DE2332065C2

DE2332065C2 - Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen sowie deren N-Alkoxycarbonyl- oder N-Arylcarbamoylderivaten

Info

Publication number: DE2332065C2
Application number: DE19732332065
Authority: DE
Inventors: Junzi Ikeda Hosoda; Hiroshi Imanaka; Kazuyoshi Kawanishi Jomon; Daizou Hatsutoriyutakamachi Morino; Heiichi Ikeda Sakai; Ikuo Yao Ueda
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-06-27
Filing date: 1973-06-23
Publication date: 1984-11-22
Also published as: CH596227A5; NL7308948A; GB1425081A; FR2190420A1; CH596308A5; DE2332065A1; FR2190420B1

Description

sowie von deren N-Alkoxycarbonyl- oder N-Arylcarbamoyldcrivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces wadayamensis ATCC 21 948 in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis das Nährmedium eine ausgeprägte, durch die Erzeugung der Cephalosporine A bis E bedingte antibiotische Aktivität aufweist, das Nährmedium gegebenenfalls mit einem Acylierungsmittel, das zur Einführung der Alkoxycarbonyl- oder der Arylcarbamoylgruppe geeignet ist, in an sich bekannter Weise umsetzt, und die Cephalosporine A bis E oder ihre N-Alkoxycarbonyl- oder N-Arylcarbamoylderivate in an sich bekannter Weise isoliert

Die Erfindung betrifft das durch den Anspruch gekennzeichnete Verfahren.

Die Cephalosporine A bis E, hier als WS-3442 A, B, C, D und E bezeichnet, sind bekannte Verbindungen, denen in der Literatur die folgende chemische Struktur zugeordnet wird:

HOOC-CH(CHj)₁CONH NH₂

WS-3442

A B C D E

OCH₃

OCONH₂ OCONH₂

Britische Patentschrift 957 543 Journal of the American Chemical Society, 93, Nr. 9, S. 2308-2310

japanische Patentveröffentlichung 3286/1971 Journal of the American Chemical Society, 93, Nr. 9, S. 2308-2310

Japanische Patentveröffentlichung 3286/1971

-596(1961)

Literatur:

WS-3442 A: WS-3442 B: WS-3442 C:

WS-3442 D: WS-3442 E:

Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung von WS-3442 B durch Kultivierung von Streptomyces clavuligerus in »Program and Abstacts«, S. 13 von »ELEVENTH 1NTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTH ERAPY« (19.-22. Oktober 1971) beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums WS-3442 C durch Kultivierung von Streptomyces lactamdurans wird in der japanischen Palentveröffentlichung 3286/1971 beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika WS-3442 A, D und E durch Fermentierung wurde jedoch in keiner Druckschrift gefunden.

Bei dem zum erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E verwendbaren Mikroorganismus handelt es sich um eine vor kurzem aufgefundene Spezies von Streptomvces.

die aus einer Bodenprobe isoliert wurde, welche in Wadayamacho, Hyogo Prefecture, Japan entnommen wurde.

Eine Kultur des lebenden Organismus wurde hinterlegt und zugefügt der permanenten Kulturtypensammlung der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 21 948, und wird hier und im folgenden Steptomyces wadayamensis genannt

Es ist zu betonen, daß zur Herstellung dieser Antibiotika die Erfindung nicht auf die Verwendung des speziellen hier beschriebenen Organismus, der zur Erläuterung angegeben wird, beschränkt ist. Erfindungsgemäß sind auch Mutanten verwendbar, die von dem angegebenen Organismus in üblicher an sich bekannter Weise erzeugt werden, z. B. durch Röntgenstrahlen, Ultraviolettbestrahlung oder Stickstofflost

Streptomyces wadayamensis ATCC 21 948 zeigt die folgenden morphologischen, Kultur- und physiologischen Charakteristika.

1. Morphologische Eigenschaften

Die Morphologie der Kultur wurde mikroskopisch untersucht mit Mycel, das auf anorganischen Salzen-Stärkeagar bei 3O⁰C10 bis 15 Tage lang gewachsen war.

Die Lufthyphen dieser Kultur sind eng verzweigt und die Spitzen der Lufthyphen geschlungen oder spiralförmig und bilden eine Kette von Konidien.

Die Konidie ist kugelförmig oder ellyptisch und die Oberfläche der Konidie ist dornig.

2. Kultur-Charakteristika

Der Stamm weist die folgenden Kultur-Charakteristika auf, wenn er aiit Medien des in der folgenden Tabelle angegebenen Typs unter 30°C10 bis 15 Tage lang gewachsen ist.

20

Medium	Wachstum	Luftmycel	lösliches	Bemerkungen
			Pigment
CZAPEK's-Agar	flach, sich ausbreitend	gering, pulverig weiß	keines
	schwach kremig gelb
Glucose-	flach, sich ausbreitend,	gering, pulverig weis	keines
Asparaginagar	elfenbeinfarbig
Glycerin- Asparaginagar anorganische	flach, sich ausbreitend.	gering, pulverig weiß	keines
Salze-Stärkeagar	runzelig, etwas erho	pulverig, grau	keines	Hydrolyse von
	ben, graugelb	und weiß		Stärke: mäßig
Tyrosinagar				bis stark
	runzelig, dunkelbraun	pulverig, schwach	keines
Nähragar		graubraun
	hefeähnlich,	keines	braun
Hefemalzagar	grau-kremfarbig
	schwach braun	baumwollartig, bestand	keines
		Wassertropfen, schwach
Hafermehlagar		grau, weiß
Pepton-Hefe- Eisenagar BENNETTs Agar	schwach gelb	pulverig, gary	keines
	flach, dunkelgrau	keines	dunkelbraun
Milch	weiß	baumwollartig,	keines	dasselbe Wachs
		grauweiß		tum bei 37° C
	ringförmig, dunkelgrau	pulverig, teilweise weiß	graubraun	Koagulation:
				schwach
Gelatineansatz				Peptonisierung:
(bei Zimmertempe				schwach
ratur 20 Tage lang)	runzelig, schwarz	pulverig, grau	schwarz	Verflüssigung:
		(beschränkte	schwach
		Diffusion)

3. Physiologische Eigenschaften

(1) Optimale Wachstumstemperatur: 30 bis 37°C

(2) Optimaler pH-Wert für Wachstum: 6 bis 8

(3) Erzeugung von Tyrosinase: nicht festgestellt

(4) Erzeugung von Melanin-ähnlichem Pigment: festgestellt

(5) Hydrolyse von Stärke: hydrolysiert

(6) Verflüssigung von Gelatine: nicht verflüssigt

(7) Koagulation und Peptonisierung von entrahmter Milch: nicht festgestellt

25 30 35 40 45

50

55

60

4, Kohlenstoffquelle-Verwertungsmuster nach der Pridham-Gotllieb-Methode Kohlenstoffquelle Wachstum

L-Arabinose ±

D-Xylose ±

D-Glucose +

D-Fructose " +

_]0 Rhamnose —

Saccharose + + Raffinose —

D-Mannit + +

inosit +

++-gute Verwertung

+ — Verwertung ± — wahrscheinliche Verwertung — — leine Verwertung

Die Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E werden erzeugt, wenn Streptomyces wadayamensis ATCC 21 948 in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und ein anorganisches Salz enthält, unter gesteuerten submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Beim Nährmedium kann es sich um ein beliebiges Medium handeln, das durch Streptomyces wadayamensis ATCC 21 948 verwertet werden kann.

Die bevorzugten Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium sind Kohlehydrate, z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Mannit, Glycerin oder Stärke. Andere verwendbare Kohlenstoffquellen sind Arabinose, Xylose, Inosit Zucker, Dextrin und Melasse.

Die bevorzugten Stickstoffquellen sind z. B. Fleischextrakt, Pcpton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser und getrocknete Hefe, sowie ferner anorganische und organische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat), und Harnstoff.

Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen brauchen, obwohl sie in vorteilhafter Weise in Kombination miteinander verwendet werden, nicht in reiner Form angewandt zu werden, da weniger reine Stoffe, die Spuren an Wuchsfaktoren und beträchtliche Mengen an Mineralnährstoffen enthalten, ebenfalls verwendbar sind. Gewünschtenfalls können dem Nährmedium Mineralsalze zugesetzt werden, z. B. Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Magnesiumsalz oder Kupfersalz. Erforderlichenfalls, insbesondere wenn das Kulturmedium merklich schäumt, kann ein Entschäumungsmittel zugegeben werden, z. B. flüssiges Paraffin, Fettöl, Pflanzenöl, Mineralöl oder Silicone.

Wie es zur Herstellung anderer Antibiotika in großen Mengen ebenfalls bevorzugt ist, werden zur Erzeugung von WS-3442 A, B, C, D und E in großen Mengen submerse aerobe Kulturbedingungen angewandt. Zur Erzeugung in kleinen Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächcnkultur in einem Kolben oder einer Flasche angewandt. Wird die Züchtung in großen Tanks durchgeführt, so wird es ferner bevorzugt, die vegetative Form des Organismus zum Animpfen in den Produktionstanks zu verwenden, um Wachstumsverzögerungen im Verfahren zur Herstellung der Antibiotika zu vermeiden. Es erweist sich daher als wünschenswert, zunächst ein vegetatives Impfmaterial des Organismus herzustellen durch Beimpfen einer vergleichsweise geringen Menge an Kulturmedium mit Sporen oder Mycelicn des Organismus und diese zu kultivieren und das kultivierte vegetative Impfmaterial unter aseptischen Bedingungen in große Tanks zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Impfmaterial erzeugt wird, kann praktisch dasselbe oder verschieden sein von demjenigen Medium, das zur Erzeugung von WS-3442 A, B, C, D und E verwendet wird.

Das Rühren und die Belüftung des Kulturgemisches kann in verschiedenster Weise bewirkt werden. Das Rühren kann bewirkt werden durch einen Propeller oder eine ähnliche mechanische Rührvorrichtung, durch Drehen oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch Durchleiten von

steriler Luft durch das Medium. Die Belüftung kann durch Durchleiten von steriler Luft durch das Fermentie rungsgemisch bewirkt werden.

Die Fermentierung wird in der Regel bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40⁰C, vorzugsweise von 30° C, über eine Zeitdauer von 30 bis 100 Stunden durchgeführt.

Die erfindungsgemäß gewonnenen Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E können aus dem Kulturmedium nach bekannten, zur Isolierung anderer Antibiotika üblicherweise verwendeten Methoden isoliert werden.

In der Regel werden die meisten dieser gebildeten Antibiotika in der kultivierten Brühe gefunden und demzufolge können diese Antibiotika aus dem Filtrat, das durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Nährbrühe go gewonnen wurde, nach üblichen bekannten Methoden abgetrennt werden, z. B. durch Extraktions- oder Adsorptionstechniken.

Die Extraktion wird durchgeführt durch Behandlung des Filtrats mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem diese Antibiotika gelöst werden können, z. B. Pyridin, Alkohole, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Butanol, Ketone, z. B. Aceton, oder wäßrige Alkohole, z. B. wäßriges Methanol, Äthanol oder Butanol, oder mit einer alkalischen wäßrigen Lösung, /.. B. wäßrigem Pyridin, wäßrigem Ammoniak oder wäßrigem Natriumhydroxyd. Andere Lösungsmittel mit ähnlichem Charakter sind ebenfalls verwendbar. Kombinationen dieser Lösungsmittel sind in vorteilhafter Weise anwendbar. Wahlweise können diese Antibiotika aus der Kulturbrühe dadurch abKctrennt werden, daß die Antibiotika in

der filtrierten Brühe an Adsorptionsmittel adsorbiert werden, z. B. an Aktivkohle, aktiviertem Aluminiumoxyd, Silicagel, Magnesiumaluminiumsilicat, lonenaustauscherharz oder Cellulosepulver, worauf diese adsorbierten Antibiotika von dem Adsorptionsmittel eluiert werden mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels, in denen die Antibiotika löslich sind.

Die Antibiotika können von dem in der angegebenen Weise gewonnenen Extrakt oder Eluat isoliert werden durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, in dem diese Antibiotika unlöslich sind, zu der Lösung, oder wahlweise durch Einstellen des pH-Werts der Lösung, so daß diese Antibiotika in der Lösung ausgefällt werden können. In diesem Isolierprozeß können der Extrakt oder das Eluat selbstverständlich gewünschtenfalls auf ein vergleichsweise kleines Volumen konzentriert werden durch Verdampfen des Lösungsmittels. Die auf diese Weise isolierten Antibiotika werden in üblicher bekannter Weise gereinigt, z. B. durch Umkristallisation oder Chromatographie.

Für jedes der in der angegebenen Weise isolierten Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E wurde der Nachweis erbracht, daß es sich um eine bekannte Verbindung der im folgenden angegebenen chemischen Struktur handelt aufgrund der Interpretation der physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie anderer Untersuchungen.

Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E zeigen Aktivitäten gegenüber beispielsweise Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, und Proteus vulgaris.

Zur Herstellung der n-Alkoxycarbonyl- oder N-Arylcarbamoylderivate von WS-3442 A, B, C, D und E wird eine Fermentier-Nährlösung, die WS-3442 A, B, C, D und E enthält, mit einem entsprechenden Acylierungsmittel umgesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Reaktionsschema erläutert:

(Eine Fermentations-Nährlösung mit einem Gehalt an WS-3442 A, B, C, D und E)

Acylierungsmittel

HOOC-CH(CHj),CONH A

(worin R und R* die im Anspruch angegebene Bedeutung haben und A einen N-Alkoxycarbonyl- oder N-Arylcarbamoylrest bedeutet).

Als Acylierungsmittel können in der angegebenen Reaktion alle bekannten, üblicherweise verwendeten, dem Rest A entsprechenden, Acylierungsmittel eingesetzt werden.

Typische geeignete Acylgruppen des angegebenen Typs sind z. B. ein Alkoxycarbonylrest (z. B. Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, oder Butoxycarbonyl) mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein Arylcarbamoylrest (z. B. Phenylcarbamoyj, Tolylcarbamoyl, und Naphthaiearbamoyi) und ein Alkylarylcarbamoylrest (z. B. Methylphenylcarbamoyl und Äthyltolylcarbamoyl).

In den angegebenen Alkoxycarbonylresten, Arylcarbamoylresten und Alkylarylcarbamoylresten können ein oder mehrere mögliche Substituenten vorliegen, z. B. Halogenatome (Fluor, Chlor, Brom oder Jod), Alkoxyreste (z. B. Methoxy, Äthoxy, oder Propoxy), Alkylthioreste (z. B. Methylthio, Äthylthio, Propylthio oder Butylthio), Aryloxyreste, (z. B. Phenyloxy, Tolyloxy, oder Naphthyloxy), Arylreste z. B. Phenyl, ToIyI oder Naphthyl), Alkoxycarbonylreste (z. B. Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Propoxycarbonyl oder Butoxycarbonyl), Acyloxyreste (z. B. Acetyloxy, Propionyloxy, Butyryloxy oder Benzoyloxy), Acylthioreste (z. B. Acetylthio, Propionylthio, Butyrylthio oder Benzoylthio), Acylaminoreste (z. B. Formamido, Acetamido, Butylamido, Propionamido, Benzamido, t-Butoxycarbonylamido, Allyloxycarbonylamino, Cyclohexyloxycarbonylamino, Phenoxycarbonylamino, Phenylthiocarbonylamino, Benzyloxycarbonylamino, oder Toluolsulfonylamino) oder heterocyclische Reste (z. B.Thienyi, Furyi, Pyrroiyi, indoiyi,2-Oxobenzothiazolyl-3-yl oder Imidazolidinyl).

Die Acylierungsreaktion wird vorzugsweise unter Bedingungen zwischen schwacher Azidität und schwacher Alkalinität durchgeführt, nämlich durch Einstellen der Fermentierungsbrühe auf einen geeigneten pH-Wert mit Hilfe einer Base, z. B. Alkalimetallhydroxyd (z. B. Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd), Alkalimetallbicarbonat (z. B. Natriumbicarbonat oder Kaliumbicarbonat), Alkalimetallphosphat (z. B. Natriumphosphat, Natriumhydrogenphosphat oder Kaliumhydrogenphosphat), Alkalimetalldihydrogenphosphat (z. B. Natriumdihydrogenphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat), einer tertiären organischen Base (z. B. Trimethylamin, Triäthylamin, N-Methylpiperazin oder Pyridin).

Nach Vervollständigung der Reaktion können die gebildeten Acylderivate (II) von WS-3442 A₁B₁CD und E isoliert werden und gereinigt werden, z. B. durch Extraktion des erhaltenen Reaktionsgemisches mit einem Lösungsmittel (z. B. Äthylacetat oder Methylisobutylketon), Entfernung des Lösungsmittels von dem Extrakt, z. B. durch Abdampfen, und anschließende Behandlung des erhaltenen Rückstands mit einem hydrohilen organischen Lösungsmittel (z. B. Methanol, Äthanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan oder Acetonitril), worauf das erhaltene Produkt gewünschtenfalls mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt werden kann, z. B. aromatischen Kohlenwasserstoffen (z. B. Benzol oder Toluol), oder mit halogensubstituierten aliphatischen Kohlenwasserstoffen, mit Estern (z. B. Äthylacetat), oder mit üblichen bekannten Hilfsmitteln, z.B. Chromatographie unter Verwendung von Silicagel, Aluminiumoxyd oder Cellulosepulver. in der angegebenen Weise können die Acylderivate leicht isoliert und gereinigt werden in freier Form oder in SaIz-

30 35 40 45

55 60 65

form, ζ. B. als Metallsalz (ζ. B. Natriumsalz oder Calciumsalz), oder als organisches Aminsalz (z. B. Dicyclohexalaminsalz oder Trialkylaminsalz).

Die erfindungsgemäß hergestellten Acylderivate der Formel (II) der Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E, die durchwegs neue Verbindungen darstellen, sind gegenüber Mikrooganismen aktiv und brauchbar als Antibiotika.

Die erfindungsgemäß hergestellten Acylderivate der Antibiotika WS-3442 A, B, C, D und E sind auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von Cephalosporinderivaten mit antimikrobiologischer Aktivität brauchbar. So kann z. B. Das Acylderivat von WS-3442 A desacyliert, z. B. hydrolysiert werden unter Bildung einer Verbindung der Formel

COOH

die acyliert wird unter Bildung des entsprechenden 7-acyliertcn Cephalosporinderivats, z. B. Cefalexin (verwiesen sei z. B. auf die USA-Patentschrift 3 507 861).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Es wurde ein vegetatives Medium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glycerin	3%
Sojabohnenmehl	2%
Glutenmehl	1%
Baumwollsamenmehl	1%
D.L—Methionin	03%
Leitungswasser	nach Bedarf

100 m! des Mediums in 30 Stück 500-ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach beimpft mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATCC 21 948. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30'C 48 Stunden lang inkubiert.
Außerdem wurden 601 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischaummittels in einem 200-1-Tankfermenter ebenfalls in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankvermenter eingeimpft Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert

Ferner wurden 6501 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antischaummittels in einem 1-Tonnen-Tankfermenter nach einer üblichen Methode sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde bei 30° C 96 Stunden lang inkubiert.

Nach beendeter Fermentation wurde dem Kulturmedium unter Rühren Diatomeenerde zugesetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert Das erhaltene Filtrat (6401) wurde auf einen pH-Wert von 4 bis 5 eingestellt und danach wurden dem Filtrat 20 kg Aktivkohle zugesetzt. Der durch Filtration erhaltene Kohlekuchen wurde mit 6001 80%igem wäßrigen Aceton extrahiert.

Der Acetonextrakt wurde konzentriert und mit dem Kationenaustauscherharz »Deolite*C-20« (H+-Form) auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und anschließend durch eine Säule geleitet, die mit einem Anionenaustauscherharz »Deolite®A-6« (CH₃COO--Form) gepackt war. Aktives Material wurde eluiert mit i501 eines Gemisches aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (100 :7 :900). Das erhaltene Eluat wurde auf ein Volumen von etwa 81 konzentriert und mit »Deolite· C-20« (H^e-Form) auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt Von der konzentrierten

so Lösung wurden Verunreinigungen durch zweimaliges Waschen mit Athylacetat und einmaliges Waschen mit n-Buiano! entfernt. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Säule von »Amberiite« XAD-2« geleitet und die durchgeleitete Lösung wurde sodann durch eine Säule von »AF-Harz®« (CHaCOO^--Form) geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser, wurde aktives Material eluiert mit etwa 101 eines Gemisches aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (100:7 :900). Das Eluat wurde konzentriert und danach auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt mit »Deolite*C-20« (H+-Form). Verunreinigungen wurden entfernt durch zweimaliges Waschen mit Äthylacetat und einmaliges Waschen mit n-Butanol. Die wäßrige Schicht wurde auf einen pH-Wert von 5 bis 6 eingestellt mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung, worauf sie konzentriert wurde. Das Konzentrat wurde mit dem 5-fachen Volumen eines Gemisches aus Methanol-Aceton (1 :3) versetzt unter Bildung eines Niederschlags. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wobei etwa 25 g des Rohproduktes in Pulverform

eo erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde Chromatographien an einer Cellulosesäule mit einem Gemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1 :2). Das eluierte aktive Material wurde identifiziert durch Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättern) durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrinreaktion und des Rf-Werts (0,46 bis 0,48).

Aktive Fraktionen wurden gesammelt Das Eluat wurde konzentriert und mit Aceton versetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Der Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und danach in Wasser gelöst Die wäßrige Lösung wurde mit wäßriger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und nach dem Entsalzen lyophilisiert, wobei 18 g WS-3442 A in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Beispiel 2

Eine Haupt-Fermentationslösung, die in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde Filtriert. Zu dem Filtrat (81) wurde 1 I Aceton gegeben. Die erhaltene Lösung wurde mit 10%iger wäßriger Natriumhydroxydlösung unter Rühren bei Zimmertemperatur auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, worauf die Lösung mit 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton tropfenweise versetzt wurde. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt mit 10%iger wäßriger Natriumhydroxydlösung. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und Erbringung des Nachweises, daß die Ninhydrinreaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Aktives Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Aktives Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 η-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestiiiiert, wobei 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde Chromatographien unter Verwendung einer Silicagel-Säure und mit einem Äthylacetat-Essigsäuregemisch (4:1) entwickelt, wobei 5 g 7-[5-(3-Phenylurcido)-5-carboxyvaleramido]-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum ergab:

rf(ppm) 1,80 1,90 2,40 3,02 bis 3,52 4,17 5,06 5,55 735

(4H, Multiplen)

(3H,Singlett)

(2H, Multiplen)

(2H, Quartett. J-18 HZ)

(IH. Multiplen)

(lH,DubIett,J-4,5HZ)

(lH,Dublett,J-4,5HZ)

(5H, Multiplen)

Beispiel 3

7-(5-6-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure wurde nach praktisch demselben Verfahren wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung von t-Butoxycarbonylazid als Acylierungsmittel erhalten.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum zeigte:

rf(ppm)	(9H, Single»)
1,45	(4H, Multiple»)
1,70	(3H,Singlett)
1,95	(2H, Multiplen)
235	(2H, Quartett, J-18 HZ)
3,20 bis 3,65	(IH, Multiplen)
3,90	(lH,Dublett,J-4,5HZ)
5,08	(lH,Dublett,J=4,5HZ)
5,55	Dünnschichtchromatographie:
	Lösungsmittelsystem: Essijisäure-Äthvlacetat (1/2)
Rf-0,68

25 30

40

45

Beispiel 4

Von den wie in Beispiel 1 erhaltenen 6401 filtrierter Fermentationslösung wurden 81 des Filtrats mit 11 ss Aceton versetzt und die Lösung wurde gerührt. Die Lösung wurde mit 10°/oiger wäßriger Natriumhydroxydlösung unter Rühren bei Zimmertemperatur auf einen pH-Wert von 73 eingestellt, worauf die Lösung tropfenweise mit 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton versetzt wurde.

Die erhaltene Lösung wurde mit 10%iger wäßriger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 74 bis 8,0 eingestellt Nach Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und Feststellung, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ βο war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt Aktives Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,01 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert und in der Äthylacetat vorhandenes aktives Material wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt Nachdem der pH-Wert der überführten Lösung mit 6 η-Salzsäure auf 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wurde gewaschen mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet Durch Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurden 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten.

Die ölige Substanz wurde Chromatographien an einer Silicagel-Säule und mit einem Äthylacetat-Essigsäure-

gemisch (4 :1) entwickelt, wobei 5 g 7-[5-(3-Phenylureido)-5-carboxyvaleramido]-3-rnethyl-3-cephem-4-carbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden. Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

1,80	(4H. Multiplen)	Beispiel 5
1,90	(3H.Singleti)
2,40	(2H, Multiplen)
3,02 bis 3.52	(2H,Quartctt,J-18HZ)
4,17	(IH. Multiplen)
5,06	(1H,Dublett.J-5HZ)
5,55	(1H,Dublett,J-5HZ)
735	(5H. Multiplen)

Das wie in Beispiel 1 erhaltene Rohprodukt in Pulverform (etwa 25 g) wurde Chromatographien an einer Säule von Cellulose. Aktives Material wurde eluiert mit einem Gemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2). Das Vorliegen von aktivem Material im Eluat wurde durch Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättem) bestätigt durch Untersuchung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,27 bis 0,30). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und mit Aceton versetzt, um im Konzentrat einen Niederschlag zu bilden.

Die Niederschläge wurden getrocknet und auf einer Säule von Cellulose Chromatographien. Das aktive Material wurde mit einem Gemisch aus Acetonitril-Propanol-Wasser (2 :2 :1) eluiert.

Die Fraktionen, die eine ausgeprägte antibakterielle Aktivität gegen Escherichia coli und einen Rf-Wert von etwa 03 aufwiesen, wurden gesammelt. Ferner wurden die Fraktionen gesammelt, die eine ausgeprägte antibakterielle Aktivität gegenüber Bacillus subtilis zeigten und einen Rf-Wert von etwa 0,3 aufwiesen. Jede der beiden, diese unterschiedlichen Typen von Fraktionen enthaltenden Lösungen wurde konzentriert und jedes der beiden erhaltenen Konzentrate wurde zur Niederschlagsbildung mit Aceton versetzt. Jeder der beiden Niederschläge wurde lyophilisiert und aus der Fraktion mit antibakterieller Wirkung gegen Escherichia coli wurden 50 g WS-3442 C erhalten und aus der Fraktion mit antibakterieller Wirkung gegen Bacillus subtilis wurden 50 g WS-3442 B gewonnen.

Beispiel 6

Eine Haupt-Fermentierungslösung, die in ähnlicher Weise wie in Beispiel I beschrieben, erhalten worden war, wurde filtriert

Das Filtrat (0,81) wurde mit einer wäßrigen, In-Natriumhydroxydlösung unter Kühlung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und mit 700 ml Aceton versetzt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 35 ml Phenylisocyanat in 35 ml Aceton tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydiösung eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und Feststellung, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war. wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das aktive Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung mit 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und danach über Magnesiumsulfat getrocknet

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 29,7 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde in 100 mi Methanol gelöst und die erhaltene Lösung wurde unter Kühlung mit 18,5 g Dicyclohexylamin versetzt Zu der Lösung wurden 250 ml Äther zugegeben, worauf sie stehen gelassen wurde zur Ausbildung von Kristallen. Die gebildeten Kristalle wurden in Äthylacetat suspendiert und die Suspension wurde mit 1 η-Salzsäure behandelt, wobei 1,2 g 7-[5-(3-PhenyIureido)-5-carboxyvaleramido]-3-(carbamoyloxymethyl)-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat

Innerer Standard: TMS

60 rf(ppm)	(4H. Multiplen)
130	(2H, Multiplen)
2,40	(2H,Quartett,J«18HZ)
3,08 bis 3,55	(IH, Multiplen)
65 4,15	(lH.Dublett.J-4.5HZ)
5,05	(1H.DublettJ-4.5HZ)
5.60	(5H, Multiplen)
735

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1:2) Rf-Wert-039

Beispiel 7

Sine Haupt-Fertncntierungslösung. die nach einem ähnlichen FcrmentierungsverfHhrcn wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten worden war. wurde filtriert.

Das Fdtrat (81) wurde auf einep pH-Wert von 7.5 mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung eingestellt und anschließend mit 11 Aceton versetzL 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton wurden tropfenweise zu der Lösung zugegeben, worauf deren pH-Wert mit IO%iger wäßriger Natriumhydroxydlösung auf 7.5 bis 8,0 eingestellt wurde. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und dem Nachweis, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylhamstoff durch Filtration entfernt Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert Das in der Äthylacctatschicht vorliegende aktive Material wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 n-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wurde mit einer wäßrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und danach über Magnesiumsulfat getrocknet

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde auf einer Säule von Silicagel Chromatographien und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthyiacetat-Essigsäure (4:1) entwickelt, wobei 10 g 7-{5-(3-Phenylureido)-5-carboxyvaleramido]-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure in Form eir. js weißen Pulvers erhalten wurden.

Kernmagnetische Resonanz: Lösungsmittel: Deuterium -I- Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

rf(ppm)	(4H, Multiplett)
130	(2H. Multiplen)
2,40 *	(2H, Quartett J-18 HZ)
3.02 bis 3,53	(3H, Single«)
3,54	(IH. Multiplen)
4,18	(IH.Singlett)
5.15	(5H, Multiplen)
730

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1 :2) Rf -039

Beispiel 8

7-(5-t-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wurde praktisch nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 7 beschrieben, erhalten unter Verwendung von t-Butoxycarbonylazid als Acylierungsmittel.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum: Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

rf(ppm)	(9H,Singlett)
1,43	(4H₁ Multiplen)
1,75	(2H, Multiplen)
2,40	(2H, Quartett, J-18 HZ)
3,25 bis 3,72	(3H,Singlett)
3,53	(I H, Multiplen)
3,85	(IH.Singlett)
5,16

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure : Äthylacetat (I : 2) Rf-0,49

Beispiel 9 0,8 1 einer wie in Beispiel 1 erhaltenen filtrierten Fermentationslösung wurden mit wäßriger 1 n-Natriumhy-

30 35 40 45

50

55

60

65

droxydlösung unter Kühlung auf einen pH-Wert von 73 eingehellt, worauf das Filtrat mit 70OmI Aceton versetzt wurde. Zu der Lösung wurden 35 ml Phenylisocyanat in 34 ml Aceton tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydjotiing aufeinen pH·;Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und dem Nachweis, dsß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Dipbenylharnstoff durch Filtration entternt Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die waSrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert yon 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert Das in der Äthylacetatschicht vorliegende aktive Material wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 13 mit 6n-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat, extrahiert. Der Extrakt wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und danach über Magnesiumsulfat_; getrocknet Das Lösungsmittel würde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 29,7 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden:

Die ölige Substanz wurde in 100 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde unter Kühlung mit 183 g Dicyclohexylamin versetzt Zu der erhaltenen Lösung wurden 250 ml Äther zugegeben, worauf die Lösung zur Kristallbildung stehengelassen wurde. Die gebildeten Kristalle wurden in Äthylacetat suspendiert und die Suspension wurde mit 1 n-Salzsaure behandelt, wobei 1,2 g 7-f5-(3-phenylureido)-5-carboxyvaleramido]-3-(cart>amoyk)xymetr ' " · - ·■ ·

Kernmagnetisches Resonanzspektrum: Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat

• Innerer Standard: TMS ^;

rf (ppm)	i (4H. Multiplen)
L80	(2H. Multiplen)
2.40	(2H,QuaftettI-18HZ)
3,08 bis 335	(IH, Multiplen)
4,15	(lH.Dublett,J-43HZ)
5,05	(lH.Dublett,]-43HZ)
5.60	(5H, Multiplen)
735

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1:2) . Rf-039

Beispiel 10

Von den wie in Beispiel 1 erhaltenen 6401 filtrierter Fermentations-Lösung wurden 81 mit einer lOVoigen wäßrigen Natriumhydroxydlösung unter Kühlung auf einen pH-Wert yon 73 eingestellt worauf das Filtrat mit 11 Aceton versetzt wurde. Zu der Lösung würden 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde mit einer 10%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und dem Nachweis, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 13 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert Das aktive Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt Nachdem der pH-Wert der überführten Lösung mit 6 η-Salzsäure auf 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde Chromatographien an einer Silicagel-Säule und in einem Gemisch aus Äthylacetat-Essigsäure (4:1) entwickelt, wobei 10 g 7-[5-(3-Phenylureido)-5-carboxyvaleramido]-3-(carbomyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Kernmagnetische Resonanz: Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

rf(ppm)	(4H, Multiple«)
1,80	(2H, Multiplen)
2,40	(2H,Quartett,J-18Hz)
3,02 bis 3,53	(3H, Singleu)
334	(IH, Multiplen)
4,18	(IH. Singled)
5,15	(51 i, Muiiipieit)
730

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1 :2) Rf-0,39

10

Beispiel 11

Das wie in Beispiel 1 erhaltene Rohprodukt in Pulverform (etwa 25 g) wurde Chromatographien an einer Säule mit Cellulose. Aktives Material wurde eluiert mit einem Lösungsmittclgemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 :1 :2). Der Nachweis für aktives Material im Elual wurde mit Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Cclluloseblättcrn) erbracht durch Untersuchung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,48 bis 0,50). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und mit Aceton versetzt zur Ausfällung. Der gebildete Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und anschließend in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wurde mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und nach dem Entsalzen lyophilisiert, wobei 4 g WS-3442 D in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Beispiel 12

Eine Haupt-Fermenlicrungslösung, die nach einem ähnlichen Fermentierungsverfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten worden war, wurde filtrier-. Zu 1,01 Filtrat wurden 200 ml Aceton zugegeben und die erhaltene Lösung wurde unter Rühren bei Zimmertemperatur mit 15 ml Phenylisocyanat in 15 ml Aceton tropfenweise versetzt. Die Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und der Bestätigung, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnsioff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Hilfe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 1.0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das aktive Material in der Athylacetatschicht wurde in eine 3%ige Nartriumacetatlösung überführt. Nachdem der pH-Wert der überführten Lösung mit 6 η-Salzsäure auf 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetai extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 4 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde säulenchromalographisch behandelt unter Verwendung von Silicagel. Die Entwicklung erfolgte mit einem Gemisch aus Äthylacetat-Essigsäure (4:1). wobei 50 mg 7-[5-(3-Phenylureido)-5-carboxyvaleramido]-3-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbictrbonat ■:

Inri^rtr Standard: TMS _; ,

rf(ppm)	(4H, Multiple»)
130	(3H,Singlett)
1,88	(2H, Multiplen)
2,45	(2H₁DUbIeIt₁J-18 HZ)
2,93 bis 3,44	(3H, Single»)
3,54	(IH, Multiplen)
4,18	(lH.Singlett)
5,08	(5H, Multiplen)
7,35

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1 :2) Rf -0,56

Beispiel 13

7-(5-t-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wurde nach praktisch dem selben Verfahren wie in Beispiel 12 beschrieben, erhalten unter Verwendung von t-Butoxycarbonylazid als Acylierungsmittel.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat

Innerer Standard: TMS

35 40 45 50

1,43	(9H, Single«)
1,75	(4H, Multiplen)
1,92	(3H,Singlett)
2,40	(2i i. iMuuipiett)
3,10 bis 3,60	(2H,DubIett,]-18HZ)
3,51	(3H, Single«)
3,90	(IH, Multiplen)
5,11	(lH.Singlett)

60

65

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure(Eiscssig)-Äthylacctai(i : 2) Rf=0.67

Beispiel 14

Von den wie in Beispiel 1 erhaltenen 6401 filtrierter Fermentationslösung wurde 1 1 mit 200 ml Aceton versetzt und die erhaltene Lösung wurde unter Rühren bei Zimmertemperatur mit 15 ml Phenylisocyanat in 15 ml Aceton tropfenweise versetzt. Die Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydiösung auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und der Bestätigung, daß

ίο die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnsloff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf eijicn pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltricrl. Das aktive Material in der Äthylacetalschicht wurde in eine 3%ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 n-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacclut extrahiert Der Extrakt wurde mit gesättigter wäßriger Natriuinchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdcstilliert, wobei 4 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde Chromatographien an einer Säule von Silicagel. Die Säule wurde entwickelt in einem Gemisch aus Äthylacetat-Eu.sigsäure (4:1), wobei 50 mg 7-[5-(3-Phcnyl-ureido)-5-carboxyvalerami doJ-3-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden.

25	(ppm)	(4H, Multiplen)
1,80	(3H,Singlctt)
1,88	(2H, Multiplctt)
2,45	(2H.Dublett,] = 18HZ)
30 2,93 bis 3.44	(3H, Single«)
3,54	(IH. Multiplen)
4,18	(IH.Singleti)
5,08	(5H, Multiplen)
7.35

Stärke	4%
Baumwollsamenmchl	2%
Trockenhefe	1%
KH₂PO₄	0,1%
D.L— Methionin	0,1%
Sojabohnenöl	0,5%
Leitungswasser	q.s.

Dünnschichtchromatographic:

Lösungsmittclsystcm: Essigsäurc-Äthyhicctat (1 :2) Rf-0,56

Beispiel 15

Das verwendete vegetative Medium hatte die folgende Zusammensetzung:

100 ml dieses Mediums in jedem von 30 Stück 500 ml-Kolben wurde in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelicn von Streptomyccs wadayamcnsis ATCC 21 948 beimpft. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30⁰C48 Stunden king inkubiert.

Außerdem wurden 601 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischaummittel in einem 200-l-Tankfermcntcr in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermchrungskulturen wurde in diesen Tankfcrmcnter eingeimpft. Diese /weile Vermehrungskultur wurde bei 30°C 24 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 650 I des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antischaummittel in

einem 1-t-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde in diesen 1-t-Tankfermenter eingeimpft. Die erhaltene Hauptkullur wurde bei 30°C 96 Stunden lang inkubiert.

Nach Beendigung der Fermentation wurde diese Kultur unter Rühren mit Diatonerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbcschichtctcn Filterpresse filtriert. Das erhaltene Kulturfiltrat (640 I) wurde auf 100"C 20 bis 30 Minuten lang erhitzt und danach wurde das Filtrat auf einen pH-Wert von 4 eingestellt. Das Filtrat wurde mildem Kationcnaustauschcrharz NDcI)IiIc¹⁸C^Ow(H ' -Form) auf einen pH-Wert von 2 bis 2,5 eingestellt und auf eine Säule von »ΛF-Harz®« (CHiCOO -Form) aufgebracht. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde aktives Material eluiert mit einem Gemisch aus Pyridin-Essig-

säure Wasser(10 :1 :90). Das Eluat wurde konzentriert. n-Butanol wurde zu dem Konzentrat zugegeben und es wurde gerührt.

Die wäßrige Schicht wurde mit Wasser auf 60 I verdünnt und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule von »Deolite® A-6« (CH₅COO -Form) geschickt. Die durchgelaufene Lösung wurde konzentriert und das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert von 5 bis 6 eingestellt und danach konzentriert. Fünf Volumen eines Gemisches aus Methanol-Accton (1 :3) wurden zu dem Konzentrat zugegeben, um einen Niederschlag zu bilden. Der ausgefallene Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wobei etwa 300 g Rohprodukt in Form eines Pulvers erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde auf einer Säule von Cellulose Chromatographien. Die Säule wurde eluiert mit einem Gemisch aus Acetonitril-Prupanol-Wasscr (2:2:1). Das Eluat wurde mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Cellulosebiättern) untersucht durch Bestimmung der antibukteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,27). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit n-Buianol versetzt und gerührt.

Die abgetrennte wäßrige Schicht wurde mi! Wasser auf 60 ! verdünnt und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule des Anionenaustauschers »Deolite® A-6« (CH jCOO -Form) geschickt.

Die durchgelaufene Lösung wurde konzentriert und das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert von 5 bis 7 eingestellt. Die konzentrierte Lösung wurde sodann mit einem Gemisch aus Methanol-Aceton(l : 1) versetzt zur Niederschlagsbildung. Die erhaltenen Niederschläge wurden gesammelt und getrocknet, wobei 150 g eines Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Pulver wurde an einer Cellulose-Säulc Chromatographien und mit einem Gemisch aus Acetonitril-Propanol-Wasser(2 : 2 :1) entwickelt. Das Eluai wurde untersucht mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Cellulosebiättern) durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,27). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Aceton wurde zu den Fraktionen zugesetzt zur Niederschlagsbildung. Der gebildete Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und danach entsalzen und lyophilisiert, wobei 60 g WS-3442 E erhalten wurden.

Beispiel 16

7-[5-(3-Phenylureido)-5-carboxyvaleramido]-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure wurde in analoger Weise wie in Beispiel 12 beschrieben erhallen.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Natriumbiearbonat

Lösungsmittel:	Deuterium + Natriumbiearbonat
Innerer Standard:	TMS
δ (ppm)
1,80	(4H, Multiplen)
2,42	(2H.Muitiplett)
3,62 bis 3,65	(2H, ab. Quartett. J = 18 HZ)
4.20	(IH, Multiplen)
4,26	(2H, Singleu)
5,08	(IH.Dubletl, \|= 4.5 HZ)
5,63	(1H,Dub!ett,] = 4,5HZ)
7,35	(5H, Multiplen)

45

65

13

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin der aligemeinen Formel

R HOOC—CHiCH^CONH

NH₂ J

OOH worin R und R' folgende Bedeutungen aufweisen:

A) R-H.R'-H

B) R-H,R'-OCONH₂

C) R-OCH₃, R' -OCONH₂

D) R-OCH₃, R'-H oder

E) R-H.R'-0H