder 5n Natriumhydroxid zum jeweils angeführten pH zwischen 3 und 9 eingestellt. In je ein ml jedes der Phosphatpuffer wurde je ein ml der Lösung des Tritylesters des Antibioticums PS-5 eingegeben und nötigenfalls wurde das pH der Mischung mit Phosphorsäure oder mit Natriumhydroxid erneut zum erwünschten Wert eingestellt. Die Lösung wurde während 30 min bei 60° C in einem Wasserbad gehalten, mit fliessendem Wasser abgekühlt und mit einer kleinen Menge von Phosphorsäure oder von Natriumhydroxid zu pH 7,0 neutralisiert.

Die Kontroilösung (pH 7,0) wurde für die Dauer des Versuchs in einem Eisbad gehalten. Die verbleibende antibiotische Wirksamkeit oder Residualaktivität wurde gemäss dem üblichen Plättchenverfahren mit Comamonas terrigena B-996 als Prüfmikroorganismus ermittelt. Die Tabelle 12 zeigt das in Prozenten ausgedrückte Verhältnis der Aktivität der wärmebehandelten Lösungen zu jener der Kontrollösung.

(6) Infrarotabsorptionsspektrum Das in Fig. 6 gezeigte Infrarotabsorptionsspektrum des Trity-10 lierungsproduktes des Antibioticums PS-5 wurde mit4,5 mg dieses Produktes in 0,6 ml Chloroform mit einem Infrarotspek-trophotometermodell Hitachi 215 (Hitachi, Ltd.) registriert. Die charakteristischen Absorptionsmaxima wurden bei den folgenden Wellenzahlen registriert:

15

20

25

Tabelle 12

pH 3,0

4,0 5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

Verbleibende

Wirksamkeit (%) 0

0 6,5

79,0

100

100

100

Diese Resultate zeigen, dass der Tritylester des Antibioticums PS-5in einer wässrigen Lösung bei 60° C während 30 min bei pH 6,0-9,0 stabil ist.

Kein wesentlicher Wirksamkeitsverlust konnte übrigens nach Inkubation einer wässrigen Lösung des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 bei pH 7,5 und 60° C während 90 min beobachtet werden.

(4) Schmelzpunkt Der Schmelzpunkt wurde in einem Mikroschmelzpunktappa-rat Kofier B Y-l (Yazawa Scientific Mfg. Co., Ltd.) bei einer 1° C in der min betragenden Temperatursteigerungsgeschwindigkeit gemessen. Das Tritylierungsprodukt des Antibioticums PS-5 schmolz bei 83,5-85,5°C und wurde bei 140°C allmählich braun.

(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5, das eine Ausführungsform der

3430

3100-3000 (C-H der Phenylgruppe)

2990

2950

1770 (C=0 des Betalactamringes)

1695 (-CO- der Amidbindung)

1665 (-C0-0- der Esterbindung)

1445

1340

1275

1130 cm'1

(7) Magnetisches Protonenresonanzspektrum 30 Das in Fig. 7 gezeigte 100 MHz magnetisches Protonreson-manzspektrum des Tritylesters des Antibioticums PS-5 wurde mit4,5 mg des Esters in 0,3 ml Deuterochloroform unter Verwendung eines NMR-Spectrometermodells JEOL JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) registriert. Die 35 am meisten charakteristischen Signale sind die folgenden: Triplett bei etwa 1,10 ppm (J = etwa 7,0 Hz)

Singlett bei 1,86 ppm Multiplett im Bereich 7,10-7,56 ppm (Protone im Benzolring der Tritylgruppe)

40

(8) Elementaranalyse

3,5 mg des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 wurden bei Raumtemperatur und bei einem 1X10"2 mm Hg betragenden reduzierten Druck während 4 h getrocknet und 45 darauffolgend elementaranalysiert, wobei die folgenden Resultate erhalten wurden:

Befund: C 61,89% H 5,78% N 4,458% S 4,62%

(9) Färbungsreaktion

50 Ehrlichreagens: positiv

Tripnenyltetrazoliumchlorid: negativ

Eisenchlorid: negativ

Eisenchlorid-Jod: negativ

Jodoplatinat: positiv

55 Hydroxylamin: positiv

Chlor-Tolidin: positiv

Ninhydrin: negativ

(10) Dünnschichtchromatographie (TLC) 60 Der Tritylester des Antibioticums PS-5 ergab unter den angegebenen Bedingungen die im folgenden angeführten Rf-Werte. Die Lage der Wanderung wurde durch Bioautographie an Comamonas terrigena B-996 ermittelt.

(a) Silicagel TLC 65 Platte: vorverkleidete Silicagelplatte 60 F254, E. Merck, Darmstadt

Lösungsmittel: Benzol/Aceton (2/1)

Rf: 0,29

643262

22

(b) Cellulose TLC Platte: Eastman Chromagramblatt 13254 Cellulose mit Fluoreszierindikator (Nr. 6065)

Lösungsmittel Rf

Obere Phase von 5

Butanol/Äthanol/Wasser (4/1/5) 0,56

n-Butanol 1,0

Isopropanol/Wasser (8/7) 0,91

Isopropanol/Wasser (1/4) 1,0

Wie die Molekularstruktur des Antibioticums PS-5 und die 10 vorstehend erläuterten physikalischchemischen Eigenschaften bestätigen, hat der Tritylester des Antibioticums PS-5 eine Molekularstruktur der Formel

S~CH2~CH2_NH"C0"CH3 15

20

25

Die biologischen Eigenschaften des Tritylesters des Antibioticums PS-5 sind die folgenden:

(1) Antimikrobielles Spectrum 30

Die MIC- (minimale inhibitorische oder Hemmkonzentration) Werte der beschriebenen Verbindung wurden an verschiedenen pathogenen Mikroorganismen einschliesslich mehrerer resistenter Stämme geprüft, wobei das Verdünnungsverfahren in Hirnherzbouillon «Eiken» (Eiken Chemical Co., Ltd.) angewendet wurde.

Der Tritylester des Antibioticums PS-5 wurde in einer kleinen Menge von Methanol gelöst und sobald möglich in der Hirnherzbouillon «Eiken» (pH 7,0) verdünnt, bis die Konzentration des Tritylesters des Antibioticums PS-5 40-20 |ig/ml betrug. Die Methanolkonzentration in der Endlösung betrug nicht mehr als 10 %. Diese Lösung wurde in einer zweifach geometrischen Reihe verdünnt. Die in Tabelle 13 angeführten Mikroorganismen wurden während 18 h bei 28° C in der Hirnherzbouillon «Eiken» kultiviert und dann bei einer 1 x 105 Zellen/ml betragenden Endinoculumgrösse in die Verdünnungsreihe inokuliert. Nach Inkubation bei 35° C während 20 h wurden dann die Resultate festgestellt. Die MIC- oder Minimalhemmkonzentra-tionswerte bedeuten die nidrigste Konzentration des Trityla-tionsproduktes des Antibioticums PS-5, bei welcher unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen kein Wachstum des entsprechenden Mikroorganismus festgestellt werden konnte. Als Kontrollantibiotica wurden Lösungen von Ampicillin und Cephaloridin in Hirnherzbouillon «Eiken» (pH 7,0) bei 100 Hg/ ml betragender Konzentration hergestellt und auf jener der beschriebenen Probeverbindung ähnliche Weise behandelt.

Die Tabelle 13 zeigt die MIC-Werte des Tritylesters des Antibioticums PS-5 zusammen mit jenem von Ampicillin und Cephaloridin als Kontrollantibiotica.

Wie die in Tabelle 13 angeführten Resultate zeigen, hat der Tritylester des Antibioticums PS-5 ein breites antimikrobielles Spektrum und insbesondere eine starke antibiotische Wirksamkeit gegen verschiedene betalactamresistente betalactamaseproduzierende Mikroorganismenstämme.

Tabelle 13

Microorganism

MIC (ug/ml)

Trityl

Ampicil

Cephalori

PS-5

lin din

Staphylococcus aureus FDA 209p

0,17

0,20

0,04

Staphylococcus aureus Smith

0,27

0,20

0,04

Diplococcus pneumoniae Type III

0,08

0,04

0,01

Streptococcus pyogenes NY-5

0,17

0,02

0,01

Sarcina lutea S-19

0,27

0,05

0,05

Escherichia coli K12

5,37

3,13

2,5

Alcaligenes faecalis B-326

1,25

0,25

6,25

Citrobacter freundii E-9

5,0

>100

>100

Serratia marcescens S-18

10,0

50

>100

Klebsiella pneumoniae K-2

10,7

>100

10,0

Enterobacter sp. E-8

10,0

>100

>100

Enterobacter cloacae E-16

10,0

>100

>100

Enterobacter aerogenes E-19

8,7

>100

>100

Proteus vulgaris P-5

21,5

>100

>20,0

Proteus mirabilis P-6

21.5

3,13

10,0

Proteus rettgeri P-7

10,0

50,0

50,0

Pseudomonas aeruginosa P-l

>43,0

50,0

>20,0

60

(2) Steigerung der antibiotischen Wirksamkeit von Penicillin- Feststoffschicht von Nähragar (pH 7,0) (15 ml) angebracht und Cephalosporinverbindungen gegen resistente Mikroorganis- wurden. Wie vorstehend beschrieben, wurden 25 ul der zu men durch den Tritylester des Antibioticums PS-5 prüfenden antibiotischen Lösungen an einer Pulpscheibe von 8

(A) Resistente Mikroorganismen enthaltende Versuchspetri- mm betragendem Durchmesser angebracht und an die Versuchschalen von 9 cm betragendem Durchmesser wurden dadurch 65 spetrischalen gelegt. Nach Inkubation oder Bebrütung während hergestellt, das 10 ml mit betalactamresistenten betalactamase- 18 h bei 35° C wurden die Hemmzonendurchmesser gemessen produzierenden Mikroorganismen besätes geschmolzenes Nähr- Und mit jenen der entsprechenden, weder Penicillin G noch agar an der 50 ug/ml Penicillin G oder Cephaloridin enthaltenden Cephaloridin enthaltenden Versuchsschalen verglichen. Die in

23

643262

Tabelle 14 gezeigten Resultate zeigen, dass die Kombination des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 bei einer jene der unteren Grenze des Plättchenversuchs unterschreitenden Konzentration mit Penicillin G oder Cephaloridin bei einer jene der vorerwähnten unteren Grenze gleichwohl unterschreitenden Konzentration eine überraschend grosse Hemmzone ergab. Diese experimentelle Tatsache ist ein klarer Beweis der Steigerung der antibiotischen Wirksamkeit von Penicillin G oder Cephaloridin durch das Tritylierungsprodukt des Antibioticums PS-5.

Tabelle 14

Betalactamaseresistenter Hemmzone (mm)

Microorganismus Proteus vulgaris P-5

Trityl PS-5 (ig/ml 42

Kontroll 0

Penicillin G eingegeben

27,0

Kontroll

Cephaloridin

eingegeben

Proteus vulgaris P-5

50

0

15,0

100

11,0

18,0

Proteus sp. P-22

50

0

11,5

100

0

13,5

Citrobacter freundii E-9

50

13,0

15,5

100

16,0

18,0

(B) Als weiterer Beweis der Wirksamkeitssteigerungsfähigkeit des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 wurde der antimikrobielle Synergismus dieses Produktes mit Cephaloridin anhand eines betalactamresistenten Proteus vulgaris-Stammes gemäss dem Verdünnungsprüfverfahren nachgewiesen. Zunächst wurden fünf Cephaloridin und den Tritylester des Antibioticums PS-5 in den in Tabelle 15 angegebenen verschiedenen Konzentrationen enthaltende Probestammlösungen hergestellt, wobei Hirnherzbouillon «Eiken» (pH 7,0) als Lösungsmittel verwendet wurde.

Tabelle 15

Stammlösung Nr. Tritylester v. Anti- Cephaloridin bioticum PS-5

1

100 (xg/ml

0 (xg/ml

2

75

500

3

50

1000

4

25

1500

5

0

2000

Aus jeder Stammlösung wurden im gleichen Hirnherzbouillon 1:2,2:5 und 3:10 betragende Verdünnungen hergestellt, wobei 15 Probesubstammlösungen erhalten wurden. Jede Substammlö-sung wurde ferner in der Hirnherzbouillon zweifach verdünnt. Mit jeder Substammlösung wurden ferner im Hirnherzbouillon 15 Schritte zweifacher Verdünnung durchgeführt. In jeder der 15 Verdünnungen wurde dann Proteus vulgaris P-5 bei einer 1 x 105 Zellen/ml betragenden Konzentration inokuliert und während 20 h bei 35° C bebrütet. Die minimale inhibitorische oder Hemmverdünnung wurde dann für jede Stammlösung festgestellt. Die Tabelle 16 zeigt die dabei erhaltenen Resultate:

Tabelle 16

Stammlösung Trityl PS-5:

MIC

Gesamtmenge

Nr. Cephaloridin

Trityl PS-5:

der Antibiotica

CER

1 100:0(|x,g)

10+0 ((ig)

10,0 ((ig)

2 75:500

3,75+25

28,75

3 50:1000

1,88+37,5

39,38

4 25:1500

1,25+74

76,25

5 0:2000

0+1000

1000

Obwohl die Resultate der Tabelle 16 den vorstehend genannten Synergismus klar nachweisen, werden zwecks noch besserer Illustration der synergistischen Wirkung des beschriebenen Tritylesters des Antibioticums PS-5 an Cephaloridin in Fig. 17 statt den MIC-Werten der Fig. 16 die entsprechenden relativen MIC-Werte angeführt, die an den 100 gleichgesetzten MIC-Wert jedes Antibioticums allein bezogen sind.

Tabelle 17

Stammlösung Nr. Trityl PS-5: Relative MIC-Werte

Cephaloridin (Trityl PS-5+Cer=Total)

1

100:0 ((ig)

100+0=100

2

75:500

37,5+2,5=40

3

50:1000

18,8+3,75=22,55

4

25:1500

12,5+7,5=20

5

0:2000

0+100=100

Wie die Resultate derTabelle 17 zeigen, genügt bereits die Kombination von bloss 7,5 % der MIC von Cephaloridin mit bloss 12,5 % der MIC des Tritylesters des Antibioticums PS-5 zur Hemmung des Wachstums des als Testkeim verwendeten, infolge seiner Betalactamaseproduktion gegen Betalactamverbindungen resistenten Mikroorganismus Proteus vulgaris P-5. Die synergistische Wirkung des Tritylesters des Antibioticums PS-5 an Cephaloridin dürfte damit offenbar sein.

(3) Wirksamkeit in vivo Die antimikrobielle Wirksamkeit in vivo des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 wurde in Mäusen gemessen, die intraperitoneal mit einer 5 x 103 Zellen/Maus betragenden Dosis von Staphylococcus aureus Smith infiziert wurden. Der Tritylester des Antibioticums PS-5 wurde unmittelbar nach der Infektion subkutan eingespritzt.

Die 50 % kurative Dosis in ddy Mausmännchen (SHO-ZU-OKA) betrug 2,55 mg/kg (27,540 CCU/kg).

(4) Betalactamasehemmende Wirksamkeit (A) Prüfverfahren

Der IC5^-Wert der Hydrolyse von Cephaloridin durch Betalactamase wurde während 10 min (von der ersten min bis zur zehnten min nach dem Beginn der Inkubation) ermittelt. Der Hydrolysengrad von Cephaloridin wurde durch Erfassung der Abnahme der optischen Dichte bei 225 mil gemessen. Als Prüfmaterial wurden, nach Reinigung durch Affinitätschromatographie mit Cephalexin-Sepharose 48, Betalactamase von Citrobacter freundii E-9 und Proteus vulgaris P-5 verwendet.

(B) Reagens)

Puffer: 0,1 M Phosphatpuffer (Na-K Phosphat) (pH 6,8) Substrat: 0,05 Micromol/ml in Phosphatpuffer Betalactamase: Das Enzym wurde genügend verdünnt, um in Abwesenheit eines Inhibitors bei 255 mu eine etwa 0,1 Einheiten

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

643262

24

in 10 min betragende Abnahme der optischen Dichte zu ergeben (Apparat: Spektrophotometermodell Hitachi UV-VIS139, Hitachi, Ltd. ; dieses kann ein Kontrollbecken und drei Probebecken aufnehmen. Vier Quarzbecken von 1 cm betragendem Durchmesser und 3 ml betragendem Volumen wurden verwendet. Die Temperaturen wurden während der Reaktion bei 30° C gehalten).

Inhibitor: Die Verdünnung wurde in 0,1M Phosphatpuffer (pH 6,8) oder in Dimethylsulfoxid (DMSO) durchgeführt. Das Kontrollbecken enthielt eine jener des Probebeckens gleiche Verdünnungslösung, jedoch ohne Inhibitor.

Reaktionsbedingungen: Die Enzym-Inhibitor-Mischung folgender Komposition wurde während 15 min bei 30° C vorinku-biert:

Phosphatpuffer

Enzym

Inhibitor

100(11 0,5-2,0 (il 0,5-40 (il

Nach der Vorinkubation wurden 3,0 ml von auf 30° C vorgewärmter Substratlösung eingegeben und zwecks Einleitung der Reaktion schnell gemischt. Nach erfolgter Reaktion wurde die Änderung der optischen Dichte bei 255 m[x während 10 min bei 30° C registriert. Der Ic5^rWert (ug/ml) wurde durch Verdünnung des Inhibitors bis 50 % des in der Kontrolle ohne Inhibitor für 10 min (von der ersten min bis zur elften min nach Eingabe des Substrats) registrierten Cephaloridinhydrolysegrades ermittelt.

(C) Resultate

Unter den vorstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen wurden mit dem Tritylester des Antibioticums PS-5 die folgenden Ic|rWerte erhalten:

Betalactamase aus:

IC5E0R

(Hg/ml)

Proteus vulgaris P-5 -Citrobacter freundii E-9

0,060 0,80

Die physikalischchemischen Eigenschaften des so erhaltenen Produktes waren jenen des Produktes des Beispiels 10 praktisch gleich.

5 Beispiel 12

Herstellung des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 in Gegenwart eines Kronäthers 10,1 g des gemäss dem Verfahren des Beispiels 5 erhaltenen io rohen bräunlichweissen lyophilisierten Pulvers wurden in 200 mg Methylenchlorid suspendiert und beim Rühren unter Eingabe von 1 ml Dicyclohexyl-15-kron-5 (Nippon Soda Co., Ltd.) gelöst. Bei einer mit Eis unter 5° C gehaltenen Temperatur wurden dann 8,5 g Tritylchlorid eingegeben. Die Reaktionsmischung wurde 15 auf Raumtemperatur erwärmt und bei dieser Temperatur während 3 h gerührt. Nach Filtrieren wurde das Filtrat unter reduziertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde sofort in 10 ml Benzol gelöst, filtriert und gemäss dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren gereinigt, wobei 7,3 mg 20 eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten wurden, das jenem des Produktes des Beispiels 10 gleiche physikalischchemische Eigenschaften aufwies.

25

Dabei wurden somit in der Prüfung mit Betalactasmasen von Proteus vulgaris P-5 und Citrobacter freundii E-9 bei den vorstehend angeführten Bedingungen mit 0,060 (ig/ml bzw. 0,80 [xg/ml des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 50 % der Cephaloridinhydrolyse inhibiert oder eingehemmt.

(5) Giftigkeit

Bei intraperitonealer Verabfolgung einer 500 mg/kg betragenden Dosis hat der Tritylester des Antibioticums PS-5 in ddy Mausmännchen (Shizouka) keine Todesfälle bewirkt.

Beispiel 13

Verfahren zum Herstellen des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5 in Gegenwart eines quaternären Ammoniumsalzes

Das Antibioticum PS-5 wurde aus 481 Bouillonfiltrat (11,7 30 CCU/ml) zweimal mit jel51von0,05% Cetyldimethylbenzylam-moniumchlorid enthaltendem Dichloromethan extrahiert, wobei die Aktivität des Dichloromethanextraktes 24,0 CCU/ml und jene des gebrauchten Bouillonfiltrates 5,7 CCU/ml betrug. Das Dichloromethanextrakt wurde über400 g wasserfreiem Natrium-3S sulfat getrocknet und unter reduziertem Druck in einem Drehverdampfer bis 500 ml eingedampft. Die Konzentrate (450 CCU/ ml) wurden vorangehend über 10 g von wasserfreiem Natrium-sulfat entwässert und dann, nach Filtrieren, mit 5 g von Molekularsieben 4A (Union Carbide Corporation) gesiebt. 40 In diese trockene Lösung wurden 4,5 g Tritylchlorid bei einer weniger als 5° C betragenden Temperatur eingegeben und die Mischung wurde während 5 h bei 5° C gerührt. Nach Entfernung des Dichloromethans durch Verdampfung bei Raumtemperatur wurde der Rückstand in 15 ml Benzol gelöst und gemäss einem 45 jenem des Beispiels 10 ähnlichen Verfahren gereinigt, wobei 8 mg von wasserfreiem kristallinem Pulver des Tritylesters des Antibioticums PS-5 erhalten wurden. Die physikalischchemischen Eigenschaften dieser Verbindung waren jenen der in Beispiel 10 beschriebenen Verbindung praktisch gleich.

50

Beispiel 11

Verfahren zum Herstellen des Tritylierungsproduktes des Antibioticums PS-5

715 mg des gemäss dem Verfahren des Beispiels 7 hergestellten bräunlichgelben Natriumsalzpulvers (235 CCU/mg) des Antibioticums PS-5 wurden in 3,5 ml Hexamethylphosphortriamid (HMPA) gelöst. Nach Eingabe von 70 mg Triäthylamin unter Kühlung mit Eis, wurden 250 mg Tritylbromid bei einer weniger als 10° C betragenden Temperatur in die Mischung gegeben. Die Mischung wurde dann zwecks Vervollständigung der Tritylie-runsreaktion bei 10° C während 7 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in 50 ml Eiswasser gelegt und bis zum Schmelzen des Eises stehen gelassen.

DerTritylester des Antibioticums PS-5 wurde mit je 15 ml Benzol dreimal extrahiert und dann gemäss dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren behandelt, wobei 9,4 mgfarbloses kristallines Pulver des erwünschten Produktes erhalten wurden.

65

Beispiel 14

Methylester des Antibioticums PS-5 90 mg des gemäss dem Verfahren von Beispiel 9 erhaltenen Natriumsalzes (8,000 CCU/mg) des Antibioticums PS-5 wurden 55 in 3 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert und 50 mg Triäthylamin sowie 0,3 ml Methyljodid wurden eingegeben. Nach Rühren während 2,5 h bei Raumtemperatur wurden 100 ml Benzol eingegeben und zwecks Extrahierung gründlich vermischt. Die Benzolschicht wurde getrennt, mit 100 ml 0,1 M, pH 60 6,8 Phosphatpuffer gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die trockene Benzollösung wurde unter reduziertem Druck zu einem kleinen Volumen konzentriert und an einer Kolonne (1,2x90 cm) von Bio-Beads S-X3 (Bio-Rad Laboratories) angebracht.

Der Methylester wurde mit Benzol entwickelt. Die esterhalti-gen Fraktionen wurden kombiniert und unter reduziertem Druck bis zur Trockne einbgedampft, wobei ein farbloses Öl erhalten wurde. Das ölige Material wurde in einer kleinen Menge von

25

643262

Aceton gelöst und an einer Kolonne (1,2 x 90 cm) von Sephadex LH-20 mit Aceton als Entwicklungsmittel chromatographiert. Die den Methylester des Antibioticums PS-5 enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und bis zur Trockne eingedampft, wobei 11,2 mg des Methylesters des Antibioticums PS-5 erhalten wurden, der die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften aufwies:

(1) Dünnschichtchromatographie Rf = 0,45 (Silicagel 60 F254 Platte; Benzol:Aceton 1:1)

(2) Ultraviolettabsorptionsmaximum in Methanol /•CHm°" = 315,5 nm

(3) Infrarotabsorptionsmaxima in Chloroform 3430,1766,1600 cm"1

(4) Signale im magnetischen Protonenresonanzspektrum in Deu-teriochloroform (ô)

1,05 (3H, t, J=7,5 Hz)

1.7-2,0 (2H, m)

2,00 (3H, s)

2.8-3,65 (7H, m)

3,83 (3H, s)

3,84-4,06 (1H, m)

(5) Molekulargewicht (Hochauflösungsmassenspektrometrie) 312,1131 (Befund)

312,1143 (Rechnung für CX4H20N2O4S Der Methylester des Antibioticums PS-5 hat aufgrund der vorstehend beschriebenen Struktur des Antibioticums PS-5 und der vorerläuterten physikalischchemischen Daten eine Struktur der folgenden Formel:

Bei parenteraler Verabfolgung wird als Einheitsdosiswirkstoff das reine bis hochreine Antibioticum PS-5, ein pharmazeutisch annehmbares Salz und/oder das Tritylierungsprodukt dieses Antibioticums PS-5 in steriler Wasserlösung oder in Form eines gelöst zu werden bestimmten löslichen Produktes verwendet.

Bevorzugte, das Antibioticum PS-5 und/oder das Tritylierungsprodukt dieses Antibioticums PS-5 enthaltende Formulierungen können gemäss folgenden Verfahren hergestellt werden:

10

Beispiel A: Kapseln

Bestandteil

Je Kapsel

Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) 15 Lactose (J. P.)

Magnesiumstearat

100 mg eine ausreichende

Menge

1mg

Die aktive Verbindung und die Lösungsmittel werden zwecks 20 Erhaltung eines gleichmässig vermischten Produktes kräftig gemischt. 200 mg der dabei erhaltenen Mischung werden in eine harte Gelatinekapsel Nr. 3 gefüllt.

25

Beispiel B: Tabletten

Bestandteil

Pro Tablette

30

Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) 200 mg

Lactose (J. P.) 120 mg

Getreidestärke 175 mg

Magnesiumstearat 5 mg

35

CH3-CH2-

//

S-CH2-CH2-NH-C0-CH3

40

Zur Erhaltung der vorstehend angeführten Komposition wird der aktive Bestandteil mit Lactose und einem halben Anteil Getreidestärke gemischt.

Die Mischung wird mit 10 % des vorstehend genannten Getreidestärkekleisteranteils granuliert und gesiebt. Der Getreidestär-kenrestanteil und das Magnesiumstearat werden eingegeben und die Mischung wird in j e 500 mg wiegende Tabletten von etwa 1 cm betragendem Durchmesser komprimiert.

S

00-CH,

Das vorstehend in Beispiel 14 erläuterte Verfahren wurde statt mitMethyljodid mit Äthyljodid, Isopropyljodid, Isobutyljodid, n-Pentyljodid und n-Heyljodid durchgeführt, wobei die folgenden bezüglichen Ester erhalten wurden:

Antibioticum PS-5 Äthylester Antibioticum PS-5 Isopropylester Antibioticum PS-5 Isobutylester Antibioticum PS-5 n-Pentylester Antibioticum PS-5 n-Hexylester

Die Bildung dieser Ester wurde durch Dünnschichtchromatographie, Infrarotabsorptionsspektrometrie, magnetische Proto-nenresonanzspektrometrie und Massenspektrometrie betätigt werden.

Wie bereits erläutert, können das Antibioticum PS-5 und/oder sein Tritylerster enthaltende Kompositionen in verschiedenen Einheitsdosisformulierungen wie peroral eingenommen zu werden bestimmte Feststoff- oder flüssige Formulierungen verabfolgt werden. Die Komposition der Einheitsdosisformulierung kann dabei, fest oder flüssig, einen 0,1-99 %, vorzugsweise 10-66 %, betragenden Wirkstoffanteil enthalten. Der Anteil dieses aktiven Bestandteiles oder Wirkstoffes der Komposition kann in Abhängigkeit von Parametern wie die Dosierungsform und das Gesamtgewicht der Komposition variieren und beträgt üblicherweise 10-1000 mg, vorzugsweise 100-1000 mg.

Beispiel C: Lyo Form für Einspritzung Bestandteil Pro Phiole

45 Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) 25 mg

Steriles destilliertes Wasser für Einspritzung (J. P.) 2 ml

50 Der aktive Bestandteil wird zwecks Einspritzung in sterilem Wasser gelöst, filtriert und sterilisiert. Die so erhaltene Lösung wird in sterile Phiolen oder Fläschchen verteilt und Wasser wird durch Lyophilisierung aseptisch entfernt. Die den sterilen trok-kenen Feststoff enthaltenden Fiolen werden aseptisch verschlossen.

Für parenterale Verabfolgung werden 2 ml sterile physiologische Saline in den Fioleninhalt gegeben.

55

Beispiel D: Tabletten

60 Bestandteil

Pro Tablette

65

Antibioticum PS-5 (Nat'riumsalz

Cephaloridin

Lactose (J. P.)

Getreidestärke

Magnesiumstearat

20 mg 180 mg 120 mg 175 mg 5 mg

500 mg

643262

26

Antibioticum PS-5 und Cephaloridin werden mit den anderen Ingredienzien gemischt und wie inBeispielB beschrieben, in Tabletten komprimiert. Die Tabletten werden zunächst mit einem Zuckerüberzug und dann mit einem magendarmtraktgere-chen Überzug versehen.

Beispiel E: Tabletten

Bestandteil Pro Tablette

Antibioticum PS-5 (Natriumsalz) 10 mg

Aminobenzylpenicillin 190 mg

Lactose 120 mg

Getreidestärke 175 mg Magnesiumstearat 5 mg

500 mg

Die Antibioticum PS-5 und Aminobenzylpenicillin enthaltenden Tabletten werden gemäss einem jenem des Beispiels B gleichen Verfahrens hergestellt.

Beispiel F: Kapseln Bestandteil Pro Kapsel

Tritylester v. Antibioticum PS-5 100 mg

Lactose eine ausreichende

Menge

Magnesiumstearat 1 mg

Der aktive Bestandteil und die Verdünnungsmittel werden zwecks Erhaltung eines gleichmässigen Gemisches kräftig vermischt. Etwa je 200 mg des Gemisches werden in harten Kapseln Nr. 3 abgefüllt.

Beispiel G: Tabletten

Bestandteil Pro Tablette

Tritylester v. Antibioticum PS-5 200 mg

Lactose (J. P.) 120 mg

Getreidestärke 175 mg

Magnesiumstearat 5 mg

500 mg

In diesem Beispiel wird der aktive Bestandteil mit Lactose und einem halben Anteil Getreidestärke im angegebenen Verhältnis vermischt. Das Gemisch wird mit 10 % des angegebenen Getreidestärkeanteiles granuliert und gesiebt. Magnesiumstearat und der Getreidestärkerestanteil werden eingegeben und die Mischung wird in 500 mg wiegende Tabletten von 1 cm betragendem Durchmesser komprimiert. Die Tabletten werden zunächst mit einem Zuckerüberzug und dann mit einem magendarmtraktge-rechten Überzug versehen.

Beispiel H: Lyo Form für Einspritzung

Bestandteil Pro Phiole

Tritylester v. Antibioticum PS-5 25 mg

Sterilesw destilliertes Wasser für Einspritzung (J. P.) 2 ml

Der aktive Bestandteil wird in sterilem destilliertem Wasser für Einspritzung gelöst und durch Filtrieren sterilisiert. Die Lösung wird in Phiolen oder Fläschchen verteilt und aseptisch gefriergetrocknet. Die den sterilen trockenen Feststoff enthaltenden Phiolen werden aseptisch verschlossen.

Zwecks Einspritzung werden 2 ml von sterilem 70 % N-(Beta-hydroxyäthyl)-lactamid in den Phioleninhalt gegeben.

Beispiel I: Tabletten

Bestandteil Pro Tablette

Tritylester v. Antibioticum PS-5 50 mg

Cephaloridin 150 mg

Lactose (J. P.) 120 mg

Getreidestärke 175 mg

Magnesiumstearat 5 mg

500 mg

Der Tritylester des Antibioticums PS-5 und Cephaloridin werden vermischt und dann gemäss einem jenem des Beispiels J gleichen Verfahren in Tabletten komprimiert sowie verkleidet.

Beispiel J: Tabletten

Bestandteil pro Tablette

Tritylester v. Antibioticum PS-5 20 mg

Aminobenzylpenicillin 180 mg

Lactose (J. P.) 120 mg

Getreidestärke 175 mg

Magnesiumstearat 5 mg

500 mg

Als aktive Ingredienzien werden der Tritylester des Antibioticums PS-5 und Aminobenzylpenicillin vermischt und gemäss einem jenem des Beispiels I gleichen Verfahrens verarbeitet.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

M

5 Blatt Zeichnungen

Claims (21)

1. 643262

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verbindung der Formel

   2

   CH3-CH2

   -CH2-CH2-NH-CO-CH3

   COOR.

   (A)

   1

   15

   worin Rj Wasserstoff, Niederalkyl oder Triphenylmethyl bedeutet , einschliesslich der Salze der Verbindung der Formel A, wobei Ri Wasserstoff bedeutet.
2. 2. Verbindung nach Anspruch 1, wobeiRx Wasserstoff bedeutet.
3. 3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ri Triphenylmethyl bedeutet.
4. 4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ri Methyl bedeutet.
5. 5. Verbindung nach Anspruch 1, die ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel A ist, wobei Ri Wasserstoff bedeutet.
6. 6. Verbindung nach Anspruch 1, die ein Natriumsalz der Verbindung der Formel A ist, wobei Rj Wasserstoff bedeutet.
7. 7. Das Natriumsalz des AntibioticumsPS-5 in praktisch reiner Form, als Verbindung nach Anspruch 1.
8. 8. Antibiotisch wirksame Komposition,m die einen geeigneten pharmazeutischen Träger und als aktiven Bestandteil eine Verbindung der Formel A nach Anspruch 1 oder ein Salz der Verbindung der Formel A umfasst, wobei Ri Wasserstoff bedeutet.
9. 9. Komposition nach Anspruch 8, in welcher der aktive Bestandteil ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel A ist, wobei Rj Wasserstoff bedeutet.
10. 10. Komposition nach Anspruch 8, in welcher der aktive Bestandteil eine Verbindung der Formel A ist, wobei Ri Triphenylmethyl bedeutet.
11. 11. Komposition nach einem der Ansprüche 8-10, in welcher m der aktive Bestandteil in einer antibiotisch wirksamen Menge enthalten ist.
12. 12. Komposition nach Anspruch 8, in welcher die Verbindung der Formel A mit einem betalactamaseempfindlichen Antibioti-

    25 cum in einem Verhältnis gemischt wird, das zur Bewirkung eines Synergieeffektes gegen antibiotisch empfindliche betalaktamase-herstellende Bakterien ausreicht.
13. 13. Komposition nach Anspruch 12, in welcher der wirksame Bestandteil ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel A ist, wobei Rx Wasserstoff oder Triphenylmethyl bedeutet.
14. 14. Komposition nach Anspruch 12, in welcher das betalacta-maseempfindliche Antibioticum ein Penicillin- oder ein Cepha-losporinderivat ist.
15. 15. Komposition nach Anspruch 12, in welcher das Verhältnis der Verbindung der Formel A zum betalactaseempfindlichen Antibioticum von 10:1 bis 1:100 beträgt.
16. 16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

    30

    35

    CVCH2

    S-CH„-CH„-NH-C0-CH,

    (A)

    C00R

    1

    worin Rj Wasserstoff bedeutet, oder eines Salzes der Verbindung der Formel A, das die Verfahrensschritte umfasst, dass ein zum Produzieren der antibiotisch wirksamen Verbindung der Formel A fähiger Mikroorganismus in einem Nährmedium aerobisch kultiviert und die antibiotisch aktive Verbindung von den kultivierten Materialien isoliert wird.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, in welchem als Mikrobenstamm Streptomyces A271, ATCC 31358, verwendet wird.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 16, in welchem die Gärung bei einer 20-40° C betragenden Temperatur bei einem 3-9 betragenden pH während einer 30-90 Stunden betragenden Dauer durchgeführt wird.

    50

    55
19. 19. Verfahren nach Anspruch 16, in welchem die Isolierung des antibiotisch wirksamen Fermentationsproduktes gemäss einem jener Verfahren durchgeführt wird, die zum Isolieren von carbonsäureartigen Antibioticis aus ihren Fermentationsmaterialien geeignet sind.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 16, in welchem die antibiotische Wirksamkeit in Form des Natriumsalzes der Verbindung der Formel A isoliert wird.

    cYch2

    /V
21. 21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

    S-CH„-CHo-NH-C0-CH„

    -(A)

    C00R

    643262

    worin R] Niederalkyl oderTriphenymethyl bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel A, worin Rj Wasserstoff bedeutet oder einem Salz davon, gemäss dem Verfahren nach Anspruch 16 herstellt und anschliessend das erhaltene Zwischenprodukt durch Reaktion mit einem Nieder-diazoalkan oder einer Verbindung der Formel RY, worin R Niederalkyl oder Triphenylmethyl und Y ein Atom oder eine Gruppe bedeuten, die durch Spaltung leicht entfernbar sind, in eine Verbindung der Formel A, wobei Ri Niederalkyl oder Triphenylmethyl bedeutet, umwandelt.