DE2813922A1 - Antibiotikum ps-5-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur bekaempfung von bakteriellen infektionen - Google Patents

Description

"Antibiotikum PS-5 -Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen"

Antibiotika mit Hemmwirkung gegenüber ß-Lactamase oder ß-Lactamase-Inhibitoren sind bekannt, wie sich beispielsweise aus den nachstehenden Literaturstellen ergibt. Die US-PS 3 betrifft die Isolierung von MC696-SY2-A und B aus der Kulturbrühe von MC696-SY2 bildenden Stämmen der Gattung Streptomyces. Die Isolierung von MM455O oder MM139O2 aus der Kulturbrühe von MM455O oder MM139O2 bildenden Stämmen der Gattung Streptomyces ist aus den DE-OSen 2 513 855 und 2 513 854 bekannt. Die DE-OS 2 517 316 betrifft die Isolierung von Clavulansäure nach Züchtung von Streptomyces clavuligerus. Das Antibiotikum Thienamycin mit einem penicillinähnlichen Gerüst und deren Derivate sind aus folgenden Literaturstellen bekannt: US-PS 3 950 357, BE-PS 848 346, BE-PS 848 349 und DE-OSen 2 652 674, 2 652 675, 2 652 676, 2 652 677 und 2 652 680.

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Aufgabe der Erfindung ist es, neue Antibiotika, d.h.. die als Antibiotikum PS-5 bezeichnete Verbindung und seine Derivate zur Verfügung zu stellen, die ß-Lactamase-Inhibitoren darstellen und die die antibiotische Wirkung von Penicillinen, Cephalosporinen und ähnlichen Antibiotika gegenüber ß-Lactamase bildenden, resistenten Problemkeimen synergistisch erhöhen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen de- ^O finiert.

Als Mikroorganismen zur Erzeugung des erfindungsgemäßen Antibiotikums PS-5 eignen sich insbesondere Stämme der Gattung Streptomyces. Ein besonders bevorzugter Stamm dieser Gattung wurde aus einer in der Nähe von Eiheiji Temple, Distrikt Yoshida, Präfektur Fukui, Japan, gewonnenen Bodenprobe isoliert und mit der Stammnummer A271 bezeichnet. Dieser Stamm wurde sowohl beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba City, Japan, unter der Registrierbezeichnung FERM-P Nr. 3984 als auch bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., V.St.Α., unter der Registrierbezeichnung ATCC Nr. 31358 hinterlegt.

Nachstehend sind die taxonomischen Eigenschaften des Stammes A271 zusammengestellt:

1) Morphologische Eigenschaften

Verzweigung des sporentragenden Luftmycels: Einfach verzweigt.

Form des sporentragenden Luftmycels: Die Oberseite des Luftmycels weist Haken, Schleifen oder unvollständige Spiralen auf.

Dies wird als ein Hinweis auf die Zugehörigkeit zur Sektion Retinaculum-Apertum angesehen. Diese Formen lassen sich insbesondere bei Züchtung auf Hafermehl-Agar-Medium und Glycerin-Asparagin-Agar-Medium beobachten, während

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eine gerade oder gebogene Form sich gelegentlich auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium feststellen läßt. Form und Anzahl der Sporen in der Kette: Ovale oder zylindrische Sporen bilden eine Kette von mehr als 10 (gewöhn-

5 lieh 10 bis 50) Sporen.

Größe und Oberflächenstruktur der Sporen: 0,8 bis 1,0 χ 1,0 bis 1,8 μ, glatte Oberfläche. Es werden weder Geißeln noch Sporangium beobachtet. Auf dem Luftmycel bilden sich Hyphen.
10

2) Kulturelle Merkmale

Die kulturellen Merkmale des Stammes A271 sind in Tabelle I zusammengestellt. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die Angaben auf die Beobachtungen nach 2-wöchi-15

ger Züchtung bei 28 C. Die Farbangaben beruhen auf dem Verfahren von H.D. Tresner und E.J. Backus, "System of color wheels for Streptomycete taxonomy", Appl. Microbiol., Bd. 11 (1963), S. 335,und auf dem Farbton-Code in "Guide

to Color Standard" der Japan Color Institute Foundation. 20

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Tabelle I

Medium

Wachs trum

Farbe des Luftmycels

Saccharose- hell Kitrat- orange-

Agar reichlich gelb (Jea)

Farbe des Substratmycels

hellgelb (2fb) bis hell orangegelb (3ea)

lösliches Pigment

keines

Glucose-

Asparagin-Agar

Glycerin-

Asparagin-

Agar

blass orangegelb (3ca) bis

reichlich hell orangegelb (3ea) hellgelb (1 1/2 keines

fb-2fb) blass orangegelb (3ca) bis
hell orange- hellgelb (2fb) bis

reichlich gelb (3ea; etwas gelblich

rosafarben(4-gc) keines

blass orange- hell orange-Starke- gelb (3ca) bis gelb (3ea) bis anorganische hell orange- hellgelb (2fb) keines Salze-Agar reichlich gelb (3ea;

blass orange- hell orange-

Tyrosin- gelb (3ca) bis gelb (3ea) bis

Agar reichlich hell orange- bräunlich-gelb keines

gelb (3^a;

Nähragar reichlich kaum gebildet; blassgelb

falls gebildet, (2db) etwas dunkel

keines

Hefeextrakt- blass orange- hell orange-Malzextraktgelb (3ca) bis gelb (3ea) bis Agar reichlich hell orange- blassbraun (4ie)

gelb (3ea)

Hafermehl-Agar

reichlich blass orange- hellgelb (2fb) farben (3ca)
bis hell orangegelb (3ea)

keines

keines

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■j 3) Physiologische Eigenschaften

1) Temperaturbereich des Wachstums: 10 bis 40°C, Optimum 20 bis 30⁰C.

2) Gelatineverflüssigung (auf Glucose-Pepton-Gelatine-Medium; Züchtung bei 20°C): positiv

3) Stärkehydrolyse (auf Stärke-anorganische-Salze-Agar-Medium): positiv

4) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch: Peptonisierung aber keine Koagulation.

5) Bildung von Melanoidpigment auf Tyrosin-Agar-Medium,

auf Pepton-Hefe-Ionen-Agar-Medium und in Trypton-Hefeextrakt-Brühe: negativ
6) Verwertung von Kohlenstoffquellen: (Agar-Medium nach

Pridham und Gottlieb):

¹⁵ L-Arabinose +

D-Xylose + D-Glucose + D-Fructose Saccharose +; ²⁰ Inosit

L-Rhamnose + Raffinose D-Mannit -

+ : gute Verwertung, _+ : geringfügige Verwertung, - : sehr geringe oder gar keine Verwertung.

Aus den vorstehenden Eigenschaften ergibt sich, daß der Stamm A271 zur Gattung Streptomyces gehört und gleiche Eigenschaften wie Mikroorganismen der Sektion RA aufweist, da der Farbton der Myceloberflache gelb oder rot ist, die Sporenoberfläche glatt ist und kein wasserlösliches Pigment ähnlich einem Melanoidpigment gebildet wird. Nach Arten mit derartigen taxonomischen Eigenschaften wurde in folgenden Nach-

Schlagwerken gesucht: S.A. Waksman und H.A. Lechevalier, 35

"The Actinomycetes", Bd. 2, 1961; E.B. Shirling und

D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology,

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r ι

Bd. 18 (1968), S. 69 bis 189 und 279 bis 892, Bd. 19 (1969), S. 391 bis 512, Bd. 22 (1972), S. 265 bis 394; und Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., 1974. Ähnliche Arten der Sektion RA sind Actinomyces cremeus, Actinomyces flavidovirens, Actinomyces albohelvatus, Actinomyces flavescens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces chryseus und Streptomyces helvaticus. Als eine ähnliche Art wurde auch Streptomyces pluricolorescens ausgewählt, die ähnliche morphologische Eigenschaften aufweist, aber zur Sektion RF gehört. Diese 8 Arten sollen,mit Ausnahme der letztgenannten Streptomyces pluricolorescens, ein Luftmycel mit gerader Form oder Schleifen bilden, wobei die jeweilige Form von den Züchtungsbedingungen abhängt. Kulturen der vorgenannten 8 Arten wurden nach Züchtung unter gleichen Bedingungen mit dem erfindungsgemäßen Stamm A271 verglichen. Es ergibt sich, daß der Stamm A271 in Bezug auf Wachstum, Farbe des Luftmycels, Farbe des Substratmycels und Verwertung von Kohlenstoffquellen deutliche Unterschiede zu den vorgenannten Arten zeigt.

In den Tabellen II, III und IV sind die Ergebnisse des Vergleichs mit den beiden ähnlichsten Arten zusammengestellt.

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Tabelle II Farbe bzw. Ausmaß des Luftmycels

Medien

Stamm A271

Saccharose- hell orange-Nitratgelb (3ea;
Agar

Actinomyces cremeus ISP 514-7

spärlich gebildet Actinomyces flavidovirens isp 5150

nicht gebildet

Glucose-

Asparagin-

blass orange- blass orangegelb (3ca) bis gelb (3ca) . hell orangegelb (3eaJ

weiss (b)

Glycerin-

Asparagin-

blass orange- blass orangegelb (3ca) bis gelb (3ca) hell orangegelb (3ea)

Stärke-

anorganische g
Salze-Agar hell orange
(3ea)

blass orange- blass orangegelb (3ca) bis gelb (3ca) nicht bis spärlich gebildet, falls gebildet, weiss (a)

schwach gebildet, weiss (a) bis blassgelb (2db)

Nähragar kaum gebildet, weiss (a) bis falls gebildet, blass orangeetwas dunkel gelb (3ca) weiss

Hefeextrakt- blass orange- blassgelb (2db) Malzextrakt- gelb (3caJ bis
Agar hell orangegelb (3ea)

weiss (b) bis blass gelbstichig grün O cb)

Hafermehl-Agar

blass orange- weiss (b) bis gelb (3ca) bis blass orangehell orange- gelb (3ca) gelb (3ea)

weiss (b) Ms blass gelbstichig grün O)

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- 12 Tabelle III

Medien

Farbe des Substratmycels

Actinomyces

Actinomyces eremeus flavidovirens Stamm A271 ISP 514-7 ISP 5150

Saccharose-Nitrat- Agar

hellgelb (2fb) geringes Wachstum, bis hell orange- farblos bis weiss gelb (3ea) (b)

geringes Wachstum, farblos bis weiss (a)

Glucose-Asparagin- Agar

hellgelb

(1 1/2 fb-2fb) hell orangegelb (3>ea;

blassgeIb (2db)

Glycerin-Asparagin- Agar

hellgelb (2fb) hell orangebis etvxas gelb- gelb (3ea; stichig rosa (4-gc)

graustichig

?elb
3ec)

Stärke- hell orange-gelb massig gelbanorganische (3ea) bis hellgelb stichig rosa Salze-Agar (2fb) (4ea)

hellgelb (2fb)

Tyrosin-Agar

hell orange-gelb (3ea) bis braunstichig gelb blassbraun (4-ie)

graustichig gelb (3ec)

Nähragar

blassgelb (2db) hell orange-gelb
(3ea)

blassgelb (2db)

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

hell orange-gelb (3ea) bis blassbraun (4-ie) hell orange-gelb
(3ea) bis dunkelgelb

mattgelb

Hafermehl-Agar

hellgelb (2fb) etwas gelbstichig
rosa (4-gc)

blassgelb (2db) bis blass orangegelb (3ca)

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Tabelle IV

"Verwertung von Kohlenstoffquellen

Actinomyces Actinomyces

Kohlenstoff- cremeus flavidovirens

quellen Stamm A2?1 ISP 5^57 ISP 5^50

L-Arabinose + + +

D-Xylose' + + +

D-Glueose + + +

D-Fructose - + +

Saccharose + - -

Inosit - - +

L-Bhamnose + - +

Eaffinose - - -

D-Mannit - - —

Folgende Schlüsse lassen sich aus den vorstehenden Ergebnissen

ziehen:

Farbe des Luftmycels: Bei Actinomyces flavidovirens ist es im allgemeinen weiss, zeigt aber, sofern es gelb ist, einen Stich ins Grüne und unterscheidet sich somit klar vom erfindungsgemässen Stamm A271. Actinomyces cremeus zeigt im allgemeinen einen schwächeren Rotstich der blass orange-gelben Farbe

als der Stamm A271, was einen deutlichen Unterschied darstellt.

Farbe des Substratmycels: Bei Actinomyces flavidovirens ist es blassgelb und bei Actinomyces cremeus in vielen Fällen hell orange-gelb gefärbt, während es beim Stamm A271 im allgemeinen hellgelb gefärbt ist.

Ein genauer Vergleich der vorstehend aufgeführten Versuchsergebnisse mit den verschiedenen Medien zeigt, dass der Stamm A271 sich von den anderen beiden Arten unterscheidet. Der

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Stamm A271 unterscheidet sich von Actinomyces cremeus in der Verwertung von D-Pructose und L-Khamnose und von Actinomyces flavidovirens in der Verwertung von D-Fructose und Inosit.

Demgemäss unterscheidet sich der Stamm A271 klar von den beiden Arten, die ihm am ähnlichsten kommen. Infolgedessen unterscheidet sich der Stamm A271 von allen bekannten Arten der Streptomyceten und ist infolgedessen eine neue Art die als Streptomyces sp. A271 bezeichnet wird. Eine Kultur dieses Stamms wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Kr. EERM-P 3984-hinterlegt. Ferner wurde der Stamm auch bei ATCC unter der Nr. 3^358 hinterlegt.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens können nicht nur der Stamm A271 selbst, sondern auch dessen natürliche und künstliche Mutanten verwendet werden, deren Bildung durch ; chemische oder physikalische Behandlung induziert werden kann und die das Antibiotikum PS-5 produzieren.

Die das Antibiotikum PS-5 bildenden Stämme können aus einer grossen Anzahl von Mikroorganismen ausgewählt werden, die nicht auf eine spezielle Gattung beschränkt sind. Die Auswahl der PS-5 bildenden Mikroorganismen kann vom Fachmann nach dem nachstehend erläuterten Verfahren durchgeführt werden.

Aus Bodenproben isolierte Mikroorganismen werden gezüchtet. Proben der Filtrate der Kulturbrühen werden auf Agar-Platten aufgebracht, die in einem Fall mit einem ß-Lactam-Antibiotikum-empfindlichen Mikroorganismus beimpft sind und im anderen Fall ß-Lactamase enthalten und mit dem gleichen Mikroorganismus beimpft sind. Mikroorganismen, deren Kulturbrühenfiltrate auf den letztgenannten Platten kleinere Hemmzonen als auf den erstgenannten Platten aufweisen, werden für die weitere Verwendung ausgewählt. Anschließend werden die aktiven Bestand-

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teile in den Kulturbrühen der auf diese Weise ausgewählten Mikroorganismen an Aktivkohle adsorbiert und sodann eluiert. Die Eluate werden konzentriert,und die Konzentrate werden der Papierchromatographie oder der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Hierauf wird eine Bioautographie unter Verwendung eines ß-Lactam-Antibiotikum-empfindlichen Mikroorganismus als Testkeim vorgenommen. Dieses Screening-Verfahren wird im nachstehenden Beispiel näher erläutert.

Als Agar-Platte wird die nachstehend näher beschriebene Comamonas-Bioplatte verwendet, die mit einem ß-Lactam-Antibiotikum-empf indlichen Testkeim beimpft wird. Die Comamonas CV-Bioplatte und die Comamonas CM-Bioplatte werden hergestellt, indem man die vorstehende Comamonas-Bio-

platte mit der durch Proteus vulgaris P-5 bzw. Citrobacter freundii E-9 gebildeten ß-Lactamase versetzt.

Zellstoff scheiben von 8 mm Durchmesser, die mit den Kulturbrühenfiltraten der aus den Bodenproben isolierten Mikroorganismen versetzt sind, werden auf die vorgenannten Platten gelegt. Die Platten werden 20 Stunden bei 35⁰C inkubiert. Mach der Inkubation werden die Mikroorganismen, deren Kulturbrühenfiltrate auf der Comamonas-Bioplatte eine Hemmzone und auf der Comamonas CV-Bioplatte oder auf der Comamonas CM-Bioplatte eine

kleinere Hemmzone aufweisen, ausgewählt.

Die Kulturbrühenfiltrate dieser Mikroorganisman werden mit 2 Prozent (Gewicht/Volumen) Aktivkohle versetzt. Nach 15-minütigem

Rühren wird das unlösliche Material zentrifugiert. .Die.ses un-

"

lösliche Material wird mit einem dem Kulturbrühenfiltrat entsprechenden Volumen an destilliertem Wasser gewaschen und wieder abzentrifugiert. Dieses gewaschene, unlösliche Material wird einem Elutionsvorgang unterzogen, indem man es mit einer

50prozentigen (Vol./Vol.) wässrigen Acetonlösung, deren Volumen 35

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^Γ - 16 -

dem halben Volumen des Kulturbrühenfiltrats entspricht, versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur rührt. Nach dem Zentrifugieren wird der überstand unter Verwendung eines Drehverdampfers bei 30 bis 35⁰C bis zum Entstehen einer 20-fach konzentrierten Lösung (im Vergleich zum Kulturbrühenfiltrat) eingedampft. Die eingeengte Lösung wird der absteigenden Papierchromatographie an Filterpapier unterzogen, wobei die Laufzeit 16 Stunden beträgt und als Laufmittel So % Acetonitril/Tris-EDTA (zusammengesetzt aus 120 ml Acetonitril, 80 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 und 1 ml einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von Äthylendiamintetraessigsäure) verwendet wird. Anschließend wird unter Verwendung von Comamonas terrigena B-996 als Testkeim eine Bioautographie durchgeführt.

Die aus Bodenproben isolierten Mikroorganismen, deren biologisch aktives Stoffwechselprodukt eine Hemmzone der gleichen Laufstrecke (bzw. mit dem gleichen R_f-Wert) ergibt wie das Antibiotikum PS-5 werden als Kandidaten für die Herstellung des Antibiotikums PS-5 ausgewählt. Diese ausgewählten Mikroorganismen werden weiteren Untersuchungen unterzogen, wobei die Fähigkeit zur Bildung des Antibiotikums PS-5 durch zusätzliche papier- und dünnschichtchromatographische Untersuchungen bestätigt wird.

Aufgrund des vorstehend erläuterten Verfahrens ist es dem Fachmann leicht möglich, neben dem beschriebenen Stamm Streptomyces sp. A271 auch weitere Stämme aufzufinden, die das Antibiotikum PS-5 bilden.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Sporen des Mycels eines Mikroorganismenstamms, der zur Bildung des Antibiotikums PS-5 in der Lage ist, beispielsweise von Streptomyces sp. A271, auf ein Nährmedium überimpft und

35 unter aeroben Bedingungen gezüchtet.

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Es können zahlreiche Nährstoffe verwendet werden, die im allgemeinen bei der Züchtung von Streptomyceten Anwendung finden und Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthalten. Als Kohlenstoffquellen kommen Kohlenhydrate, wie Glucose, Glycerin, Maltose, Saccharose, Melassen, Dextrin und Stärke, oder öle oder Fette, wie Sojabohnenöl, Erdnußöl und Schweinefett, in Frage. Beispiele für Stickstoff quellen sind Pepton, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatöl, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Casein aus Magermilch, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. Beispiele für organische Salze sind Dikaliumphosphat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat und Magnesiumsulfat. Gegebenenfalls können Spurenelemente, wie Kobalt oder Mangan, zugesetzt werden. Ferner können alle Nährstoffe verwendet werden,die der Mikroorganismus unter Bildung des Antibiotikums PS-5 verwertet. Zur Unterdrückung der Schaumbildung während der Hitzesterilisation und der Züchtung können Antischaummittel, wie Silikonöl und pflanzliche Öle, zugesetzt werden. Das Mengenverhältnis der Nährstoffe in den Nährmedien kann innerhalb eines weiten Bereichs geändert werden. Die günstigste Zusammensetzung der Nährmedien kann vom Fachmann leicht durch Vorversuche im Kleinmaßstab ermittelt werden. .

Das Nährmedium kann vor der Züchtung sterilisiert werden. ' Der pH-Wert des Mediums wird vor oder nach der Sterilisation auf 4- bis 9 und vorzugsweise auf 6 bis 8 eingestellt. Die Züchtung des das Antibiotikum PS-5 bildenden Stamms kann im wesentlichen nach den gleichen Verfahren durchgeführt werden, die im allgemeinen zur Herstellung von Antibiotika durch Züchtung von Streptomyceten angewendet werden. Im allgemeinen wird ^di'^e Züchtung unter aeroben Bedingungen, d.h. unter Rühren und/oder Belüften, bevorzugt.

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Es können beliebige Stationär-, Schüttel- oder Submerskultüren angewendet werden. Die Submerskultur wird bevorzugt. Die Züchtungs temp era tür unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, wird aber im allgemeinen innerhalb eines Bereichs gewählt, in dem das Wachstum des das Antibiotikum PS-5 bildenden Stamms nicht wesentlich gehemmt wird und in dem die Bildung des Antibiotikums PS-5 erfolgen kann. Obgleich sich die Züchtungstemperatur Je nach Art des verwendeten Stamms ändern kann, liegt sie im allgemeinen im Bereich von 20 bis 40⁰C und vorzugsweise im Bereich von 25 bis 35⁰C. Während der Züchtung wird der pH-Wert der Kulturflüssigkeit auf 4 bis 9 und vorzugsweise auf 6 bis 8 eingestellt. Bei Großansätzen wird vorzugsweise eine entsprechende Anzuchtkultur hergestellt, die anschließend auf das Nährmedium für die Submerskultur überimpft wird. Die Züchtung wird im allgemeinen fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge des Antibiotikums PS-5 in der Kulturflüssigkeit angereichert hat. Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen 30 bis 90 Stunden, kann aber je nach der Zusammensetzung des Nährmediums, der Züchtungstemperatur, dem verwendeten Mikroorganismenstamm und ähnlichen Faktoren variieren. Die optimalen Züchtungsbedingungen können vom Fachmann leicht durch Vorversuche im Kleinmaßstab ermittelt werden. Das in der Brühe angereicherte Antibiotikum PS-5 läßt sich durch die nachstehend erläuterte biologische Bestimmungsmethode und durch Bioautographie ermitteln.

Da das in der Gärbrühe angereicherte Antibiotikum PS-5 wasserlöslich ist und sich vorwiegend außerhalb des Mycels befindet, wird das Mycel nach der Züchtung vorzugsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und extrahiert. Anschließend wird das Antibiotikum aus dem Filtrat, überstand und Extrakt gewonnen. Dabei kann man nach verschiedenen, an sich üblichen Verfahren vorgehen. Vorzugsweise bedient man sich der Verfahren,

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die häufig zur Gewinnung von Antibiotika vom Carbonsäuretyp angewendet werden. Beispielsweise können die nachstehend angegebenen Verfahren unabhängig voneinander oder in Kombination, gegebenenfalls auch wiederholt, zur Gewinnung und Isolierung des Antibiotikums PS-5 angewendet werden:

(a) Extraktion bei niedrigem pH-Wert mit einem Lösungsmittel, wie Essigsäureäthylester und n-Butanol, und Rückextraktion aus der Lösungsmittelphase in eine wässrige Phase bei höherem pH-Wert;

(b) Extraktion bei neutralem pH-Wert mit Lösungsmitteln, wie Methylenchlorid und Chloroform, in Gegenwart eines lipophilen quaternären Ammoniumsalzes, wie Benzalkoniumchlorid und Tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, oder einer Kronenverbindung, _wie stSB5=äxä33£&~ß8Jkrone-6 und ■ee«¥6=kS&S£p^-/157krone-5 (vgl. Angew. Chem., Bd. 84 (1972),

16) und Rückextraktion aus der
Lösungsmittelphase in eine neutrale wässrige Phase mit einem Gehalt an Natriumiodid, Kaliumiodid und dergl.;

(c) Adsorption an Aktivkohle oder hochporösen Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisaten, wie Amberlite XAD und Diaion HP-2O_# und Elution mit wässrigem Methanol, wässrigem Aceton oder dergl.;

(d) Adsorption und Elution mit einem Ionenaustauscherharz, wie Dowex 1-X2 und Q4E-Sephadex A-25;

(e) Gelfiltration mit Sephadex G-10, Bio-Gel P-2 und Bio-Beads

S-X3;
(f·) Säulen- oder Dünnschichtchromatographie mit Cellulose,

Avicel SF, DEAE-Cellulose,Whatman DE-32, DEAE-Sephadex A-25, . Kieselgel, Aluminiumoxid oder dergl.; und (g) erzwungene Fällung durch Zusatz eines Lösungsmittels, wie

Aceton.

Das Verhalten des Antibiotikums PS-5 bei den Gewinnungs- und Isolierungsverfahren lässt sich durch die nachstehend er-

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läuterten Methoden . zur biologischen Bestimmung und Bioautographie ermitteln. Auf diese Weise lässt sich das Antibiotikum PS-5, das die nachstehend angegebenen Eigenschaften aufweist, erhalten.

Physiko-chemische Eigenschaften des Antibiotikums PS-5

(1) Löslichkeit

Das Antibiotikum PS-5 ist beim pH-Wert 6 bis 9 in. V/asser löslich. Insbesondere ist dieses Antibiotikum nicht nur in Wasser vom pH-Wert 7₅ sondern auch in leicht sauren, auf den pH-Wert 6 oder höher durch Zusatz von Salzsäure oder ähnlichen Säuren eingestellten wässrigen Medien löslich. Ferner ist es in schwach alkalischen wässrigen Medien, die durch Zusatz von Basen, wie Natriumhydrogencarbonat oder Natriumhydroxid, auf einen pH-Wert unter 9 eingestellt worden sind, löslich. Das Antibiotikum ist in Essigsäureäthylester und Benzol bei pH-Werten oberhalb von 4 praktisch unlöslich.

(2) Dünnschichtchromatographie (TLC)

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 ergibt bei Verwendung der folgenden Dünnschichtplatten und Laufmittel die nachstehend angegebenen R~-Werte. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die Mengenverhältnisse der angegebenen Lösungsmittel auf das Volumen.

(a) Mit Avicel SF-Cellulose beschichtete Dünnschichtplatte. n-Butanol/Äthanol/Vasser (7/7/6) R_f = 0,94 Isopropanol/Wasser (7/3) E„ = 0,96

(b) Mit Kieselgel beschichtete Fertigplatten 60 1*254 (^E* Merck) ^Äthanol/Wasser (7/3) E_f = 0,82 n-Propanol/Wasser (7/3) R = o,77

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(3) Papierchromatographie

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 ergibt bei Verwendung von Toyo Filterpapier Nr. 50 bei der absteigenden PapierChromatographie unter Verwendung der nachstehend angegebenen Lösungsmittel die folgenden Rr.-Werte:

n-PropanolA'asser (7/3) E_f = 0,68

n-Propanol/IsopropanolA/asser

(7/7/6) R_f = 0,70

Acetonitril/Wasser (8/2) R_f = 0,36

Acetonitril/Tris/EDTA* R_f = 0,34

Äthanol/Wasser (7/3) Rp = 0,63

*: Lösungsmittelgemisch aus 120 ml Acetonitril, 30 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 7?5 u^-d 1 ml 0,1 m Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure vom pH-Wert 7*5·

(4) Hochspannungs-Papierelektrophorese

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 zeigt bei der Hochspannungselektrophorese an Toyo Filterpapier Nr. unter Verwendung eines Hochspannungs-Papierelektrophoresegeräts (Savant Instruments Inc., Hochspannungs-Netzteil HV 3000A, flache Plattenelektrophoresekammer FP18A) folgendes Verhalten: Mindestens 5 mm und im allgemeinen bis 40 mm Wanderung zur Anode bei 30-minütigem Betrieb mit einem Potentialgradienten von 42 V/cm in einem Puffer vom pH-Wert 8,6 aus 3000 ml Wasser, 3,3 g Barbital und 25_?5 S Barbitalnatrium.

(5) Acidität

Das Antibiotikum PS-5 ist eine einbasige Säure mit einer Carbonsäuregruppe im Molekül.

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(6) UV-Absorptionsspektrum

Das nachstellende UV-AbSorptionsmaximum ist charakteristisch, für das ITatriumsalz des Antibiotikums PS-5:

-3011»

(7) IR-Absorptionsspektrum

Das ITatriumsalz des Antibiotikums PS-5 zeigt folgende charakteristische IR-Absorptionsmaxima bei Messung in einem KBr-Pressling:

etwa I75O cm fCO- im ß-Lactamring)

etwa 1650 cm"¹ (-CO- des Amids)

etwa 1640 - 1540 cm"¹ (-COcR)

(8) Protonen-MIR-Spektrum

Das ITatriumsalz des Antibiotikums PS-5 zeigt folgende charakteristische Signale beim 100 Mhz-Protonen-HMR-Spektrum in D₂O:

(I) Ein bei etwa 1,06 ppm zentriertes Triplett mit Kopplungskonstanten von etwa 7,5 Hz (CH₅-CH₂-)

(II) Ein Multiplett bei etwa 1,72 bis 2,0 ppm (CH₃-CH₂-) (III) Ein scharfes Singulett bei etwa 2,05 ppm (CH₅-CO-) (IV) Ein Multiplett bei etwa 2,88 bis 3,58 ppm (CH₂, -CH-)

(V) Multiplett bei etwa 3,92 bis 4,20 ppm ?

(-CH-)

(9) Spezifische Drehung

/~<x_7 ^² + 1,23 (c =1,59, 0,01 m Natriumphosphatpuffer vom pH-V7ert 8)

(1o) Molekulargewicht und Summenformel

Das Molekulargewicht beträgt etwa 298 (berechnet aus den Ergebnissen der hochauflösenden Massenspektroskopie für

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den Methylester des Antibiotikums PS-5). Die Summenformel ist C

positiv positiv negativ

(11) Farbreaktion

Ehrlich-Reagenz-Reaktion:

Jod-Chlorplatinsäure-Reaktion:

Ninhydrin-Reaktion:

Die vorstellenden physikochemischen Eigenschaften belegen, dass in einem Molekül des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 folgende Gruppen vorhanden sind:

CH₃-CH₂-, CH₃CO-, -CH₂-, -CH-, -CH-,

-NHCO-. und

-COO

Aus der Elementaranalyse des Tritylesters des Antibiotikums PS-5 (vgl. Beispiel 10) ergibt sich die Anwesenheit von Schwefel. Die Daten des UV-AbSorptionsmaximums und-minimums sowie deren Absorptionsverhältnis und Extinktionskoeffizienten ergeben eine Stütze für die Anwesenheit eines Thienamycin-Gerüsts im Molekül. Dies wird durch die Tatsache bestätigt, dass das UV-Absorptionsmaximum durch Veresterung der Carboxylgruppe von 301 nm auf nm verschoben wird; vgl. Conference on Antimicrobial Agents & Chemotherapy, Chicago, 29. Oktober 1976).

Aufgrund der vorstehenden Daten wird für das Antibiotikum PS-5 folgende Strukturformel angenommen:

CH₃-CH₂

S-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₃

COOH

(i-a)

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Diese Formel findet zusätzlich ihre Stütze darin, dass wie

nachstehend im Beispiel 9 beschrieben, das Antibiotikum PS-5

13
13 Signale im C-MMR-Spektrum aufweist und die chemischen

Verschiebungen mit der vorgenannten Strukturformel bei einem Vergleich mit den Daten von Thienamycin in Einklang stehen.

Obgleich das Antibiotikum PS-5 beispielsweise bei der Durchführung der Isolierung bei Raumtemperatur anscheinend instabil ist, ist es bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise unter O⁰C und insbesondere unter -10°C, ausreichend stabil. Ferner ist es in wässrigen Lösungen bei ρH-Verten um den Neutralpunkt oder bei schwach alkalischen pH-Werten ausreichend stabil. Fach 15-miE-ütigem Erhitzen auf 60°C in einer wässrigen Lösung mit pH-Werten um den Ueutralpunkt oder mit schwach alkalischen pH-Werten unterhalb von 9 behält es mindestens 50 Prozent und im allgemeinen mehr als 70 Prozent seiner antibiotisehen Aktivität.

Biologische Eigenschaften des Antibiotikums PS-5

(Ί ) Antibiotisch.es WirkungsSpektrum

Das Antibiotikum PS-5 weist ein breites antibiotisches WirkungsSpektrum auf und zeigt eine starke Aktivität gegen verschiedene Bakterien, beispielsweise gram-positive Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina und Bacillus und gram-negative Bakterien der Gattungen Alcaligenes und Comamonas. Das Antibiotikum PS-5 zeigt ferner eine gute Aktivität gegen gram-negative Bakterien, wie Escherichia, Klebsiella und Proteus. Gegenüber gram-negativen Bakterien, die gegen Antibiotika mit

der ß-Lactamringstruktur resistent sind, zeigt das Antibiotikum PS-5 eine starke Aktivität, beispielsweise gegen Keime der Gattungen Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella und Serratia.

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(2) Verstärkung der antiMotisdien Aktivität von anderen. Antibiotika gegenüber ß-Lactamase "bildenden Bakterien

Das Antibiotikum PS-5 zeigt die Fähigkeit, die antibiotische Aktivität von anderen Antibiotika, insbesondere von ß-Lactam-Äntibiotika, wie Penicillinen und Cephalosporinen, gegenüber ß-Lactamase bildenden Bakterien,wie Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens, zu erhöhen. In den meisten !Fällen zeigt sich dabei eine synergistische Wirkung.

(3) in vivo-Äktivltät

Bei der Behandlung von mit pathogenen, gram-positiven Bakterien infizierten Mäusen hat das. Antibiotikum PS-5 eine signifikante Schutzwirkung.

(4) Toxizität

Bei xntraperitonealer Verabfolgung des Antibiotikums PS-5 an Mäuse in Dosen von 500 mg/kg werden keine Todesfälle beobachtet.

Derivate des Antibiotikums PS-5

Da das Antibiotikum PS-5, wie vorstehend erläutert, keine besonders hohe Stabilität zeigt, müssen die Gewinnungsund Isolationsverfahren sehr schonend durchgeführt werden. Da die Salze des Antibiotikums PS-5 im allgemeinen stabiler sind als die freie Säure, wird es für pharmakologische Zwecke, bei der Verwendung als Zwischenprodukt zur Herstellung von anderen Derivaten und während des Isolierungsyerfahrens vorzugsweise in Form von Salzen eingesetzt. Beispiele für entsprechende Salze sind Alkalimetallsalze, wie das Natrium-, Kalium- und Lithiumsalz, Erdalkalimetallsalze, wie das Calcium- und Magnesiumsalz, Salze von anderen

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Metallen, wie das Aluminiumsalζ, das Ammoniumsalz, Salze mit primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie Monoäthylamin, Dimethylamin, Triäthylamin, Monoäthanolamin und Diäthanolamin, und Salze mit organischen Basen, wie Benzathin und Procain. Bevorzugt sind pharmakologisch verträgliche Salze, d.h. Salze mit Kationen, die die pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften der freien Säure nicht nachteilig beeinflussen. Besonders bevorzugt sind die Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz.

Wie vorstehend erläutert, ist das Antibiotikum PS-5 eine eihbasige Säure mit einer Carboxylgruppe im Molekül. Somit kann diese Verbindung mit Alkoholen, Mercaptanen oder deren Derivaten verestert werden. Dabei bedient man sich beispielsweise der gleichen Verfahren, die bei der Veresterung der bekannten Antibiotika Clavulansäure oder Thienamycin, Verwendung finden. Diese Ester sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Bevorzugt sind Ester der allgemeinen Formel i-b

,S-CH-CH-NH-CO-CH CH₃-CH₂- ' w ^L -3

I!

(I-b)

in der E einen niederen Alkylrest oder die Triphenylmethylgruppe bedeutet. ^Als niedere Alkylreste kommen geradkettige oder verzweigte Reste in Frage, die vorzugsweise höchstens 6 und insbesondere 1 bis 4- Kohlenstoff atome aufweisen. Beispiele dafür sind die Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl-, n-Pentyl-, Isopentyl- und n-Hexylgruppe.

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- ²¹ -

Die Ester der allgemeinen Formel I-b lassen sich herstellen, indem man das Antibiotikum PS-5 der Formel I-a oder dessen Salze mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II

R-Y (II)

in der R die vorstehend angegebene Bedeutung hat und Y ein Atom oder eine abspaltbare Gruppe bedeutet, oder mit niederen Diazoalkanen umsetzt, die den Rest R liefern.

In der allgemeinen Formel II kann Y beliebige Atome oder Gruppen bedeuten, die bei der Umsetzung mit der Carboxylgruppe des Antibiotikums PS-5 abgespalten werden können, beispielsweise Halogenatome, wie Chlor-, Brom- oder Jodatome, Sulfonyloxygruppen und reaktive Carbonyloxygruppen,- wie -O-CO-CJ¹,. Besonders bevorzugt sind Halogenatome. Nachstehend sind spezielle Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel II angegeben: Methanol, Methyljodid, Dimethylsulfat, Methylmercaptan, Äthanol, Äthylbromid, Äthyljodid, Äthylmercaptan, n-Propylchlorid, n-Propyljodid, Propanol, Isopropanol, Isopropylbromid, n-Butanol, n-Butylbromid, n-Butyljodid, n-Pentanol, n-Pentylchlorid, n-Pentylbromid, n-Pentyljodid, n-Hexanol, n-Hexylbromid, n-Hexyljodid, Tritylalkohol, Tritylmercaptan, Tritylchlorid und Tritylbromid.

Als niederes Diazoalkan zur Herstellung der Ester des Antibiotikums PS-5 ist Diazomethan besonders bevorzugt.

Die Umsetzung des Antibiotikums PS-5 mit Verbindungen der allgemeinen Formel II oder mit niederen Diazoalkanen kann nach an sich üblichen Verfahren zur Veresterung durchgeführt v/erden. Vorzugsweise wird die Veresterung in einem inerten, flüssigen Medium durchgeführt, wenngleich auch in Abwesenheit

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eines derartigen Mediums gearbeitet werden kann. Beispiele für entsprechende inerte Medien sind:

(a) Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, η-Hexan und Cyclohexan;

(b) Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Methylenchlorid;

(c) Amide, wie Dimethylformamid und Hexame thylpho sphor säuretriamid;

(d) Dimethylsulfoxid;

(e) Äther, wie Diäthyläther, Diisopropyläther, Di-n-butyläther,

Tetrahydrofuran und Dioxan;

(f) Ester, wie Essigsäureäthylester und Essigsäure-n-butylester; und

(g) Ketone, wie Aceton und MethyläthyIketon.

Diese Lösungsmittel können allein oder in Form von Gemischen aus zwei oder mehr Bestandteilen verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und kann je nach Art der Verbindungen der allgemeinen Formel III,der Art des niederen Diazoalkans oder der Art des flüssigen Mediums variieren. Die Reaktionstemperatur kann in einem Bereich gewählt werden, in dem das Antibiotikum PS-5 keiner merklichen Zersetzung unterliegt. Im allgemeinen liegen die geeigneten Temperaturen unter 60⁰C, vorzugsweise im Bereich von 0 bis 40⁰C und insbesondere im Bereich von 5⁰C bis Raumtemperatur. Bei der Durchführung der Umsetzung wird gegebenenfalls ein Katalysator bzw. Reaktionsbeschleuniger, wie Trimethylamin, Triäthylamin, Pyridin oder Dicyclohexylcarbodiimid ,verwendet. Unter diesen Bedingungen erreicht man innerhalb von 1 bis 24-Stunden und im allgemeinen innerhalb von 3 bis 12 Stunden einen vollständigen Reaktionsablauf.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das Antibiotikum PS-5, das zur Umsetzung mit dem reaktiven

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Derivat der allgemeinen Formel II verwendet wird, in der R die Triphenylmethylgruppe bedeutet, nicht notwendigerweise in Form eines isolierten, gereinigten Präparats vor. Es kann sogar die gegebenenfalls vom Mycel befreite Gärbrühe zur Umsetzung verwendet werden, ebenso wie ein rohes Präparat des Antibiotikums PS-5, das teilweise durch die vorstehend beschriebenen Gewinnungs- und Isolierungsverfahren gereinigt worden ist. Beispiele für teilweise gereinigte Präparate sind:

(a) Nach der Elution der Aktivkohle, mit der die filtrierte Gärbrühe behandelt worden ist, erhaltene konzentrierte

Eluate;

(b) nach der Elution von hochporösen Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisaten, mit denen die filtrierte Gärbrühe behandelt worden ist, erhaltene konzentrierte Eluate;

(c) nach Behandlung mit Aktivkohle und mit hochporösen Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisaten, unter anschließender Adsorption an einem Ionenaustauscherharz, wie QAE-Sephadex, und Elution mit einem Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten in Phosphatpuffer erhaltene entsalzte Konzentra-

20 te ;

(d) in Gegenwart von Benzalkoniumchlorid erhaltene konzentrierte Methylenchloridextrakte;

(e) mit Chloroform in Gegenwart von Kronen-Verbindungen erhaltene konzentrierte Extrakte; und

(f) durch Extraktion mit Butanol beim pH-Wert 3,5 bei niedrigen Temperaturen gehaltene Extrakte.

Der auf diese Weise erhaltene Tritylester des Antibiotikums PS-5 kann aus dem Reaktionsgemisch nach verschiedenen bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise kann das Reaktionsgemisch nach beendeter Umsetzung zuerst in ein wässriges Medium gegossen x«ierden, um die in Wasser löslichen Verunreinigungen, wie Nebenprodukte oder dergl., zu entfernen.

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Vorzugsweise wird ein neutraler Puffer als wässriges Medium verwendet, um den pH-Wert in der Nähe des Neutralpunkts zu halten. Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 in diesem Gemisch wird sodann mit einem weniger polaren organischen Lösungsmittel, das im wesentlichen mit Fasser nicht mischbar ist, "beispielsweise mit Essigsäureäthylester, Benzol oder Chloroform, extrahiert. Während der Extraktion wird gegebenenfalls ein Salz, wie Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat,zugesetzt, um den Wirkungsgrad der Extraktion zu erhöhen. Nach dem Trocknen des organischen Extrakts mit wasserfreiem Natriumsulfat kann der Tritylester aus der Lösungsmittelphase nach an sich üblichen Verfahren isoliert werden, beispielsweise durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Beads S-X3 oder Sephadex LH-20, oder durch Adsorptionschromatographie unter Verwendung eines Trägers, wie Kieselgel, Aluminiumoxid oder Puller-Erde. Diese Verfahren können gegebenenfalls zusammen und/oder wiederholt angewendet werden.

Der Tritylester kann durch Kristallisation aus einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch, wie Benzol, Toluol, Xylol, Essigsäureäthylester, Diäthylather, Methylenchlorid,, Chloroform, Hexan und/oder Petroläther (Siedebereich 30 bis 60⁰C), weiter gereinigt werden.

Unter den Estern der allgemeinen Formel i-b,die nach den vorstehenden Verfahren erhältlich sind, ist der Tritylester der Formel i-c

S-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₃

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(I-c)

einer der wertvollsten Ester, der durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet ist: Er ist im Vergleich zum Antibiotikum PS-5 der Formel I-a stabiler, so daß seine Isolierung leichter ist; er zeigt eine starke antibiotische Wirkung sowie eine starke ß-Lactamase-Hemmwirkung. Demgegenüber zeigen die Tritylester von bekannten Penicillinen keine wesentliche antibiotische Aktivität. Ferner ist der Tritylester der Formel I-c wertvoll als aktiver Ester und ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung anderer wertvoller Derivate, da die Tritylgruppe leicht abgespalten werden kann.

Die physiko-chemischen und biologischen Eigenschaften des Tritylesters des Antibiotikums PS-5 sind nachstehend zusammengestellt.

Physiko-chemische Eigenschaften des Tritylesters des Antibiotikums PS-5

A) Schmelzpunkt

Der Tritylester schmilzt bei 83 bis 88⁰C. Der Schmelzpunkt wird in diesem Fall nach dem Kofier-Verfahren bestimmt, wobei der Temperaturanstieg 1⁰C pro Minute beträgt.

B) UV-Absorptionsspektrum 25 ^2ä°^H = 315,5 nm

C) IE-Absorptionsspektrum

Nachstehend sind die charakteristischsten Absorptionsmaxima in Chloroformlösung angegeben: 34-30, 31ΟΟ-3ΟΟΟ, 2990, 2950, 1770, 1695, 1665, 1445, 134-0, 1275 und 1139 cm"¹.

D) Löslichkeit

Die Verbindung ist in Wasser, Hexan und Petroläther (Siedebereich 30 bis 6O⁰C) praktisch unlöslich. Sie ist löslich 35

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in Benzol, Essigsäureäthylester, Chloroform, Aceton und Dimethylsulfoxid.

E) Farbreaktionen

Ehrlich positiv

Triphenyltetrazoliumchlorid negativ

Eisen(III)-chlorid negativ

Jodplatinat .positiv Hydroxylamin-Eisen(III)-chlorid positiv

Chlor-o-Tolidin positiv

Ninhydrin negativ

F) Farbe der Verbindung: farblos

G) Dünnschichtchromatographie (TLC)

Nachstehend sind die R~-Verte unter Verwendung der angegebenen Dünnschichtplatten und Lösungsmittel zusammengestellt:

(a) "Chromagram Sheet Ήτ. 6065"(Eastman Kodak Co.)

Obere Phase von n-Butanol/Äthanol/Vasser (VV5)

IsopropanolA'asser (8/7) n-Butanol
Isopropanol/V^rasser (1/4)

(b) Mit Kieselgel vorbeschichtete Platten (E.Merck) Benzol/Aceton (2/1)

R_f = 0,56 R_f = 0,91 R_f = 1,0
IU = 1,0

0,29

H) Prοtonen-MMR-Spektrum

Das MMR-Spektrum bei 100 MHz des Tritylesters in CDCl, 3Q zeigt folgende charakteristische Signale:

I) Ein bei etwa 1,10 ppm zentriertes Triplett mit Kopplungskonstanten von etwa 7»0 Hz;

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II) Singulett in der Nähe von 1,86 ppm;

III) Multiplett bei etwa 7,0 bis 7,67 ppm.

Die vorstehend angegebenen physiko-chemi sehen Eigenschaften stehen mit der Strukturformel I-c in Einklang.

Insbesondere bestätigen die nachstehend angegebenen Tatsachen, dass es sich bei dem Tritylierungsprodukt des Antibiotikums PS-5 um einen Ester handelt:

(I) Die breite IB-Absorption der -COO ^ -Gruppe bei etwa 1640 bis 1540 cm~ , die beim IR-Spektrum des Hatriumsalzes des Antibiotikums PS-5 auftritt, wird beim entsprechenden Spektrum des Tritylesters nicht beobachtet. Dafür ergibt die Tritylestergruppe eine scharfe Absorption der -CO-Gruppe eines Esterrests bei etwa 1695 cm

II) Das Antibiotikum PS-5 kann mit Lösungsmitteln aus neutralen oder schwach alkalischen wäßrigen Lösungen praktisch nicht extrahiert werden, während der Trity!ester leicht extrahierbar ist.

III) Das UV-Absorptionsmaximum des Antibiotikums PS-5 liegt bei 301 nm, während das Maximum des Trity!esters bei 315,5 nra liegt. Die Verschiebung wird auch beim N-Acetyl-thienamycinmethylester beobachtet.

Biologische Eigenschaften des Tritylesters des Antibiotikums PS-5

(1) Antibiotisches WirkungsSpektrum

Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 zeigt ein breites antibiotisches VirkungsSpektrum insbesondere gegen verschiedene gram-positive Bakterien, beispielsweise der Gattungen Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina und Bacillus, und gegen gram-negative Bakterien, beispielsweise der Gattungen Alcalxgenes und Comamonas.

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Ferner zeigt er eine gute Aktivität gegen

gram-negative Bakterien der Gattungen Esch.erich.ia, Klebsiella und Proteus. Eine "bemerkenswerte Eigenschaft dieser Verbindung ist die starke Aktivität gegen gramnegative Bakterien, die gegenüber Antibiotika mit ß-Laetamringstruktur resistent sind, beispielsweise gegen Bakterien der Gattungen Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella und Serratia.

(2) Steigerung der antibiotischen Aktivität von anderen Antibiotika gegen ß-Lactamase bildende Bakterien

Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 ist ferner in der Lage, die antibiotische Aktivität von anderen Antibiotika, insbesondere von ß-Lactam-Antibiotika, wie Penicillinen und Cephalosporinen, gegen ß-Lactamase bildende Bakterien, beispielsweise Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens, zu erhöhen.

(3) in vivo-Aktivität

Bei der Behandlung von mit pathogenen, gram-positiven Bakterien infizierten Mäusen hat der Tritylester des Antibiotikums PS-5 eine signifikante Schutzwirkung.

(4) Toxizität

Bei intraperitonealer Verabfolgung des Tritylesters an Mäuse in Dosen von 500 mg/kg werden keine Todesfälle beobachtet .

Das Antibiotikum PS-5 und seine Derivate, insbesondere der Tritylester, sind wertvolle Arzneistoffe, die zur Bekämpfung bakterieller Infektionen in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden können.

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Das Antibiotikum PS-5 oder dessen Tritylester und Arzneipräparate mit einem Gehalt an diesen Wirkstoffen können oral, lokal oder parenteral, beispielsweise intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal, verabfolgt werden. Die Wirkstoffe können in Forn von üblichen Arzneipräparaten, je nach Art der Anwendung vorliegen. Beispielsweise kann das Antibiotikum PS-5 oder dessen Tritylester mit einem pharmakologisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder ähnlichen Zusatzstoffen zu festen Präparaten, beispielsweise Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, mit Zucker überzogenen Tabletten, Pastillen, pulverförmigen Spritzmitteln und Suppositorien, zu halbfesten Präparaten, beispielsweise Salben, Cremes und halbfeste Kapseln, oder zu flüssigen Präparaten, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Lotionen, Sirups, Injektionslösungen und flüssige Spritzmittel, verarbeitet werden.

Einheitsdosen mit einem Gehalt am Antibiotikum PS-5 oder dessen Tritylester enthalten im allgemeinen 0,1 bis 99 Gewichtsprozent Wirkstoff in flüssiger, halbfester oder fester Form. Spezielle Beispiele für Trägerstoffe, Füllstoffe und Verdünnungsmittel, die zur Herstellung der erfindungsgemässen Präparate verwendet werden können sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Präparate sind nachstehend angegeben; Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können in Form von Einheitsdosis-Präparaten vorliegen und Bindemittel, wie Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Traganth und Polyvinylpyrrolidon» Füllstoffe, wie Lactose, Saccharose, Stärke, Calciumphosphat, Sorbit und Glycin, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol und Siliciumdioxid,, Spreng-

^L 80 9 842/0711

mittel, wie Kartoffelstärke und/oder Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können nach bekannten "Verfahren dragiert werden. Flüssige Präparate für die orale Gabe liegen beispielsweise in Form von öligen oder wässrigen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen oder Sirups vor und können als Trockenpräparate zur Verfügung gestellt werden, die vor ihrer Verwendung mit Wasser oder anderen entsprechenden Trägermitteln angesetzt werden. Diese flüssigen Präparate zur oralen Verabfolgung können folgende pharmakologisch verträgliche Zusatzstoffe enthalten: Suspendiermittel, wie Methylcellulose, Sorbitsirup, Zuckersirup, Hydroxyäthylcellulose, Gelatine, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel und hydrierte Speisefette und -öle, Emulgiermittel, wie Lecithin aus Akazien und Sorbitanmonooleat, nicht-wässrige Trägerstoffe, wie Äthanol, Propylenglykol, ölige Ester, fraktioniertes Kokosnussöl und Mandelöl, und Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäuremethylester, p-Hydroxybenzoesäurepropylester und Sorbinsäure .

Suppositorien können übliche Suppositoriengrundstoffe, wie Kakaobutter und verschiedene Glyceride, enthalten.

Injektionspräparate können in Einheitsdosen

in Ampullen oder in Mehrfachdosen-Behältern unter Verwendung eines Konservierungsmittels hergestellt werden. Sie können in Form von Suspensionen, Lösungen und Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägerstoffen vorliegen und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe, wie Suspendiermittel, Dispergiermittel und Stabilisatoren, enthalten. Ferner können die Antibiotika der Erfindung in Form von Pulvern zur Verfügung gestellt werden, die vor ihrer Verwendung mit pyrogenfreiem, sterilem Wasser vermischt werden.

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Präparate mit einem Gehalt an dem Antibiotikum PS-5 oder dessen Tritylester können in verschiedenen Formen zur Verfügung gestellt werden, die sich für eine Absorption durch Schleimhautmembranen von Hase, Rächen oder Bronchien eignen. Beispielsweise sind pulverförmige oder flüssige Spritzmittel, Inhalationsmittel, Pastillen und Mittel zum Auspinseln des Rachens für diese Zwecke geeignet. Zur Behandlung von Ohren und Augen können die Antibiotika der Erfindung beispielsweise zu Einzelkapseln oder Tropfen in flüssiger oder halbfester Form verarbeitet werden. Für lokale . Anwendungszwecke können die Präparate in hydrophilen oder hydrophoben Grundlagen, beispielsweise Pulvern, Lotionen, Cremes oder Salben, vorliegen.

Gegebenenfalls können die Präparate neben

einem Trägerstoff auch andere Bestandteile enthalten, wie Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, Gleitmittel, Viskosität smittel, Aromastoffe, Suspendiermittel, Bindemittel und Stabilisatoren.

Wenn das Antibiotikum PS-5 und/oder dessen Tritylester für die Behandlung von Infektionen bei Tieren, wie Schweinen, Rindern, Schafen und Hühnern, gedacht sind, können sie beispielsweise in Form von intramammären Präparaten in Grundlagen, die eine Langzeitwirkung oder eine rasche Freisetzung erlauben, oder als Konzentrate für den Zusatz zu Futtermitteln vorliegen.

Die vorerwähnten pharmakologisehen Präparate der Erfindung können das Antibiotikum PS-5 und/oder dessen Tritylester als alleinigen Wirkstoff oder zusammen mit anderen therapeutisch wirksamen Bestandteilen enthalten.

Wie vorstehend eingehend erläutert, wird das Antibiotikum PS-5 und dessen Tritylester aufgrund seiner synergistischen Wirkung mit ß-Lactam-Antibiotika ■ gegenüber verschiedenen ß-Lactamase

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bildenden Bakterien in Arzneipräparaten vorzugsweise mit ß-Lactam-Antibiotika kombiniert. Beispiele für derartige ß-Lactam-Antibiotika sind Penicilline, wie Benzylpenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Carbenicillin, Ampicillin und Amoxycillin, und Cephalosporin-Derivate, wie Cephaloridin, Cephalotin, Cefazolin, Cephalexin, Cefoxitin, Cephacetril, Cephamandol, Cephapirin, Cephradine und Cephaloglycin.

Wenn das Antibiotikum ΡΞ-5 und/oder dessen Tritylester mit -ΙΟ einer oder mehreren der vorerwähnten ß-Lactam-Antibiotika kombiniert wird, ist das Mengenverhältnis von erfindungsgemäßem Antibiotikum zum ß-Lactam-Antibiotikum nicht kritisch und kann innerhalb eines breiten Bereichs variieren. Aus praktischen Gesichtspunkten ist es zweckmäßig, das Mengenverhältnis von Antibiotikum der Erfindung zu ß-Lactam-Antibiotikum im Bereich von 20:1 bis 1:150 und vorzugsweise im Bereich von 10:1 bis 1 : 100 zu wählen.

20 Bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei

Tieren kann die Dosis des Antibiotikums PS-5 und/oder von dessen Tritylester je nach Art des zu behandelnden Tieres des Körpergewichts, der Art, der Schwere und Symptome der Infektionen und der Art und Anzahl der Verabfolgungen variieren.

PUr übliche orale oder parenterale Verabfolgungen beträgt die Dosis vorzugsweise 0,05 "bis 500 mg/kg, und insbesondere 0,5 bis 200 mg/kg, wobei insbesondere die Verabfolgung von unterteilten Dosen bevorzugt ist. Selbstverständlich können auch Dosen, die unterhalb des vorstehend empfohlenen Bereichs liegen, verwendet werden, was vom Zustand des zu behandelnden Säuge-• tiers abhängt.

Das Antibiotikum PS-5 und/oder dessen Tritylester können nicht nur in Arzneipräparaten verwendet werden, wie 35

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vorstehend erläutert ist, sondern sie können auch direkt oder als Konzentrate zu Futtermitteln für Tiere zugesetzt werden. Ausserdem können sie als Wirkstoffe für die Konservierung oder Desinfektion von Futtermitteln verwendet werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In allen Beispielen werden die quantitativen und qualitativen Bestimmungen der antibiotischeri .- Aktivität nach, folgenden Verfahren durchgeführt:
(Ό Biologische Bestimmungsmethode .

Auf Nähragar-Schrägröhrchen wird Comamonas terrigena B-996 etwa 16 Stunden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wird in einer Nährbrühe suspendiert, so dass sich eine optische Dichte von 0,040 bei 610 nm ergibt. Diese Anzuchtsuspension wird in einer Menge von 1 Prozent zu einem geschmolzenen Agar-Medium mit einem Gehalt an 0,8 Prozent Kyokuto-Nährbrühepulver und 1,0 Prozent Bacto-Agar (Difco-Laboratories) gegeben. 7 ^ml der Anzuchtkultur auf dem geschmolzenen Agar-Medium werden in einer Petrischale von 9 cm Durchmesser verteilt und erstarren gelassen. Diese Platte wird als Comamonas-Bestimmungsplatte bezeichnet.

Staphylococcus aureus EDA 2O9P wird etwa 16 Stunden in einer Nährbrühe unter Schütteln gezüchtet und auf die 50-fache Menge in Nährbrühe verdünnt. Die erhaltene Anzuchtsuspension wird in einer Menge von 1 Prozent ("Vol/Vol.) mit geschmolzenem Agar-Medium mit einem Gehalt an 1 Prozent Kyokuto-Nährbrühepulver und 1 Prozent Bacto-Agar versetzt und gründlich vermischt. Jeweils 7 ml der Anzuchtkultur in geschmolzenem Agar-Medium werden in eine Petrischale von 9 cm Durchmesser gegossen und erstarren gelassen. Diese Platte wird als Staphylococcus-Bestimmungsplatte bezeichnet.

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— ÜT> —

Auf ähnliche Feise wird eine Alcaligenes-Bestimmungsplatte hergestellt. Dienach etwd 16 Stunden erhaltene Nähragar-Schräg- fvon. Alealigenes faecalis B-326 wird in Nährbrühe suspendiert. Die Zellenkonzentration der erhaltenen Anzuchtsuspension wird auf eine optische Dichte von 0,020 bei 6Ί0 mn eingestellt. Sodann wird Agar-Medium mit einem Gehalt an 0,5 Prozent Kyokuto-Nährbrühepulver und 1,0 Prozent Bacto-Agar bei der zulässigen Temperatur geschmolzen und mit 1,0 Prozent Inoculum der Anzucht suspension beimpft. 7 ml des beimpften geschmolzenen Agar-Mediums werden in eine Petrischale von 9 cm Durchmesser gegeben und erstarren gelassen. Diese Platte wird als

Alcaligenes-Bestimmungsplatte bezeichnet.

Eine Zellstoffscheibe von 8 mm Durchmesser wird

. mit der zu bestimmenden Probenlösung angefeuchtet, zur Entfernung von überschüssiger Lösung auf ein sauberes Blatt Filterpapier gelegt und anschliessend auf die Bestimmungsplatte übertragen. Hach 20-stündiger Inkubation bei 35°C wird der Durchmesser der beobachteten Hemmzone gemessen und mit Eichlösungen von Cephaloridin verglichen. Die

Aktivität des Antibiotikums PS-5 und der entsprechenden Derivate wird iⁿ Form von Cephaloridin-Äquivalenteinheiten/ml angegeben.

Eine Lösung des Antibiotikums PS-5 oder von dessen Derivaten, die den gleichen Durchmesser der Hemmzone wie 100 ^ug/ml Cephaloridin zeigen, weist somit 100 Cephaloridin-Einheiten/ml auf. Venn in ähnlicher Weise eine feste Probe des Antibiotikums PS-5 oder von dessen Derivaten bei einer Konzentration von Λ mg/ml den gleichen Durchmesser wie 1 jig/ml Cephaloridin ergibt, beträgt die spezifische Aktivität der festen Probe 1 Cephaloridin-Einheit/mg. Bekanntlich variiert die zur Bestimmung verwendete Eichkurve in gewissem Umfang, je nach Art des zur Untersuchung verwendeten Mikro—

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Organismus. Um dies zu berücksichtigen werden die nachstehenden Ausdrücke für die Aktivitätseinheiten verwendet: Comamonas-Cephaloridin-Einheit (kurz CCU); Staphylococcus-Cephaloridin-Einheit (kurz SCU) und Alcaligenes-Cephaloridin-Einheit (kurz ACU).

(2) Bioautographie

Eine grosse Bestimmungsplatte wird gemäss den vorstehenden Ausführungsformen unter (1) hergestellt, mit der Abänderung, dass 100 ml des beimpften, geschmolzenen Agarmediums in ein rechteckiges Gefäss der Abmessungen 32x24- cm und nicht in eine Petrischale von 9 cm Durchmesser gegossen werden.

Ein zu bestimmendes Papierchromatogramm wird 15 Minuten auf diese grosse Bestimmungsplatte gelegt. Nach dem Entfernen des Papiers wird die Bestimmungsplatte zur Ermittlung der Hemmzonen 20 Stunden bei 35°C inkubiert. Dieses Verfahren erlaubt nicht nur die Berechnung der R~- Verte (qualitative Bestimmung), sondern auch die Bestimmung der anti biotischen Aktivität (halbquantitatives Verfahren) unter Zugrundelegung der Grosse des gebildeten Hemmhofs.

Bei Verwendung von Dünnschichtplatten wird ein Blatt dünnes Papier zwischen die Dünnschichtplatte und die Oberfläche der Bestimmungsplatte gelegt. In entsprechender Weise wird bei qualitativen und halbquantitativen Be^- stimmungen verfahren.

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Γ ... Π

•j Beispiel 1

Ein 500 ml fassender Erlenmeyer-Kolben, der das Medium für die Anzuchtkultur (SE-4) der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthält, wird 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Eine Schrägkultur von Streptomyces sp. A271 mit guter Sporenbildung und 10 ml einer 0,02prozentigen Lösung von Polyoxyäthylensorbitanmonooleat werden zugegeben. Das Gemisch wird zur Herstellung einer Sporensuspension leicht gerührt. Sodann wird der?5"ooⁿm?-Erlenmeyer-Kolbens mit 1 ml dieser Sporen suspension beimpft und 48 Stunden auf einem Drehschüttler (200 U/min, Radius 3,5 cm) bei 28⁰C gezüchtet. Sodann werden jeweils 2 ml der Anzuchtkultur auf sechs 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml des Herstellungsmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthalten, überimpft und auf einem

15 Drehschüttler 48 bis 96 Stunden bei 28⁰C gezüchtet.

Anzuchtmedium (SE-4) ι

Eindfleischextrakt (Difco Laboratories) 0,3 % (Gew./Vol.) \

20 Bacto-Trypton (Difco Laboratories) 0,5

Glucose 0 1

lösliche Stärke 2,4

Hefeextrakt 0,5

Calciumcarbonat 0 4

25 entfettetes Sojabonnenmehl 0,5

pH-Wert vor der Sterilisation 7,5; nacn der Sterilisation 7,1; nach 2-tägiger Züchtung 7,4

produktion smedium

30 ~~~————^—- .

(1) AG-1-Medium

^⁰⁰³⁶⁵ 1,5 % (Gew.AoI.) !

Maisstärke 2,5 :

Maisquellflüssigkeit 2,0 35

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Trockenhefe 1,0 % (Gew. /Vol. )

D ,L-Methionin 0, 1

CoCl₂.6H₂O 0,00013

pH-Wert vor der Sterilisation 7,2; nach der Sterilisation 6,1; nach. 4-tägiger Züchtung 7,8.

(2) AGA-2-Medium . .

Glucose 1,5 % (Gew./Vol.)

Kartoffelstärke 2,5

Maisquellflüssigkeit 2,0

Trockenhefe 1,0

CoCl₂.6H₂O 0,00013

pH-Wert vor der Sterilisation 6,5; nach der Sterilisation 5,8; nach 4-tägiger Züchtung 7,8.

(3) AGB-1-Medium

Maltose 3,0 % (Gew./Vol.)

Maisquellflüssigkeit 1,0

Trockenhefe 1,0

CoCl₂.6H₂O 0,0001

pH-Wert vor der Sterilisation 6,5, nach der Sterilisation 5,9j nach 4-tägiger Züchtung 7,9·

(4) AGB-41-Medium

Maltose 5,0 % (Gew./Vol.)

lösliche Stärke 1,0

Glycerin 0,3

Trockenhefe 2,5

HaCl 0,5

K₂HPO₄ 0,05

MgSO₄.7H₂O 0,05

CaCO₃ 0,3

CoCl₂.6H₂O 0,00013

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-44- 2813322

pH-Wert vor der Sterilisation 7,0; nach, der Sterilisation 6,9; nach. 4-tägiger Züchtung 7,9·

(5) ML-19-Medium %

Glycerin 4,0 (Gew.AoI.)

Pepton 0,5

Glucose 0,2

Kartoffelstärke 0,2

entfettetes Sojabohnenmehl 0,5

Trockenhefe 0,5

NaCl 0,5

CaGO_x 0,2 D

pH-Wert vor der Sterilisation 6,4; nach der Sterilisation 7,0; nach 4-tägiger Züchtung 7,0.

(6) AGO-1-Medium

Sojabohnenöl 3,0 % (Gew./Vbl.)

Trockenhefe 2,0

NaCl 0,5

K₂HPO₄ 0,05

MgSO₄.7H₂O 0,05

CaCO₅ 0,3

CoCl₂.6H₂O 0,00013

pH-Wert vor der Sterilisation 7,0; nach der Sterilisation 7,2; nach 4-tägiger Züchtung 7,2.

Der Antibiotikumgehalt des Gärbrühenfiltrats wird nach dem vorstehend erläuterten Blättchentest unter Verwendung von Comamonas terrigena B-996, Staphylococcus aureus 209P und Alealigenes faecalis B-326 bestimmt. Die 72 Stunden nach der Überimpfung beobachteten Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

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Tabelle V

antibiotische Wirksamkeit Medium CCU/ml SCU/ml ACU/ml

AG-I 105 1,1 420

AGA-2 72

AGB-I 105

AGB-41 185

ML-I9 ■ 60

AGO-I 67

V	420
0,9	340
8,9	440
1,4	122
0,9	340

Beispiel2

100 ml der gemäss Beispiel 1 hergestellten Anzuchtkultur werden in einen 30 Liter fassenden 3?ermenter mit einem Gehalt an 15 Liter ML-19-Medium übertragen "und 96 Stunden unter Zwangsbelüftung bei 28°C und 200 U/min gezüchtet, wobei 7,5 Liter/min sterile Luft zugeführt werden. Ein Siliconöl (Silicone EM-75 ) „wird als

Antischaummittel in einer Konzentration von 0,05 Prozent verwendet. Die Gärbrühe wird gewonnen und zu den angegebenen Zeitpunkten zentrifugiert. Der Antibiotikumgehalt der Gärbrühe ist nachstehend angegeben.

	Tabelle VI	pH-Werte
Zeit	Wirksam keit (CCU/ml)	7;0 7,2 7,1 7,0
24 Std. 48 72 96	19 48 72 59

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Beispiel 3

Gemäss Beispiel 1 wird Streptomyces sp. A271 in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 100 ml SE-4-Medium gezüchtet und anschliessend in einen 30 Liter-Fermenter mit einem Gehalt an 15 Liter SE-4-Medium überimpft. Nach 24-stündiger Züchtung "bei 28°C und 200 U/min unter einer Zwangsbelüftung von 7,5 Liter/min wird 1 Liter der Anzuchtkultur in einen 200 Liter fassenden Tankfermenter aus korrosionsbeständigem Stahl mit einem Gehalt an 100 Liter ML-19-Medium gegossen. Der Tankfermenter wird 72 Stunden bei 28⁰C mit einer Geschwindigkeit von 100 U/min gerührt, wobei eine Belüftungsgeschwindigkeit von 50 Liter/min aufrechterhalten wird. Der ursprüngliche pH-Wert beträgt 7,0 und der endgültige pH-Wert 7,1· Die Gärbrühe wird sodann mit 5 Prozent

(Gew../Vol.) Perlit als Filterhilfe vermischt und durch eine Filterpresse filtriert, wobei man 80 Liter Gärbrühenfiltrat erhält. Der Antibiotikumgehalt der klaren Flüssigkeit beträgt 60 CCü/ml.

Beispiel 4 Herstellung des Aktivkohlekonzentrats

Man verfährt wie in Beispiel 1 und inkubiert sodann zehn 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt von jeweils 100 ml ML-19-Medium 72 Stunden unter Schütteln. Die vereinigte Gärbrühe wird mit 2 Prozent (Gew./Vol.) Perlit als Filterhilfe versetzt und durch einen Büchner-Trichter filtriert. Man erhält 800 ml Gärbrühenfiltrat. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 7 bis 8 werden 16 g Aktivkohle zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren wird die Aktivkohle abzentrifugiert, mit 800 ml destilliertem Wasser gewaschen und sodann zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltene beladene Aktivkohle wird mit 400 ml 50prozentigem (Vol./Vol.) Aceton unter Rühren 30 Minuten bei

Raumtemperatur eluiert. Die erhaltene überstehende Lösung (Eluat) mit einem Antibiotikumgehalt entsprechend

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- 4

52 CCU/ml wird bei 30 bis 35°C in einem Drehverdampfer auf 50 ml eingeengt. Der Antibiotikumgehalt des Konzentrats beträgt 800 CCU/ml.

Die nachstehenden Versuche werden durchgeführt, um sicherzustellen, daß sich das Antibiotikum PS-5 von Antibiotikum MM455O .(Komplex), das in den DE-OSen 2 513 855 und 2 513 als ß-Lactamase-Inhibitor beschrieben ist, unterscheidet.

Drei Stämme von Streptomyces-olivaceus ATCC 31126 (=ATCC 21379/M3), ATCC 21380 und ATCC 21382 werden 72 Stunden bei j 28°C auf einem Drehschüttler in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben j mit einem Gehalt an 100 ml des nachstehenden Mediums gezüchtet.;

Sojabohnenmehl 1,0

Glucose 2,0

CaCO₅ 0,2

CoCl₂.6H₂O 0,001

pH-Wert vor der Sterilisation im Autoklaven 7,0.

Die antibiotisch aktiven Substanzen in der filtrierten Gärbrühe werden an Aktivkohle adsorbiert. Die Aktivkohle wird mit Wasser gewaschen und mit 50prozentigem Aceton eluiert. Bas erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt und sodann der absteigenden Papierchromatographie unter den nachstehend angegebenen Bedingungen unterworfen.

30 Filter Papier: Toyo Filterpapier Nr. 50

Lösungsmittelsystem: (80% Acetonitril/Tris/EDTA) Acetonitril: 120 ml

0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-

aminomethan-HCl vom pH-Wert 7» 5: 30 ml

0,1 m Tetranatrium-äthylendiamin-

tetraacetat vom pH-Wert 7,5: 1 ml

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Die R_f-Werte werden durch Bioautographie unter den genannten Bedingungen mit Comamonas terrigena B-996 festgestellt.

Parallel mit den vorstehend erwähnten drei Stämmen von Streptomyces olivaceus, wird der erfindungsgemässe Stamm Streptomyces sp. A271 in einem Medium der nachstehenden Zusammensetzung gezüchtet: 4,0 % Glycerin, 0,2 % Glucose, 0,5 % . Pepton, 0,2 % Kartoffelstärke, 0,5 % entfettetes Sojabohnenmehl, 0,5 % Trockenhefe, 0,5 % NaCl und 0,2 % CaCO₅; pH-Wert 6,4 vor der Sterilisation im Autoklaven. Die anschließende Aufarbeitung und die biologische Bestimmung erfolgen auf die vorstehend beschriebene ¥eise.

Die bioautographischen Untersuchungen ergeben, dass das Antibiotikum PS-5, das erfindungsgemässe Produkt der Züchtung von Streptomyces sp. A271, sich von dem in den vorstehend erwähnten DE-OSen beschriebenen Antibiotikum MM455O (Komplex) unterscheidet.

Beispiel 5

Herstellung eines konzentrierten Eluats des Antibiotikums PS-5 Gemäß Beispiel 1 werden 15 Liter ML-19-Medium in 150 Flaschen 72 Stunden lang gezüchtet. Die gewonnene Gärbrühe wird mit 1OO mg Dinatrium-äthylendiamin-tetraacetat und 2 Prozent (Gew./Vol.) Perlit als Filterhilfe versetzt und durch einen großen Büchner-Trichter filtriert. Man erhält 14,1 Liter Gärbrühenfiltrat vom pH-Wert 7,9. Dieses FiItrat wird auf eine mit perlenförmigem hochporösem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit Makronetzstruktur Diaion HP20 gepackten Säule der Abmessungen 7x50 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit 7 Liter destilliertem Wasser gewaschen und mit 50prozentigem (Vol./Vol.) Methanol eluiert. Das Elutionsverhalten der anti-

^⁵ biotischen Aktivität ist nachstehend zusammengestellt:

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_ 4.9 -

Tabelle VII

Aufgesetzte Aktivität: 40 CCU/ml χ 14 000 ml

Eluatfraktion	Volumen (ml)	Wirksamkeit	; (CCU/ml)	150 i
1	1Ό00	0		270
2	500	0		850
3	500	0		870
4	50	19		300
5	50	37		270
6	50	72		230
7	50	200
8	50	170
9	50	125
10	50	105
11	50	87
12	50	75
13	50	60
14	50	48
15	50	38
16	50	27
17	50	18.
18	50	14
19	50	10
20	50
21	50
22	50
23	50
24	50
25	50
26	50
27	50
28	50
29	50
0
0
0

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Die Eluatfraktionen 8 bis 14 werden vereinigt, bei einer Temperatur unter 30°C in einem Drehverdampfer auf 100 ml eingeengt und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 2,6 g eines gelbstichig-braunen Pulvers, dessen Antibiotikumgehalt 54 CCU/mg entspricht. Dieses gelbstichig-braune Pulver wird in so viel destilliertem Wasser gelöst, daß die Konzentration 500 CCü/ml beträgt.

Sodann werden Phosphatpuffer der nachstehend angegebenen pH-Werte hergestellt, indem man 1/15 m Dikaliumphosphat mit 5 η NaOH oder 5 n Phosphorsäure auf den gewünschten pH-Wert einstellt. 1 ml der Lösung des Antibiotikums PS-5 wird mit 1 ml Phosphatpuffer versetzt. Gegebenenfalls wird sodann der pH-Wert wieder auf den ursprünglichen Wert eingestellt. Die Lösungen des Antibiotikums PS-5 von unterschiedlichen pH-Werten werden 30 Minuten in ein Wasserbad von 60⁰C gestellt, sodann in laufendem Wasser gekühlt und mit einer geringen Menge 5 e. NaOH oder 5 n Phosphorsäure auf den pH-Wert 7,0 neutralisiert. Ein Kontrollreagenzglas mit einem Gehalt der Lösung des Antibiotikums PS-5 vom pH-Wert 7,0 wird 30 Minuten in ein Eisbad gestellt. Die verbleibende antibiotische Aktivität wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt, wobei als Testkeim Comamonas terrigena B-996 verwendet wird. Nachstehend sind die prozentualen Restaktivitäten, bezogen auf die Kontrolle, angegeben.

pH-Wert	3,0	4,0	5	,0	6	,0	7	,0	8	,0	9	,0
Restaktivi
tät (%)	0	0	9	,0	79	,0	76	,5	88	,5	82	,0

Die Ergebnisse zeigen, dass das gemäss diesem Beispiel erhaltene gelbstichig-braune Pulver im pH-Bereich von 6,0

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"bis 9,0 30 Minuten bei 60⁰C relativ stabil ist. Ferner scheint die Stabilität des Antibiotikums PS-5 bei niedrigeren Temperaturen auch bei sauren pH-Werten anzusteigen. Beispielsweise behält das Antibiotikum PS-5 nach 5-^in-ütiger Behandlung bei -17°C beim pH-Wert 3,0 mindestens 30 Prozent seiner ursprünglichen antibiotischen Aktivität.

Beispiel 6

Extraktion bei niedrigen Temperaturen mit n-Butanol Ein grosses Reagenzglas mit einem Gehalt an 20 ml destilliertem ¥asser, 12 ml n-Butanol und 7 g Natriumchlorid wird ohne Einfrieren auf -17°C abgekühlt. Das gemäss Beispiel 5 erhaltene Antibiotikum PS-5 in Form eines gelbstichig-braunen Pulvers wird in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 200 mg/ ml verdünnt und sodann vorgekühlt. 1 ml der kalten Lösung des Antibiotikums PS-5 werden in das genannte Reagenzglas gegeben und rasch mit Schwefelsäure auf die pH-Werte 2,75» 3,0 oder 3,25 eingestellt, wobei die Temperatur des Gemisches unter -10⁰C gehalten wird. Nach gründlichem Mischen wird die n-Butano!phase gewonnen und gründlich mit 5 ml 0,5 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 vermischt, wobei die aktive Komponente in' die xvässrige Phase übergeht. Die biologische Bestimmung der /Lösung ergibt die nachstehend angegebene Extrahierbarkeit des Antibiotikums PS-5 aus dem gelbstichig-braunen Pulver:

pH-Wert prozentuale Extraktion

35 %

16

2	,75
3	,00
3	,25

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Beispiel 7

Herstellung des QAE-Sephadex-Pulvers

Gemäss Beispiel 5 werden 27,7 g Antibiotikum PS-5 in Form eines gelbstichig-braunen Pulvers aus 100 Liter Gärbrühefiltrat nach/Gefriertrocknung erhalten. Dieses Pulver mit einer spezifischen Aktivität von 13,2 CCTJ/mg wird in 30 ml 25 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 gelöst und auf eine mit QAE-Sephadex A-25 (vollständig quaternisiertes, stark basisches Anionenaustauscherharz, das durch. Einführung von Diäthyl-2-hydroxypropylammoniumgruppen in Dextrangel erhalten worden ist) gepackte Säule der Abmessungen 3,3 x 25,0 cm aufgesetzt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Nach dem Vaschen mit einer geringen Menge des gleichen Phosphatp'uf f ers wird das Antibiotikum mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an Natriumchlorid, dessen Konzentration während der Elution linear von 0 bis 0,5 m ansteigt, eluiert. Die aktive Fraktion (300 ml) wird auf 0⁰C abgekühlt und mit 6 g Aktivkohle behandelt. Die Aktivkohle wird gewonnen, mit V/asser gewaschen und mit 50prozentigem (Vol./vol.) Aceton eluiert. Nach dem Entfernen des Acetons durch Eindampfen bei Temperaturen unter 30⁰C erhält man durch Lyophilisation 727 mg des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 in Form eines braunstichig-gelben Pulvers. Die spezifische Aktivität dieses Präparats beträgt 264 CCII/mg.

Beispiele

Herstellung des DEAE-Cellulose-Pulvers Das gemäss Beispiel 7 in Form eines braunstichig-gelben Pulvers erhaltene Antibiotikum PS-5 (727 mg) wird in 1 ml 25 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 gelöst und auf eine mit Biogel P-2 (Gelperlen aus einem vernetzten Methylen-bis-acrylamid-Copolymerisat) gepackte Säule der Abmessungen 1,5 χ 27,0 cm, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert

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worden ist, aufgesetzt. Each Elution mit dem gleichen Phosphatpuffer erhält man 15 ml einer aktiven Fraktion. Diese aktive Fraktion wird sodann auf eine mit Diäthylaminoäthyl · cellulose DE32 gepackte Säule der Abmessungen 2,5 χ 28,0 cm, die vorher mit dem gleichen Phosphatpuffer äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Die Elution wird mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0 "bis 0,5 m in dem genannten Phosphatpuffer durchgeführt. Die gewonnene aktive Fraktion (240 ml) wird bei 0⁰C an 4,5 g Aktivkohle adsorbiert. Die Ä^xvkohle .wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und mit 50prozentigemAceton (Vol./Vol.) eluiert. Das Acetoneluat wird unterhalb 3O°C eingedampft, bis sich kein Aceton mehr nachweisen lässt. Anschliessend wird lyophilisiert. Man erhält 120 mg Eatriumsalz des Antibiotikums PS-5 in Form eines braunstichig-weissen Pulvers. Die spezifische Aktivität dieses Präparats beträgt 600 CCü/mg.

Beispiel 9

Herstellung eines hochgereinigten Präparats des Antibiotikums PS-5

Zwei 200 Liter fassende Fermentationstanks aus korrosionsbeständigem Stahl werden gemäß Beispiel 3 mit jeweils 100 Liter ML-19-Medium mit einem Gehalt an 2,5 Prozent entfettetem Sojabohnenmehl gefüllt, unter Druck sterilisiert und mit Streptomyces sp. A271 beimpft. Die Züchtung wird 72 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Inhalte der beiden Fermentationstanks werden vereinigt, mit 5 Prozent (Gew./Vol.) Perlit als Filtrierhilfe vermischt und durch eine Filterpresse filtriert. Man erhält 160 Liter Gärbrühenfiltrat. Der Antibiotikumgehalt dieses Filtrats beträgt 235 CCü/ml. Dieses Gärbrühenfiltrat wird auf eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz mit vernetzter Polystyrolmatrix und Trimethylammoniumchloridgruppen (Diaion PA-306) gepackte Säule der Abmessungen 10 χ 52 cm (Volumen in feuchtem Zustand 4,5 Liter) gegeben, ohne auf

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dieser Säule festgehalten zu werden. Anschließend wird die durch diese Säule geleitete Aktivität an einer mit 15 Litern perlenförmigem hochporösem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit MakronetzStruktur (Diäiön HP-20)" gepackten Säule der Abmessungen 14 χ 97 cm adsorbiert und mit 75piOzentigem Methanol eluiert. Das gesammelte aktive Eluat (2 Liter mit 9854 CCU/ml) wird 3 mal mit 4 Liter Wasser verdünnt und auf eine 2 Liter-Säule von Diaion PA-306S der Abmessungen 5,5 x 84 cm aufgesetzt. Nach. Waschen mit 500 ml Wasser wird die antibiotische Aktivität mit 8 Litern eines linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 3 Prozent eluiert und in Fraktionen von 200 ml Volumen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 17 bis y\ v/erden zu 2,8 Liter aktivem Eluat (4120 CCU/ml) vereinigt. Dieses Eluat wird sodann auf eine mit 1 Liter Diaion HP-20 gepackte Säule der Abmessungen 4,5 x 63 cm aufgesetzt und mit 3 Liter eines linearen Acetongradienten von 0 bis 25 Prozent eluiert. Die Volumina der einzelnen Fraktionen betragen 30 ml. Das aktive Eluat (390 ml, 27 220 CCU/ml) wird durch Vereinigung der antimikrobiell aktiven Fraktionen Nr. 54 bis 66 gewonnen.

Nach dem Entfernen des Acetons durch Destillation unter vermindertem Druck wird das Diaion HP-20-Eluat über eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 gepackte Säule der Abmessungen 2,5 x

41 cm gegeben. Die antimikrobielle Aktivität wird nach Elution mit 2 Litern eines linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 1,5 Prozent in Fraktionen von 10 ml Volumen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 68 bis 81 werden als aktives Eluat (140 ml,

42 120 CCU/ml) vereinigt.

Dieses QAE-Sephadex A-25-Eluat wird mit Iprozentiger Natronlauge vorsichtig auf den pH-Wert 8,3 eingestellt und auf eine mit 200 ml Diaion HP-20 AG gepackte Säule der Abmessungen 2,5 χ cm aufgesetzt. Die Elution wird mit 1 Liter eines linearen, wässrigen Acetongradienten von 0 bis 10 Prozent durchgeführt.

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Das Fraktionsvolumen "beträgt 10 ml. Die Fraktionen Nr. 4-8 "bis 53 werden zu 60 ml eines aktiven Eluats (45 000 CCU/ml) vereinigt. Nach Gefriertrocknung erhält man 249 mg gelbes Pulver (8000 CGU/mg). Zur weiteren Reinigung werden 150 mg dieses gelben Pulvers in einer geringen Menge 0,01 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 gelöst und über eine mit 130 ml Sephadex G-10 (perlenförmiges Dextrangel, hergestellt durch Vernetzen von Dextranfraktionen mit Epichlorhydrin) gepackte Säule der Abmessungen 1,5 x 73 cm gegeben. Das Antibiotikum PS-5 wird mit 0,01m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 eluiert. Das Volumen der Eluatfraktionen beträgt 2 ml. Die Fraktionen Nr. 38 bis 55 ergeben 36 ml aktives Eluat (65 CCU/ml).

Das Sephadex G-10-Eluat wird an einer mit 100 ml QAE-Sephadex A-25 gepackten Säule der Abmessungen 2,0 χ 32 cm unter Verwendung von 1 Liter eines linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 1,5 % 3-ls Elutionsmittel chromatographiert. Das Fraktionsvolumen beträgt 10 ml. Die fünf aktiven Fraktionen Nr. 4-8 bis 52 werden zu 50 ml eines aktiven Eluats (22 000 CCU/ml) vereinigt.

Dieses aktive Eluat wird vorsichtig mit Iprozentigem NaOH auf den pH-Wert 8,3 eingestellt und auf eine mit 50 ml Diaion HP-20 gepackte Säule der Abmessungen 1,2 χ 44 cm aufgesetzt. Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 wird in 5 ml-Fraktionen durch Elution mit 400 ml eines linearen, wässrigen Acetongradienten von 0 bis 10 Prozent gewonnen. Die aktiven Fraktionen Nr. 39 t>is 41 werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält 51 mg weisses Pulver (21 000 CCU/mg).

Dieses spezielle Präparat des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 weist folgende physiko-chemisehen Eigenschaften auf:

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-1) Farbe: weiss

2) Löslichkeit:

Löslich in Wasser, praktisch unlöslich in Aceton

3) Zersetzungspunkt:

Bei Messung in einer Kofler-Mikroschmelzpunktsapparatur BY-1 mit einem Temperaturanstieg von 1°C/min zeigt dieses Präparat keinen klaren Schmelzpunkt. Es beginnt sich bei etwa 14-8⁰C gelb zu färben und erweicht allmählich oberhalb von 160⁰G. Bei etwa 2O3°C schlägt die Farbe des Präparats langsam von gelb nach braun um. Bei 220⁰C liegt ein braunes Harz vor.
4-) UY-AbsorptionsSpektrum.

60 ug des Katriumsalzes des Antibiotikums PS-5 werden in 3,0 ml Wasser gelöst und in einem Spektrophotometer mit Schreiber gemessen. Das aufgezeichnete Spektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben. Es ergeben sich folgende charakteristischen Werte:

^H2° = etwa 246 nm(£j °^/o -= 82,0) min

^H2° = etwa 301 nm(E^j °^/o = 267,5) max

Eine wässrige Lösung dieses Präparats (21 000 CCU/mg) in destilliertem Wasser wird mit einer Hydroxylaminlösung vom pH-Wert 7,5 versetzt, so dass sich ein Reaktionsgemisch, mit einem Gehalt an 21,3 ,ug/ml des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 und 10 millimolar Hydroxylamin ergibt. Wach. 30-minütigem Stehen bei 22°C verliert das Reaktionsgemisch etwa 94- Prozent seiner ursprünglichen optischen Dichte bei 301 nm.
5) IR-Soektrum

Das IR-Spektrum des Fatriumsalzes des Antibiotikums PS-5,

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aufgenommen als KBr-Pressling an einem IR-Spektrophotometer' ^{ist in Fi<}3- ² abgebildet. Es ergeben sich folgende charakteristische Absorptionsmaxima:

(I) etwa 1750 cm~¹ (-C0- im ß-Lactamring)

(II) etwa I65O cm~ (-C0- in der Amidbindung)

(III) etwa 1640 bis 154-0 cm"¹ (-C00 θ )

6) Protonen-jHMR-Spektrum

In Fig. 3 ist das Protonen-NMR-Spektrum des Eatriumsalzes des Antibiotikums PS-5 in D₂O, aufgenommen mit einem JEOL MMR-Spektrometer JNM PS-100, abgebildet. Es ergeben sich die folgenden charakteristischen Signale:

(I) bei etwa 1,06 ppm zentriertes Triplett (J = etwa 7,5 Hz) (CH₃-CH₂-)

(II) Multiplett im Bereich 1,72 bis 2,00 ppm (CH₃-CH₂)

(III) scharfes Singulett um 2,05 ppm (CH₃-CO-)

(IY) Multiple tts im Bereich von 2,88 bis 3,58 ppm (-CH₂-,

-CH-)

(V) Multiplett im Bereich von 3,9 "bis 4-,2O ppm (-CH-)

7) Farbreaktionen

Ehrlich - positiv

Jod-Chlorplatinsäure positiv Ninhydrin negativ

8) Spezifischer Drehwert

/~oc_7 p^ + 1,23 (c = 1,59, 0,01 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 8)

9) Dünnschichtchromatographie

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 wird unter den angegebenen Bedingungen der Dünnschichtchromatographie

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unterworfen. Die R~-Werte werden durch Bioautographie ermittelt.

(a) Avicel/SF-Cellulose-Dünnschichtplatten:

Lo* sungsmi tt e 1 sy s t em R^-Wert

n-Butanol/Äthanol/Vas s er

= 7/7/6 (Vol./Vol./Vol.) 0,94

IsopropanolA^asser -

7/3 (Vol./Vol.) 0,96

(b) Kieselgel-Dünnschichtplatte (mit Kieselgel vorbeschichtete Kieselgelplatte 60 ?254 ^^er ^i^rma ^. Merck, Darmstadt):

Lösungsmittelsystem IL.-¥ert

SthanolA'asser =

7/3 (Vol./Vol.) 0,82

n-Propanol/Wasser =

7/3 (Vol./Vol.) 0,77

10) PapierChromatographie

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 ergibt bei der Papierchromatographie an Toyo Filterpapier Fr. 50 unter den angegebenen Bedingungen folgende Rr.-¥erte:

Lö sungsmittelsystem R^-Vert

n-PropanolA^rasser =

7/3 (Vol./Vol.) 0,68

n-Propanol/Isopropanol/

Wasser = 7/7/6

(Vol. /Vol. /Vol.) 0,70

Acetonitril/Vasser = 8/2

(Vol./Vol.) 0,36

Acetonitril/Tris-Puffer/

EDTA* 0,34-

£thanolA^rasser = 7/3

(Vol./Vol.) 0,63

80 98 42/071 1

* Losungsmittelgemisch aus 120 ml Acetonitril, 30 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer vom pH-Vert 7,5 und 1 ml 0,1 m Äthylendiamintetraacetat vom pH-¥ert 7,5·

11) Hochspannungs-Papierelektrophorese

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 wird unter den angegebenen Bedingungen der Hocl^spannungs-Papierelektrophorese unterzogen. Es wird ein Gerät der Savant Instruments Inc. verwendet (Hochspannungs-Netzgerät Modell ITr. HV 3000 V und flache Elektrophoreseplatte Modell Nr. EP 18A). Als Filterpapier wird Toyo Filterpapier Nr. 50 verwendet. Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten: Bei 30-minütiger Elektrophorese unter Kühlung (unter 4°C) und unter Verwendung eines Puffers vom pH-Vert 8,6 mit einem Gehalt an 3,3 g Barbital und 25,5 g Natriumbarbital in 3000 ml Wasser wandert das Antibiotikum PS-5 bei einem Potential von 4-2 V/cm 28 mm zur Anode.

12) ¹^C-NMR-Spektrum

Unter Verwendung von Dioxan als internem Standard wird

1-5

das 20 MHz- ^C-NMR-Spektrum des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 in DoO ^mi"k einem Varian CFT-20-Spektrometer gemessen. Die folgenden charakteristischen Signale werden beobachtet:

(1) 184,04 ppm

(2) 174,96

(3) 169,29

(5)	130,40
(6)	67,39 (Dioxan)
(7)	60,19
(8)	55,63
(9)	40,41
00)	40,00

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OD

(12)
(13)

31,49 22,62 22,46 11,36

Die vorstehend aufgeführten physiko-chemischen Eigenschaften zeigen, dass das Antibiotikum PS-5 folgende Strukturformel aufweist:

CH₃-CH₂

S-CH₂-CH₂-NH-CO-CH

COOH

Mit dem gemäss diesem Beispiel hergestellten Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 wurden folgende "biologischen Eigenschaften ermittelt:

1) Antimikrobielles Spektrum

Die minemale Hemmkonzentration (MHK) des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 wird an verschiedenen pathogenen ' Keimen unter Einschluß von resistenten Stämmen gemäß dem Reihenverdünnungstest unter Verwendung der Hirn-Herz-Infusionsbrühe "Eiken" bestimmt.

Das Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 wird in einer Konzentration von 5 "bis 50 ^ug/ml in der genannten Infusionsbrühe vom pH-Wert 7,0 gelöst. Hiervon werden entsprechende VerdünnungsSerien im gleichen flüssigen Medium hergestellt. Die in Tabelle VIII aufgeführten Keime werden 18 Stunden bei 28⁰C in der Infusionsbrühe gezüchtet und auf die genannte Verdünnungsserie des Anti-

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biotikums PS-5 mit einer Einsaatdichte von 1 χ 10 Zellen/ml überimpft. Die Kulturen werden 20 Stunden bei 35⁰C stehengelassen. Sodann wird das Keimwachstum bei jeder Verdünnung des Antibiotikums PS-5 bestimmt. Die MHK stellt die geringste Konzentration des Antibiotikums PS-5 (Natriumsalz) dar, bei der sich visuell keine Vermehrung des entsprechenden Keimes feststellen läßt. Zur Kontrolle werden die beiden ß-Lactam-Antibiotika Cephaloridin und Cefoxitin in der gleichen Infusionsbrühe vom pH-Wert 7,0 in Konzentrationen von 1 μg/ml bis i00^ig/ml gelöst und anschließend zu mehreren Verdünnungsserien im vorgenannten flüssigen Medium verdünnt. Diese Proben werden auf die vorstehend beschriebene Weise zur Bestimmung der MHK-Werte behandelt. In Tabelle VIII

15 sind die Ergebnisse zusammengestellt.

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Tabelle VIII

Testkeim

Antibiotikum 'Cephaloridin Cefoxitin PS-5

Staphylococcus aureus FDA 209 P Smith Russell Bx-1633

Diplococcus pneumoniae Type III Streptococcus pyogenes NY-5 Bacillus subtilis ATCC 6633 Eschen chi a coli K 12 Alcaligenes faecalis B-326 Citrobacter freundii E-9* Serratia marcescens S-18* _ IOebsieila pneumoniae K-2^" Enterobacter sp. E-8 '*> Enterobacter cloacae E-16 -^ Entorobacter acrogenes E-19'K" Proteus vulgaris P-5*\ Proteus niirabilis P-6. Protous rettgeri P-7 Proteus sp. P-22
Providencia sp. P-8

2*·

0,31-

0,16 0,02 0,08 0,16

0,78 3,13

3,13 3,13 12,5 6,25 12,5 6,25 3,13 6_?25 6,25

0,031	1,25	I
0,031	2,50	I
0,125	2,50	CTi ro
0,031	1725
0,031	1,25	I
0,008	0,63
0,031	1,25
2,5	2J5
6;25	1,56
>100	>100
> 100	50
6?25	6,25
3,13	12,5
>100	>100
>100	>100
>100	12,5
12,5	12,5
100	6,25
>100	12,5
>100	25.0

Anmerkung:

* ß-Lactamase-Erzeuger;

2* resistent gegen Kanamycin, Gentamicin und Tobramycin; 3* resistent gegen Gentamycin und Tobramycin; 4* das Medium wird mit 10 Prozent Pferdeblut ergänzt.

CD K) K)

2) Potenzierung der antibiotischen Aktivität von bekannten ß-Lactam-Antibiotika gegen ß-Lactam-Antibiotika-resistente Keime
(A) 10 ml geschmolzenes Nähragar mit einem Gehalt an 50 ug/ml Penicillin G oder Cephaloridin, 0,8 Prozent Kyokuto-Nährbrühepulver und 1,0 Prozent Agar vom pH-Wert 7,0 werden mit den in den Tabellen IX und X angegebenen ß-Lactam-Antibiotika-resistenten ß-Lactamase bildenden Keimen beimpft und sodann in .Petrischalen von 9 cm Durchmesser gegossen. Auf derartige biologische Bestimmungsplatten werden Zellstoffscheiben von 8 mm Durchmesser mit einem Gehalt an jeweils 25 μΐ Lösungen des Antibiotikums PS-5 der angegebenen Konzentrationen gelegt und 18 Stunden bei 35°C inkubiert. Sodann wird die Größe der Hemmzonen ermittelt. Kontrollplatten werden auf ähnliche Weise ohne Penicillin G oder Cephaloridin hergestellt. Zum Vergleich werden Kontrollbestimmungen mit Penicillin G, Ampicillin, Oxacillin und Cefazolin unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen IX und X zusammengestellt.

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Tabelle IX	Hemmzone,	mm
	ohne. Pen. G	ι mit Pen.G ;
.- Testkeiin .^ibi°; c tikum PS-5
tyig/ml)	16,0	26,6
Proteus vulgaris P-5 318	14,0	24,5
159	10,3	22,2
100	0	18,3
79,5	20 ?1	I 20,0
Enterobacter sp. E-8 318	17,2	17,5
159	13,8	13;8
100	11,0	11,0
79,5	20,8	23,0
Citrobacter freundii E-9 318	17,2	19,2
159	13J2	15,2
100	10,4	13,1
79,5	21^3	22jl
Serratia marcescens S-18 318	17,8	22,0
159	13jO	16,1
100	0	13,8
79,5	13,6	21,4 ;
Proteus sp. P-22 318	11,7	18,2 ;
159	0	13,8
100	0	12,8
79,5

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	Tabelle X	Hemmzone,	•prm
		ohne CER*	mit CER*
Testkeim	Antibiotikum PS-5	21,0	21,9
Enterobacter sp. E-18	318	18,2	19,4
	159	16,1	18,0
	100	15,1	17,6
	79,5	22,5	24,6
Citrobacter freundii E-9	318	17,4	22,3
	159	17,4	21,6 ;
	100	16>0	19,4
	79,5	21,0	. 26,1
Serratia inarcescens	318	17,0	24,8
	159	16,8 .	23,3
	100	14,8	22,3
	79,5	18!, 5	25,2
Proteus vulgaris P-5	318	15,2	24,0
	159	13,7	22,0
	100	12,5	21,8
	79,5	G (Jjg/ml)
	Penicillin	14,9 0	14,5 0
Proteus vulgaris P-5	10 000 2 500	0	0
	625

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Tabelle X (Forts.)

	-	Ampicillin	tyig/ml)	(jig/ml)	0 0	(jig/ml)	14;5 0	12,9
		10 000	14,7	0	0	0
Proteus	vulgaris P-5.	2 500	0		0
		625	0
		Oxacillin	0 0
		10 000 2 500	0
Proteus	vulgar!s P-5	625
		Cefazolin	12;0 0
		10 000 2 500	0
Proteus	vulgaris P-5 . .	625

■^ CER = Cephaloridin

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Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass sich bei Verwendung von Penicillin G oder Cephaloridin in Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze und gleichzeitiger Verwendung des AntibiotikumsPS-5 in Konzentrationen unterhalb der Kachweisgrenze der Scheibenbestimmung eine Hemmzone feststellen lässt, was bedeutet, dass eine Potenzierung der Aktivität von Penicillin G und Cephaloridin durch das Antibiotikum PS-5 eingetreten ist. Im Gegensatz dazu sind Penicillin G, Ampicillin, Oxacillin und Cefazolin nicht dazu in der Lage, die antibiotische Aktivität von Cephaloridin zu erhöhen.

(B) Die nachstehenden Untersuchungen wurden durchgeführt, um nachzm\^reisen, dass die potenzierende Wirkung des Antibiotikums PS-5 in synergistischer Weise erfolgt.

Auf eine Nähragar-Bestimmungsplatte wird ein ß-Lactam-Antibiotikum-/ resistenter Stamm von Proteus vulgaris P-5 (ß-Lactamase-Erzeuger) überimpft. 2 Filterpapierstreifen mit einem Gehalt an Penicillin G oder Cephaloridin und 2 Streifen mit einem Gehalt an dem Antibiotikum PS-5 werden in Form eines Quadrats aufgelegt, wobei sich jeweils 2 Streifen des Antibiotikums an einer Ecke berühren. Die antibiotische Aktivität wird nach 18-stündiger Inkubation bei 35°G bestimmt. Bei Auswahl von geeigneten Konzentrationen von Penicillin G oder Cephaloridin und des Antibiotikums PS-5 lassen sich Hemmzonen nur an den Ecken beobachten, wo sowohl das Antibiotikum PS-5 als auch Penicillin G oder Cephaloridin vorhanden sind, während an den Ecken, wo nur das Antibiotikum PS-5, Penicillin G oder Cephaloridin allein vorhanden sind, keine Hemmbereiche auftreten. Dieser Befund lässt sich durch einen Synergismus zwischen dem Antibiotikum PS-5 und Penicillin G oder Cephaloridin

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erklären. Die Tatsache, dass 2 Verbindungen, die in so niedrigen Konzentrationen angewendet werden, dass sie als Einzelverbindungen keine Hemmzone ergeben, in Kombination miteinander eine grosse Hemmwirkung aufweisen, ist auf eine synergistische Wirkung zurückzuführen.

3) in vivo-Aktivität Die therapeutische Aktivität des Natriumsalzes

des Antibiotikums PS-5 wird an Mäusen untersucht,die intraperitoneal mit 5 x 10 Zellen/Maus Staphylococcus aureus Smith infiziert worden sind, unmittelbar nach der Infektion wird den Tieren eine wässrige Lösung des Eatriumsalzes des Antibiotikums PS-5 subkutan injiziert. Bei männlichen Mäusen vom ddy-Stamm (Shizuoka) ergibt sich eine DC- vom 2,45 mg/kg.

4) Toxizität

Eine wässrige Lösung des Eatriumsalzes des Antibiotikums PS-5 Xtfird in einer Dosis von 500 mg/kg intraperitoneal an männliche Mäuse vom ddy-Stamm (Shizuoka) verabfolgt. Es werden keine Todesfälle beobachtet.

5) ß-Lactamase-Hemmaktivität

Die ß-Lactamase-Hemmaktivität des Antibiotikums PS-5 wird auf folgende Weise anhand der Hydrolyse von Penicillin G durch ß<-Lactamase aus Proteus vulgaris P-5 ermittelt:

(A) Reagenz:

(1) Substrat:

Kaliumsalz von Penicillin G

Λ ,uMol/ml (= 372,3^gZmI) in 25 millimolarem Phos-

phatpuffer vom pH-Wert 6,8

(2) ß-Lactamase:

induzierbare ß-Lactamase von Proteus vulgaris P-5> die säulenchromatographisch an CM-Cellulose gereinigt worden ist.

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(3) Inhibitor:

Natriumsalz des Antibiotikums PS-5
0,6 ^uMol/ml ( =192 /ig/ml)

(4) 25 millimolarer Phosphatpuff er vom pH-Vert 6,8
(B) Durchführung des Versuchs:

Das Substrat (= Penicillin G),der Inhibitor (= Antibiotikum PS-5) und der Puffer werden bei 3O⁰C in den in Tabelle XI angegebenen Mengen gründlich vermischt. Die Umsetzung x^ird durch Zusatz der angegebenen Mengen an ß-Lactamase bei 30⁰C gestartet.

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Tabelle XI

co ο co

	Penicillin G (1 μ Mol/ml)	(I)	(0,040 ml)	(II)	(III)	(IV)
	Antibiotikum 3 (0,6 ^μ Mpl/ml)	Enzym Standard (H)	Enzym Standard (L)	Hemmung durch das Antibiotikum (PS-5) (H)	Hemmung durch, das Antibiotikum PS-5 (L)
(D	2,5 Mol	2,5 Mol (2,5 ml)	2,5 Mol (2,5 ml)	2,5 Mol (2,5 ml)
(2)	?s-5 0	0	0,105 Mol* (0,175 ml)	0,06 Mol** (0,100 ml)
(3)	Phosphatpuffer (25 millimolar, (0,5 ml) pH-Wert 6,8)	(0,5 ml)	(0,325 ml)	(0,40 ml)
W	ß-Lactamase	(0,020 ml)	(0,040 ml)	(0,040 ml)

Molverhältnis von Substrat zu Inhibitor: * 24:1 ** 42:1

Die Hydrolyse von Penicillin G wird an Hand der Abnahme der optischen Dichte bei 240 nm gemessen/ wobei angenommen wird, dass die differenzielle molare Extinktion von Penicillin G bei 240 nm 556 beträgt. Dieser Wert wurde aus mehreren Vorversuchen ermittelt.

(C) Ergebnisse

Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Hydrolyse von Penicillin G in Abwesenheit des Inhibitors (Antibiotikum PS-5) unter den angegebenen Bedingungen. Eine starke Hemmung von Proteus vulgaris-Penicillinase durch das Antibiotikum PS-5 geht klar aus M.g. 4 hervor. Bei Anwesenheit von 1/42-Äquivalenten des Antibiotikums PS-5 in Penicillin G als Substrat werden mehr als 50 Prozent der Aktivität der Proteus vulgaris P-5-ß-Lactamase gehemmt.

Beispiel 10

Verfahren zur Herstellung des Tritylesters des Antibiotikums PS-5

160 Liter Gärbrühenfiltrat werden gemäss Beispiel 3 hergestellt. Nach dem Aufarbeiten gemäß Beispiel 4 werden 30,Og eines gelbstichigbraunen lyophilisierten Pulvers des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 (spezifische Aktivität 27 CCU/mg) erhalten. Dieses Pulver wird in 100 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3,0 g Triethylamin versetzt. Unter Kühlung mit Eis wird das Reaktionsgemisch mit 9,0 g Tritylchlorid versetzt, wobei die Temperatur der Lösung unter 5⁰C gehalten wird. Bach 12-stündigem Rühren bei 5°C ist das gesamte Antibiotikum PS-5 trityliert. Die Reaktionslösung wird in 1000 ml 0,5 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 gegossen und sodann 3-mal mit jeweils 1000 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft.

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28Ί3922

Der Rückstand wird in 20 ml Benzol gelöst und über eine mit Bio-Beads-S-X3 (poröse Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat-Perlen für die Gelpermeation, Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 2000) gepackte Säule der Abmessungen 4,5 x 60,0 cm, die vorher mit Benzol äquilibriert worden ist, gegeben. Als Laufmittel wird Benzol verwendet. Die aktive Fraktion, die auf der Comamonas-Bestimmungsplatte eine antibiotische Aktivität aufweist, wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 1 ml Benzol gelöst und auf eine mit 25 g Kieselgel (Kieselgel 60, lichte Maschenweite 0,210 bis 0,063 mm (70 bis 230 mesh ASTM)) gepackte Säule der Abmessungen 1,5x 24-,O cm aufgesetzt. Nach dem Waschen mit einem 10 : 1-Gemisch von Benzol und Essigsäureäthylester zur Entfernung der restlichen Reagentien werden die aktiven Bestandteile mit einem 1 : 2-Gemisch von Benzol und Essigsäureäthylester eluiert. Das aktive Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und wieder in 0,5 ml Benzol gelöst. Die Benzollösung wird auf eine mit 20 g neutralem Aluminiumoxid gepackte Säule der Abmessungen 0,9 χ 22,0 cm aufgesetzt. Als Laufmittel wird ein Gemisch aus Benzol und Essigsaureäthylester mit verschiedenen Mischungsverhältnissen (10 :1, 6:1, 4:1, 3:1,2:1 und 1:1) verwendet. Die aktiven Eluate werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand xiird in 0,3 ml Benzol gelöst und auf eine mit 10 g Kieselgel (vgl. oben) gepackte Säule der Abmessungen 0,9 x 22,0 cm aufgesetzt. Nach der Entfernung der Verunreinigungen mit einem 10 : 1-Gemisch aus Benzol und Essigsaureäthylester werden die aktiven Bestandteile mit einem 1 : 2-Gemisch aus Benzol und Essigsaureäthylester eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zu. einem festen Pulver eingedampft. Das erhaltene Pulver xvird in 0,5 ml Benzol gelöst und an einer mit Bio-Beads S-X3-Säule der Abmessungen 1,2 χ 96 cm gepackten

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Säule gereinigt, wobei Benzol als Laufmittel verwendet wird. Das aktive Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Das erhaltene trockene Pulver wird in 0,5 ml Aceton gelöst und der Gelfiltration an einer mit in Aceton gequollenen Sephadex LH-20 (perlenförmiges Dextrangel, hergestellt durch Vernetzen von Dextranketten durch Hydroxypropylierung) gepackte Säule der Abmessungen 1,2 χ 96,0 cm unterworfen. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 23 mg eines weißen Pulvers. Durch Umkristallisation dieses Pulvers aus einer Mischung von Benzol und Hexan erhält man 12 mg farbloses, kristallines Pulver (10 800 CCU/mg). Bei diesem farblosen, kristallinen Pulver handelt es sich um den Tritylester des Antibiotikums PS-5. Dieses Produkt weist folgende physiko-chemische Eigenschaften auf:

(1) Farbe Farblos

(2) Löslichkeit

Die Löslichkeit des tritylierten Produkts des Antibiotikums PS-5 wird bestimmt, indem man 5 mg der Verbindung in jeweils 0,1 ml der nachstehend angegebenen Lösungsmittel bei 20⁰C unter Schütteln auflöst. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben:

Praktisch unlöslich in Wasser, η-Hexan und Petroläther vom Siedebereich 30 bis 60⁰C; gut löslich in Benzol, Essigsäureäthylester, Chloroform, Methanol, Äthanol, Iceton, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid.

(3) Stabilität

Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 wird in 1 Volumteil

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Methanol gelöst und sodann rasch mit 9 Volumteilen destilliertem Wasser

auf 125 CCU/ml verdünnt. Eine 0,1 m Dikaliumphosphatlösung wird mit 5 n Phosphorsäure oder 5 η Natriumhydroxidlösung auf die angegebenen pH-Werte im Bereich von 3 his 9 eingestellt. Jeweils 1 ml dieser Phosphatpuffer wird mit 1 ml der genannten Lösung des Tritylesters des Antibiotikums PS-5 versetzt. Gegebenenfalls wird der pH-Wert des Gemisches mit Phosphorsäure oder Uatriumhydroxidlösung auf den gewünschten pH-Vert eingestellt. Die Lösung wird sodann 30 Minuten in einem Wasserbad von 60⁰C stehengelassen, mit laufendem Wasser abgekühlt und mit einer geringen Menge Phosphorsäure oder Katriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,0 neutralisiert. Während der Versuchsdauer wird eine Kontroilösung vom pH-Wert 7,0 in einem Eisbad stehengelassen. Die restliche antibiotische Aktivität wird gemäss dem Blättchentest mit Comamonas terrigena B-996 als Testkeim bestimmt. Die prozentuale Aktivität der hitzebehandelten Lösungen im Vergleich zur Kontrolllösung ist in Tabelle XII angegeben.

Tabelle XII

pH-Wert	3,0	4,0	5,	0	6	,0	7,0	8,0	9,0
Re-st- aktivität	(%) o	0	6,	5		,0	100	100	100

Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass der Tritylester des Antibiotikums PS-5 in wässrigen Lösungen bei 60⁰G im pH-Bereich von 6,0 bis 9,0 30 Minuten lang stabil ist. Ferner lässt sich kein wesentlicher Aktivitätsverlust feststellen, wenn eine wässrige Lösung des tritylierten

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Produkts 90 Minuten "bei 60⁰C "beim pH-Wert 7,5 inkubiert

(4) Schmelzpunkt

Der Schmelzpunkt wird in einer Kofler-Mikroschmelzpunktsapparatur BY-I bei einem Temperaturanstieg von 1°C/min bestimmt. Der Έ. beträgt 83,5 "bis 85,5°C. Das Produkt verfärbt sich oberhalb von 140⁰C braun.

(5) UV-Absorptionsspektrum

Das UV-Absorptionsspektrum des tritylierten Produkts des Antibiotikums PS-5 wird mit einem Spektrophotometer .bei einer Konzentration von 128 μg/3 ml Methanol aufgenommen; vgl. Fig. 5:

^Me0H . 315,5 rm (E] *, = 156)

max

(6) IR-Absorptionsspektrum

Das ΙΕ-Absorptionsspektrum des tritylierten Produkts des Antibiotikums PS-5 (4,5 mg) in 0,6 ml Chloroform wird mit einem IR-Spektrophotometer aufgenommen; vgl. Pig. 6. Bei den nachstehend angegebenen Wellenzahlen treten charakteristische Absorptionsmaxima auf: 3430, 3IOO bis 3000 (C-H der Phenylgruppe), 2990, 2950, 1770 (C=O des ß-Lactamrings), 1695 (-C0- der Amidbindung), 1665 (-C0-0 der Esterbindung), 1445, 1340, 1275 und 1130 cm"¹.

(7) Protonen-MMR-Spektrum

Aus Pig. 7 geht das 100 MHz-Protonen-HMR-Spektrum des Antibiotikums PS-5-Tritylesters hervor, das mit 4,5 mg Substanz in 0,3 ml Deuterochloroform unter Verxtfendung eines JEOL EMR-Spektrometers JNM'PS-100 aufgenommen worden ist. Folgende besonders charakteristische Signale treten auf: Triplett um 1,10 ppm (J = etwa 7,0 Hz) Singulett bei 186 ppm

Multiplett im Bereich 7,10 bis 7,56 ppm (Protonen der Benzolringe der Tritylgruppe).

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(8) Elementaranalyse

3,5 ^mg des Tritylierungsnrodukts des Antibiotikums PS-5

_2 werden 4 Stunden bei einem Druck von 1 χ 10 Torr bei Eaumtemperatur getrocknet und sodann der Elementaranalyse unterx-rorf en. Es ergeben sich, folgende Werte: C 61,89 %, H 5,78 %, Ή 4,48 % und S 4,62 %.

(9) Farbreaktion en

Ehrlich positiv

Triphenyltetrazolium-

chlorid negativ

Eisen(III)-chlorid negativ Eisen(IIl)-chlorid-Jod negativ Jodoplatinat positiv

Hydroxylamin-Eisen(lII)-chlorid positiv

Chlor- o-Tolidin positiv Ninhydrin negativ

(10) Dünnschichtchromatographie

Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 ergibt unter den nachstehend angegebenen Bedingungen folgende E^-Werte. Der Nachweis der gewanderten Flecken wird durch Bioautographie mit Comamonas terrigena B-996 durchgeführt.

(a) Mit Kieselgel vorbeschichtete Platten 60 ^254' ^E' ^Merck Darmstadt.

Lösungsmittelsystem: Benzol/Aceton (2/1) · E_f = 0,29

(b) Fluoreszierende Celluloseplatten Eastman Chromogram Sheet 13254, Indikator Nr. 6Ο65.

Laufmittel E^-Vert

Obere Phase von n-Butanol/Äthanol/

Wasser (4/1/5) 0,56

n-Butanol 1,0

IsopropanolA/asser (8/7) 0,91

, IsopropanolA^Tasser (1/4) 1,0

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Die Molekülstruktur des Antibiotikums PS-5 und die vorstehend angegebenen physiko-chemischen Eigenschaften bestätigen die folgende Strukturformel für den Tritylester des Antibiotikums PS-5.

CH₃-CH₂

S-CH₂-CH₂-MH-CO-CH₃

Biologische Eigenschaften 1) Antimikrobielles Spektrum

Die minimale Hemmkonzentration wird an verschiedenen pathogenen Keimen unter Einschluß von einigen resistenten Stämmen bestimmt. Dazu wird der Reihenverdünnungstest unter Verwendung der Hirn-Herz-Infusionsbrühe "Eiken" durchgeführt. Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und rasch in der genannten Infusionsbrühe vom pH-Wert 7,0 verdünnt, bis die Konzentration des Tritylesters des Antibiotikums PS-5 im Bereich von 40 μg/ml bis 20 μg/ml liegt. Die Methanolkonzentration in der endgültigen Lösung beträgt nicht mehr als 10 Prozent. Diese Lösung wird in einer 2-fach geometrisch abgestuften Reihe verdünnt. Die in Tabelle XIII aufgeführten Testkeime werden 18 Stunden bei 28⁰C in der Infusionsbrühe gezüchtet und sodann auf die Verdünnungsreihe in einer Einsaatdichte von 1 χ 10 Zellen/ml überimpft. Die Ergebnisse werden nach 20-stündiger Inkubation bei 35⁰C festgestellt.

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Als Kontrollantibiotika werden Lösungen von Ampicillin und Cephaloridin in der angegebenen Infusionsbrühe vom pH-Wert 7,0 in einer Konzentration von 100 ^ug/ml verwendet und auf die gleiche Weise wie die zu untersuchende

5 Verbindung behandelt.

In Tabelle XIII sind die MHKi-Werte des Tritylesters des
Antibiotikums PS-5 zusammen mit den entsprechenden Werten vom Ampicillin und Cephaloridin als Vergleichsantibiotika angegeben. Aus dieser Tabelle geht hervor, dass der Tritylester des Antibiotikums PS-5 ein breites antimikrobielles WirkungsSpektrum aufweist und insbesondere eine starke
antibiotische Aktivität gegen verschiedene ß-Lactam-resistete (ß-Lactamase bildende) 1 IikrοOrganismenstämme zeigt.

Tabelle	Testkeim	XIII	MHK-; P	Cephalori
			Anraicil-	din'
	Staphylococcus aureus FDA 209p		iin	0,04
Staphylococcus aureus Smith	Trityl	0,20	0,04
Diplococcus pneutnoniae Type III	PS-5	0,20	0,01
Streptococcus pyogenes NY-5	0,17	0,04	0;01
Sarcina lutea S-19	0.27	0,02	0,05
Escherichia coli K12	0.08	0,05	2,5
Al callgenes faecal is B-326	0.17	3jl3	6,25
Citrobacter freundii E-9	0.27	0j25	>100
Serratia marcescens S-I8	5.37	>100	>100
Klebsiella pneumoniae K-2	1,25	50	10,0
Enterobacter sp. E-8	5,0	>100	>100 :
Enterobacter cloacae E-I6	10,0	>100	>ioo ■
Enterobacter aerogenes E-19	10,7	>100	>100
Proteus vulgaris P-5	10,0	>100	>20,0
Proteus mirabilis P-6	10,0	>100	■ ιο,ο
Proteus rettgeri P-7	8,7	3,13	50,0
Pseudomonas aeruginosa P-I	21,5	50;0	>20,0
	21,5	50,0'
10,0	I
>43,0

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Γ

— 7Q —

■j 2) Potenzierung der antibiotischen Aktivität von Penicillinen

und Cephalosporinen gegenüber resistenten Mikroorganismen (A) Petri-Schalen von 9 cm Durchmesser mit einem Gehalt an resistenten Keimen werden vorbereitet, indem man 10 ml geschmolzenes Nähragar, das mit ß-Lactam-Antibiotika-resistenten (ß-Lactamase bildenden) Mikroorganismen beimpft ist, auf 15 ml einer festen Nähragar-Grundschicht vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 50μg/ml Penicillin G oder Cephaloridin überschichtet. Wie vorstehend beschrieben, werden die zu untersuchenden Antibiotikumlösungen in Mengen von 25 μΐ

auf eine Zellstoffscheibe von 8 mm Durchmesser aufgebracht und auf die Bestimmungsplatten gelegt. Nach 18-stündiger Inkubation bei 35⁰C werden die Hemmhöfe gemessen und mit den Ergebnissen der Vergleichsplatten, die weder Penicillin G

^⁵ noch Cephaloridin enthalten, verglichen. Aus den Ergebnissen der Tabelle XIV geht hervor, daß durch Kombination des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5 bei Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze mit Penicillin G oder Cephaloridin, ebenfalls in Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze, eine deutliche Bildung eines Hemmhofs eintritt. Diese Tatsache zeigt, daß durch das Tritylierungsprodukt des Antibiotikums PS-5 eine Potenzierung der antibiotischen Aktivität von Penicillin G oder Cephaloridin

eintritt. 25

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Tabelle XIY

Testkeim

(mm)

Proteus vulgar-is P-5

Trityl PS-5

Kontrolle

Penicillin G-zusatz

27,0

	50 100	Kontrolle	Cephaloridin· Zusatz
Proteus vulgaris P-5	50 100	0 11,0	15,0 18,0
Proteus sp. P-22	50 100	0 0	11,5 15,5
Citrobacter freundii E-9	15,0 16,0	15,5 18,0

(B) Zum weiteren Nachweis der potenzierenden Wirkung wird der Synergismus des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5 mit Cephaloridin nach dem Reihenverdünnungstest an einem ß-Lactam-Antibiotikum-resistenten Stamm von Proteus vulgaris bestimmt. Zunächst werden 5 Proben von Vorratslösungen mit einem Gehalt an Cephaloridin und dem Tritylester des Antibiotikums PS-5 in unterschiedlichen Konzentrationen, die in Tabelle XV angegeben sind, hergestellt, wobei eine Hirn-Herz-Infusionsbrühe "Eiken" vom pH-Wert 7,0 als Lösungsmittel verwendet wird.

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	Tabelle XV	Cephaloridin
Vorratslösung	Tritylester des	0 p.g/m.1
Nr.	Antibiotikums PS-5	500
1	100 ^g/ml	1000
2	75	1500
3	50	2000
4	25
5	0

Aus jeder Vorratslösung werden durch Verdünnen im Verhältnis von 1 : 2, 2 : 5 und 3 : 10 in der genannten Infusionsbrühe weitere Vorratslösungen hergestellt. Insgesamt werden I5 dieser weiteren Vorratslösungen erhalten. Mit jeder dieser weiteren Vorratslösungen werden 15 Stufen der 2-fach abgestuften Verdünnung in der genannten Infusionsbrühe durchgeführt. Jede der 15 Verdünnungen wird mit Proteus vulgaris P-5 in einer Endkonzentration von 1 χ 10 Zellen/ml beimpft und 20 Stunden bei 35⁰C inkubiert. Für jede ursprüngliche Vorratslösung wird die MHK bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVI zusammengestellt.

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Tabelle XVI

-Vor- τη-tyl PS-5: Trityl^ : CER %

rats- Gepnaiori- bidtika

lösung _diS biotika

1	100 :	0 (jug)	10 +	0 (jjg)	10,0 Oi9)
2	75 :	500	3,75 +	25	28,75
3	50 :	1000	1,88 +	37,5	39,38
4	25 :	1500	1,25 +	75	76,25
5	0 :	2000	0 +	1000	1000 .

Zur weiteren Erläuterung der synergistischen Wirkung des Trityleste'rs des Antibiotikums PS-5 auf Cephaloridin v/erden die MHK-Werte ausgedrückt als relative MHK-Werte jedes einzelnen Antibiotikums. Tabelle XVII zeigt deutlich den Synergismus der beiden Antibiotika, wobei die MHK-Werte der einzelnen Antibiotika allein mit 100 angegeben sind.

Tabelle XVII

Vorrats- _Trity-, _PS_₅ . Relative iffiR-tferte

lösung Cepha- (Trityl PS-5 + CER =Gesamtwert)

^^Γ loridin

1	100 :	0	(/ig)	100 -\	100
2	75 :	500		37,5 π	40
3	50 :	1000		18,8 -i	22,55
4	25 :	1500		12,5 ^	20
5	O :	2000	-	0 i	100
r- 0 =
(· 2,5 =
I- 3j75 =
ϊ 7,5 =
κ 100

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Aus Tabelle XVII geht der synergistssehe Effekt des Tritylesters des Antibiotikums PS-5 auf Cephaloridin klar hervor. Venn Proteus vulgaris P-5₅ der aufgrund seiner Bildung von ß-Lactamase gegen ß-Lactanr-Antibiotika .. resistent ist, als Testkeim · verwendet wird, wird das Wachstum dieses Keimes bei einer Kombination von 7>5 Prozent des MHK-Werts von Cephaloridin mit 12,5 Prozent des MHK-Werts des Tritylesters des Antibiotikums PS-5 gehemmt.

3) in vivo-Aktivität

Die in vivo-Aktivität des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5 wird nach intraperitonealer Infektion von Mäusen mit 5 x 10 Zellen/Maus Staphylococcus aureus Smith, bestimmt. Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 wird den Tieren unmittelbar nach der Infektion subkutan injiziert. Die DC₅ bei männlichen

Mäusen vom ddy-Stamm (Shozuoka) beträgt 2,55 mg/kg (27 CCUAg).

4-) ß-Lactamase-Hemmwirkung (A) Bestimmun^sverfahren

CPT?
Der I₁-Q -Wert der Hydrolyse von Cephaloridin durch ß-Lactamase bei 10-minütiger Beobachtung (von 1 bis Minuten nach Beginn der Inkubation) wird ermittelt. Die Hydrolysegeschwindigkeit von Cephaloridin wird an Hand . der Abnahme der optischen Dichte bei 225 πτμ gemessen. !Für routinemässige Hemmtests wird ß-Lactamase von Citrobacter freundii E-9 und Proteus vulgaris P-5 verwendet, die durch Affinitätschromatographie mit Cephalexin-Sepharose 4B gereinigt worden ist.

(B) Beagentien

Puffer: O_r1 _m Phosphatpuffer (Na-K-Phosphat) vom pH-Wert 6,8;

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Substrat:

0,05 ^μΜοΙ/ml in Phosphatpuffer; ß-Lactamase:

Das Enzym wird so stark verdünnt, dass die optische Dichte bei 255 nm in Abwesenheit von Inhibitor innerhalb von 10 Minuten auf etwa 0,1 abfällt. Das verwendete Spektrophotometer kann eine Vergleichsküvette und drei Probenküvetten aufnehmen. Es werden 1 cm-Quarzküvetten mit 3 ml Volumen verwendet. Während der Umsetzung wird die Temperatur auf 30⁰C gehalten. Inhibitor:

Die Verdünnung wird in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 oder in Dimethylsulfoxid durchgeführt. Die Kontrollküvette enthält die gleiche Menge an Verdünnungslösung ohne Inhibitor wie die Probenküvette. Reakti onsbe dingungen:

Das Enzym-Inhibitorgemisch der folgenden Zusammensetzung wird 15 Minuten bei 30⁰C vorinkubiert: Phosphatpuffer 100 ul
Enzym 0,5 - 2,0 ul

Inhibitor 0,5-40

Nach der Vorinkubation werden 3,0 ml der auf 30⁰C vorgewärmten Substratlösung zugesetzt und zum Start der Reaktion rasch vermischt. Die Reaktion wird durch Aufzeichnung der.bei 30⁰C eintretenden Änderung der opti-

Dei 255 n¹¹¹
sehen Dichte/innerhalb von 10 Minuten verfolgt. Der

CEH
It-Q -Vert (ug/ml) wird bestimmt, indem man den Inhibitor soweit verdünnt, bis sich 50 Prozent der Hydrolysegeschwindigkeit von Cephaloridin ergeben, die innerhalb von 10 Minuten (von 1 bis 11 Minuten nach der Substratzugabe) im inhibitorfreien Kontrollversuch festgestellt wird.

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(C) Ergebnisse:

Unter den vorgenannten Reaktionsbedingungen ergeben sich für den Tritylester des Antibiotikums PS-5 folgende

ß-Lactamase aus: Ic₀ Qug/ml)

Proteus vulgaris P-5 0,060 Citrobacter freundii E-9 0,80

Somit ergibt sich eine 50prozentige Hemmung der Hydrolyse von Cephaloridin durch ß-Lactamase von Proteus vulgaris P-5 bzw. Citrobacter freundii E-9 bei einer Konzentration von 0,060 ;ag/ml bzw. 0,80 ^ig/ml des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5.

5) Toxizität

Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 ^verursacht bei intraperitonealer Verabfolgung an Mäuse vom ddy-Stamm (Shizuoka) in Dosen von 500 mg/kg keine Todesfälle.

BeispielH

Verfahren zur Herstellung des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5

715 mg (235 CCU/mg) des gemäss Beispiel 7 hergestellten Hatriumsalzes des Antibiotikums PS-5 in Form eines braunstichig-gelben Pulvers werden in 3,5 ml Hexamethylphosphorsäuretxiamid (HMPA) gelöst. Uach Zusatz von 70 mg Triethylamin unter Eiskühlung wird das Reaktionsgemisch bei Temperaturen unter 10⁰C mit 250 mg Tritylbromid versetzt. Das Gemisch wird zur Vervollständigung der Tritylierungsreaktion 7 Stunden bei 10⁰C gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 50 ml Eiswasser gegossen und solange

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stehengelassen, bis das Eis geschmolzen ist. Der Tritylester des Antibiotikums PS-5 wird 3 mal mit je 15 ml Benzol extrahiert und gemäss Beispiel 10 behandelt. Man erhält 9,4- mg eines farblosen kristallinen Pulvers des gewünschten Produkts. Die physikochemischen Eigenschaften dieses Präparats sind identisch mit den Eigenschaften des Produkts von Beispiel 10.

Beispiel 12

Herstellung des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5 in Gegenwart eines Kronenäthers

10,1 g des gemäss Beispiel 5 hergestellten braunstichig-weissen lyophilisierten Pulvers werien in 200 ml Methylenchlorid suspendiert und unter Zusatz von 1 ml Β*β$»±βαβ!ΡρΒ-/ΐ 5_7krone-5

unter Rühren gelöst. Sodann werden 8,5 g Tritylchlorid zugesetzt, wobei die Temperatur der Lösung mit Eis unter 5°C gehalten wird. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Fach Filtration wird das IPiltrat. unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird auf einmal in 10 ml Benzol gelöst, abfiltriert und gemäss Beispiel 10 gereinigt. Man erhält 7,3 mg farbloses kristallines Pulver mit den gleichen physiko-chemisehen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel

Beispiel 13

Verfahren.zur Herstellung des Tritylierungsprodukts des Antibiotikums PS-5 in Gegenwart eines quaternären Das Antibiotikum PS-5 wird aus 4-8 Liter Gärbrühenfiltrat (H₉ CGU/ml) 2 mal mit je 15 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt an 0,05 Prozent Cetyldimethylbenzylammoniumchlorid extrahiert (Aktivität des Dichlormethanextrakts; 24,0 CCU/ml; Aktivität des verbrauchten Gärfiltrats: 5.,7 CCU/ml). Der Dichlormethanextrakt wird über 400 g wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und in einem Drehverdampfer unter vermindertem Druck auf 500 ml

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eingeengt. Das Konzentrat (4-50 CCIT/ml) wird einer Vortrocknung über 10 g wasserfreiem Natriumsulfat unterzogen und nach Filtration an 5 S Molekularsieb 4A getrocknet.

Diese wasserfreie Lösung wird bei Temperaturen unter 5°C mit 4,5 g Tritylchlorid versetzt. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 5°C gerührt. Nach dem Entfernen des Dichlormethans durch Eindampfen bei Raumtemperatur wird der Eückstand in 15 ml Benzol gelöst und auf ähnliche Weise wie in Beispiel 10 gereinigt. Man erhält 8 mg wasserfreies, kristallines Pulver des Tritylesters des Antibiotikums PS-5. Die physiko-chemischen Eigenschaften dieses Präparats sind praktisch identisch mit denen des Produkts von Beispiel 10.

Beispiel 14 Methylester des Antibiotikums PS-5

90 mg des gemäß Beispiel 9 hergestellten Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5 (8000 CCü/mg) werden in 3 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 50 mg Triäthylamin und 0,3 ml Methyljodid versetzt. Nach 2 1/2-stündigem Eühren bei Raumtemperatur werden zur Extraktion 100 ml Benzol zugesetzt. Nach gründlichem Vermischen wird die Benzolphase abgetrennt, mit 100 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 gewaschen und anschliessend über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die wasserfreie Benzol-. lösung wird unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt und auf eine mit Bio-Beads S-X3 gepackte Säule der Abmessungen 1,2 χ 90 cm aufgesetzt. Der Methylester wird mit Benzol eluiert. Die Eluatfraktionen mit einem Gehalt an diesem Ester werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem farblosen Öl eingedampft. Dieses öl wird in einer ' geringen Menge Aceton gelöst und an einer mit Sephadex LH-20 gepackten Säule der Abmessungen 1,2 χ 90 cm unter Verwendung von Aceton als Laufmittel chromatographiert. Die Eluatfraktionen mit einem Gehalt an dem Methylester des Antibiotikums PS-5 v/erden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man

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erhält 11,2 mg des Methylesters des Antibiotikums PS-5. Dieses Produkt weist folgende physikalische und chemische Eigenschaften

(1) Dünnschichtchromatographie

E_f = 0,45 (Kieselgel 60 F₂₅₄ Platten; Benzol:Aceton =1:1)

(2) W-Absorptionsmaximum in Methanol

\^CH5^0H = 315,5 um
max

(3) IR-Absorptionsmaxima in Chloroform 3430, 1766, 1660 cm"

(4) Signale des Protonen-MMR-Spektrums in Deuterochloroform (0 ) 1,05 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,7 - 2,0 (2H, m), 2,00 (3H, s), 2,8 - 3,65 (7H, m), 3,83 (3H, s), 3,84 - 4,06 (1H, m).

(5) Molekulargewicht (hochauflösende Massenspektroskopie) 312,1131 (gefunden), 312,1143 (berechnet für

Aufgrund der vorstehenden Daten kommt dem Methylester des Antibiotikums PS-5 folgende Strukturformel zu:

CH₃-CH₂

,S-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₃ OO-CH

Das Verfahren von Beispiel 14 wird mit rÄthyljodid, Isopropyljodid, Isobutyljodid, n-Pentyljodid und n-Hexyljodid anstelle von Methylo'odid wiederholt. Man erhält folgende Ester des Antibiotikums PS-5: Ä'thylester, Isopropylester, Isobutylester, n-Pentylester und n-Hexylester.

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Die Bildung dieser Ester lässt sich durch Dünnschichtchromatographie, IR-Absorptionsspektroskopie, Protonen-NMR-Spektroskopie und Massenspektroskopie bestätigen.

Bedeutung der Figuren

Fig. 1: UV-Absorptionsspektrum des gemäss Beispiel 9 hergestellten Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5;

Fig. 2: IR-Absorptionsspektrum des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5;

Fig. J: Protonen-NMR-Spektrum des Natriumsalzes des Antibiotikums PS-5;

Fig. 4-: Zeitlicher Verlauf des Abbaus von Penicillin G durch ß-Lactamase von Proteus vulgaris P-5; Hemmwirkung des gemäss Beispiel 9 hergestellten Antibiotikums PS-5;

Fig. 5: UV-Absorptionsspektrum des gemäss Beispiel 10 hergestellten Tritylesters des Antibiotikums PS-5;

Fig. 6: IR-Absorptionsspektrum des Tritylesters des. Antibiotikums PS-5; und

Fig. 7: Protonen-NMR-Spektrum des Tritylesters des Antibiotikums PS-5.

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Lee

rs e ι fe

Claims (21)

VOSSfUS · VOSSiUS . HILTL · TAUCHNER . HEUNEMANN PATENTANWÄLTE 9 8 1 ^ 9 ? 2 SIEBERTSTRASSE4 . 8OOO MÜNCHEN 86 . PHONE: (O89) 474075 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 4-5 3 VOPAT D u.Z.: M 606 (Vo/kä) 31. März 1978 Gase: PS-5 SAmAKU-0CEA.1T CO., LTD. Tokyo, Japan PANLABS INC., Fayetteville, N.Y., V.St.A. "Antibiotikum PS-5 -Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen" Priorität: 31. März 1977, Japan, Nr. 35375/77 9. August 1977, Japan, Nr. 94651/77 PatentansDrüche

1. Antibiotikum PS-5-Verbindungen der allgemeinen Formel Γ

(D

in der E^ ein Wasserstoff atom, einen niederen Alkylrest oder die Triphenylmethylgruppe bedeutet, sowie die Salze

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der Verbindungen, bei denen R^, ein Wasser stoff atom ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ILein Wasserstoffatom bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R,, die Triphenylmethylgruppe bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R^ die Methylgruppe bedeutet.

5- Pharmakologisch verträgliche Salze der Verbindung nach Anspruch 2.

6. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch 2.

7. Natriumsalz des Antibiotikums PS-5 in im wesentlichen reiner Form.

8. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zur Bildung der antibiotischen Aktivität der Verbindung der allgemeinen Formel I, in der R^, ein Wasserstoffatom bedeutet, in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, das Produkt mit antibiotischer Aktivität isoliert und gegebenenfalls die Verbindung der allgemeinen Formel I, in der R^ ein Wasserstoff atom bedeutet, oder deren Salze in eine Verbindung der allgemeinen Formel I, in der R^ einen niederen Alkylrest oder die Triphenylmethylgruppe bedeutet, durch Umsetzung mit einem niederen Diazoalkan oder einer Verbindung der allgemeinen Formel RY, in der R einen niederen Alkylrest oder die Triphenylmethyl gruppe und Y ein leicht abzuspaltendes Atom oder eine leicht abzuspaltende Gruppe

b edeutet, üb erführt.

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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismenstamm Streptomyces A271 (FERM-P Nr. 3984 bzw. ATCC Nr. 31 358) oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten, die zur Bildung der genannten antibiotischen Aktivität in der Lage sind, verwendet.

10. Verfahren nach. Anspruch 8, dadurch, gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismenstamm Streptomyces Α27Ί verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung 30 "bis 90 Stunden bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von

4 bis 9 durchführt.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Isolierung des Züchtungsprodukts mit antibiotischer Aktivität nach einem an sich üblichen Verfahren zur Gewinnung von Antibiotika vom Carbonsäuretyp aus den entsprechenden Züchtungsprodukten durchführt.

13- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt mit antibiotischer Aktivität als Natriumsalz der Verbindung der allgemeinen Formel I, in der R^ ein Wasserstoffatom bedeutet, isoliert.

14-, Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt mit antibiotischer Aktivität der allgemeinen Formel I, in der R,, ein Wasserstoff atom bedeutet, oder deren Salze in eine Verbindung der allgemeinen Formel I, in der R^₁ einen niederen Alkyl-

, ν durch

rest oder die Triphenylmethylgruppe (Tritylgruppe) bedeutet,/ Umsetzung mit einer Verbindung der allgemeinen Formel RI _t in der R einen niederen Alkylrest oder die Triphenylmethyl-

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gruppe und Y ein leicht abzuspaltendes Atom oder eine leicht abzuspaltende Gruppe bedeutet, überführt.

15- Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen.

16. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 zusammen mit einem Antibiotikum, das gegenüber ß-Lactamase empfindlich ist, zur Bekämpfung bakterieller Infektionen.

17- Ausführungsform nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein pharmakologisch verträgliches Salz der Verbindung der allgemeinen Formel I, in der ]L· ein Wasserstoffatom bedeutet, verwendet wird.

18. Ausführungsform nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel I verwendet wird, in der IL, die Tripheny!methylgruppe bedeutet.

19- Ausführungsform nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein pharmakologisch verträgliches Salz der Verbindung der allgemeinen Formel I, in der IL ein Wasserstoffatom bedeutet, oder die Verbindung der allgemeinen Formel I, in der IL die Trxphenylmethylgruppe bedeutet, zusammen mit einem Penicillin- oder Cephalosporin-Derivat als gegenüber ß-Lactamase empfindlichem Antibiotikum verwendet wird.

20. Ausführungsform nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel I und das gegenüber ß-Lactamase empfindliche Antibiotikum in Verhältnissen von 10:1 bis 1:100 verwendet werden.

21. Biologisch reine Kultur des Stammes Streptomyces A271.

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